JP2011506652A

JP2011506652A - ヒドロキシアルキルデンプン誘導体およびその調製方法

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Publication number: JP2011506652A
Application number: JP2010537332A
Authority: JP
Inventors: ハケット，フランク; ハイ，トーマス; ハウシルト，フランツィスカ; クノラー，ヘルムート; シンメル，マルティン; ゾンマーマイヤー，クラウス
Original assignee: フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2011-03-03
Anticipated expiration: 2028-12-15
Also published as: IL206223A0; HK1144780A1; IL206223A; EA018222B1; AU2008337931A1; JP5486507B2; ZA201004220B; BRPI0821133A2; ES2399003T3; EP2231711B1; KR20100099282A; US20130230898A1; US8404834B2; AU2008337931B2; CN101918455B; EP2231711A1; NZ586021A; CN101918455A; WO2009077154A8; KR101578955B1

Abstract

本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）をＨＡＳの場合により酸化された還元末端を介して、アミノ基とは別に特別に保護されたカルボニル基、すなわちアセタール基またはケタール基を含む架橋性化合物のアミノ基Ｍと反応させるステップを含む、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の調製の方法に関するものである。

Description

本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を調製する方法に関し、この方法は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、ＨＡＳの場合により酸化された還元末端を介して、アミノ基とは別に特別に保護されたカルボニル基、すなわちアセタール基またはケタール基を含む架橋性化合物のアミノ基Ｍと反応させるステップを含む。この方法は、このように得たＨＡＳ誘導体を、アルキル化、好ましくは還元的アミノ化を介して、生物活性化合物のアミノ基と反応させることをさらに含むことができる。さらに本発明は、本発明のプロセスによって得られる又は得られたＨＡＳ誘導体に関し、またその特定のＨＡＳ誘導体に関する。本発明は、生物活性化合物を含有するＨＡＳ誘導体を含む製薬組成物に関し、また治療剤または予防剤としてのＨＡＳ誘導体および薬剤の調製のための特定のＨＡＳ誘導体の使用にも関する。

ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、自然発生型炭水化物ポリマーのアミロペクチンの置換誘導体であり、これはコーンスターチ中に最大９５重量％の濃度で存在し、体内でα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは特に有利な生物特性を示し、血液量置換剤として診療所の血液療法で使用される（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８；Ｗｅｉｄｌｅｒｅｔａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／ＤｒｕｇＲｅｓ．，４１，４９４−４９８）。

ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を産生する方法は、当該技術分野において開示されている。

独国特許出願公開第２６１６０８６号明細書には、ヘモグロビンのヒドロキシエチルデンプンへの結合が開示されており、この最初のステップでは、ブロモシアンなどの架橋剤がヒドロキシエチルデンプンに結合され、続いてヘモグロビンが中間生成物に連結されている。

ＨＥＳが使用される１つの重要な分野は、特定の生理効果を得るために例えば循環系に利用されるポリペプチドの安定化である。これらのポリペプチドの具体的な一例はエリスロポエチンであり、これは循環中の赤血球レベルを制御するのに必須である約３４，０００ｋＤａの酸性糖タンパク質である。

ポリペプチドおよび酵素の利用による周知の問題は、これらのタンパク質がしばしば不十分な安定性を示すことである。特にエリスロポエチンは、相対的に短い血漿半減期を有する（ＳｐｉｖａｋａｎｄＨｏｇａｎｓ，１９８９，Ｂｌｏｏｄ７３，９０；ＭｃＭａｈｏｎｅｔａｌ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ７６，１７１８）。これは治療的血漿レベルが急速に消失し、反復静脈内投与を実施する必要があることを意味する。さらに、ある環境において、ペプチドに対する免疫応答が観察される。

ポリペプチドをポリマー分子に結合させると、ポリペプチドの安定性を改善することができ、これらのポリペプチドに対する免疫応答が低減されることが一般に認められている。

国際公開第９４／２８０２４号パンフレットには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された生理活性ポリペプチドは免疫原性および抗原性の低下を示し、未結合タンパク質よりもかなり長く血流中に循環する、すなわち長いクリアランス速度を有することが開示されている。しかし、ＰＥＧ−薬物結合体はいくつかの欠点を示し、例えばｉｎｖｉｖｏ分解経路の要素が認識できる天然構造を示さない。したがってＰＥＧ結合体とは別に、他の結合体およびタンパク質ポリマレートが生成されている。

国際公開第０２／０８０７９号パンフレットには、活性剤およびヒドロキシアルキルデンプンが直接またはリンカ化合物を介してのどちらかで結合されている、活性剤およびヒドロキシアルキルデンプンの結合体を含む化合物が開示されている。直接結合に関する限り、活性剤およびヒドロキシアルキルデンプンの反応は、少なくとも１０重量％の水を含む水性媒体中で実施する。ヒドロキシアルキルデンプンを架橋性化合物に、保護カルボニル基をさらに含有する架橋性化合物のアミノ基を介して結合することを指示する例は与えられていない。さらに、ＨＡＳ誘導体を示す例が与えられ、ＨＡＳ誘導は、該カルボニル基を介して生物活性剤のアミノ基と反応させることによって得られる。

国際公開第０３／０７４０８７号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン分子とタンパク質との間の結合が共有結合であり、ヒドロキシアルキルデンプンの末端アルデヒド基または該アルデヒド基の反応から生じた官能基とタンパク質の官能基との結合の結果である、ヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質結合体が開示されている。

国際公開第０３／０７４０８８号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン分子と低分子量化合物との間の結合が共有結合であり、ヒドロキシアルキルデンプンの末端アルデヒド基または該アルデヒド基の反応から生じた官能基とタンパク質の官能基との結合の結果である、低分子量化合物とのヒドロキシアルキルデンプン結合体が開示されている。

国際公開第２００５／０１４０２４号パンフレットには、官能化ポリマーがオキシム結合基によってタンパク質に共有結合されている、アミノオキシ基による官能化ポリマーまたはその誘導体、結合体、官能化ポリマーを調製するプロセス、結合体を調製するプロセス、本発明のプロセスにより得られるような官能化ポリマー、プロセスにより得られるような結合体、ならびに少なくとも１つの結合体を含む製薬組成物およびヒトまたは動物の体の予防または治療のための組成物が開示されている。

国際公開第２００５／０９２３９０号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプンまたはヒドロキシアルキルデンプンの誘導体とタンパク質との間の共有結合によって形成される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質との結合体およびこれらの結合体を産生する方法およびこれらの結合体の使用が開示されている。

国際公開第２００４／０２４７７７号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、特にヒドロキシアルキルデンプンをリンカ化合物の１級または２級アミノ基と反応させるプロセスによって得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体が開示されている。特に好ましい実施形態において、国際公開第２００４／０２４７７７号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプンをリンカ化合物の１級または２級アミノ基と反応させて、得られた生成物をポリペプチドと、好ましくは糖タンパク質と、特に好ましくはエリスロポエチンと、リンカ化合物の少なくとも１つの他の反応性基を介して反応させるプロセスによって得られる、ヒドロキシデンプン誘導体が開示されている。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンである。国際公開第２００４／０２４７７７号パンフレットによれば、ヒドロキシアルキルデンプンおよび好ましくはヒドロキシエチルデンプンをリンカ化合物と、反応の前に酸化されていないその還元末端にて反応させる。

国際公開第２００４／０２４７７６号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体、特にヒドロキシアルキルデンプンを、架橋性化合物の１級または２級アミノ基と、または得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物の官能基Ｙと反応することが可能である少なくとも１つの官能基Ｙを有し、さらなる化合物のこの基Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオール基である２つの架橋性化合物と反応させるプロセスによって得られる、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体が開示されている。特に好ましい実施形態によれば、国際公開第２００４／０２４７７６号パンフレットは、ヒドロキシアルキルデンプンを架橋性化合物の１級または２級アミノ基と反応させて、得られた反応生成物を場合により第２の架橋性化合物とさらに反応させるプロセスによって得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関し、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、さらなる化合物の官能基Ｙと反応することが可能である少なくとも１つの官能基Ｘを有し、この基Ｙは、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオール基であり、得られた反応生成物を、これらの官能基Ｙの少なくとも１つを含む、ポリペプチドと、好ましくはＡＴＩＩＩ、ＩＦＮ−βまたはエリスロポエチンなどのポリペプチドと、特に好ましくはエリスロポエチンと反応させる。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンである。国際公開第２００４／０２４７７６号パンフレットにより、ヒドロキシアルキルデンプンおよび好ましくはヒドロキシエチルデンプンをリンカ化合物と、反応の前に場合により酸化されるその還元末端にて反応させる。

国際公開第２００５／０９２９２８号パンフレットには、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンとタンパク質との結合体を開示し、これらの結合体は、ヒドロキシアルキルデンプンの、またはヒドロキシアルキルデンプンの誘導体の少なくとも１つのアルデヒド基と、タンパク質の少なくとも１つのアミノ基との間の還元アミノ化反応によって形成されるので、ヒドロキシアルキルデンプンまたはその誘導体はアゾメチン結合またはアミノメチレン結合を介してタンパク質に共有結合される。国際公開第２００５／０９２９２８号パンフレットは、これらの結合体を産生する方法および結合体の詳細な使用にも関する。

米国特許出願公開第２００６／０１９４９４０号明細書には、水溶性ポリマーアルカナールが開示されている。特に、ポリマーと反応させる保護アルデヒド試薬が開示されている。ポリサッカライドが一般的と言及しているが、特に好ましいポリマーはポリエチレングリコールである。米国特許出願公開第２００６／０１９４９４０号明細書には、デンプン、または特にヒドロキシアルキルデンプンなどの修飾デンプンは開示されていない。結果として、米国特許出願公開第２００６／０１９４９４０号明細書は、所与のリンカ化合物をヒドロキシアルキルデンプンに結合する詳細な方法に関する開示を含んでいない。同じことが米国特許第７１５７５４６号明細書、欧州特許出願公開第１５９１４６７号明細書および国際公開第２００４／０２２６３０号パンフレットにも当てはまる。

米国特許第６９１６９６２号明細書には、非保護形および保護形のアミノアセタール架橋性化合物が開示されている。本明細書には、この架橋性化合物のポリエチレングリコール以外のポリマーとの考えられる結合に関連する開示が含まれていない。特に、ヒドロキシアルキルデンプンなどの修飾デンプンはおろか、デンプンも米国特許第６９１６９６２号明細書には開示されていない。結果として、米国特許第６９１６９６２号明細書は、所与のリンカ化合物をヒドロキシアルキルデンプンに結合する詳細な方法に関しての開示を含んでいない。同じことが米国特許第６９５６１３５号明細書および国際公開第０３／０４９６９９号パンフレットにも当てはまる。

米国特許第５９９０２３７号明細書には、保護アルデヒド基を含有する構造が開示されている。これらの構造を含む化合物は好ましくはポリエチレングリコールに結合され、結合は、保護アルデヒド基含有化合物に含まれる官能基としてのハライドを介して実施され、該ハライド基はポリエチレングリコールのヒドロキシ基と反応する。

本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得る新規方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、ＨＡＳを特別な官能化架橋性化合物と反応させることによって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体などの新規ＨＡＳ誘導体を提供することである。

本発明のまた別の目的は、ＨＡＳを特別な官能化架橋性化合物と反応させることによって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体を、生物活性化合物の好適な官能基と反応させることによって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体などの更なる新規のＨＡＳ誘導体を提供することである。

驚くべきことに、特別なＨＡＳ誘導体の調製ために、一方ではアミノ基を介して、ヒドロキシアルキルデンプンの場合により酸化された還元末端に選択的に結合されることが可能であり、他方では、第２の官能基として完全保護カルボニル基、すなわちアセタール基またはケタール基を有する架橋性化合物を使用できることが見出された。遊離アルデヒドもしくはケト基または、例えばヘミアセタール基を官能基として有する架橋性化合物が利用される実施形態と比較して、このような完全保護基を利用することによって、ＨＡＳの架橋性化合物との反応の間に、架橋性化合物分子間に望ましくないオリゴマー化または重合が起こるリスクが大幅に最小化される。予想外に、得られたＨＡＳ誘導体に含まれるアセタールまたはケタール基の脱保護は、アセタール基およびエーテル基などの多くの官能基を特徴とするヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプンの特別な化学構造を少なくとも部分的に破壊することなく可能である。したがって、本発明により、生物活性化合物との有効な結合を可能にするＨＡＳ誘導体を提供するために、得られたＨＡＳ誘導体の官能基を、ＨＡＳ構造の少なくとも部分的な破壊を伴わずに脱保護する可能性と併せて、個々の架橋性化合物分子間のオリゴマー化または重合のリスクを最小限に抑えることによって、第１のＨＡＳを調製する極めて効果的な方法を可能にする。

したがって、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の調製方法であって、
（ｉ）式（Ｉ）

で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、ＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ^＊を介して、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
（Ａは、アセタール基またはケタール基であり、ならびにＬは、ＭおよびＡを架橋するスペーサであり、式中、Ｃ^＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合により酸化される）による架橋化合物のアミノ基Ｍと反応させて、式（ＩＩＩ）

（Ｘは、ＨＡＳの場合によっては酸化された還元末端の炭素原子Ｃ^＊を介するアミノ基ＭとＨＡＳとの反応から生じた官能基であり、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である）
で示すＨＡＳ誘導体を得るステップを含む方法に関する。

さらに、本発明は、本方法によって得られるまたは得たヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体に関する。

さらに、本発明は、式（ＩＩＩ）

で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体に関し、
Ａは、アセタールまたはケタール基であり、Ｌは、ＸおよびＡを架橋するスペーサであり、
Ｘは、式（ＩＩ）

で示す架橋化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）

で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによるＨＡＳの炭素原子Ｃ^＊を介した反応から生じる官能基であり、Ｃ^＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合によっては酸化され、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である。

（ヒドロキシアルキルデンプン）
本発明の状況において、「ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）」という用語は、少なくとも１個のヒドロキシアルキル基によって置換されたデンプン誘導体を指す。本発明の好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、式（Ｉ’）

に示す構造式を有し、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素、直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基、または

基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は独立して、水素、およびアルキル基、好ましくは水素およびメチル基であり、
ｍは２〜４であり、残基Ｒ^１およびＲ^２は、ｍ個のＣＲ^１Ｒ^２基中で同じかまたは異なることができ、
ｎは０〜２０、好ましくは０〜４であり、
ｏは２〜２０、好ましくは２〜４であり、ここで残基Ｒ^３およびＲ^４は、ｏ個のＣＲ^３Ｒ^４基において同じかまたは異なることができる。

好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３は独立して、基−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ（式中、ｎは、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、または６である）、ならびに特に、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３は独立して、水素または２−ヒドロキシエチルである。

式（Ｉ）および（Ｉ’）において、デンプン分子の還元末端は非酸化形で示され、ＨＡＳの末端サッカライド単位は、溶媒に応じて（遊離）アルデヒド形と平衡状態にあり得るヘミアセタール形で示されている。本発明の状況で使用するようなＨＡＳ’の省略形は、ＨＡＳ分子の還元末端に末端サッカライド単位のないＨＡＳ分子を指す。これは、本発明の状況で使用するような「ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部」という用語を意味する。

本明細書で使用するような「ヒドロキシアルキルデンプン」という用語は、末端炭水化物部分が式（Ｉ）および（Ｉ’）で簡潔にするために示されたようなヒドロキシアルキル基Ｒ_１、Ｒ_２および／またはＲ_３を含む化合物に限定されないが、末端炭水化物部分および／またはヒドロキシアルキルデンプン分子、ＨＡＳ’の残部のどちらかの、いずれかの箇所に存在する少なくとも１個のヒドロキシ基がヒドロキシアルキル基Ｒ_１、Ｒ_２および／またはＲ_３よって置換される化合物も指す。

２つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンも可能である。

ＨＡＳに含まれる少なくとも１個のヒドロキシアルキル基は、１個以上の、特に２個以上のヒドロキシ基を含有し得る。好ましい実施形態により、ＨＡＳに含まれる少なくとも１個のヒドロキシアルキル基は、１個のヒドロキシ基を含有する。

「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現は、アルキル基が１置換または多置換されている誘導体も含む。この状況において、アルキル基がハロゲン、特にフッ素によって、またはアリール基によって置換されることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキル基のヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化され得る。

さらに、アルキルの代わりに、直鎖または分枝置換または非置換アルケニル基が使用され得る。

ヒドロキシアルキルデンプンは、デンプンのエーテル誘導体である。該エーテル誘導体に加えて、他のデンプン誘導体も本発明の状況で使用できる。例えば、エステル化ヒドロキシ基を含む誘導体が有用である。これらの誘導体は例えば、２〜１２個の炭素原子を持つ非置換モノもしくはジカルボン酸の誘導体、またはその置換誘導体であり得る。特に有用なのは、２〜６個の炭素原子を持つ非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体である。この状況では、アセチルデンプン、ブチリルデンプンおよびプロピオニルデンプンが好ましい。

さらに、２〜６個の炭素原子を持つ非置換ジカルボン酸の誘導体が好ましい。

ジカルボン酸の誘導体の場合、ジカルボン酸の２級カルボキシ基もエステル化されることが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体も本発明の状況で好適である。

置換モノまたはジカルボン酸では、置換基は好ましくは、置換アルキル残基について上述したのと同じであり得る。

デンプンのエステル化技法は当該技術分野で公知である（例えばＫｌｅｍｍＤ．ｅｔａｌ，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣｅｌｌｕｌｏｓｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．２，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｃｈａｐｔｅｒ４．４，ＥｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＩＳＢＮ３−５２７−２９４８９−９））を参照。

本発明の好ましい実施形態により、上述の式（Ｉ）によるヒドロキシアルキルデンプンが利用される。ＨＡＳ’に含まれる他のサッカライド環構造は、明示的に記載されたサッカライド環と同じまたは異なり得て、それらに還元末端がないという点で異なる。

式（Ｉ）による残基Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３に関する限り、具体的な制限はない。好ましい実施形態により、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素または各アルキル残基に２〜１０個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリル基である。２〜１０個の炭素原子を有する水素およびヒドロキシアルキル基が好ましい。さらに好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、２〜６個の炭素原子、さらに好ましくは２〜４個の炭素原子、およびなおさらに好ましくは２〜３個の炭素原子を有する。好ましい実施形態において、ヒドロキシアルキルデンプンは、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３が独立して、水素または基（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ（式中、ｎは、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、または６である）であるヒドロキシエチルデンプンである。

したがって「ヒドロキシアルキルデンプン」は好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンを含み、ここでヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは特に好ましく、ヒドロキシエチルデンプンは最も好ましい。

アルキル、アラルキルおよび／またはアルカリル基は、直鎖または分枝であることができ、好適に置換されることができる。

したがって、本発明は、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、水素または２〜６個の炭素原子を持つ直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である、上述した方法およびＨＡＳ誘導体にも関する。

したがって、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は好ましくは、Ｈ、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル、例えば２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシエチル、例えば２−ヒドロキシエチルであることができ、水素および２−ヒドロキシエチル基が特に好ましい。

したがって、本発明は、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である、上述した方法およびＨＡＳ誘導体にも関し、少なくとも１個の残基Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が２−ヒドロキシエチルである実施形態が特に好ましい。

ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明のすべての実施形態に最も好ましい。

したがって、本発明は、ポリマーがヒドロキシエチルデンプンであり、誘導体がヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体である、上述した方法およびＨＡＳ誘導体に関する。

ＨＡＳ、特にＨＥＳは、主に分子量分布、置換度およびＣ_２：Ｃ_６置換の比によって特徴付けられる。置換度の説明には２つの可能性がある。

ＨＡＳの置換度（ＤＳ）は、すべてのグルコース部分と比較した置換グルコースモノマーの部分に対して相対的に説明される。

ＨＡＳの置換パターンも、グルコース部分１個当りのヒドロキシエチル基の数がカウントされる、モル置換（ＭＳ）として説明することができる。

本発明の状況では、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの置換パターンは、上述のようにＭＳと呼ばれる（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８，ｉｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒｐ．２７３も参照）。

ＭＳは、ＨＥＳ分子の完全な加水分解の後にガスクロマトグラフィーによって決定する。各ＨＡＳ、特にＨＥＳ開始物質のＭＳ値を与える。ＭＳ値は本発明のプロセスのステップａ）およびｂ）の誘導体化処置の間に影響されないことを前提としている。

ＨＡＳ、特にＨＥＳ溶液は、各分子が重合度、分枝部位の数およびパターン、ならびに置換パターンで他の分子と異なる、多分散組成物として存在する。したがってＨＡＳ、特にＨＥＳは、分子量が異なる化合物の混合物である。結果として、特定のＨＡＳおよび特にＨＥＳ溶液は、統計的手段を用いて平均分子量によって決定される。この状況ｄえ、Ｍ_ｎは、分子の数に応じて算術平均として計算される。また、Ｍ_ｗ（またはＭＷ）、すなわち重量平均分子量は、ＨＡＳ、特にＨＥＳの質量に依存する単位を表す。

この状況で、数平均分子量は、等式１によって定義される。

式中、ｎ_ｉは、モル質量Ｍ_ｉの種ｉの分子数である。

は、値が平均値であることを示すが、線は慣例により通常は省略される。

Ｍ_ｗは、等式２によって定義される重量平均分子量である。

式中、ｎ_ｉは、モル質量Ｍ_ｉの種ｉの分子数である。

好ましくは、本発明で使用するヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプンは、１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシエチルデンプンは、０．１〜３の、好ましくは０．１〜２の、さらに好ましくは０．１〜０．９または０．４〜２の、好ましくは０．４〜１．３の好ましいモル置換、ならびにヒドロキシエチル基に対して２〜２０の範囲の好ましいＣ_２：Ｃ_６置換の比をさらに示すことができる。

本発明の文脈で使用されるような「平均分子量」という用語は、Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８；ａｎｄＷｅｉｄｌｅｒｅｔａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／ＤｒｕｇＲｅｓ．，４１，４９４−４９８に記載されたようなＬＡＬＬＳ−（低角レーザ光散乱法）−ＧＰＣ法に従って決定された重量に関する。１０ｋＤａ以下の平均分子量では、さらに、ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣによって以前に適格とされた標準を用いて校正を実施した。

本発明の好ましい実施形態により、利用したヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、約１〜約１０００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａ、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａ、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａ、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａ、特に約５０〜１５０ｋＤａである。

さらに、ＨＡＳおよび特にＨＥＳのモル置換は、好ましくは約０．１〜３、好ましくは約０．４〜約１．３、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３である。

約５〜３００ｋＤａ、好ましくは５０〜１５０ｋＤａの平均分子量を有するＨＥＳの例は、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換を有するＨＥＳである。

Ｃ_２：Ｃ_６置換の比に関する限り、該置換は、好ましくは２〜２０の範囲、さらに好ましくは２〜１５の範囲、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲である。

ヒドロキシアルキルデンプン以外のデンプン
一般に、本発明の方法も実施可能であり、本発明の誘導体も、ヒドロキシアルキルデンプン、特に上述したヒドロキシエチルデンプン以外のデンプンを使用しても調製可能であり、ただし、これらのデンプンも場合により（遊離）アルデヒド形と平衡状態にある、ヘミアセタール形で存在している還元末端を含有し、還元末端が好適に酸化されて各酸化形を与え得るという条件である。特に、高分枝、非置換または低置換デンプン生成物、すなわちアミロペクチンよりも著しく高い分岐度を有し、グリコーゲンのα−１，６分枝の程度を有する、またはこれさえ超過し、置換された場合にわずか０．３までの、好ましくは０．０５〜０．３のモル置換ＭＳを有するデンプンが利用可能である。ＭＳ（モル置換）という用語は、この高分岐、非置換または低置換デンプン生成物の状況で使用するように、アンヒドログルコース単位当りのヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基の平均数を意味する。ＭＳは通常、試料中のヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基の含有量を決定することおよびその中に存在するアンヒドログルコース単位への計算割当によって測定される。ＭＳは、ガスクロマトグラフィーによっても決定できる。分枝度は、ポリマー中のα−１，４，６−グリコシド結合アンヒドログルコースのｍｏｌ％として、ガスクロマトグラフメチル化分析によって決定できる。分枝度がいずれの場合でも平均値であるのは、本発明の高分枝非置換または低置換デンプン生成物が多分散化合物であるためである。該高分枝、非置換または低置換デンプン生成物中のグルコース単位は、α−１，４およびα−１，６結合を介して結合される。分枝度は、全アンヒドログルコースαの合計のモル％中の−１，４，６−結合グルコース単位の割合を意味する。Ｃ_２／Ｃ_６比は、Ｃ−２における置換の、Ｃ−６における置換の比を表す。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物は、分枝酵素を用いたトランスグルコシド化ステップによって達成可能な６％〜５０％の好ましい分枝度を有する。なおさらに好ましくは、分枝度は、１０〜４５の、さらに好ましくは２０〜４０の範囲、例えば２０、２５、３０、３５、または４０である。２０を超えて４０までの、好ましくは２０を超えて３０までの、例えば２１〜４０の、好ましくは２１〜３０の範囲も好ましい。この目的に使用できる開始物質は、原則として任意のデンプンであるが、好ましくは高い割合のアミロペクチンを有するワックス状デンプンまたはアミロペクチン画分そのものである。デンプン生成物の本発明による使用のために必要である分枝度は、これらの「他のデンプン」に関する限り、アンヒドログルコースのモル％で表した、８％〜２０％の範囲内である。このことは、本発明の目的に使用できるデンプン生成物が平均で１個のα−１．６結合を、したがって１２．５〜５グルコース単位ごとに１個の分枝点を有することを意味する。好ましい高分岐、非置換または低置換デンプン生成物は、１０％を超えて２０％までの、特に１１％〜１８％の分枝度を有する。より高い分枝度は、本発明のデンプン生成物のより高い溶解度および体内でのこれらの溶解したデンプン生成物のより高い生物学的利用能を意味する。分枝度が１０％超の、特に１１％〜１８％の未修飾デンプン生成物が特に選好される。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物は、遊離ヒドロキシル基のヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基による部分誘導体化が適切に後続する、いわゆる分枝または転移酵素を使用する標的化酵素的構築によって調製できる。この代わりに、いわゆる分枝または転移酵素を使用する酵素的構築によって、ヒドロキシエチル化またはヒドロキシプロピル化デンプンを高分枝、非置換または低置換デンプン生成物に変換することも可能である。１０％までの分枝度を持つ分枝デンプン生成物をコムギデンプンから酵素的に得ることは、それ自体公知であり、例えば国際公開第００／６６６３３号パンフレットに記載されている。好適な分枝または転移酵素およびそれを得ることは、国際公開第００／１８８９３号パンフレット、米国特許第４４５４１６１号明細書、欧州特許出願公開第０４１８９４５号明細書、特開２００１−２９４６０１号公報または米国特許出願公開第２００２／０６５４１０号明細書に記載されている。この後者の刊行物は、４％を超え１０％以上の分枝度を有する未修飾デンプン生成物について記載している。酵素的トランスグリコシル化は、それ自体公知の方式で、例えばワックス状コーンスターチ、高いアミロペクチン含有量を有するジャガイモから得たジャガイモデンプン、またはコメからの、マニオクからの、コムギからの、高いアミロペクチン含有量を有するコムギからの、トウモロコシからの、高いアミロペクチン含有量を有するトウモロコシからの、もしくは高いアミロース含有量を有するトウモロコシからのデンプンを適切な酵素によって、水溶液中で６〜８のｐＨ値および２５〜４０℃の温度の穏和な条件下でインキュベートすることによって実施できる。分子量Ｍ_ｗは、高分枝、非置換または低置換デンプン生成物の状況で使用するように、重量平均分子量を意味する。これは、それ自体公知の方式で各種の方法によって、すなわち光散乱およびＲＩ検出と併せたゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定できる。置換デンプンに好ましいＣ_２／Ｃ_６比は、５〜９の範囲内である。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物の高い分岐度によって、その水への溶解度は、デンプン生成物を溶解させておくために、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル置換が完全にまたは実質的に分配できるような程度まで上昇する。高分枝、非置換または低置換デンプン生成物の平均分子量は、腹膜の浸透限界による好適な方式で増加させることができる。この場合に使用できる特徴的な変数は、いわゆるボトム画分のＧＰＣ値ＢＦ９０％（より小さい分子画分の割合の尺度としての、ピーク面積の９０％での分子量）でもある。分子量の適切な上昇と同時の、腹膜での急激な吸収低下によって、より高い限外濾過（ＵＦ）効率が達成可能である。同時に、内在性アミラーゼによる分解によって産生され、もはやアミラーゼによってさらに分解することができず、臓器または組織に貯蔵されている高分子量残留断片は、もはや発生しないか、または今やわずかな程度までしか発生しない。

本発明により、ヒドロキシアルキルデンプンは架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａと反応し、式中、Ｍはアミノ基であり、Ａはアセタール基またはケタール基であり、Ｍ基および基Ｌは好適なスペーサによって分離されている。

（アセタールまたはケタール基Ａ）
アセタール基またはケタール基Ａに関する限り、具体的な制限は存在しない。本発明の状況において、「アセタール基」という用語は硫黄アセタールおよび窒素アセタールも含み、「ケタール基」という用語は硫黄ケタールおよび窒素ケタールも含む。さらに、「アセタール基」という用語に関する限り、ヘミアセタールは明示的に除外され、「ケタール基」という用語に関する限り、ヘミケタールは明示的に除外される。

本発明の好ましい実施形態により、架橋化合物Ｍ−Ｌ−ＡのＡ基は、式（ＩＩａ）

で示す残基であり、
Ｚ_１およびＺ_２はそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲ_ｘであり、好ましくはＯであり、ここでＲ_ｘは、Ｈまたは低級アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル、例えばｎ−プロピルもしくはｉ−プロピル、またはＣ（Ｏ）−Ｒ_ｙであり、ここでＲ_ｙは、好ましくはＣ_１−Ｃ_６アルキルおよびＣ_６−Ｃ_１４アリールからなる群よりは選択され、なおさらに好ましくは場合により置換された、好ましくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択され；Ｒ_ｘは好ましくはＨである。
Ａ_１およびＡ_２はそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであり、または式（ＩＩｂ）

で示す環を形成し
Ａ_１およびＡ_２はひとまとめにされて、−（ＣＨ_２）_２−または−（ＣＨ_２）_３−または−（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−であり、ならびに
Ａ_３は、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであり、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成する。

好ましくは、Ｚ_１およびＺ_２の少なくとも１つがＯであり、好ましくはＺ_１およびＺ_２の両方がＯである。

残基Ａ_３に関する限り、本発明に従ってアセタール基が好ましく、すなわちＡ_３は好ましくはＨである。

Ａがケタール基である場合、Ａ_３はメチルであることが好ましい。したがって、本発明により考えられるケタール基Ａは、特に

または、

または、

または、

または、

または、

である。

Ａ_３が例えば、アミノ基ＭのＮ原子またはＬに含まれる好適な元素のどちらかと環を形成する場合、本発明により考えられる架橋性化合物は、例えば

または、

である。

本発明による特に好ましい架橋性化合物は

であり、すなわちアミノ基Ｍは２級アミンであり、Ｚ_１およびＺ_２はどちらもＯであり、Ａ_１およびＡ_２はひとまとめにされて−（ＣＨ_２）_２−である。

好ましい実施形態により、Ａ_１およびＡ_２はそれぞれメチルまたはエチル、なおさらに好ましくはエチルである。したがって、本発明による特に好ましいアセタール基Ａは、−ＣＨ（ＯＣＨ_３）_２または−ＣＨ（ＯＣ_２Ｈ_５）_２、特に−ＣＨ（ＯＣ_２Ｈ_５）_２である。

Ａ_１およびＡ_２が式（ＩＩｂ）による環を形成するさらなる実施形態により、Ａ_１およびＡ_２はひとまとめにされて、好ましくは−（ＣＨ_２）_２−である。本実施形態に関する限り、本発明による特に好ましいアセタール基Ａは、

および

である。

（アミノ基Ｍ）
アミノ基Ｍに関する限り、アミノ酸が酸化または非酸化還元末端のどちらかと、すなわちＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの還元末端サッカライドユニットの炭素原子Ｃ^＊を介して、非酸化状態で、すなわちヘミアセタールとしてもしくは遊離アルデヒド基として、または酸化状態で、すなわちラクトンとしてもしくは遊離カルボキシ基として反応できるという条件で、特定の制限は存在しない。「アミノ基」という用語は本願明細書で使用するように、アミノ基、例えばプロトン化アミノ基の、製薬的に許容されるアニオンとの好適な塩、例えば塩化物、硫酸水素塩、硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、リン酸塩、またはリン酸水素塩も含む。

好ましくは、本発明による架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａのアミノ基は、式（ＩＩｃ）

で示す基であり、
Ｙは、存在しないか、または

からなる群より選択される化学部分であるかのどちらかであり、Ｇは、ＯまたはＳまたはＮＨであり、２個存在する場合には、各Ｇは独立して、ＯまたはＳまたはＮＨであり、Ｇは好ましくはＯであり、ならびに
Ｒ’は、Ｈまたはヒドロキシ基またはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、および置換アルキルアリールからなる群より選択される有機残基である。本明細書において、「アルキル」という用語は、非分枝アルキル残基、分枝アルキル残基、およびシクロアルキル残基に関する。好ましくは、これらの有機残基のそれぞれが１〜１０個の炭素原子を有する。考えられる置換基として、ハロゲン、例えばＦ、ＣｌまたはＢｒが挙げられる。好ましくは、有機残基は非置換炭化水素である。

Ｒ’がヒドロキシ基である場合、本発明の好ましいアミノ基はＨＯ−ＮＨ−であり、すなわちＹは存在しない。

好ましくは、Ｒ’が有機残基である場合、Ｒ’は、アルキルおよび置換アルキルからなる群より選択され、アルキル残基が特に好ましい。なおさらに好ましくは、場合により置換されたアルキル残基は、１〜１０個の、さらに好ましくは１〜６個の、さらに好ましくは１〜４個の、例えば１、２、３、または４個の炭素原子を有する。したがって、本発明による好ましい有機残基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、またはｔ−ブチルである。特に好ましい実施形態により、有機残基Ｒ’は、メチルまたはエチル、特にメチルである。

したがって、Ｒ’が有機残基である場合、本発明による好ましいアミノ基は、例えばＨ_３Ｃ−ＣＨ_２−ＮＨ−、Ｈ_３Ｃ−ＮＨ−、Ｈ_５Ｃ_６−ＮＨ−、Ｈ_３Ｃ−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、Ｈ_３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−、Ｈ_５Ｃ_６−ＮＨ−Ｏ−であり、Ｈ_３Ｃ−ＮＨ−、Ｈ_５Ｃ_６−ＮＨ−およびＨ_３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−が特に好ましい。

本発明によれば、Ｒ’が独立した残基ではなく、Ｌに含まれる好適な原子と、または架橋性化合物のＡ基の残基Ａ_３と環構造を形成することも可能である。これらの構造も、Ｒ’に関して「アルキル」という用語の上述の定義に含まれる。一例として、Ｒ’は、架橋性化合物のＡ基の残基Ａ_３と環構造を形成可能であり、Ａはケタール基である。考えられる架橋性化合物は、例えば

または、

または

である。

この場合、本発明に係る特に好ましい架橋性化合物は、

本発明の好ましい実施形態において、Ｒ’はＨである。したがって、本発明の好ましいアミノ基は、

であり、式中、Ｇは、ＯまたはＳであり、２個存在する場合は、独立してＯまたはＳであり、Ｏが好ましい。

本発明の特に好ましいアミノ基Ｍは、Ｒ’がＨである場合、Ｈ_２Ｎ−、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、およびＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である。

したがって、本発明は、上述の方法および誘導体にも関し、アミノ基Ｍは、Ｈ_２Ｎ−、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、Ｈ_３Ｃ−ＮＨ−またはＨ_３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−、好ましくはＨ_２Ｎ−、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である。

（スペーサＬ）
本発明により、架橋性化合物の官能基ＭおよびＡは、好適なスペーサによって分離される。「スペーサ」という用語は本願明細書によって使用するように、ＭおよびＡを架橋する任意の好適な化学部分に関する。

一般に、Ｌが特に新規誘導体の調製のための本発明の方法の実施を可能にして、新規誘導体にその所期の使用に関する限り好適な化学的特性を与える化学的特性を有するという条件で、スペーサＬの化学的性質に関して特定の制限はない。

本発明の好ましい実施形態により、ＭおよびＡを架橋するＬは、式（ＩＩｄ）

で示す少なくとも１個の構造単位を含むスペーサであり、
Ｌ_１およびＬ_２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”からなる群より選択される有機残基であり、Ｒ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択される。

本明細書において、「アルキル」という用語は、非分枝アルキル残基、分枝アルキル残基、およびシクロアルキル残基に関する。好ましい置換基として、ハロゲン、例えばＦ、ＣｌまたはＢｒが挙げられる。

好ましくは、Ｌ_１およびＬ_２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基であり、さらに好ましくは、Ｌ_１およびＬ_２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルであり、なおさらに好ましくは、Ｌ_１およびＬ_２のどちらもＨである。

好ましくは、Ｌ_１およびＬ_２が有機残基である場合、Ｌ_１およびＬ_２のそれぞれが独立して、１〜２０個の、好ましくは１〜１０個の、さらに好ましくは１〜８個の、さらに好ましくは１〜６個の、さらに好ましくは１〜４個の炭素原子を含有することができる。特に好ましいのは、場合により置換された、好ましくは非置換メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル残基などの残基Ｌ_１およびＬ_２である。本発明により、Ｌ_１はＨであることができ、Ｌ_２は上で定義したような有機残基であることができる。

整数ｎに関する限り、ｎは、好ましくは１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜４、さらに好ましくは２である。

整数ｎが１より大である場合、基（ＣＬ_１Ｌ_２）は、相互に同じまたは異なり得る。本発明の好ましい実施形態により、相互に直接結合した基（ＣＬ_１Ｌ_２）は同じ構造を有する。

本発明の好ましい実施形態により、スペーサＬは、Ｌ_１およびＬ_２が上で定義した通りである式（ＩＩｄ）による構造単位より成る。さらに好ましくは、整数ｎは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。なおさらに好ましくは、基（ＣＬ_１Ｌ_２）のそれぞれは、ＭおよびＡを架橋するスペーサＬが構造

を有するように（ＣＨ_２）であり、式中、整数ｎは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。なおさらに好ましくは、ｎは、１〜６の範囲、さらに好ましくは１〜４の範囲、例えば１、２、３、または４、特に２である。

したがって、本発明の特に好ましい実施形態により、スペーサＬは、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である。

本発明のさらなる実施形態により、架橋性化合物のスペーサＬは、式（ＩＩｄ）

で示す少なくとも１個の構造単位を含み、
式中、ｎ、Ｌ_１およびＬ_２は、好ましくは上で定義した通りであり

および式中、Ｌは、−（ＣＬ_１Ｌ_２）−とは異なる少なくとも１個の化学部分をさらに含む。

本明細書において、スペーサＬが構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−および−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−をＭ基またはＡ基から分離するさらなる化学部分Ｔからなる実施形態が言及され得る。スペーサＬが構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−およびＴ_１が−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−をＭ基から分離して、Ｔ_２が−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−をＡ基から分離する２個のさらなる化学部分からなる実施形態も考えられる。したがって、本発明は、以下の構造の１つを有する架橋化合物による実施形態も含む。
Ｍ−Ｔ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ａ
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ｔ−Ａ
Ｍ−Ｔ_１−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ｔ_２−Ａ

化学部分Ｔ、Ｔ_１またはＴ_２に関して、Ｌが特に新規誘導体の調製のための本発明の方法の実施を可能にして、新規誘導体にその所期の使用に関する限り好適な化学的特性を与える化学的特性を有するという条件で、化学的性質に関して特定の制限はない。

したがって、Ｔ、Ｔ_１および／またはＴ_２は、場合により置換されたアリール残基、好適なヘテロ原子、好適な官能基などを含み得る。官能基に関する限り、これらの官能基が架橋性化合物の調製から生じる実施形態に言及することができ、この実施形態では少なくとも第１の化合物および少なくとも第２の化合物が相互に反応して化合物Ｍ−Ｌ−Ａを与える。一例として、第１の化合物Ｍ−Ｌ’−Ｗ_１および第２の化合物Ｗ_２−Ｌ”−Ａを反応させて架橋性化合物Ｍ−Ｌ−Ａを得ることができ、式中、−Ｌ−は−Ｌ’−Ｆ−Ｌ”であり、Ｆは、官能基Ｗ_１と官能基Ｗ_２との反応から生じた官能基を表し、ここでＬ’およびＬ”の少なくとも一方が構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−を含む。このような官能基Ｗ_１およびＷ_２は好適に選択され得る。一例として、基Ｗ_１およびＷ_２の一方、すなわちＷ_１またはＷ_２は、以下のリストによる官能基からなる群より選択され得るが、他方の基Ｗ_１またはＷ_２は、好適に選択され、Ｗ_１またはＷ_２との化学結合を形成することが可能であり、ここでＷ_２またはＷ_１は好ましくは、上述の群からも選択される。
−Ｃ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合。
−チオ基またはヒドロキシ基。
−アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド。
−１，２−ジオール。
−１，２−アミノ−チオアルコール。
−アジド。
−１，２−アミノアルコール。
−アミノ基−ＮＨ_２またはアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、もしくはアルカリアミノ基などの構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体。
−ヒドロキシアミノ基−Ｏ−ＮＨ_２またはヒドロキシアルキルアミノ基、ヒドロキシアリールアミノ基、ヒドロキシアラルキルアミノ基、もしくはヒドロキシルアルカリルアミノ基などの構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシアミノ基の誘導体。
−それぞれ構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリルオキシアミノ基。
−カルボニル基を有する残基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ’、式中、Ｇは、ＯまたはＳであり、Ｍ’は例えば、
−−−ＯＨまたは−ＳＨ。
−−アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリルオキシ基。
−−アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリルチオ基。
−−アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリルカルボニルオキシ基。
−−活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのイミド構造を有するヒドロキシルアミンのエステル。
−−ＮＨ−ＮＨ_２、または−ＮＨ−ＮＨ−。
−−ＮＯ_２。
−ニトリル基。
−カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基。
−カルボキシ基。
−−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基。
−ビニルハライド基、例えばヨウ化ビニルまたは臭化ビニル基またはトリフレート。
−−Ｃ≡Ｃ−Ｈ。
−−（Ｃ＝ＮＨ_２Ｃｌ）−Ｏアルキル
−基−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ_２−Ｈａｌ、ここでＨａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。
−−ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ_２−。
−構造−Ｓ−Ｓ−を含むジスルフィド基。
−

基。
−

基。

一例として、Ｗ_１またはＷ_２は、カルボキシ基または活性化エステルであり得て、およびＷ_１またはＷ_２は、官能基Ｗ_１と官能基Ｗ_２との反応から生じる官能基を表すＦがアミドまたはエステルであるように、アミノ基またはヒドロキシ基であり得る。

したがって、一例として、構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−以外に官能基を含む、スペーサＬを有する架橋性化合物は、
Ｍ−Ｌ’−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ａ
または
Ｍ−Ｌ’−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ａ
または
Ｍ−Ｌ’−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ａ
または
Ｍ−Ｌ’−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｌ”−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｌ”−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ”−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ”−Ａ
などの構造を有し得て、式中、Ｌ’およびＬ”は、構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−を含むことも含まないこともある。

これらの構造のうち、構造
Ｍ−Ｌ’−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｌ”−Ａ
を有する架橋性化合物が好ましい。

また、これらの構造の中で、Ｌ’およびＬ”が存在する場合、単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−を含有するスペーサが好ましい。これらの場合で、ｎが１〜４の範囲、さらに好ましくは１〜３の範囲、例えば１，２、または３であることがなおさらに好ましい。所与のスペーサが例えば２個の構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−を含有する場合、各構造単位の添字ｎは同じであることもできまたは異なることもできる。

したがって、以下の構造を有する以下の架橋性化合物が好ましい。
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−Ａ
式中、各ｎはそれぞれ独立して、好ましくは１〜４の範囲、さらに好ましくは１〜３の範囲、例えば１、２、または３である。したがって、好ましいスペーサＬは、構造
−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−
を有する。

したがって、特に好ましい-（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を含有する架橋性化合物は、
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ａ_{［ＲＳ１］}
である。

さらに好ましい-（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を含有する架橋性化合物は、
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ａ
である。

なおさらに好ましくは、Ｌ_１およびＬ_２はどちらもＨである。したがって、次の構造を有する架橋性化合物、
Ｍ−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−Ａ_{［ＲＳ２］}
が特に好ましい。

次の構造を有する架橋性化合物
Ｍ−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−Ａ
または
Ｍ−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−Ａ
が最も好ましい。

一例として、本発明の好ましい架橋性化合物

または

または

または

または

である。

再度一例として、上述の構造を例証するために、本発明の状況で考えられる架橋性化合物は

であることができる。

本発明のさらなる実施形態により、スペーサＬは、１個を超える構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−を含み得て、ここでこれらの構造単位は、同じでありまたは異なり得て、すなわち構造はｎならびに／またはＬ_１および／もしくはＬ_２が異なり得て、ここで少なくとも２個のこのような構造単位はＯまたはＳなどのヘテロ原子によって分離され得る。好ましくは、本実施形態により、スペーサＬは、少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ２−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ２を含み、式中、ｎ１は、ｎ２と等しいまたは異なり、および式中、スペーサＬは、−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−を介して架橋性化合物、すなわち次のサブ構造
Ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ２−
を含む架橋性化合物のアミノ基Ｍに結合される。

好ましい考えられる実施形態により、
−（（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−Ｏ）_ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ２−
などのスペーサ構造が挙げられ、ｍは１〜２０の、好ましくは１〜１０の、さらに好ましくは１〜６、例えば１、２、３、４、５、または６の整数である。特に好ましくは、ｍは１、２、または３、さらに好ましくは２または３である。好ましくは、ｎ１は２〜４、さらに好ましくは２である。好ましくは、ｎ２は１〜４、さらに好ましくは１または２である。したがって、好ましい構造は、一例として、
−（（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ｏ）_ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）−
およびさらに好ましくは
−（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−
である。

再度一例として、上述の構造を例証するために、本発明の状況で好ましくは使用される架橋性化合物は

または

または

である。

本発明のさらなる実施形態により、Ｍ基およびＡ基は、Ｍ基のＮ原子およびケタール基ＡのＣ原子が環を形成するように、その少なくとも一方が−（ＣＬ_１Ｌ_２）ｎ−を含む２個の好適な化学部分によって分離され得る。好ましい実施形態は、すでに上に示され、構造式

を有する。

本発明の特に好ましい架橋性化合物は、Ｍ基として、基Ｈ_２Ｎ−または基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−または基Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、特に好ましくはＨ_２Ｎ−を、およびＡ基として、アセタール基、好ましくは構造式

を有するアセタール基を有する化合物であり、
さらに好ましくは、Ｚ_１およびＺ_２はＯであり、ならびになおさらに好ましくは、Ａ_１およびＡ_２はどちらもエチルである。なおさらに好ましくは、スペーサＬは、構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−から成り、Ｌ_１およびＬ_２は好ましくはＨであり、および整数ｎはなおさらに好ましくは、１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜６、さら好ましくは１〜４、さらに好ましくは２である。

したがって、本発明による好ましい架橋性化合物は、一例として

（ａ１）または

（ａ２）または

（ａ３）または

（ａ４）または

（ａ５）または

（ａ６）または

（ａ７）または

（ａ８）または

（ａ９）または

（ａ１０）または

（ａ１１）または

（ａ１２）または

（ａ１３）または

（ａ１４）または

（ａ１５）または

（ａ１６）または

（ａ１７）または

（ａ１８）または

（ａ１９）または

（ａ２０）または

（ａ２１）
である。

なおさらに好ましくは、架橋性化合物は、（ａ２）、（ａ４）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される。さらに好ましくは、架橋性化合物は、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される。特に、架橋性化合物は、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、および（ａ１６）の構造からなる群より選択される。

架橋性化合物Ｍ−Ｌ−Ａとして特に好ましいのは、１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン、

である。

一例として、本発明により考えられるアミノ−アセタール架橋性化合物は、

４，４−ジエトキシ−２−メチルブタン−２−アミン

１−（１，３−ジオキサン−２−イル）−２−メチルプロパン−２−アミン

１−（１，３−ジオソラン−２−イル）−２−メチルプロパン−２−アミン

４，４−ジエトキシ−Ｎ，２−ジメチルブタン−２−アミン

１−（１，３−ジオキサン−２−イル）−Ｎ，２−ジメチルメチルプロパン−２−アミン

１−（１，３−ジオソラン−２−イル）−Ｎ，２−ジメチルメチルプロパン−２−アミン

２，２−ジエトキシ−Ｎ−メチルエタンアミン

４，４−ジエトキシブタンイミドヒドラジド

３，３−ジメトキシプロパンイミドヒドラジド
である。

一例として、本発明により考えられるアミノ−ケタール架橋性化合物は、

１−オキサ−チア−８−アザスピロ［４．５］デカン

１，４−ジチア−８−アザスピロ［４．５］デカン

Ｎ−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）メタンアミン

１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン

４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−１−アミン

１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−２−アミン

２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−１−フェニルエタンアミン

１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−２−アミン

３−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−２−アミン

２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン

３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ペンタン−２−アミン

２−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−２−アミン

２−（４−メトキシフェニル）−２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン

２−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチル−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）エタンアミン

２，２−ジメチル−３−（２−メチル−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−１−アミン

３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−３−フェニルプロパン−１−アミン

４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−ブタン−２−アミン

５−メチル−５−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−１−アミン

２，２−ジメチル−３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−１−アミン

７，２−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘプタン−１−アミン

２−メチル−４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−２−アミン

４−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−１−アミン

４−アミノ−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ペンタン−３−オール

３−（２，４−ジメチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−２，２−ジメチルプロパン−１−アミン

２−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）プロパン−２−アミン

Ｎ−メチル−３−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ブタン−１−アミン

１−（２，５，５−トリメチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘプタン−４−アミン

３−（２−メチル−１，３−ジチアン−２−イル）プロパン−１−アミン

３，３−ジメチル−１−（２−メチル−１，３−ジチアン−２−イル）ブタン−２−アミン

３−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）ブタン−２−アミン

１−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）ペンタン−２−アミン

３−メチル−１−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）ブタン−２−アミン

１，１，１−トリフルオロ−３−（２−メチル−１，３−ジオキサン−２−イル）プロパン−２−アミン
である。

（ヒドロキシアルキルデンプン誘導体）
したがって本発明は、上述の方法によって得られるまたは得たヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体に関する。

さらに、本発明は、式（ＩＩＩ）

（ＩＩＩ）
のＨＡＳ誘導体に関し、式中、Ａは、アセタールまたはケタール基であり、Ｌは、ＸおよびＡを架橋するスペーサである。
Ｘは、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ
で示す架橋性化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）

（Ｉ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによるＨＡＳの炭素原子Ｃ^＊を介した反応から生じる官能基であり、Ｃ^＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合によっては酸化され、
ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である。

ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳ、Ｌ、Ａ、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３に関する好ましい実施形態に関する限り、上述した実施形態を特に参照されたい。

さらに、本発明は、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が独立して−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ基（ｎは、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、または６である）である上述したＨＡＳ誘導体に関する。

さらに、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である上述したＨＡＳ誘導体に関する。

さらに、本発明は、上述したＨＡＳ誘導体に関し、Ａは、式（ＩＩａ）

（ＩＩａ）
による残基であり、
Ｚ_１およびＺ_２はそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲ_ｘ、好ましくはＯであり、Ｒ_ｘは、Ｈまたは低級アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル、好ましくはＨであり、
Ａ_１およびＡ_２はそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであり、または式（ＩＩｂ）

（Ａ_１およびＡ_２はひとまとめにされて、−（ＣＨ_２）_２−または−（ＣＨ_２）_３−または−（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−である）による環を形成し、
Ａ_３は、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであり、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、Ａ_３は好ましくはＨである。

本発明によるＨＡＳ誘導体の基Ｘの正確な化学的性質は、Ｍ基のそれぞれの化学的性質に、ＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ^＊の酸化状態に、ならびに反応条件、例えば反応に利用された溶媒、温度などに依存する。炭素原子Ｃ^＊が酸化および非酸化状態で利用される本発明の実施形態により、詳細なおよび好ましい実施例について以下で詳細に議論する。

好ましくはＸに関する限り、本発明は、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、好ましくは−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−からなる、ならびに−ＣＨ_２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−からなる、さらに好ましくは−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、および−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−からなる群より選択される上述したＨＡＳ誘導体に関する。

基Ｘのある実施形態では、ＨＡＳ誘導体に存在するようなＨＡＳの末端サッカライド単位が上の式（ＩＩＩ）による開構造と平衡にあり得る環構造で存在し、環構造および開構造がある平衡分布を有することが考えられる。これらの場合では、および本発明の目的では、上に示したような式（ＩＩＩ）は、環構造と同様に開構造を有し、式（ＩＩＩ）は開構造に対してＨＡＳ誘導体を制限しない。詳細なおよび好ましい実施例について以下で詳細に議論するので、環構造をいくつかの場合で示す。

さらに、本発明は、ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）による少なくとも１個の構造単位を含む、好ましくは式（ＩＩｄ）による構造単位からなるスペーサである、上述したＨＡＳ誘導体に関し

式中、Ｌ_１およびＬ_２はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”（ここでＲ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択され）からなる群より選択される有機残基、好ましくはＨまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基、さらに好ましくはＨまたはアルキル、さらに好ましくはＨであり、
式中、ｎは、１〜２０の、好ましくは１〜１０の、さらに好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは２の整数である。

ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの場合により酸化された還元末端
本発明により、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳは、デンプンの末端還元末端の炭素原子Ｃ^＊を介して架橋性化合物のアミノ基と反応することが可能であり、ここでＣ^＊は、ＨＡＳとＭとの反応の前に場合により酸化される。

「ＨＡＳが還元末端を介して反応する」または「ＨＡＳが末端還元末端の炭素原子Ｃ^＊を介して反応する」という用語は、本発明の状況で使用するように、ＨＡＳが主にその（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して反応するプロセスに関し得る。

「主にその（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して」という用語は、所与の反応に利用されるＨＡＳ分子の統計的に５０％超の、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、およびなおさらに好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＨＡＳ分子による少なくとも１個の（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して反応するプロセスに関し、ここで少なくとも１個の（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して反応する所与のＨＡＳ分子が、同じ所与の反応において、該ポリマー分子に含まれ、還元末端でない少なくとも１個のさらなる好適な官能基を介して反応することが可能である。１個以上のＨＡＳ分子が少なくとも１個の（場合により選択的に酸化された）還元末端を介して、および同時にこのＨＡＳ分子に含まれ、（場合により選択的に酸化された）還元末端でない少なくとも１個のさらに好適な官能基を介して反応する場合、これらのＨＡＳ分子の反応した官能基すべての統計的に好ましくは５０％超、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、およびなおさらに好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が（選択的に酸化された）還元末端であり、該官能基は（場合により選択的に酸化された）還元末端を含む。

「還元末端」という用語は、本発明の状況で使用するように、アルデヒド基としておよび／または対応するヘミアセタール形としておよび／またはアセタール基として存在し得るＨＡＳ分子の末端アルデヒド基に関し、アセタール基は以下の構造

を有し、上の式（Ｉ）による残基−ＯＲ_３が−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨである場合に、存在できる。

還元末端が酸化されている場合、酸化された還元末端はカルボキシ基および／または対応するラクトンの形である。

酸化された還元末端
したがって、本発明の第１の実施形態により、架橋性化合物はアミノ基を介して、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの末端還元末端の酸化されたＣ^＊原子と反応する。

酸化はヒドロキシアルキルデンプンの酸化還元末端を生じるすべての好適な１つまたは複数の方法に従って実施され得るが、例えば、ここに引用することで本明細書の一部をなすものとするＳｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒらの米国特許第６０８３９０９号明細書の第５欄第６３〜６７行及び第７欄第２５〜３９行、第８欄第５３行〜第９欄第２０行に記載されたようなアルカリ性ヨウ素溶液を使用して好ましくは実施され得る。

ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳを選択的に酸化すると、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳはラクトン

および／またはカルボン酸

またはカルボン酸の好適な塩、例えばアルカリ金属塩、好ましくはナトリウムおよび／またはカリウム塩であり、およびＨＡＳ’は好ましくはＨＥＳ”である。

本発明の最初の代案に従って、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳのこの形は、架橋性化合物のアミノ基Ｍなどと反応する。

本発明の第２の代案に従って、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳ、好ましくはＨＥＳは、最初に好適な化合物と反応して、反応性カルボキシ基を含むＨＡＳ、好ましくはＨＥＳを生じる。

その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳへの反応性カルボキシ基の導入は、すべての考えられる方法およびすべての好適な化合物によって実施され得る。

本発明の詳細な方法により、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳはその酸化還元末端にて少なくとも１つのアルコール、好ましくは少なくとも１つの酸性アルコール、例えば２５℃にて６〜１２または７〜１１の範囲のｐＫ_Ａ値を有する酸性アルコールと反応する。酸性アルコールの分子量は、８０〜５００ｇ／ｍｏｌの、例えば９０〜３００ｇ／ｍｏｌの、または１００〜２００ｇ／ｍｏｌの範囲であり得る。

好適な酸性アルコールは、酸性プロトンを有するすべてのアルコールＨ−Ｏ−Ｒ_Ａであり、酸化されたＨＡＳと反応して、好ましくは式

による、なおさらに好ましくは式

による各反応性ＨＡＳエステルを与えることができる。

好ましいアルコールは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ−Ｎ−Ｎ−ヒドロキシ、好適に置換されたフェノール、例えばｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば２，４，６−トリクロロフェノールもしくは２，４，５−トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば２，４，６−トリフルオロフェノールもしくは２，４，５−トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、またはヒドロキシアゾール、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである。特に好ましいのはＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが特に好ましい。すべてのアルコールは単独で、またはその２つ以上の好適な組合せとして利用され得る。本発明の状況において、例えば炭酸のジエステルを添加することによって、各アルコールを放出する化合物を利用することも可能である。

したがって、本発明は、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳが、酸化ＨＡＳを酸性アルコールと、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによって活性化する上述した方法にも関する。

本発明の好ましい実施形態により、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳは、少なくとも１つのカルボン酸ジエステルＲ_Ｂ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ_Ｃ（式中、Ｒ_ＢおよびＲ_Ｃは同じであることもできまたは異なることもできる）と反応する。好ましくは、本方法により、式

による反応性ＨＡＳが得られ、式中、ＨＡＳ’は好ましくはＨＥＳ’である。

好適な炭酸ジエステル化合物として、そのアルコール成分が独立してＮ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、好適に置換されたフェノール、例えばｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば２，４，６−トリクロロフェノールもしくは２，４，５−トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば２，４，６−トリフルオロフェノールもしくは２，４，５−トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、またはヒドロキシアゾール、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールである化合物が利用され得る。特に好ましいのはＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートおよびスルホ−Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートであり、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートが特に好ましい。

したがって、本発明は、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳが、酸化ＨＡＳをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートと反応することによって活性化される上述した方法にも関する。

酸性アルコールは、酸化ＨＡＳまたは酸化ＨＡＳの塩と、好ましくは５：１〜５０：１の、さらに好ましくは８：１〜２０：１の酸性アルコール、ＨＡＳのモル比で、２〜４０℃の、さらに好ましくは１０〜３０℃の、および特に好ましくは１５〜２５℃の好ましい反応温度にて反応する。反応時間は好ましくは、１〜１０時間の、さらに好ましくは２〜５時間の、さらに好ましくは２〜４時間の、および特に２〜３時間の範囲である。

炭酸ジエステル化合物は、酸化ＨＡＳまたは酸化ＨＡＳの塩と、一般に１：１〜３：１の、例えば１：１〜１．５：１のジエステル化合物：ＨＡＳのモル比で反応する。反応時間は一般に、０．２〜６時間の、または０．５〜２時間のまたは特に０．７５〜１．２５時間などの０．１〜１２時間の範囲である。

本発明の好ましい実施形態により、酸化ＨＡＳと酸性アルコールおよび／または炭酸ジエステルとの反応は、少なくとも１つの非プロトン性溶媒中で、例えば０．５重量パーセントを超えない、好ましくは０．１重量パーセントを超えない含水率を有する無水非プロトン性溶媒中で実施される。好適な溶媒は、特に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびその２つ以上の混合物である。反応温度は好ましくは、２〜４０℃の、さらに好ましくは１０〜３０℃の範囲である。

酸化ＨＡＳを少なくとも１つの酸性アルコールと反応させるために、少なくとも１つのさらなる活性化剤を利用する。

好適な活性化剤は、特に、カルボニルジイミダゾール、カルボイミド、例えばジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が特に好ましい。

したがって、本発明は、その還元末端で選択的に酸化されたＨＡＳが、さらなる活性化剤の存在下で酸性アルコールと反応して反応性ＨＡＳエステルを与える上述した方法にも関する。

本発明の一実施形態により、酸化ＨＡＳと炭酸ジエステルおよび／または酸性アルコールとの反応は、反応混合物を水に１０：１の水の反応混合物に対する体積比で添加することによって決定され得る低塩基活性にて実施される。添加の前に、本質的に緩衝剤を含まない水のｐＨ値は、２５℃にて７である。反応混合物の添加後に、ｐＨ値を測定することによって、反応混合物の塩基活性が得られ、好ましくは９．０以下の、好ましくは８．０以下の、および特に好ましくは７．５以下の値を有する。

本発明の別の実施形態により、酸化ＨＡＳは、ＥＤＣを含む水の非存在下の無水ＤＭＡ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミドとＥＤＣと反応して、式

によるポリマーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを選択的に与え、
さらに好ましくはＨＡＳ’はＨＥＳ’である。

この反応によって、ＨＥＳのＯＨ基との反応から生じる副生成物は得られず、ＥＤＣにより生成されたＯ−アシルイソ尿素および酸化ＨＡＳの各Ｎ−アシル尿素へ転位反応は、驚くほど抑制される。

本発明の別の好ましい実施形態により、酸化ＨＡＳは水の非存在下および活性化剤の非存在下にて無水ＤＭＦ中でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートと反応して、式

によるＨＡＳ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを選択的に与え、
さらに好ましくはＨＡＳ’はＨＥＳ’である。

本発明の別の実施形態により、その還元末端にて選択的に酸化されたＨＡＳは、酸化された還元末端にてアゾリド、例えばカルボニルジイミダゾールまたはカルボニルジベンズイミダゾールと反応して、反応性カルボキシ基を有するポリマーを与える。カルボニルジイミダゾールの場合、式

による反応性イミダゾリドＨＡＳ誘導体が生じ、
式中、ＨＡＳ’は好ましくはＨＥＳ’である。

上述した、好ましくはＨＡＳと酸性アルコール、カーボネートおよび／またはアゾリドとの反応から生じた、少なくとも１個の反応性カルボキシ基を含む反応性ＨＡＳ誘導体は、次に架橋性化合物Ｍのアミノ基Ｍとさらに反応する。

上述のように場合によりさらに活性化された酸化還元末端を介した、ＨＡＳとアミノ基Ｍとの反応は、すべての好適な方法に従って実施できる。好ましくは、アミノ基は、１級アミノ基Ｈ_２Ｎ−または２級アミノ基である。

一般に、好ましくは、ある量の、例えば最大１０重量％の水も含有し得る極性非プロトン性溶媒が使用される。好ましい非プロトン性溶媒は特に、ＤＭＳＯまたはＤＭＦである。

好ましい反応温度範囲の例は０〜８０℃、さらに好ましくは０〜７０℃、さらに好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜５０℃、およびなおさらに好ましくは０〜４０℃である。

架橋性化合物が好ましい実施形態により、アミノ基ＭとしてＨ_２Ｎ−を有する酸化形の還元末端を有するＨＡＳとの反応に使用される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物がアミド結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体はアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。

したがって、本発明は、（ｉ）において、ＨＡＳがその酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ_２Ｎ−であるアミノ基Ｍと反応して、反応が０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−である、上述の方法にも関する。

したがって本発明は、上述の方法によって得られるまたは得たＨＡＳ誘導体にも関する。

さらに、本発明は、例えば以下の構造

を有するＨＡＳ誘導体にも関し、
式中、架橋性化合物のアミノ基Ｍが１級アミノ基である場合に、Ｒ’はＨであり、式中、架橋性化合物のアミノ基Ｍが１級アミノ基である場合に、Ｒ’はＨ以外の化学基である。Ｒ’の正確な化学的性質は架橋性化合物に依存し、したがって上の一般に考えられるおよび好ましくは利用される架橋性化合物の議論を参照されたい。

本発明で利用される上述の好ましい架橋性化合物に従って、以下のＨＡＳ誘導体は、それぞれの場合において、ＨＡＳが−本発明の好ましい実施形態により−ＨＥＳである、一例として好ましい実施形態として挙げられる。

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

または

構造（ａ２）、（ａ４）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体がさらに好ましい。なおさらに好ましいのは、構造（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。特に好ましいのは、構造（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、および（ａ１６）からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。

特に好ましい実施形態により、本発明は、以下の構造、

を有するＨＥＳ誘導体に関し、
式中、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ_２：Ｃ_６置換の比を有する。

非酸化還元末端
本発明の第２の好ましい実施形態により、架橋性化合物は、アミノ基を介してＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの末端還元末端の非酸化Ｃ^＊原子と反応する、すなわちＨＡＳ分子の末端アルデヒド基はアルデヒド基として、および／または対応するヘミアセタール形として存在し得る。

非酸化還元末端を介したＨＡＳとアミノ基Ｍとの反応は、すべての好適な方法に従って実施できる。好ましくは、アミノ基Ｍは、Ｈ_２Ｎ−、好適な２級アミノ基ＨＮＲ’−、例えばＨ_３Ｃ−ＮＨ−、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、または好適な２級ヒドロキシアミノ基ＨＮＲ’−Ｏ−、例えばＨ_３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−、またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である。

好ましくは、アミノ基Ｍは、Ｈ_２Ｎ−、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、なおさらに好ましくはＨ_２Ｎ−もしくはＨ_２Ｎ−Ｏ−、および特にＨ_２Ｎ−である。

本発明の好ましい実施形態により、この反応は水性系で実施される。「水性系」という用語は、本発明の明細書で使用するように、溶媒または含まれる溶媒の重量に基づいて少なくとも１０重量％から、好ましくは少なくとも５０重量％、さらに好ましくは少なくとも８０重量％、なおさらに好ましくは少なくとも９０重量％または最大１００重量％までの範囲で水を含む溶媒の混合物を指す。さらなる溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、エタノールまたはメタノールなどの溶媒が挙げられる。

好ましい実施形態により、ＨＡＳが架橋性化合物と水性媒体中で反応して、架橋性化合物のアミノ基Ｍがヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、反応温度は好ましくは５〜４５℃の範囲、さらに好ましくは１０〜３０℃の範囲、および特に好ましくは１５〜２５℃の範囲である。

本発明の別の好ましい実施形態により、ＨＡＳが架橋性化合物と水性媒体中で反応して、架橋性化合物のアミノ基Ｍが基Ｈ_２Ｎ−またはＲ’ＨＮである場合、反応は還元的アミノ化であり、温度は、好ましくは１００℃までの範囲、さらに好ましくは１０〜９０℃の範囲、さらに好ましくは２０〜８０℃の範囲、さらに好ましくは３０〜７０℃の範囲および特に好ましくは４０〜６０℃の範囲である。

反応過程の間、温度は、好ましくは上述の範囲で変化し得るか、または本質的に一定に維持され得る。

ＨＡＳと架橋性化合物Ｍとの反応の反応時間は、詳細な要求に適合させることができ、一般に１時間〜７時間の範囲である。例えばアミノ基Ｍがヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、反応時間は、好ましくは１時間〜３日間、さらに好ましくは２時間〜４８時間、および特に好ましくは３〜２４時間である。

例えばＨＡＳと架橋性化合物との反応が還元的アミノ化である場合、反応時間は好ましくは１時間〜７日間、さらに好ましくは４時間から６日間、さらに好ましくは８時間〜５日間の範囲、およびなおさらに好ましくは１６時間〜３日間の範囲である。

ＨＡＳと架橋性化合物との反応のｐＨ値は、反応物質の化学的性質などの詳細な要求に適合されることができる。例えば架橋性化合物のＭ基がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、ｐＨ値は、好ましくは３〜９の、さらに好ましくは４〜８の、およびなおさらに好ましくは４．５〜６．５の範囲である。

例えばＨＡＳと架橋性化合物との反応が還元的アミノ化である場合、ｐＨ値は、好ましくは３〜９の、さらに好ましくは３．５〜８の、およびなおさらに好ましくは４〜６の範囲である。

反応混合物の好適なｐＨ値は、各反応ステップで、少なくとも１つの好適な緩衝剤を添加することによって調整され得る。好ましい緩衝剤剤のうちで酢酸塩緩衝剤、好ましくは酢酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩またはホウ酸塩緩衝剤が挙げられる。

架橋性化合物が、好ましい実施形態により、アミノ基ＭとしてＨ_２Ｎ−を有する非酸化形の還元末端を有するＨＡＳとの反応に使用される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物がイミン結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体はアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。反応が好適な還元剤の存在下にて還元的アミノ化条件下で実施される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物がアミン結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体はアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。

したがって、本発明は、ステップ（ｉ）において、ＨＡＳが好ましくは水性系において、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ_２Ｎ−であるアミノ基Ｍと反応して、反応が４〜７の範囲のｐＨにて２０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ⁻である、上述の方法にも関する。

さらに、本発明は、ステップ（ｉ）において、反応が還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、例えば４−（ジメチルアミン）ピリジンボラン錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、Ｎ−エチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−メチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体、好ましくはＮａＣＮＢＨ_３の存在下で実施されてＨＡＳ誘導体が得られ、Ｘが−ＣＨ_２−ＮＨ−である、上述の方法にも関する。

本発明の還元的アミン化に使用するこれらの還元剤の濃度は、それぞれの場合で反応溶液の体積に関連して、好ましくは０．０１〜２．０ｍｏｌ／ｌの範囲、さらに好ましくは０．０５〜１．５ｍｏｌ／ｌの範囲、およびさらに好ましくは０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌの範囲である。

ＭがＨ_２Ｎ−であり、架橋性化合物とＨＡＳとの反応が還元的アミノ化条件下で実施される上述の好ましい実施形態により、架橋性化合物：ＨＡＳのモル比は、好ましくは１：１〜１００：１、さらに好ましくは２：１〜８０：１、さらに好ましくは３：１〜７０：１、さらに好ましくは４：１〜６０：１、およびさらに好ましくは５：１〜５０：１の範囲である。

ＭがＨ_２Ｎ−であり、架橋性化合物とＨＡＳとの反応が還元的アミノ化条件下で実施される上述の好ましい実施形態により、水性系のＨＡＳ、好ましくはＨＥＳの濃度は、それぞれの場合で反応溶液の重量に関連して、好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは３〜４５重量％、およびさらに好ましくは５〜４０重量％の範囲である。

架橋性化合物が、好ましい実施形態により、アミノ基ＭとしてＨ_２Ｎ−Ｏ−またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を有する非酸化形の還元末端を有するＨＡＳとの反応に使用される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物が−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−結合または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−結合を介して結合され、得られたＨＡＳ誘導体がアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する、本発明のステップ（ｉ）によって得られる。反応が好適な還元剤の存在下にて還元条件下で実施される場合、ＨＡＳ誘導体は、開始物質として利用されるＨＡＳおよび架橋性化合物が−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−結合または−ＣＨ_２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−結合を介して結合される本発明のステップ（ｉ）によって得られ、得られたＨＡＳ誘導体がアセタールまたはケト基Ａをさらに含有する。

したがって本発明は、ステップ（ｉ）において、ＨＡＳが好ましくは水性系において、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ_２Ｎ−Ｏ−またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−であるアミノ基Ｍと反応して、反応が４．５〜６．５の範囲のｐＨにて５〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である、上述の方法にも関する。

さらに本発明は、ステップ（ｉ）において、反応が還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、例えば４−（ジメチルアミン）ピリジンボラン錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、Ｎ−エチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−メチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体、好ましくはＮａＣＮＢＨ_３の存在下で実施されてＨＡＳ誘導体が得られ、Ｘが−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−または−ＣＨ_２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である、上述の方法にも関する。

本発明の本反応に使用するこれらの還元剤の濃度は、それぞれの場合で反応溶液の体積に関連して、好ましくは０．００１〜２．０ｍｏｌ／ｌの範囲、さらに好ましくは０．０１〜１．０ｍｏｌ／ｌの範囲、およびさらに好ましくは０．１〜０．８ｍｏｌ／ｌの範囲である。

ＭがＨ_２Ｎ−Ｏ−またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−であり、架橋性化合物とＨＡＳとの反応が還元条件下で実施される上述の好ましい実施形態により、架橋性化合物：ＨＡＳのモル比は、好ましくは１：１〜１００：１、さらに好ましくは２：１〜８０：１、さらに好ましくは３：１〜７０：１、さらに好ましくは４：１〜６０：１、およびさらに好ましくは５：１〜５０：１の範囲である。

さらに、本発明は、例えば以下の構造式

（反応条件および／もしくは架橋性化合物の詳細な化学的性質に応じて、Ｃ−Ｎ二重結合は、ＥもしくはＺ立体配座で存在し得て、そこではある平衡分布を有する両方の形の混合物も存在し得る）、
または、本発明の目的のために上の開構造と同一と見なされ得る、対応する環状の構造式

（反応条件および／もしくは架橋性化合物の詳細な化学的性質に応じて、これらのＨＡＳ誘導体は、エクアトリアル位もしくはアキシアル位のＮ原子と共に存在し得て、そこではある平衡分布を有する両方の形の混合物がまた存在し得る）

または

または対応する環状の構造式

または

または

または対応する環状の構造式

または

を有するＨＡＳ誘導体にも関する。

上述の好ましい架橋性化合物に従って、以下のＨＡＳ誘導体は、一例として好ましい実施形態として挙げられ、それぞれの場合において、ＨＡＳが−本発明の好ましい実施形態により−ＨＥＳであり、

ここで対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式も含まれ、または

または

ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

または

が含まれ、
ここで、対応する環状の構造式、すなわち

が含まれる。

（ａ２）、（ａ４）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体がさらに好ましい。なおさらに好ましいのは、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、（ａ１４）、（ａ１６）、および（ａ１８）の構造からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。特に好ましいのは、（ａ２）、（ａ１１）、（ａ１２）、および（ａ１６）の構造からなる群より選択される架橋性化合物に基づくＨＡＳ誘導体である。

特に好ましい実施形態により、本発明は、以下の構造式、

対応する環状の構造式

および／または

を有するＨＥＳ誘導体に関し、
さらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａ、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａ、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａ、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａ、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａ、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ_２：Ｃ_６置換の比を有する。

（ＨＡＳに関する他の考えられる実施形態）
完全を期すために、本発明により好ましくはないが、少なくとも２個のアルデヒド基が以下の式によるＨＡＳに導入されるように、ＨＡＳが架橋性化合物との反応の前に酸化されることが考えられることに言及するものとする。

一般に、ポリマーの少なくとも１個のサッカライド環を酸化して少なくとも１個の、好ましくは少なくとも２個のアルデヒド基を有するサッカライド開環を与えることができる、各酸化剤または酸化剤の組合せが利用され得る。本反応は、酸化されて２個のアルデヒド基を有する開環を与えるＨＡＳのサッカライド環を示す、以下の反応スキームによって例証され得る。

好適な酸化剤は特に、過ヨウ素酸塩、例えばアルカリ金属化ヨウ素酸塩またはその２つ以上の混合物であり、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムが好ましい。これらのアルデヒド基は架橋性化合物Ｍ−Ｌ−Ａとアミノ基Ｍを介して反応できることが考えられる。

（単離および／または精製）
一般に、本発明のステップ（ｉ）からのＨＡＳ誘導体は続いて、以下に記載するように反応する。好ましい実施形態により、ステップ（ｉ）からのＨＡＳ誘導体は、反応ステップ（ｉ）の後に好適に精製される。

ステップ（ｉ）からのＨＡＳ誘導体の精製のために、一例として以下の可能性Ａ）〜Ｃ）を挙げることが可能であり、ここでは可能性Ａ）が好ましい。
Ａ）水または好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの、さらに好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌおよびさらに好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの、例えば約１０ｍｍｏｌ／ｍｌの濃度、好ましくは２〜１０の、さらに好ましくは４〜１０の、さらに好ましくは６〜１０およびさらに好ましくは８〜１０の範囲、例えば約９のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する限外濾過、交換サイクルの回数は、好ましくは１０〜５０、さらに好ましくは１０〜４０およびなおさらに好ましくは１０〜３０、例えば約２０である。
Ｂ）水または好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの、さらに好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌおよびさらに好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの、例えば約１０ｍｍｏｌ／ｍｌの濃度、２〜１０、さらに好ましくは４〜１０の、さらに好ましくは６〜１０およびさらに好ましくは７〜９の好ましい範囲のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する透析、ここで５〜２０重量％の好ましい濃度でＨＡＳ誘導体を含有する溶液が利用され；ならびにここで緩衝剤または水は、ＨＥＳ誘導体溶液に対して特に約１００：１の過剰量で使用される。
Ｃ）エタノールまたはイソプロパノールによる沈殿、遠心分離および約１０重量％の好ましい濃度を有する溶液を得るための水への再溶解、ならびに水または好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの、さらに好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌおよびなおさらに好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの、例えば約１０ｍｍｏｌ／ｍｌの濃度、２〜１０の、さらに好ましくは４〜１０の、さらに好ましくは６〜１０およびさらに好ましくは７〜９の好ましい範囲のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する、続いての限外濾過、交換サイクルの回数は、好ましくは１０〜４０、さらに好ましくは１０〜３０およびなおさらに好ましくは１０〜２０、例えば１０である。

好ましい精製ステップの後、ＨＡＳ誘導体は好ましくは固体として得られる。本発明のさらに考えられる実施形態により、２〜４０重量％の好ましいＨＡＳ誘導体含有率を有するＨＡＳ誘導体溶液または凍結ＨＡＳ誘導体溶液が挙げられ、ここでこれらの溶液のｐＨは、好ましくは３〜１０の範囲であり、使用した緩衝液の濃度は、好ましくは０．１〜１ｍｏｌ／ｌの範囲である。

したがって本発明は、（ｉ）の後に、（ｉ）で得たＨＡＳ誘導体を、水または０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度、２〜１０の範囲のｐＨを有する緩衝水溶液を使用する限外濾過を使用して精製し、交換サイクルの回数が１０〜５０である、上述の方法にも関する。

（生物活性剤ＢＡとの反応）
さらなる好ましい実施形態により、本発明は、上述のＨＥＳ誘導体

が生物活性化合物ＢＡとアセタールまたはケタール基Ａを介してさらに好適に反応して、Ａ基がＢＡとの反応の前に対応するアルデヒドまたはケト基に好ましくは変換される、方法に関する。

最も好ましくは、Ａ基、好ましくは対応するアルデヒドまたはケト基は、ＢＡに含まれるアミノ基と、なおさらに好ましくは１級アミノ基と反応する。このような場合に、および本発明の目的のために、ＢＡは、ＢＡ’がＢＡの残部である、Ｈ_２Ｎ−ＢＡ’としても表される。

したがって、本発明は、さらに
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）によるＨＡＳ誘導体を生物活性剤Ｈ_２Ｎ−ＢＡ’のアミノ基と、Ａ基を介して還元的アミノ化によって反応させて、式（ＩＶ）

（ＩＶ）
によるＨＡＳ誘導体を得るステップをさらに含む上述した方法にも関する。

本発明の第１の実施形態により、好ましくは精製された（ｉ）から得たＨＡＳ誘導体は、Ａ基の対応するアルデヒドまたはケト基への変換を好適に受け、この変換では得られたＨＡＳ誘導体がＢＡとの反応の前に好適な精製および／または単離ステップを受ける。アルデヒドまたはケト基への変換は好ましくは、酸触媒加水分解反応によって実施される。反応は、好ましくは０〜１００℃の、さらに好ましくは１０〜８０℃の、およびさらに好ましくは２０〜６０℃の温度にて、好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜５の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは１〜３の、およびなおさらに好ましくは１〜３未満の範囲であるｐＨで実施される。加水分解反応生成物の精製および緩衝液交換は、当業者に周知の方法によって、例えば透析または限外濾過によって達成することができる。変換された物質は、例えば凍結乾燥によって溶液から固体として回収することができる。

本発明の第２の実施形態により、好ましくは精製された（ｉ）から得たＨＡＳ誘導体は、Ａ基の対応するアルデヒドまたはケト基への変換を好適に受け、この変換では得られたＨＡＳ誘導体が直接、すなわちアルデヒドまたはケト基を含むＨＡＳ誘導体の独立した好適な精製および／または単離ステップなしで、ＢＡと反応する。アルデヒドまたはケト基への変換は好ましくは、酸触媒加水分解反応によって実施される。反応は、好ましくは０〜１００℃の、さらに好ましくは１０〜８０℃の、およびさらに好ましくは２０〜６０℃の温度にて、好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜５の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは１〜３の、およびなおさらに好ましくは１〜３未満の範囲であるｐＨで実施される。．加水分解反応生成物は、直接またはＢＡとの反応に適合する値にｐＨを調整した後のどちらかに、緩衝溶液中でＢＡと化合することができる。

したがって、本発明は、（ｉｉ）の前に、式（ＩＩＩ）によるＨＡＳ誘導体のＡ基を対応するアルデヒドまたはケト基に変換する、上述した方法にも関する。

本発明の第３の考えられる実施形態により、好ましくは精製された、（ｉ）から得たＨＡＳ誘導体は、ＢＡと直接反応する、すなわち独立した好適な精製および／または単離ステップなしで、ならびにＡ基の対応するアルデヒドまたはケト基への変換の独立したステップなしで、Ａ基の対応するアルデヒドまたはケト基へのｉｎｓｉｔｕ変換を可能にする反応条件下で、ＢＡと反応する。アルデヒドまたはケト基への変換は好ましくは、酸触媒加水分解反応によって実施される。反応は、好ましくは０〜１００℃の、さらに好ましくは１０〜８０℃の、およびさらに好ましくは２０〜６０℃の温度にて、好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜５の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは１〜３の、およびなおさらに好ましくは１〜３未満の範囲であるｐＨで実施される。．加水分解反応生成物は、直接またはＢＡとの反応に適合する値にｐＨを調整した後のどちらかに、緩衝溶液中でＢＡと化合することができる。

上述の３つの実施形態による方法のどれを実施するかは、例えば利用する生物活性物質ＢＡの詳細な性質に依存する。例えばＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＦＮαなどのタンパク質がＢＡとして利用される場合、上述の第１または第２の実施形態が一般に好適である。

ステップ（ｉｉ）の反応は、好ましくは水性系で実施される。「水性系」という用語は、本発明の明細書で使用するように、溶媒または含まれる溶媒の重量に基づいて少なくとも１０重量％から、好ましくは少なくとも５０重量％、さらに好ましくは少なくとも８０重量％、なおさらに好ましくは少なくとも９０重量％または最大１００重量％までの範囲で水を含む溶媒の混合物を指す。さらなる溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、エタノールまたはメタノールなどの溶媒が挙げられる。

式（ＩＶ）、すなわち

（ＩＶ）
によるＨＡＳ誘導体の非還元形を得るための条件下で、ステップ（ｉｉ）_{［ＲＳ３］}の反応を実施することが考えられるが、少なくとも１つの好適な還元剤の存在下にて、還元的アミノ化条件下でステップ（ｉｉ）による反応を実施することが特に好ましい。特にこれらの条件下で、ＨＡＳ誘導体のＡ基およびＢＡのＨ_２Ｎ基から生じるアルデヒド基またはケト基の反応によって得た基−ＣＨ＝Ｎ−は、−ＣＨ_２−ＮＨ−に還元される。

一例として、以下の還元剤：ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、４−（ジメチルアミン）ピリジンボラン錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、Ｎ−エチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−メチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体が利用され得る。ＮａＢＨ_４およびＮａＣＮＢＨ_３が好ましく、ＮａＣＮＢＨ_３が特に好ましい。

一実施形態において、ＨＡＳ誘導体は生物活性剤を含有する水溶液に添加される。好ましくは、続いて少なくとも１つの還元剤、特にＮａＣＮＢＨ_３が添加される。

他の実施形態において、ＨＡＳ誘導体は場合により水溶液中に添加され、次にＢＡが添加される。好ましくは、続いて少なくとも１つの還元剤、特にＮａＣＮＢＨ_３が添加される。

ステップ（ｉｉ）におけるＨＡＳ誘導体と生物活性化合物ＢＡのアミノ基とのの反応は、３〜９の、好ましくは３〜８の、さらに好ましくは３〜７の、さらに好ましくは３〜７以下のｐＨ値にて、例えば３または４または５または６にて好ましくは実施される。反応混合物の好適なｐＨ値は、少なくとも１つの好適な緩衝剤を添加することによって調整され得る。好ましい緩衝剤剤のうちで、酢酸塩緩衝剤、好ましくは酢酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩またはホウ酸塩緩衝剤が挙げられる。

ステップ（ｉｉ）における、ステップｂ）で得たＨＡＳ誘導体の生物活性化合物ＢＡのアミノ基との反応は、−１０〜１００℃の、好ましくは０〜５０℃の、さらに好ましくは０〜３７℃の、さらに好ましくは０〜２５℃の、例えば０、５、１０、１５、２０、または２５℃の温度にて好ましくは実施される。

ステップ（ｉｉ）の反応時間は、温度、ＨＡＳ、特にＨＥＳ誘導体および化合物ＢＡの比ならびにＨＡＳ誘導体および化合物ＢＡの絶対濃度に依存する。一般に、５分間〜７日間、好ましくは１時間〜７日間の反応時間が考えられる。

ステップ（ｉｉ）における得られたＨＡＳ誘導体の化合物ＢＡに対するモル比は、ＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍ_ｎ）に基づいて、好ましくは０：１〜２００：１〜２００：１当量、なおさらに好ましくは１：１〜１００：１である。好ましくは、モル比は１：１〜５０：１である。ＢＡがタンパク質、特にＩＦＮαである場合には、低いモル比、例えば５０：１以下、好ましくは１：１〜２０：１、さらに好ましくは１：１〜１０：１、およびなおさらに好ましくは２：１〜９：１、さらに好ましくは３：１〜８：１およびなおさらに好ましくは４：１〜７：１のモル比が考えられる。

詳細な好ましい実施形態において、ステップ（ｉｉ）で使用するＨＡＳ誘導体の濃度は、それぞれの場合で（ｉｉ）の反応溶液の重量に対して、約１０重量％より高く、特に約１５重量％よりも高い。

したがって本発明は、（ｉｉ）において、反応が好ましくは水性系にて、還元剤、好ましくはＮａＣＮＢＨ_３の存在下で、０〜３７℃の、好ましくは０〜２５℃の範囲の温度および３〜９の、好ましくは３〜７以下の範囲のｐＨにて実施され、（ｉｉ）において、ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対するモル比が、ＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍ_ｎ）に基づいて、０．１：１〜２００：１当量、好ましくは１：１〜５０：１当量である、上述した方法にも関する。

（ｉｉ）を行った溶液、好ましくは水溶液のＢＡの好ましい濃度、例えば好ましいタンパク質濃度は、０．１〜１０ｇ／ｌの、さらに好ましくは１〜９ｇ／ｌの範囲である。（ｉｉ）の前の、（ｗ／ｖ）で示した該溶液中のＨＡＳ誘導体の濃度は、好ましくは０．１〜５０％の、さらに好ましくは０．５〜４５％およびさらに好ましくは１〜４０％の範囲である。

考えられる実施形態により、生物活性剤ＢＡは、水性媒体に、好ましくは緩衝水溶液に、特に酢酸ナトリウム緩衝溶液に溶解され得る。水溶液はさらに添加剤、例えば、特にＳＤＳ、Ｃｈａｐｓ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、およびＴｒｉｔｏｎＸ１００からなる群より選択される洗剤および／または分散剤などの添加剤を含有することができる。洗剤および／または分散剤を使用する場合、それは水溶液の総重量に基づいて、０．００５〜３重量％の、好ましくは０．０５〜３重量％の、好ましくは約０．５重量％の量で好ましくは存在する。

本発明により少なくとも１つの還元剤が利用され、ＢＡとの反応に利用されるＨＡＳ誘導体中に存在するＸが例えば−ＣＨ＝Ｎ−である場合、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−は、（ｉｉ）の反応に使用する還元的アミノ化条件下で好ましくは還元されて、−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、または−ＣＨ_２−ＮＨ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である官能基Ｘを生じる。

本発明はしたがって、上述のような方法によって、特に（ｉｉ）において、反応が好ましくは水性系にて、還元剤、好ましくはＮａＣＮＢＨ_３の存在下で、０〜３７℃の、好ましくは０〜２５℃の範囲の温度および３〜９の、さらに好ましくは３〜７の、好ましくは３〜７以下の範囲のｐＨにて実施され、（ｉｉ）において、ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対するモル比が、ステップ（ｉｉ）で利用したＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍ_ｎ）に基づいて、０．１：１〜２００：１当量、好ましくは１：１〜１０：１当量であり、それぞれの場合でＸがアミド基でないという条件である、上述のような方法によって得たまたは得られるＨＡＳ誘導体に関する。ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対する特に好ましいモル比は１０以下、例えば１：１〜９：１、さらに好ましくは１：１〜８：１、さらに好ましくは１：１〜７：１、さらに好ましくは１：１〜６：１およびなおさらに好ましくは１：１〜５：１、例えば約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１である。５０：１以下の、さらに好ましくは１０：１以下のモル比などのこのように低いモル比はいくつかの生物活性剤で考えられるが、そえらは例えばタンパク質で好ましく、ここでＩＦＮαが特に好ましい。例えばＧ−ＣＳＦおよびＥＰＯに関する限り、５０：１以下、例えば１：１〜５０：１のモル比が好ましい。一般に、一例として、１：１〜５０：１または２：１〜４０：１または３：１〜３０：１または４：１〜２０：１または５：１〜１５：１の範囲のモル比が挙げられる。

この場合、タンパク質は本発明による生物活性剤ＢＡとして、特に上に示した好ましいｐＨ範囲にて、特に７以下および３以上のｐＨにて利用されて、ＨＡＳ誘導体をタンパク質のＮ末端に位置するアミノ基と主に反応する。「主に」という用語は、本発明の状況で使用するように、利用可能なＮ末端アミノ基の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％が還元的アミノ化を介して反応する実施形態に関する。利用可能なＮ末端アミノ基の少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９６％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも９９％を反応させることも可能である。Ｎ末端アミノ基以外のアミノ基への結合は完全に排除できないが、７以下のｐＨでの本発明による還元的アミノ化を介した結合は、Ｎ末端アミノ基にて本質的に選択的に発生する。特に、これらの反応条件は、これらの条件にて安定であるタンパク質で好ましい。タンパク質が例えば酸に不安定である、例えばα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）である場合、ここで適切な反応条件、特に７．５以下〜５超のｐＨを選択することが好ましい。

したがって、本発明は、ＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体の調製方法、このような方法によって得られるまたは得たＨＡＳ誘導体、および上述した、式（ＩＶ）によるＨＡＳ誘導体にも関し、ここでタンパク質はＮ末端アミノ基および少なくとも１個のさらなるアミノ基を含み、該ＨＡＳ誘導体は主にＮ末端アミノ基に結合するＨＡＳを含む。

したがって、本発明は式（ＩＶ）

（ＩＶ）
による、ＨＡＳ誘導体にも関する。

さらに、本発明は、式（ＩＶ）

（ＩＶ）
のヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関し、
式中、Ｘは、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
の架橋性化合物のアミノ基Ｍ（式中、Ｘは、アミド基−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ではない）の、式（Ｉ）

のヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）との、ＨＡＳの炭素原子Ｃ^＊を介した反応から生じる官能基であり、式中、Ｃ^＊は、ＨＡＳのＭとの反応の前に場合により酸化され、最も好ましくは酸化されない。
式中、ＨＡＳ’は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基であり、
式中、Ａは、式（ＩＩａ）

による残基であり、
式中、
Ｚ_１およびＺ_２はそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲ_ｘ、好ましくはＯであり、ここでＲ_ｘは、Ｈまたは低級アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル、例えばｎ−プロピルもしくはｉ−プロピル、またはＣ（Ｏ）−Ｒ_ｙであり、ここでＲ_ｙは、好ましくはＣ_１−Ｃ_６アルキルおよびＣ_６−Ｃ_１４アリールからなる群よりは選択され、なおさらに好ましくは場合により置換された、好ましくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択され；Ｒ_ｘは好ましくはＨである。
Ａ_１およびＡ_２はそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであり、または式（ＩＩｂ）

による環を形成し、
式中、Ａ_１およびＡ_２はひとまとめにされて、−（ＣＨ_２）_２−または−（ＣＨ_２）_３−または−（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−であり、ならびに
式中、Ａ_３は、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであり、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、Ａ_３は好ましくはＨである。
および式中、Ｌは、ＭおよびＡを架橋するスペーサであり、
式中、ＢＡ’は、ＢＡのアミノ基の、還元的アミノ基を介したＡとの、またはＡに対応するアルデヒド基またはケト基との反応後に残存する、生物活性剤ＢＡ’−ＮＨ_２の残部である。

ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳ、および架橋性化合物に関する好ましい実施形態に関しては、上の各開示を参照されたい。

式（ＩＶ）のＨＡＳ誘導体に関する限り、Ｘは、−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、および−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、さらに好ましくは−ＣＨ_２−ＮＨ−および−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、最も好ましくは−ＣＨ_２−ＮＨ−からなる群より好ましくは選択される。

さらに式（ＩＶ）のＨＡＳ誘導体に関する限り、ＭおよびＡを架橋するＬは、式（ＩＩｄ）による少なくとも１個の構造単位を含む、好ましくは式（ＩＩｄ）による構造単位からなるスペーサであり

「生物活性物質」（ＢＡ）という用語は、本発明の状況で使用するように、これに限定されるわけではないが、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物、およびヒトを含む生物の任意の物理的または生化学的特性に影響を及ぼすことができる物質に関する。特に、「生物活性物質」という用語は、本発明の状況で使用するように、ヒトもしくは動物における疾患の診断、治癒、軽減、処置、もしくは予防を目的とした、またはそうでなければヒトまたは動物の身体的または精神的健康を増進する物質に関する。活性物質の例は、これに限定されるわけではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、小型分子薬、染料、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、例えば５’−アミノヘキシルスペーサなどの好適なスペーサを有するオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルを含む。好ましくは、本発明による生物活性物質は未変性アミノ基を含有する。

タンパク質の例は、これに限定されるわけではないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）またはＥＰＯミメティック、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、α−インターフェロン（ＩＦＮα）、β−インターフェロン（ＩＦＮβ）またはガンマ−インターフェロン（ＩＦＮガンマ）、例えば組換えヒトＩＦＮαまたはＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮαまたはｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮαおよびＩＦＮβ、インターロイキン、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−３４、例えば組換えヒトＩＬ−２またはＩＬ−３（ｒｈＩＬ−２またはｒｈＩＬ−３）などのＩＬ−２またはＩＬ−３またはＩＬ−１１、血清タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第ＩＶ因子、第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子などの凝固第ＩＩ〜ＸＩＩＩ因子、セリンプロテアーゼ阻害因子、例えばα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、プラスミノゲン活性化因子、例えば組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、例えばヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｈＴＰＡ）、ＡＴＩＩＩ、例えば組換えヒトＡＴＩＩＩ（ｒｈＡＴＩＩＩ）、ミオグロブリン、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、増殖因子、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、脳由来増殖因子（ＢＤＧＦ）、神経増殖因子、（ＮＧＦ）、Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）、脳由来神経栄養増殖因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、トランスフォーミング増殖因子、例えばＴＧＦαまたはＴＧＦβ、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、成長ホルモン、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）などのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦαまたはＴＮＦβ、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、ヘモグロビン、ホルモンまたはプロホルモン、例えばインスリン、ゴナドトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、トリプトレリン、視床下部ホルモン、例えば抗利尿ホルモン（ＡＤＨおよびオキシトシンはもちろんのこと、放出ホルモンおよび放出抑制ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン、例えばチロキシン、甲状腺刺激ホルモン、チロリベリン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２など）、エクセンジン、例えばエクセンジン−４、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈレプチン）、ケンプチド（Ｔｒｐ^４−ケンプチド）、バソプレシン、ガストリン、セクレチン、インテグリン、糖タンパク質ホルモン（例えばＬＨ、ＦＳＨなど）、メラノシド刺激ホルモン、リポタンパク質およびアポリポタンパク質、例えばａｐｏ−Ｂ、ａｐｏ−Ｅ、ａｐｏ−Ｌ_ａ、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、マウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、ヒルジン、組織経路阻害因子、植物タンパク質、例えばレクチンまたはリシン、ハチ毒、ヘビ毒、イムノトキシン、抗原Ｅ、αプロテイナーゼ阻害因子、ブタクサアレルゲン、メラニン、オリゴリジンタンパク質、ＲＧＤタンパク質またはこれらのタンパク質の１つの場合により対応する受容体；プロラクチンまたはそのミュータント、例えば１２９位の野生型アミノ酸がアルギニンに置換によってされたＧ１２９Ｒ（このミュータントの商標名は「ＬａｃｔｏＶｅｒｔ」である）ならびにこれらのタンパク質または受容体のいずれかの機能性誘導体または断片を含む。

ポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒアスパラギナーゼ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈレプチン）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、および他のタンパク質骨格からなる群より好ましくは選択される。

さらに好ましくは、ポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈＬｅｐｔｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、およびα−１−アンチトリプシンからなる群より選択される。

活性物質は、抗生物質、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗利尿薬、抗コリン作用薬、抗不整脈薬、制吐薬、鎮咳薬、抗てんかん薬、抗ヒスタミン薬、抗真菌薬、抗交感神経緊張薬、抗血栓薬、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、抗骨粗鬆症薬、抗腫瘍剤、血管拡張薬、他の降圧剤、解熱剤、鎮痛薬、抗炎症剤、β遮断薬、免疫抑制薬およびビタミンからなる群より好ましくは選択される。

活性物質のいくつかの追加の非制限的な例は、アレンドロネート、アミカシン、アテノロール、アザチオプリン、シメチジン、クロニジン、コシントロピン、シクロセリン、デスモプレシン、ジヒドロエルゴタミン、ドブタミン、ドーパミン、イプシロン−アミノカプロン酸、エルゴメトリン、エスモロール、ファモチジン、フレカイニド、葉酸、フルシトシン、フロセミド、ガンシクロビル、グルカゴン、ヒドラザリン、イソプロテレノール、ケタミン、ライオスロニン、ＬＨＲＨ、メルパトリシン、メチルドパ、メトプロロール、ネオマイシン、ニモジピン、ナイスタチン、オキシトシン、フェントラミン、フェニレフリン、プロカインアミド、プロカイン、プロプラノロール、リトドリン、ソタロール、テルブタリン、チアミン、チルドロネート、トラゾリン、トリメトプリム、トロメタミン、バソプレシン。アミフォスチン、アミオダロン、アミノカプロン酸、パラアミノ馬尿酸ナトリウム、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アスパラギナーゼ（例えばＥ．ｃｏｌｉからの例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｅ））、アントラサイクリン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシン、シラスタチンナトリウム、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、カンプトセシン、１３−シスレチノイン酸、オールトランスレチノイン酸。ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デフェロキサミン、デキサメサゾン、ジクロフェナク、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フェキソフェナジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、エピネフリン、Ｌ−ドパ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イトラコナゾール、ゴセレリン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、リシノプリル、ロボチロキシンナトリウム、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、重酒石酸メタラミノール、メトトレキセート、メトクロプラミド、メキシレチン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ナロキソン、ニコチン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロクロルペラジン、オンダンセトロン、ラルチトレキセド、シロリムス、ストレプトゾシン、タクロリムス、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストステロン、テトラヒドロカンナビノール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ドラセトロン、グラニセトロン；フォルモテロール、フルチカゾン、ロイプロリド、ミダゾラム、アルプラゾラム、アンホテリシンＢ、ポドフィロトキシン、ヌクレオシド抗ウイルス薬、アロイルヒドラゾン、スマトリプタン。マクロリド、例えばエリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベルシン、アジスロマイシン、フロリスロマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、アンダジスロマイシン、およびスウィノリドＡ。フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシンおよびサチフロキサシン。アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、ネチルミシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマシイン、およびストレプトマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ランポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメテート。ポリミキシン、例えばポリミキシンＢ、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム；ペニシリンＧ、ペニシリンＶなどのペニシリナーゼ感受性因子を含むペニシリン；ペニシリナーゼ抵抗性因子、例えばメチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシン、フロキサシン、ナフシリン。グラム陰性微生物活性剤、例えばアンピシリン、アモキシシリン、およびヘタシリン、シリンおよびガラムピシリン。抗緑膿菌性ペニシリン、例えばカルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリンおよびピペラシリン；セファロスポリン、例えばセフポドキシム、セフプロジル、セフトブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロシン、セファピリン、セファレキシン、セファラドリン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロール、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラミド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフィネタゾール、セフタジジム、ロラカルベフ、およびモキサラクタム、モノバクタム、例えばアズトレオナム。ならびにカルバペネム、例えばイミペネム、メロペネム、イセチオン酸ペンタミジン、硫酸アルブテロール、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロンアセタミド、ブデソニドアセトニド、フルチカゾン、臭化イプラトロピウム、フルニソリド、クロモリンナトリム、および酒石酸エルゴタミン。タキサン、例えばパクリタキセル。ＳＮ−３８、ならびにチルホスチンである。

したがって、「小型分子」として当業者に公知の化学化合物も、本発明による生物活性物質と考えられる。「小型分子」という用語は、本発明の明細書で使用するように、タンパク質およびオリゴヌクレオチド以外の、しかし５０アミノ酸までのペプチドを含む、生物活性化学化合物に関する。このような小型分子の代表的な例を以下の段落に挙げる。

オリゴヌクレオチドの例_{［ＴＨ６］}は、アパタマーおよびｓｉＲＮＡである。ペプチド核酸（ＰＮＡ）も考えられる生物活性物質として挙げられる。

したがって、本発明は、タンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈＬｅｐｔｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、または他のタンパク質骨格である上述した方法および上述したＨＡＳ誘導体にも関する。

「他のタンパク質骨格」という用語は、本発明の状況で使用するように、分子が他の非抗体タンパク質フレームワークに基づいている所与の抗体に類似の結合能力を有する分子に関する。本明細書では、Ａ．Ｓｋｅｒｒａ，Ｔ．Ｈｅｙｅｔａｌ．，ａｎｄＨ．Ｋ．Ｂｉｎｚ（下の参考文献のリストを参照）による論文が挙げられる。

本発明の生物活性物質（ＢＡ）に関する限り、これらの化合物は、本発明のステージ（ｉｉ）による結合のために１個以上のアミノ基を含み得る。このようなＢＡがこの結合に好適なアミノ基を含まない場合は、ＢＡに（ｉｉ）を受けさせる前に、当業者に公知の方法による好適な官能化によって少なくとも１個のこのようなアミノ酸をＢＡに導入することが考えられる。

上述の生物活性剤、特に上述の好ましい生物活性剤により、および上述の好ましい架橋性化合物およびそれから得たＨＡＳ誘導体により、以下のＨＡＳ誘導体が一例として、好ましい実施形態として挙げられ、ここでそれぞれの場合において、ＨＡＳは、−本発明の好ましい実施形態により−ＨＥＳである。

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または

または

式中、ＢＡ’はタンパク質、さらに好ましくは、ここでタンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈＬｅｐｔｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、および他のタンパク質骨格からなる群より好ましくは選択され、特にここでタンパク質は、ＥＰＯ、ＩＦＮαまたはＧ−ＣＳＦである。なおさらに好ましくは、ＨＡＳ’はＨＥＳ’であり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ_２：Ｃ_６置換の比を有する。

特に好ましい実施形態により、本発明は、式

によるＨＡＳ誘導体に関し、
式中、ＨＡＳは好ましくはＨＥＳであり、ここで、なおさらに好ましくは、ＨＥＳは、約１〜約１０００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約８００ｋＤａの、さらに好ましくは約１〜約５００ｋＤａの、さらに好ましくは約２〜約４００ｋＤａの、さらに好ましくは約５〜約３００ｋＤａの、さらに好ましくは約１０〜約２００ｋＤａの、特に約５０〜約１５０ｋＤａの平均分子量、０．１〜３の、好ましくは０．４〜１．３の、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３のモル置換、および２〜２０の範囲の、さらに好ましくは２〜１５の範囲の、およびなおさらに好ましくは３〜１２の範囲のＣ_２：Ｃ_６置換の比を有する。

さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式

さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式

さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式

さらなる特に好ましい実施形態により、本発明は、式

さらなる態様により、本発明は、ヒトまたは動物の体の治療方法で使用するための上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体、または上述した方法によって得たもしくは得られる上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体に関する。

さらに、本発明は、治療剤または予防剤としての上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体、または上述した方法によって得たもしくは得られる上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体に関する。

さらに、本発明は、上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体、または上述した方法によって得たもしくは得られる上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体を治療的有効量で含む製薬組成物に関する。

ＢＡ’を含む本発明のＨＡＳ誘導体は、好適な方法、例えば経腸的、非経口または肺内方法によって投与され得るか、好ましくは静脈内、皮下または髄内経路によって投与され得る。選択される具体的な経路は、治療される症状に依存する。好ましくは誘導体は、当該技術分野で好適であるような（例えばアルブミンを含まないまたは賦形剤としてアルブミンを含む第１世代／未修飾生物薬剤で使用されるような）好適な担体、静脈内、髄内、または皮下用途などの好適な希釈剤と共に投与され得る。必要な投薬量は、治療される症状の重症度、患者の個々の応答、使用される投与方法などに依存する。当業者は、その一般知識に基づいて正確な投薬量を規定することができる。

上述したＢＡ’を含むＨＡＳ誘導体を含む本発明による製薬組成物に関する限り、ＨＡＳ誘導体は製薬用賦形剤と併せて使用され得る。一般に、ＨＡＳ誘導体は固体形となり、固体形または液体形のどちらかであることが可能な好適な製薬用賦形剤と組合せることができる。賦形剤としては、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびその組合せが挙げられる。糖、誘導体化糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマーなどの炭水化物は賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤は例えば：モノサッカライド、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；ジサッカライド、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；ポリサッカライド、たとばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；およびアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどを含む。賦形剤は、無機塩または緩衝剤、例えばクエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、およびその組合せも含み得る。本発明による製薬組成物は、微生物増殖を予防または阻止するための抗菌剤、例えば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソル、およびその組合せも含み得る。本発明による製薬組成物は、抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびその組合せも含み得る。本発明による製薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベートまたはプルロニックソルビタンエステル。脂質、例えばリン脂質、例えばレシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン酸および脂肪エステル。ステロイド、例えばコレステロール。およびキレート剤、例えばＥＤＴＡまたは亜鉛も含むことができる。本発明による製薬組成物は、酸または塩基、例えば塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびその組合せ、ならびに／または水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびその組合せも含み得る。一般に、賦形剤は、それぞれの場合で製薬組成物の総重量に基づいて、本発明による製薬組成物中に０．００１〜９９．９９９重量％、好ましくは０．０１〜９９．９９重量％、さらに好ましくは０．１〜９９．９重量％の量で存在する。

別の態様によれば、本発明は、貧血障害またはそれに関する造血機能不全障害もしくは疾患の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＥＰＯである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、造血機能または免疫機能の低下を特徴とする障害の治療のための血友病Ａの治療用薬剤の調製のためのＢＡがＧ−ＣＳＦである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。好ましい実施形態により、造血機能または免疫機能の低下を特徴とする障害は、化学療法、放射線療法、感染性疾患、重篤な慢性好中球減少症または白血病の結果である。

別の態様によれば、本発明は、白血病、例えばヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌、例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫および肝炎、例えば慢性Ｂ型肝炎および慢性Ｃ型肝炎の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＦＮαである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、骨粗鬆症および／または慢性悪性疾患の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＦＮガンマである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、骨粗鬆症および／または慢性悪性疾患の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＬ−２ガンマである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、骨髄抑制化学療法後の血小板輸血の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＬ−１１である上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および／または気管支炎の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＡ１ＡＴである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、多発性硬化症、好ましくは再発型多発性硬化症の治療用薬剤の調製のためのＢＡがＩＦＮβである上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子を持つ血友病ＡまたはＢ患者におけるエピソードの治療用薬剤の調製のためのＢＡが第ＶＩＩ因子である上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明は、外科手術環境での出血の管理および予防を含む、血友病Ｂ患者における出血性エピソード、例えば先天性第ＩＸ因子欠乏症すなわちクリスマス病の治療用薬剤の調製のためのＢＡが第ＩＸ因子である上述したＨＡＳ誘導体、好ましくはＨＥＳ誘導体の使用にも関する。

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−Ｋ．Ｒ．Ｒｅｄｄｙｅｔａｌ．ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ５４（２００２）ｐｐ．５７１−５８６

ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図１は、実施例２によるｏｘＨＥＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１〜４：実施例２による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、３０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー図２は、実施例２によるｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＩＦＮａ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：ＨｉＴｒａｐＱＨＰ１ｍｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）溶離液Ａ：１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０。溶離液Ｂ：１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０。運転条件：流量１ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡１０ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄２ＣＶ０％Ｂ溶離１６ＣＶ０〜５０％Ｂ再生１０ＣＶ１００％Ｂ再平衡８ＣＶ０％Ｂロード：実施例２による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２０倍希釈して、ｐＨに調整。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図３は、実施例３によるｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：実施例３による反応混合物。レーン２：結合前のＥＰＯ開始物質。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５５〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー図４は、実施例３によるｏｘＨＥＳ５５／０．７−ＥＰＯ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：ＨｉＴｒａｐＳＰＨＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡１０ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄１２ＣＶ０％Ｂ洗浄２２ＣＶ１０％Ｂ溶離２１ＣＶ１０〜５２％Ｂ再生８ＣＶ１００％Ｂ再平衡５ＣＶ０％Ｂロード：実施例３による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで１０倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図５は、実施例５によるｏｘＨＥＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：実施例５による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ｏｘＨＥＳ５５／１．０−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー図６は、実施例５によるｏｘＨＥＳ５５／１．０−ＩＦＮａ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：ＨｉＴｒａｐＱＨＰ５ｍｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）溶離液Ａ：１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０。溶離液Ｂ：１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０。運転条件：流量１ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡１０ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄２ＣＶ０％Ｂ溶離１２．５ＣＶ０〜５０％Ｂ再生５ＣＶ１００％Ｂ再平衡５ＣＶ０％Ｂロード：実施例５による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２０倍希釈して、ｐＨに調整。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合体のペプチドマッピング図７は、Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣで処理した、実施例５によるＩＥＸ精製ｏｘＨＥＳ−ＩＦＮａ結合体のクロマトグラフィー分離を示す。タンパク質分解は、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．６中の７．５％Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣ、０．０１％ＳＤＳを使用して３７℃にて一晩実施した。試料は、ＤＴＴおよび塩化グアニジンによって変性させて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＴＦＡを含む水／アセトニトリル勾配を用いた４．６×２５０ｍｍＪｕｐｉｔｅｒＣ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ランで分析した。示されたクロマトグラムを２１４ｎｍにて監視した。矢印は、タンパク質（Ａ）と結合体（Ｂ）のクロマトグラムの間の大きな差が見られる領域を示す。Ｌ１およびＬ１／Ｌ２（Ｅｎｄｏ−ＬｙｓＣ処置から生じたＮ末端ペプチド）のピークは、結合体試料では大幅に低下するのに対して、他の断片は実質的に影響されないままである。これらのデータは、ＨＥＳの、ＩＦＮａのＮ末端への優先的な結合を示唆している。ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図８は、実施例６によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：結合前のＥＰＯ開始物質１０μｇ。レーン２：結合前のＥＰＯ開始物質５μｇ。レーン３：実施例６による反応混合物。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、７０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー図１４は、実施例６によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：２×５ｍｌＨｉＴｒａｐＳＰＨＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡１０ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄１２ＣＶ０％Ｂ洗浄２２ＣＶ１０％Ｂ溶離２１ＣＶ１０〜５２％Ｂ再生２．５ＣＶ１００％Ｂ再平衡５ＣＶ０％Ｂロード：実施例６による、反応混合物としての２ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで１０倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。ｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図１０は、実施例７によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：実施例７による反応混合物。レーン２：結合前のＧ−ＣＳＦ開始物質。標的タンパク質（〜１８ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析図１１は、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視した、実施例７によるｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｕｍｍｉｔ、Ｐ５８０（ＨＰＧ）（Ｄｉｏｎｅｘ）。カラム：ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量１ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜５分、５〜５５％Ｂ；５〜１２分、５５〜６８％Ｂ；１２〜１７分、１００％Ｂ；１７〜２２分、５％Ｂ；勾配遅延２．５分。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ、タンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５分の主ピークが、〜１３分にて溶離する遊離Ｇ−ＣＳＦから分離されたＨＥＳタンパク質結合体である。ＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図１２は、実施例１０によるＨＥＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、未染色タンパク質マーカー５〜２００ｋＤａ（Ｓｅｒｖａ）。レーン１：実施例９による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー図１３は、実施例１０によるＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：５ｍｌＨｉＴｒａｐＳＰＨＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡１０ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄１２ＣＶ０％Ｂ溶離２０ＣＶ０〜５０％Ｂ再生１０ＣＶ１００％Ｂ再平衡５ＣＶ０％Ｂロード：実施例９による、反応混合物としての３ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで１０倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。ＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図１４は、実施例１１によるＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：ＩＥＸ精製ＨＥＳＥＰＯ結合体。レーン２：実施例１１による反応混合物。レーン３：結合前のＥＰＯ開始物質５μｇ。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、７０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー図１５は、実施例１１によるＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：４×５ｍｌＨｉＴｒａｐＳＰＨＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡５ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄１２ＣＶ０％Ｂ溶離１３ＣＶ０〜５２％Ｂ再生２．５ＣＶ１００％Ｂ再平衡２．５ＣＶ０％Ｂロード：実施例１１による、反応混合物としての３ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図１６は、実施例１２によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：ＩＥＸ精製ＨＥＳＧ−ＣＳＦ結合体。レーン２：実施例１２による反応混合物。レーン３：結合前のＧ−ＣＳＦ開始物質５μｇ。標的タンパク質（〜１８ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析図１７は、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視した、実施例１２によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：Ｓｕｍｍｉｔ、Ｐ５８０（ＨＰＧ）（Ｄｉｏｎｅｘ）。カラム：ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量１ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜５分、５〜５５％Ｂ；５〜１２分、５５〜６８％Ｂ；１２〜１７分、１００％Ｂ；１７〜２２分、５％Ｂ；勾配遅延２．５分。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ、タンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍｌまで水で希釈。１０〜１０．５分の主ピークが、〜１２分にて溶離する遊離Ｇ−ＣＳＦから分離されたＨＥＳタンパク質結合体である。ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＣＳＦ結合反応のカチオン交換クロマトグラフィー図１８は、実施例１２によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＣＳＦ結合反応のイオン交換カラムの、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：２×５ｍｌＨｉＴｒａｐＳＰＨＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。溶離液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０。溶離液Ｂ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０。運転条件：流量５ｍｌ／分、２１℃。ランパラメータ：平衡１０ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄２ＣＶ０％Ｂ溶離１６ＣＶ０〜５０％Ｂ再生１０ＣＶ１００％Ｂ再平衡８ＣＶ０％Ｂロード：実施例１２による、反応混合物としての３ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂、溶離液Ａで２倍希釈。貫流液中に、未反応の過剰なＨＥＳが見出される。ＨＥＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。各実施例の状況にて言及される。図２４は、２８０ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視した、「追加データ（Ａ．２）」によるｏｘＨＢＳ−ＢＳＡ結合反応のＨＰＧＰＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＳｈｉｍａｄｓｕＬＣ１０ＡＤ／ＵＶ−Ｄｅｔｅｋｔｏｒ：ＴＳＰＵＶ２０００カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６１０／３００ＧＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。溶離液：リン酸緩衝液：（Ｎａ_２ＨＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ３．８８７ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ１．９６７ｇ、ＮａＣｌ１１．６８８ｇ、ＮａＮ_３０．０５ｇを、クロマトグラフィー（ＲｅａｇｅｎｔＰｈａｒｍａｋｏｐｏｅａＥｕｒｏｐａｅａ）用に総体積１．０ｌまで水に溶解した。０．４５μｍフィルタを利用して溶液を濾過した）運転条件：流量０．４ｍｌ／分、２０℃。ロード：反応混合物としてタンパク質０．９ｍｇ、１００μｌにタンパク質濃度９ｍｇ／ｍｌまで溶解。上部は、結合反応前のＢＳＡ開始物質を示す。ピークは、左から右へ３８．０３８、３９．２７７、および４２．２７２である。下部は、ＨＢＳ−ＢＳＡ結合体を示す。ピークは、左から右へ３６．７９５、３９．３４５、および４１．５２１である。ｏｘＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図２５は、「追加データ（Ａ３）」によるｏｘＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１〜４：「追加データ（Ａ３）」による反応混合物。標的タンパク質（１９ｋＤａ）のＨＢＳ化が成功すると、３０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ｏｘＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応のアニオン交換クロマトグラフィー図２６は、イオン交換カラムを使用する、追加データ（Ａ３）によるＨＢＳ−ＩＦＮａ結合反応の、２２１ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により監視したクロマトグラフィー分離を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。カラム：ＨｉＴｒａｐＱＨＰ１ｍｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）溶離液Ａ：１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０。溶離液Ｂ：１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０。運転条件：流量１ｍｌ／分、２０℃。ランパラメータ：平衡１０ＣＶ０％Ｂ試料ロード洗浄２ＣＶ０％Ｂ溶離１６ＣＶ０〜５０％Ｂ再生１０ＣＶ１００％Ｂ再平衡８ＣＶ０％Ｂロード：実施例３による反応混合物、溶離液Ａで２０倍に希釈して、ｐＨ８．０に調整。貫流液中に、未反応の過剰なＨＢＳが見出される。ＨＢＳ化によって、タンパク質とカラムとの相互作用が弱められ、未修飾タンパク質と比較して結合体の溶離時間の短縮がもたらされた。ｏｘＨＢＳ−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図２７は、「追加データ（Ａ４）」によるｏｘＨＢＳ−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。ロード：反応混合物としてタンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：「追加データ（Ａ４）」による反応混合物。レーン２：結合前のＥＰＯ開始物質。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＢＳ化が成功すると、４５〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ２）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析図２８は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表３によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ２）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ２０Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ２０ＡＴ（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量１ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１６）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析図２９は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表５、１３行によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１６）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ２０Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ２０ＡＴ（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量１ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１１）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析図３０は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表５、２４行によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１１）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ２０Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ２０ＡＴ（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量１ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。ＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１２）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析図３１は、２２１ｍｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって監視した実施例１８、表５、３０行によるＨＥＳ１００／１．０、リンカ（ａ１２）および（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドを使用する結合反応のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の部分を示す。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。クロマトグラフィーシステム：ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ２０Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ＬＣ２０ＡＴ、（ＬＰＧ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。カラム：ＪｕｐｉｔｅｒＣ１８、３００Ａ、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）。溶離液Ａ：水中の０．１％トリフルオロ酢酸。溶離液Ｂ：アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸。運転条件：流量１ｍｌ／分、２０℃。勾配：０〜１５分、２〜３０％Ｂ；１５〜２０分、３０〜９８％Ｂ；２０〜２７分、２％Ｂ。ロード：反応混合物としてタンパク質５μｇ、タンパク質濃度０．０１５ｇ／ｍｌまで水で希釈。１１．５〜１５分の主ピークが、〜１７分にて溶離する遊離（Ｔｒｐ^４）−ケンプチドから分離されたＨＥＳペプチド質結合体である。ＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図３２は、実施例１８によるＨＥＳ１００／１．０−Ｇ−ＧＳＦ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＥＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：表５、７行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン２：表５、１６行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン３：表５、２７行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン４：表５、３３行による反応混合物（タンパク質１０μｇ添加）。レーン５：結合前のＧ−ＣＳＦ開始物質０．５μｇ。標的タンパク質（〜１８ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。ＨＥＳ１００／１．０−ＩＦＮａ結合反応およびＨＥＳ１００／１．０−ＥＰＯ結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図３３は、実施例１８によるＨＥＳ１００／１．０とｒｈＩＦＮαまたはｒｈＥＰＯとの間の結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離は、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ）およびＭＯＰＳ泳動用緩衝液と共に製造者の説明書に従って使用して、還元条件下で実施した。右側に示す電気泳動分離では、ＭＯＰの代わりにＭＥＳ緩衝液を使用した。代表的なロード：開始物質または反応混合物のどちらかとして、タンパク質１０μｇ。Ｍ：マーカー、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。レーン１：表５、４行による反応混合物。レーン２：表５、１４行による反応混合物。レーン３：表５、２５行による反応混合物。レーン４：表５、３１行による反応混合物。レーン５：結合前のｒｈＩＦＮα開始物質。標的タンパク質（〜１９ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、５０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。レーン６：表５、１５行による反応混合物。レーン７：表５、５行による反応混合物。レーン８：表５、３２行による反応混合物。レーン９：結合前のｒｈＥＰＯ開始物質。レーン１０：表５、２６行による反応混合物。標的タンパク質（〜３５〜４０ｋＤａ）のＨＥＳ化が成功すると、６０〜＞２００ｋＤａの質量分布の広いスメアバンドとして見えるようになる。

ｏｘＨＥＳ５５／０．７−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
ＨＥＳアルドン酸（ｏｘＨＥＳ）は、分子量５５ｋＤａおよびモル置換０．７のＨＥＳ（ＨＥＳ５５／０．７）のＨＥＳから開始して、国際公開第２００５／０８３１０３号パンフレットの実施例９に記載されているように合成した（該文献において、超分枝デンプン、ＨＢＳについての調製が記載されている）。

８０℃にて２日間乾燥させたｏｘＨＥＳ５５／０．７３０ｇを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６０ｍｌに溶解させて、溶液を７０℃まで加熱した。無水ＤＭＦ５０ｍｌ中の１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン２５ｇを添加して、反応混合物を７０℃にて４８時間加熱した。

ＤＭＦおよび過剰な１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンは、回転蒸発器を使用して真空中で６０〜８０℃にて除去した。残りの粗固体は、洗浄溶液に色が検出できなくなるまでアセトンで洗浄した。生成物を水５００ｍｌに溶解させて、カットオフが１００００ダルトンの膜を利用して限外濾過によって精製した。未透過物のｐＨが６〜７の値に達したときに、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を利用して９まで再調整した。この手順を４回反復した。最後に生成物を凍結乾燥させた。

ｏｘＨＥＳ５５／０．７インターフェロンα２ｂ（ＩＦＮａ）結合体の調製
実施例１で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて２４時間撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

インターフェロンα（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して組換えＤＮＡ技術によって製造した組換えヒトインターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂは１６５アミノ酸より成り、天然ヒトインターフェロンα−２ｂ（ｈＩＦＮ−ａｌｐｈａ−２ｂ）と同じアミノ酸配列を示す）を、限外濾過装置を使用して１６ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、好適な結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０）中に移した。

（Ｍ_ｗに基づいて）１０倍モル過剰のｏｘＨＥＳアルデヒドを６ｍｇ／ｍｌの反応混合物中のタンパク質濃度で使用した。ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したｏｘＨＥＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ_３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ化インターフェロンαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＱＨＰカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０であり、溶離液Ｂは、１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１６ＣＶにて０％Ｂ→５０％Ｂであった（図２）。

ｏｘＨＥＳ５５／０．７エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
実施例１で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて２４時間撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

脱保護ｏｘＨＥＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＯｘＨＥＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して（Ｍｗに基づいて）１０倍のモル過剰で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は１０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５ＭＮａＣＮＢＨ_３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を０℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣの溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ化ＥＰＯを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１０％Ｂ、２ＣＶ、２１ＣＶにて１０％Ｂ→５２％Ｂであった（図４）。

標的タンパク質のＨＥＳ結合部位は、ＩＥＸ精製ＨＥＳタンパク質結合体のペプチドマッピングによって同定した。結合体は好適なプロテアーゼ（２％エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ｐＨ８．６、３７℃、一晩）を使用して消化し、得られた断片は、ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）による逆相クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質のＨＥＳ化部位は、標的タンパク質単独の対照消化と比較したクロマトグラムの各ペプチドの還元または消失によって間接的に同定できた。

ｏｘＨＥＳ１００／１．０−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
ＨＥＳアルドン酸（ｏｘＨＥＳ）は、分子量１００ｋＤａおよびモル置換１．０のＨＥＳ（ＨＥＳ１００／１．０）のＨＥＳから開始して、国際公開第２００５／０８３１０３号パンフレットの実施例Ａに記載されているように合成した（該文献において、超分枝デンプンのＨＢＳについての調製が記載されている）。

８０℃にて２日間乾燥させたｏｘＨＥＳ１００／１．０３０ｇを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５０ｍｌに溶解させて、溶液を７０℃まで加熱した。無水ＤＭＦ６０ｍｌ中の１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン２５ｇを添加して、反応混合物を７０℃にて４８時間加熱した。

ＤＭＦおよび過剰な１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンは、回転蒸発器を使用して真空中で６０〜８０℃にて除去した。残りの粗固体は、洗浄溶液に色が検出できなくなるまでアセトンで洗浄した。生成物を水５００ｍｌに溶解させて、カットオフが１０，０００ダルトンの膜を利用して限外濾過によって精製した。未透過物のｐＨが６〜７の値に達したときに、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を利用して９まで再調整した。この手順を４回反復した。最後に生成物を凍結乾燥させた。

酸化ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα（ＩＦＮａ）結合体の調製
実施例４で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

（Ｍ_ｎに基づいて）６倍モル過剰のｏｘＨＥＳアルデヒドを８ｍｇ／ｍｌの反応混合物中の最終タンパク質濃度で使用した；ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したｏｘＨＥＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ_３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。完全に混合した後に、反応物を５℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ化インターフェロンαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＱＨＰカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０であり、溶離液Ｂは、１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１２．５ＣＶにて０％Ｂ→５０％Ｂであった（図６）。

標的タンパク質のＨＥＳ結合部位は、ＩＥＸ精製ＨＥＳタンパク質結合体のペプチドマッピングによって同定した。結合体は好適なプロテアーゼ（２％エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ｐＨ８．６、３７℃、一晩）を使用して消化し、得られた断片は、ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）による逆相クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質のＨＥＳ化部位は、標的タンパク質単独の対照消化と比較した、クロマトグラムの各ペプチドの還元または消失によって間接的に同定できた（図７）。

酸化ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
実施例４で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて２４時間インキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

脱保護したｏｘＨＥＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＯｘＨＥＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して（Ｍ_ｎに基づいて）１５倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は３．７ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は１５％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５ＭＮａＣＮＢＨ_３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ化ＥＰＯを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１０％Ｂ、２ＣＶ；２１ＣＶにて１０％Ｂ→５２％Ｂであった（図９）。

標的タンパク質のＨＥＳ結合部位は、ＩＥＸ精製ＨＥＳタンパク質結合体のペプチドマッピングによって同定した。結合体は好適なプロテアーゼ（２％エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ｐＨ８．６、３７℃、一晩）を使用して消化し、得られた断片は、ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）による逆相クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質のＨＥＳ化部位は、標的タンパク質単独の対照消化と比較した、クロマトグラムの各ペプチドの還元または消失によって間接的に同定できた。

酸化ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調製
実施例４で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩インキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

脱保護ｏｘＨＥＳアルデヒドをｒｈ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中５ｍｇ／ｍｌ。同じアミノ酸配列を有し、Ａｍｇｅｎ、Ｍuｎｃｈｅｎ、Ｄによる市販のＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）と本質的に同じ特徴を有するＥ．ｃｏｌｉによって発現されたＧ−ＣＳＦ）と合せた。ＯｘＨＥＳアルデヒドを、Ｇ−ＣＳＦ濃度に対して（Ｍ_ｎに基づいて）３０倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＧ−ＣＳＦ濃度は１．９ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５ＭＮａＣＮＢＨ_３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を０℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィー（図１１）によって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ１００／１．０−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
ＨＥＳ１００／１．０１５ｇを酢酸ナトリウム緩衝液３５ｇ（ｐＨ＝５およびｃ＝１ｍｏｌ／ｌ）に溶解させて、１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン２．０７ｍｌはもちろんのこと、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１．８８５ｇも添加した。反応混合物を６０℃にて１６〜２４時間撹拌して、水１００ｍｌで希釈し、水酸化ナトリウム希釈溶液で中和して、炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝９、ｃ＝１０ｍｍｏｌ／ｌ、４５サイクル）に対してはもちろんのこと、最後の５回の交換サイクルでは水に対しても、カットオフ１０，０００Ｄａの膜を使用する限外濾過によってワークアップした。精製および濃縮ＨＥＳ誘導体溶液（約２０重量％）は、カットオフが１０，０００Ｄａの膜を使用して６０℃の水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ＝１２）で透析した。その後、生成物を凍結乾燥によって単離した。

ＨＥＳ１００／１．０−Ｎ−（３−プロピオアルデヒド）の調製
実施例８からのＨＥＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）１０ｍｇをｐＨ＝２のＨＣｌ水溶液１００ｍｌ（ｃ＝１０ｍｍｏｌ／ｌ）に溶解して、４０℃にて１６〜２４時間撹拌した。反応混合物は、ｐＨ＝２のＨＣｌ水溶液（１０サイクル）に対してはもちろんのこと、最後の５回の交換サイクルでは水に対しても、カットオフ１０，０００Ｄａの膜を使用する限外濾過によって精製した。生成物の単離は、凍結乾燥によって実施した。

ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα（ＩＦＮａ）結合体の調製
実施例８で調製したアセタール４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

（Ｍ_ｗに基づいて）５倍モル過剰のＨＥＳアルデヒドを７ｍｇ／ｍｌの反応混合物中の最終タンパク質濃度で使用した；ＨＥＳアルデヒド濃度は１８％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したＨＥＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ_３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。完全に混合した後に、反応物を５℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ化ＩＦＮαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、２０ＣＶにて０％Ｂ→５０％Ｂであった（図１３）。

ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
実施例９からの脱保護ＨＥＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＨＥＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して（Ｍ_ｎに基づいて）４０倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は３．２ｍｇ／ｍｌであり、ＨＥＳアルデヒド濃度は３０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５ＭＮａＣＮＢＨ_３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を５℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１４）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ化ＥＰＯを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１３ＣＶにて０％Ｂ→５２％Ｂであった（図１５）。

ＨＥＳからのＨＥＳ１００／１．０顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調製
実施例９からの脱保護ＨＥＳアルデヒドをｒｈ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中５ｍｇ／ｍｌ；同じアミノ酸配列を有し、Ａｍｇｅｎ、Ｍuｎｃｈｅｎ、Ｄによる市販のＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）と本質的に同じ特徴を有するＥ．ｃｏｌｉによって発現されたＧ−ＣＳＦ）と合せた。ＨＥＳアルデヒドを、Ｇ−ＣＳＦ濃度に対して（Ｍ_ｎに基づいて）４０倍モル過剰で添加した。反応混合物の得られたＧ−ＣＳＦ濃度は１．３ｍｇ／ｍｌであり、ＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５ＭＮａＣＮＢＨ_３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合収率を決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣの溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１６）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィー（図１７）によって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣの溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＥＳ化Ｇ−ＣＳＦを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＨＰカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、溶離液Ｂは、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１５ＣＶにて０％Ｂ→４０％Ｂであった（図１８）。

マウスでの薬力学的ｉｎｖｉｖｏバイオアッセイ（実施例１１によるＨＥＳ−ＥＰＯ結合体）
ＨａｒｌａｎＷｉｎｋｅｌｍａｎｎＧｍｂＨ（Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した、体重約１８〜２０グラムのＢａｌｂＣマウスを、室温２１℃および相対湿度５５％のＥｕｒｏＳｔａｎｄａｒｄＴｙｐＩＩＩ（Ｌ×Ｂ×Ｈ４２５×２６６×１８５ｍｍ）ケージに集団で収容した（１ケージ当り最大１０匹）。「ＴａｐｖｅｉＥｉｎｓｔｒｅｕ」４×４×１ｍｍ（アスペン材）をケージの底敷き材として使用した。さらに木毛を与えた。ケージは週１回、交換および清掃した。飲用水（ｐＨ３．８〜４の硫酸）を自由に与えた。動物ケージに番号を付けた。ケージ内では、動物の耳にマークを付け、さらに色分けした。処置開始の約１週間前の割当日に、最初の検診を実施した。健康な動物のみを使用した。

実施例１１で得られたようなＨＥＳＥＰＯ結合体、未修飾開始物質（ｒＨｕＥＰＯ）およびＡｍｇｅｎによるＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）は、試料のタンパク質含有率に基づいて１００μｇ／ｋｇ体重の投薬量にて群当り４匹のマウスで、単回ボーラスの皮下容量として試験した。ビヒクル対照としての同体積のＰＢＳが含まれていた。

複数の時点（第０日、第３日、第６日、第９日、第１３日、第１６日、第２０日、および第２３日）において、全血約３０〜６０μｌの試料を尾静脈または眼球後静脈叢からＮａ−ヘパリンを含有する「Ｈａｅｍａｔｏｋｒｉｔ−Ｋａｐｉｌｌａｒｅｎ」（ＨｉｒｓｃｈｍａｎｎＬａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて採取し、ＨｅｔｔｉｃｈＨａｅｍａｔｏｃｒｉｔ２１０ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で全血を１０．０００ｒｐｍにて６分間遠心分離して、各全血試料のヘマトクリットを決定した。赤血球生成応答および期間は、時間の関数としてのヘマトクリットの機能変化［％］として監視した（図１９）。

これらのデータは、ＥＰＯ、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）またはＥＰＯ結合体を含有する試料すべてがヘマトクリットを上昇させることが可能であることを示している。Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）は開始物質と比較して効力を３〜４倍上昇させることが可能であり、ＨＥＳＥＰＯ結合体はＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）と比較して効力を１．５〜２倍上昇させることが可能であった。

マウスでの薬力学的ｉｎｖｉｖｏバイオアッセイ（実施例５によるＨＥＳ−ＩＦＮα結合体）
実施例５に従って調製した１つのｏｘＨＥＸ１００／１．０インターフェロンα結合体を、実施例１３によるｉｎｖｉｖｏアッセイで試験した。血清試料のＥＣ_５０希釈を、静脈内注射後の時間に対して片対数プロットした。半減期は、指数関数適合曲線の傾きから計算した。試料の半減期は８．９時間であった（図２０を参照）。

実施例５に従って調製したｏｘＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体の相対ｉｎｖｉｔｒｏ活性は、図２１に示すイントロンＡと比較して、図２１に示す（ｉｎｖｉｔｒｏ活性の決定に関しては、下の実施例１６を参照）。

マウスでの薬力学的ｉｎｖｉｖｏバイオアッセイ（実施例１０によるＨＥＳ−ＩＦＮα結合体）
実施例１０に従って調製した３つのＨＥＸ１００／１．０インターフェロンα結合体を、実施例１３によるｉｎｖｉｖｏアッセイで試験した。血清試料のＥＣ_５０希釈の媒体を、静脈内注射後の時間に対して片対数プロットした。半減期は、指数関数適合曲線の傾きから計算した。試料の半減期は９．７時間であった（図２２を参照）。

未修飾ＩＦＮαでは、血清の抗ウイルス活性が低すぎて血清半減期を計算できなかった。Ｋ．Ｒ．Ｒｅｄｄｙｅｔａｌ．ＡｄｖａｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ５４（２００２）ｐｐ．５７１−５８６では、ラットにおけるＩＦＮαの半減期（静脈内）は２時間と決定された。

実施例１０に従って調製した３つのＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体の相対ｉｎｖｉｔｒｏ活性は、図２３に示すイントロンＡと比較して、図２１に示す（ｉｎｖｉｔｒｏ活性の決定に関しては、下の実施例１６を参照）。

試験手順の説明：インターフェロンα（実施例１４および１５）の抗ウイルス活性
細胞培養培地での試験品目の予備希釈の後に、２倍段階希釈物を調製した。９６ウェル・マイクロタイター・プレートにおいて、希釈したインターフェロンを−１希釈物当り４個複製で−新たにトリプシン処理したＭＤＢＫ細胞に添加した（１ウェル当り４０．０００細胞）。アッセイを３７℃にて２４時間インキュベートした（１ウェル当りの総体積：１７５μｌ）。

続いて、希釈ＶＳＶ原液５０μＬを各ウェル（正の対照のウェルは除く）に添加すると、感染効率が０．１となった。

以下の対照を各アッセイに含めた：インターフェロンの代わりにウイルスおよび細胞培養培地を収容した１２ウェル（負の対照）およびインターフェロンおよびウイルスの代わりに細胞培養培地を収容した１２ウェル（正の対照）。

アッセイを３７℃にて４２時間インキュベートした。

インキュベーション期間の終りに、各ウェルの細胞培養上清をＭＴＴの溶液５０μＬ（細胞培養物中少なくとも２ｍｇ／ｍＬ）。細胞を３時間インキュベートした。増殖細胞によって形成された紫色ホルマザンは、イソプロパノール／ＨＣｌ溶液１００μＬ（４０ｍＭＨＣｌを含むイソプロパノール）を各ウェルに添加することによって可溶化した。続いて、溶液の吸収値をマイクロタイター・プレート・リーダーで５７０／６３０ｎｍにて測定した。

インターフェロンおよびＶＳＶの存在下で増殖させたＭＤＢＫ細胞の増殖活性を、インターフェロンの各希釈物について以下のように計算した：
（（インターフェロン処置ウェル４個の平均吸収）−（負の対照の平均吸収））＊１００
（正の対照の平均吸収）−（負の対照の平均吸収）

インターフェロンαの抗ウイルス活性を、試験品目それぞれの４回の別個のアッセイで決定した。

上述のアッセイ系において、各結合体ＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体（それぞれ実施例１５および１０）およびｏｘＨＥＳ１００／１．０インターフェロンα結合体（それぞれ実施例１４および５）を、未修飾ＩＮＦα開始物質、すなわちイントロンＡと比較して試験した。物質のＣＰＥ濃度を計算した。

本発明によるＨＥＳリンカ誘導体の調製
実施例１７において、本発明のＨＥＳリンカ誘導体を産生した。一方では、所与のリンカ構造に関して、ＨＥＳは平均分子量およびその分子分布について変化した。他方、所与のＨＥＳ開始物質では、リンカの化学的性質が変化した。

以下の表１および２に示したＨＥＳの量を、激しい撹拌および中程度の加熱（４０℃まで）によって、酢酸ナトリウム緩衝液（１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ＝５）（「緩衝液Ｖ」の適切な量に溶解させた。透明溶液に表示した量のリンカ（ＨＥＳ種のＭ_ｎを基準として４０当量）を添加した。いくつかの場合で、リンカの量は「ＤＭＦリンカ」溶液として添加される。したがって、必要量のリンカを少量のＤＭＦに溶解させて、表２に「ＤＭＦリンカ溶液Ｖ」として示す、生じた透明ＤＭＦリンカ溶液を反応混合物に添加した。最後に、ＮａＣＮＢＨ_３量として示された固体ＮａＣＮＢＨ_３を撹拌溶液に溶解させると、通例０．６Ｍの最終濃度が得られ、反応混合物を加熱して６０℃にて１８〜２４時間撹拌した。

反応物をワークアップするために、混合物を超純水によって希釈して、最終濃度約１００ｍｇ／ｍｌ（１０％ｍ／Ｖ）ＨＥＳ誘導体を得て、カットオフが１０ｋＤａの膜および溶媒としての超純水を使用して限外濾過（ＵＦ）または透析（Ｄ）のどちらかによって精製した。リンカ（ａ２）および（ａ３）の場合、１０ｍＭＮＨ_４ＨＣＯ_３緩衝液、ｐＨ＝９と、それに続く超純水を限外濾過に使用した。

続いての脱保護では、精製ＨＥＳ誘導体溶液（１０％、１００ｍｇ／ｍｌ）を濃ＨＣｌ溶液によって酸性化して、適切な「ｐＨレベル」の「ｃ（ＨＣｌ）」を得た。混合物を撹拌して、４０℃にて反応時間「ｔ」にわたって加熱して、その後、中和して（ＮａＯＨ希釈）、適切な「ワークアップ溶媒」を使用して限外濾過（膜カットオフ１０ｋＤａ）によってワークアップし、最後に凍結乾燥して、白色から黄色がかった粉末を得た。

誘導体化は、標的分子（ケンプチド、以下の実施例１８、表３、４、および５を参照）への結合の成功によって検証された。リンカ（ａ１５）および（ａ１０）を使用して調製したＨＥＳ誘導体では、誘導体化の成功はスペクトル特性によって確認した。上述のように調製したＨＥＳ誘導体すべてを、実施例１８で表３、４、および５に挙げた標的への結合に使用した。

表１および２で使用した省略形
Ｄ透析
ＤＭＦジメチルホルムアミド
ＨＥＳヒドロキシエチルデンプン
ＨＣｌ塩酸
ＮａＣＮＢＨ_３シアノ水素化ホウ素ナトリウム
ＮａＯＨ水酸化ナトリウム
ＵＦ限外濾過
Ｖ体積
Ｗａｔｅｒ超純水（ｍｉｌｌｉＱ）

ＨＥＳ１００／１．０およびリンカ構造（ａ２）のＨＥＳ誘導体は、本発明の実施例８および９に従って調製した。リンカ構造（ａ２）は、上で定義したような構造（ａ２）に、すなわち１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンに関する。

本発明によるＨＥＳリンカ生物活性剤誘導体の調製
以下の表３、４、および５に示すような標的分子の量を適切な反応緩衝液中に移した。ＨＥＳリンカ誘導体の表示量（リンカおよびＨＥＳ種によって定義）を反応緩衝液に溶解させて、標的物質溶液と混合した。ＮａＣＮＢＨ_３を−通例、反応緩衝液中の新たに調製した０．５Ｍ原液として−通例２０ｍＭの最終濃度まで添加した。反応混合物を温度制御下で、温度「ｒｘｎＴ」にて反応時間「ｒｘｎｔ」にわたってインキュベートした。

最終反応体積（「ｒｘｎＶ」）ならびに反応物質の得られた濃度および比を表３、４、および５に示す。

結合反応が成功したことは、クロマトグラフィー分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（選択した誘導体について図２８〜３３）によって示された。本明細書に記載したすべての結合反応において、標的ＨＥＳ結合体が検出可能であった。各種の標的分子の反応条件は最適化されなかった。

使用した省略形
ｒｈＩＦＮα：組換えヒトインターフェロンα２ｂ
ｒｈＥＰＯ：組換えヒトエリスロポエチン
ｒｈＧ−ＣＳＦ：追加のＮ末端メチオニンを含む組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子
ｒｈＦＩＸ：組換えヒト凝固第ＩＸ因子
ｒｈＦＶＩＩａ：組換えヒト凝固第ＶＩＩａ因子
ｒｈＧＨ：組換えヒト成長ホルモン
ｈＦａｂ：ヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片
ｍＩｇＧ：マウス免疫グロブリンＧ
ＧＬＰ−１：グルカゴン様ペプチド−１；アミノ酸１〜３７
ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ：Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えアスパラギナーゼ
ＮＨ_２−ＤＮＡ：配列ＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＴを有する５’−アミノヘキシルスペーサ持つオリゴヌクレオチド
ｒｈＬｅｐｔｉｎ：組換えヒトレプチン
ＡｍｐｈｏＢ：アンホテリシンＢ、ＣＡＳＮｏ．１３９７−８９−３
Ｋｅｍｐｔｉｄｅ：Ｔｒｐ^４−ケンプチド（Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）、ＣＡＳＮｏ．８０２２４−１６−４
ＮａＯＡｃ：酢酸ナトリウム含有緩衝液
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、ＣＡＳＮｏ．７３６５−４５−９

追加データ
（Ａ．１）ＨＢＳ７ｋＤａからのｏｘＨＢＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）の調製
超分枝デンプン（ＨＢＳ）アルドン酸は、国際公開第２００５／０８３１０３号パンフレットの実施例９に従って、超分枝デンプン（Ｍ_ｗ＝７０００ダルトン（７ｋＤａ）、平均分枝度：１５ｍｏｌ％）から開始して合成した。得られたアルドン酸を８０℃にて２４時間乾燥することによって、対応するラクトンに変換した（省略形「ｏｘＨＢＳ」は、ＨＢＳアルドン酸はもちろんのこと、対応するラクトンも指す）。

ラクトン５ｇを１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン１５ｍｌおよび無水ＤＭＦ１０ｍｌに溶解させて、７０℃にて４８時間撹拌した。過剰な１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンおよびＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）を真空下で蒸発させて、得られた薄黄色固体を黄色が消えるまでアセトンで洗浄した。生成物を水に溶解させて、濾液のｐＨが＞６の値に達するまでカットオフが１０００ダルトンの膜を利用する限外濾過によって精製した。

未透過物を酸性カチオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）１２０）２ｇによって処理して、樹脂を濾過し、残りの溶液を凍結乾燥させた。

化合物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは１．７ｐｐｍに三重項を、１．２ｐｐｍに多重項を示し、リンカ化合物（１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパン）の残基の窒素原子に対するα位のメチル基およびメチレン基を提示する。

（Ａ．２）ｏｘＨＢＳ７ｋＤａ−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合体の調製
（Ａ．１）で調製したアセタール７５０μｇを０．０１ＮＨＣｌに溶解させた。ｐＨを１ＮＨＣｌで２．０に調整して、反応混合物を２１℃にて１８時間撹拌した。酢酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０）中の１％ＢＳＡ溶液２ｍｌを、先に調製した混合物２００μｌに添加した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム１４０ｍｇを０．１Ｎ酢酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０）０．５ｍｌに溶解させて、分割量５０ｍｌを反応混合物にただちに添加した。反応混合物を４℃で１５時間貯蔵した。サイズ排除クロマトグラフィーによる反応混合物の分析によって、９０％のＨＢＳ−ＢＳＡ結合体の反応収率が明らかになった。（図２４）

（Ａ．３）ｏｘＨＢＳ６５ｋＤａ−インターフェロンα結合体の調製
（Ａ．１）と同様に調製した６５ｋＤａＨＢＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、濃度４０％（ｗ／ｖ）およびｐＨ値２の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、結合前に０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

インターフェロンα（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して組換えＤＮＡ技術によって製造した組換えヒトインターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂは１６５アミノ酸より成り、天然ヒトインターフェロンα−２ｂ（ｈＩＦＮ−ａｌｐｈａ−２ｂ）と同じアミノ酸配列を示す）は、限外濾過装置を使用して１６ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、好適な結合緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０）中に移した。

（Ｍ_ｗに基づいて）１０倍モル過剰のｏｘＨＢＳアルデヒドを６ｍｇ／ｍｌの反応混合物中の最終タンパク質濃度で使用した；ｏｘＨＥＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。脱保護したｏｘＨＢＳアルデヒドをタンパク質溶液と合せて、新たに調製したＮａＣＮＢＨ_３溶液（結合緩衝液中０．５Ｍ）の添加によって還元的アミノ化を開始して、２０ｍＭの還元剤の最終濃度を得た。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２５）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィーによって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

ＨＢＳ−インターフェロンαを未反応化合物から、Ａｅｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＱＨＰカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによって分離した。溶離液Ａは、１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．０であり、溶離液Ｂは、１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。結合体および未修飾タンパク質の分離のための勾配は、１６ＣＶにて０％Ｂ→５０％Ｂであった（図２６）。

（Ａ．４）ｏｘＨＢＳ６５エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の調製
（Ａ．１）と同様に調製した６５ｋＤａＨＢＳ−Ｎ−（３−プロピオアルデヒドジエチルアセタール）４００ｍｇに、適切な量の１０ｍＭＨＣｌを添加して、濃度４０％（ｗ／ｖ）の溶液を得た。溶液を２１℃にて一晩撹拌しながらインキュベートして、アルデヒド官能基を脱保護した。ｐＨ値は、０．１ＭＮａＯＨの添加によって結合緩衝液で使用する値まで調整した。

脱保護ｏｘＨＢＳアルデヒドをＥＰＯ（ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）（ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）またはＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）と本質的に同じ特徴を有する組換えヒトＥＰＯ）溶液（反応緩衝液の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中１０ｍｇ／ｍｌ）と合せた。ＯｘＨＢＳアルデヒドを、ＥＰＯ濃度に対して２０倍のモル過剰（Ｍ_ｗに基づいて）で添加した。反応混合物の得られたＥＰＯ濃度は４．６ｍｇ／ｍｌであり、ｏｘＨＢＳアルデヒド濃度は２０％（ｗ／ｖ）であった。還元的アミノ化反応は、還元剤２０ｍＭの最終濃度を得るために反応緩衝液中で作製した０．５ＭＮａＣＮＢＨ_３溶液の添加によって開始した。完全に混合した後に、反応物を１０℃にて一晩インキュベートした。

反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２７）およびＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ）での逆相クロマトグラフィー（図Ａ．４−１）によって分析して、結合が成功したことを検証して、結合収率を決定した。溶離は、０．１％ＴＦＡを含む酸性水／アセトニトリル勾配を使用して実施した。

Claims

ヒドロキシアルキルデンプン誘導体を調製する方法であって、
（ｉ）式（Ｉ）

（Ｉ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）を、このＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ^＊を介して、式（ＩＩ）

（ＩＩ）
で示す架橋化合物のアミノ基Ｍと反応させるステップ
（Ａは、アセタール基またはケタール基であり、Ｌは、ＭとＡを架橋するスペーサであり、またＣ^＊は、前記ＨＡＳのＭとの反応の前に場合によっては酸化される）と、
式（ＩＩＩ）

（ＩＩＩ）
に示すＨＡＳ誘導体を得るステップ
（Ｘは、前記場合によっては酸化されるＨＡＳの還元末端の炭素原子Ｃ^＊を介したアミノ基ＭとＨＡＳとの反応から生じた官能基であり、
ＨＡＳ’が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基である）と
を含む方法。
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ基であり、ｎが整数、好ましくは０、１、２、３、４、５または６である請求項１に記載の方法。
前記ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である請求項１または２に記載の方法。
Ａが式（ＩＩａ）

（ＩＩａ）
に示す残基である
（Ｚ_１およびＺ_２がそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲ_ｘ、好ましくはＯであり、Ｒ_ｘが、Ｈまたはメチル、エチルもしくはｎ−プロピルもしくはｉ−プロピルなどのプロピルなどの低級アルキル、またはＣ（Ｏ）−Ｒ_ｙであり、Ｒ_ｙが、好ましくはＣ_１−Ｃ_６アルキルおよびＣ_６−Ｃ_１４アリールからなる群よりは選択され、より好ましくは場合により置換され、好ましくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択され、Ｒ_ｘが好ましくはＨであり、
Ａ_１およびＡ_２がそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、もしくはエトキシベンジルであるか、または式（ＩＩｂ）

（ＩＩｂ）
（Ａ_１およびＡ_２がひとまとめにされて、−（ＣＨ_２）_２−または−（ＣＨ_２）_３−または−（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−であり）
に示す環を形成し、
Ａ_３が、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであるか、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、Ａ_３が好ましくはＨである）
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
Ｚ_１およびＺ_２がＯであり、Ａ_３がＨであり、Ａ_１およびＡ_２がそれぞれエチルであるか、またはＡ_１およびＡ_２が式（ＩＩｂ）による環を形成して、Ａ_１およびＡ_２がひとまとめにされて−（ＣＨ_２）_２−である請求項４に記載の方法。
前記アミノ基Ｍが式（ＩＩｃ）

（ＩＩｃ）
による基であり、
Ｙが、存在しないか、または

からなる群より選択される化学部分であるかのどちらかであり、Ｇが、ＯまたはＳまたはＮＨであり、２個存在する場合には、各Ｇが独立して、ＯまたはＳまたはＮＨであり、Ｏが好ましく、
Ｒ’が、Ｈまたはヒドロキシ基またはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、および置換アルキルアリールからなる群より選択される有機残基である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記アミノ基Ｍが、Ｈ_２Ｎ−、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、Ｈ_３Ｃ−ＮＨ−またはＨ_３Ｃ−ＮＨ−Ｏ−、好ましくはＨ_２Ｎ−、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）のステップにおいて、ＨＡＳがその酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ_２Ｎ−である前記アミノ基Ｍと反応して、前記反応が０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）のステップにおいて、ＨＡＳが、好ましくは水性系において、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物のＨ_２Ｎ−である前記アミノ基Ｍと反応して、前記反応が４〜７の範囲のｐＨにて２０〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ⁻である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）のステップにおいて、前記反応が、ＨＡＳ誘導体を得るために還元剤、好ましくはＮａＣＮＢＨ_３の存在下で実施され、Ｘが−ＣＨ_２−ＮＨ−である請求項９に記載の方法。
（ｉ）のステップにおいて、ＨＡＳが、好ましくは水性系において、その非酸化還元末端を介して架橋性化合物Ｈ_２Ｎ−Ｏ−またはＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である前記アミノ基Ｍと反応して、前記反応が４．５〜６．５の範囲のｐＨにて５〜８０℃の範囲の温度で実施され、Ｘが−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−または−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）

（ＩＩｄ）
による少なくとも１個の構造単位を含む、好ましくは式（ＩＩｄ）による構造単位からなるスペーサであり、
Ｌ_１およびＬ_２が、それぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”（Ｒ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択され）からなる群より選択される有機残基、好ましくはＨまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基、さらに好ましくはＨまたはアルキル、さらに好ましくはＨであり、
ｎが、１〜２０の、好ましくは１〜１０の、さらに好ましくは１〜６の、さらに好ましくは１〜４の、さらに好ましくは２の整数である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
Ｌが、−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、ｎが１〜２０の整数であり、好ましくは１〜１０の整数であり、さらに好ましくは、Ｌが、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
Ｌが、少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ２−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ２を含み、ｎ１は、ｎ２と等しいか又はｎ２とは異なり、前記スペーサＬが、−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−を介して架橋性化合物の前記アミノ基Ｍに結合される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
Ｌが−（（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ｏ）_ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）−であり、好ましくは−（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−であり、ｍが１、２または３であり、さらに好ましくは２または３である請求項１４に記載の方法。
Ｌが−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−であり、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立して、好ましくは１〜４の範囲、さらに好ましくは１〜３の範囲である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
Ｌが、−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−、−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−、−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−、および−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−からなる群より選択され、最も好ましくは、−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−および−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−からなる群より選択される請求項１６に記載の方法。
式（ＩＩ）による架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａが、
Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_７−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２およびＨ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２からなる群より選択され、好ましくは、
Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２からなる群より選択され、さらに好ましくは、
Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２および、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_２からなる群より選択される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
式（ＩＩ）による前記架橋化合物Ｍ−Ｌ−Ａが１−アミノ−３，３−ジエトキシプロパンである請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）によるＨＡＳ誘導体を生物活性剤Ｈ_２Ｎ−ＢＡ’のアミノ基と、Ａ基を介して、還元的アミノ化によって反応させて、式（ＩＶ）

（ＩＶ）
の前記ＨＡＳ誘導体を得るステップをさらに含む請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（ｉｉ）のステップの前に、式（ＩＩＩ）による前記ＨＡＳ誘導体のＡ基が前記対応するアルデヒドまたはケト基に変換される請求項２０に記載の方法。
（ｉｉ）のステップにおいて、前記反応が好ましくは水性系にて、還元剤、好ましくはＮａＣＮＢＨ_３の存在下で、０〜３７℃、好ましくは０〜２５℃の範囲の温度および３〜９、好ましくは３〜７、さらに好ましくは３〜７以下の範囲のｐＨにて実施され、および（ｉｉ）のステップにおいて、前記ＨＡＳ誘導体の生物活性剤ＢＡに対する前記モル比が、前記ＨＡＳ誘導体の数平均分子量（Ｍ_ｎ）に基づいて、０．１：１〜２００：１当量、好ましくは１：１〜５０：１当量である請求項２０または２１に記載の方法。
前記生物活性化合物ＢＡが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質の機能性誘導体、断片またはミメティック、小型分子化合物またはオリゴヌクレオチドである請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
前記タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ）、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈＬｅｐｔｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、または他のタンパク質骨格である請求項２３に記載の方法。
式（ＩＩＩ）

（ＩＩＩ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体であって、
Ａが、アセタールまたはケタール基であり、Ｌが、ＸおよびＡを架橋するスペーサであり、
Ｘが、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
で示す架橋性化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）

（Ｉ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによるＨＡＳの炭素原子Ｃ^＊を介した反応から生じる官能基であり、Ｃ^＊が、ＨＡＳとＭとの反応の前に場合によっては酸化され、
ＨＡＳ’が、前記ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基であるＨＡＳ誘導体。
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ基であり、ｎが整数、好ましくは０、１、２、３、４、５または６である請求項２５に記載のＨＡＳ誘導体。
前記ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である請求項２５または２６に記載のＨＡＳ誘導体。
Ａが式（ＩＩａ）

（ＩＩａ）
で示す残基であり、
Ｚ_１およびＺ_２がそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲ_ｘ、好ましくはＯであり、Ｒ_ｘが、Ｈまたはメチル、エチルまたはｎ−プロピルもしくはｉ−プロピルなどのプロピルなどの低級アルキル、またはＣ（Ｏ）−Ｒ_ｙであり、Ｒ_ｙが、好ましくはＣ_１−Ｃ_６アルキルおよびＣ_６−Ｃ_１４アリールからなる群より選択され、さらに好ましくは場合により置換された、好ましくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択され、Ｒ_ｘが好ましくはＨであり、
Ａ_１およびＡ_２がそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであるか、または式（ＩＩｂ）

（ＩＩｂ）
（Ａ_１およびＡ_２がひとまとめにされて、−（ＣＨ_２）_２−または−（ＣＨ_２）_３−または−（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−である）
による環を形成し、
Ａ_３が、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであるか、またはアミノ基ＭのＮ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、Ａ_３が好ましくはＨである請求項２５〜２７に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｘが、ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−からなる群より選択され、好ましくは−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−および−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−からなる群より選択される請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）

（ＩＩｄ）
で示す少なくとも１個の構造単位を含む、好ましくは式（ＩＩｄ）による構造単位からなるスペーサであり、
Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”（Ｒ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択される）からなる群より選択される有機残基であり、好ましくはＨまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基であり、さらに好ましくはＨまたはアルキルであり、さらに好ましくはＨであり、
ｎが、１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜４、さらに好ましくは２の整数である請求項２５〜２９に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、ｎが１〜２０、好ましくは１〜１０の整数であり、さらに好ましくはＬが−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である請求項３０に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ２−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ２を含み、ｎ１は、ｎ２と等しいかまたは異なり、おおびスペーサＬが、−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−を介して前記架橋性化合物の前記アミノ基Ｍに結合される請求項３０に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが−（（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ｏ）_ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）−、好ましくは−（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−であり、ｍが１、２または３であり、さらに好ましくは２または３である請求項３１に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立して、好ましくは１〜４の範囲、さらに好ましくは１〜３の範囲である請求項３０に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが、
−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−、−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−、−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−、および−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−、からなる群より選択され、さらに好ましくは
−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−、および−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−からなる群より選択される請求項３４に記載のＨＡＳ誘導体。
構造式

を有する請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
構造式

を有する請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
式（ＩＶ）

（ＩＶ）
で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）誘導体であって、
Ｘが、アミド基−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ではなく、
Ｘが、式（ＩＩ）
Ｍ−Ｌ−Ａ（ＩＩ）
で示す架橋性化合物のアミノ基Ｍと、式（Ｉ）

で示すヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とによる前記ＨＡＳの炭素原子Ｃ^＊を介した反応から生じる官能基であって、Ｃ^＊が、前記ＨＡＳとＭの反応の前に場合によっては酸化され、最も好ましくは酸化されず、
ＨＡＳ’が、前記ヒドロキシアルキルデンプン分子の残部であり、ならびにＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素または直鎖もしくは分枝ヒドロキシアルキル基であり、
Ａが、式（ＩＩａ）

（ＩＩａ）
で示す残基であり
Ｚ_１およびＺ_２がそれぞれ独立して、ＯまたはＳまたはＮＲ_ｘ、好ましくはＯであり、Ｒ_ｘが、Ｈまたはメチル、エチルまたはｎ−プロピルもしくはｉ−プロピルなどのプロピルなどの低級アルキルまたはＣ（Ｏ）−Ｒ_ｙであり、Ｒ_ｙが、好ましくはＣ_１−Ｃ_６アルキルおよびＣ_６−Ｃ_１４アリールからなる群よりは選択され、さらに好ましくは場合により置換された、好ましくは非置換であるメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルからなる群より選択され、Ｒ_ｘが好ましくはＨであり、
Ａ_１およびＡ_２がそれぞれ独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、１，１，１−トリクロロエチル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、エトキシベンジルであるか、または式（ＩＩｂ）

（ＩＩｂ）
（Ａ_１およびＡ_２がひとまとめにされて、−（ＣＨ_２）_２−または−（ＣＨ_２）_３−または−（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−である）
で示す環を形成し、
Ａ_３が、Ｈもしくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ベンジルであるか、または前記アミノ基Ｍの前記Ｎ原子もしくはＬに含まれる好適な原子と共に環を形成し、Ａ_３が好ましくはＨであり、
Ｌが、ＭおよびＡを架橋するスペーサであり、
ＢＡ’が、ＢＡのアミノ基と、ＡとまたはＡに対応するアルデヒド基またはケト基とによる還元的アミノ化を介した反応後に残存する生物活性剤ＢＡ’−ＮＨ_２の残部であるＨＡＳ誘導体。
Ｘが、−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、および−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−からなる群より選択され、より好ましくは−ＣＨ_２−ＮＨ−および−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−からなる群より選択され、最も好ましくは−ＣＨ_２−ＮＨ−からなる群より選択される請求項３８に記載のＨＡＳ誘導体。
ＭおよびＡを架橋するＬが、式（ＩＩｄ）

（ＩＩｄ）
で示す少なくとも１個の構造単位を含む、好ましくは式（ＩＩｄ）による構造単位からなるスペーサであり、
Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、および残基−Ｏ−Ｒ”（Ｒ”は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリールからなる群より選択される）からなる群より選択される有機残基であり、好ましくはＨまたはアルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される有機残基であり、さらに好ましくはＨまたはアルキルであり、さらに好ましくはＨであり、
ｎが、１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜４、さらに好ましくは２の整数である請求項３８または３９に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、ｎが１〜２０、好ましくは１〜１０の整数であり、さらに好ましくは、Ｌが−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である請求項４０に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが少なくとも１個の構造単位−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ２−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ１−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ２を含み、ｎ１が、ｎ２と等しいかまたは異なり、およびスペーサＬが、−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ１−を介して架橋性化合物のアミノ基Ｍに結合される請求項４０に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが−（（ＣＬ_１Ｌ_２）_２−Ｏ）_ｍ−（ＣＬ_１Ｌ_２）−、好ましくは−（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−であり、ｍが１、２または３であり、さらに好ましくは２または３である請求項４２に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＬ_１Ｌ_２）_ｎ−、好ましくは−（ＣＨ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、各ｎがそれぞれ独立して、好ましくは１〜４の範囲、さらに好ましくは１〜３の範囲である請求項４０に記載のＨＡＳ誘導体。
Ｌが、
−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−、−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−、−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−、および−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−からなる群より選択され、最も好ましくは
−（ＣＨ_２）_３−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−および−（ＣＨ_２）_２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−からなる群より選択される請求項４４に記載のＨＡＳ誘導体。
構造式

を有する請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
前記生物活性化合物ＢＡが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質の機能性誘導体、断片またはミメティック、小型分子化合物またはオリゴヌクレオチドである請求項３８〜４６のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
前記タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、例えば組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）などのＧ−ＣＳＦ、インターフェロン（ＩＮＦ）、例えば組換えヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮα）または組換えヒトＩＦＮβ（ｒｈＩＦＮβ）などのＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮガンマ、第ＶＩＩ因子、例えば組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）、第ＩＸ因子、例えば組換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ）、成長ホルモン（ＧＨ、例えば組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、Ｆａｂ断片、例えばヒト免疫グロブリンＧ分子に由来するＦａｂ断片（ｈＦａｂ）、免疫グロブリンＧ、例えばマウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、アスパラギナーゼ、例えば組換えアスパラギナーゼ（ｒアスパラギナーゼ）、レプチン、例えば組換えヒトレプチン（ｒｈレプチン）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、α−１−アンチトリプシン、抗体、または抗体断片、または他のタンパク質骨格である、請求項４７に記載のＨＡＳ誘導体。
治療または予防剤としての請求項３８〜４８のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
ヒトまたは動物の体を治療する方法で使用するための請求項３８〜４８のいずれか一項に記載のＨＡＳ誘導体。
請求項３８〜４８のいずれか一項に記載のＨＡＳを治療的有効量で含む製薬組成物。