JP2006505635A - ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法 - Google Patents

ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法であって、該ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
【化１】
Figure 2006505635

の構造を有し、式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化合物（Ｌ）と反応するステップ、または式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端での化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物（Ｌ）と反応するステップを含んでなり、前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらに、化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、およびチオ基からなる群から選択される、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法に関する。本発明は、さらに、このようなヒドロキシアルキルデンプン誘導体およびヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む薬学的組成物に関する。

Description

本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体、詳細には、ヒドロキシアルキルデンプンを架橋化合物の第一級アミノ基もしくは第二級アミノ基または２つの架橋化合物と反応させるプロセスによって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを有し、この官能基Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基である、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを架橋化合物の第一級または第二級アミノ基と反応させ、得られた反応生成物を、必要に応じて（オプショナリー）第２の架橋化合物とさらに反応させ、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを有し、この基Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基であり、得られた反応生成物を、ポリペプチド、好ましくはＡＴ ＩＩＩ、ＩＦＮ−β、またはエリスロポエチンなどのポリペプチド、特に好ましくはこれらの官能基Ｙの少なくとも１つを含むエリスロポエチンと反応させるプロセスによって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンである。本発明によれば、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンを、リンカー化合物と必要に応じて反応前に酸化されたその還元末端で反応させる。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であり、体内でα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、トウモロコシデンプン中に最大９５重量％の濃度で存在する炭水化物高分子アミロペクチンの置換誘導体である。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、血液容量置換剤（ｂｌｏｏｄ ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）として、およびクリニックでの血液希釈療法で使用されている（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８；およびＷｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８）。
アミロペクチンは、主鎖中にα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐部位にα−１，６−グリコシド結合が見出されるグルコース部分からなる。この分子の物理化学的性質は、主に、グリコシド結合の型によって決定される。α−１，４−グリコシド結合に切れ目が存在するために、ターンあたり約６つのグルコース単量体を有するヘリックス構造が得られる。このポリマーの物理化学的性質および生化学的性質を、置換によって改変することができる。アルカリヒドロキシエチル化によってヒドロキシエチル基を導入する。反応条件の適応により、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコース単量体中の各水酸基の異なる反応性を活用することが可能である。この事実により、当業者は、限られた範囲内で置換パターンに影響を与えることができる。
ヒドロキシエチルデンプン誘導体のいくつかの製造方法が当分野で説明されている。
ドイツ特許第２６１６０８６号は、第１の工程で、架橋剤（例えば、ブロモシアン）をヒドロキシエチルデンプンと結合させ、その後ヘモグロビンを中間生成物と結合させる、ヘモグロビンのヒドロキシエチルデンプンとの接合（コンジュゲイション）を開示する。
ＨＥＳが使用される１つの重要分野は、例えば、特定の生理学的効果を得るために循環系に適用されるポリペプチドの確立である。これらのポリペプチドの１つの具体例は、赤血球の循環レベルの調節に不可欠な約３４，０００ｋＤの酸性糖タンパク質であるエリスロポエチンである。
ポリペプチドおよび酵素の適用における周知の問題は、これらのタンパク質はしばしば不満足な安定性を示すという点である。特に、エリスロポエチンは、血漿半減期が比較的短い（Ｓｐｉｖａｋ ａｎｄ Ｈｏｇａｎｓ，１９８９，Ｂｌｏｏｄ ７３，９０；ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ ７６，１７１８）。これは、治療血漿レベルが急速に減少し、静脈投与を反復して行わなければならないことを意味する。さらに、一定の環境では、ペプチドに対する免疫応答が認められる。
ポリペプチドを高分子とカップリングした場合に、ポリペプチドの安定性を改良することができ、これらのポリペプチドに対する免疫応答が減少することが一般に認められる。ＷＯ９４／２８０２４号は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾した生理学的に活性なポリペプチドは、免疫原性および抗原性が減少し、非接合タンパク質よりもかなり長く血液中で循環する（すなわち、クリアランス速度がより長い）ことを開示する。しかし、ＰＥＧ−薬物接合体は、いくつかの欠点を示す（例えば、インビボ分解経路のエレメントが認識することができる天然の構造を示さない）。したがって、ＰＥＧ接合体以外の他の接合体およびタンパク質ポリマーが産生される。異なるタンパク質および高分子（ポリメラーゼなど）の複数の架橋方法が文献に記載されている（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３，ＣＲＣＳ，Ｉｎｃ．を参照）。
まとめると、安定性および／または生物活性が改良されたさらなる改良ポリペプチドが依然として必要である。これを、特に、エリスロポエチンに適用して高シアル酸とイソ型形成させ、それにより低シアル酸のイソ型から高活性で精製される（欧州特許第０４２８２６７Ｂ１号を参照）。したがって、大規模精製を必要とせずに高活性ポリペプチドが得られる製造方法が利用可能な場合、非常に有利である。不運なことに、しばしばポリペプチドが適切に折りたたまれた天然の高次構造で生成されずに適切なグリコシル化を欠くので、細菌または昆虫細胞中でのポリペプチドの生成はしばしば困難である。
ＷＯ０２／０８０７９Ａ２号は、活性成分およびヒドロキシアルキルデンプンが直接結合しているかリンカー化合物を介して結合している活性成分とヒドロキシアルキルデンプンとの接合体を含む化合物を開示する。直接結合を考慮する限り、少なくとも１０重量％の水を含む水性媒体で活性成分とヒドロキシアルキルデンプンとの反応を行う。活性成分中に含まれるカルボキシル基と結合したヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する例は記載されておらず、アルデヒド基またはケト基やアセタール基またはヘミアセタール基との例もない。
したがって、本発明の目的は、官能基としてチオ基、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、またはアセタール基を含むさらなる化合物（例えば、ポリペプチド）と化学結合を形成することができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することにある。好ましくは、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、またはアセタール基は、さらなる化合物の炭水化物部分に含まれる。
したがって、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法において、該ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
Figure 2006505635
 の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化合物（Ｌ）と反応するステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物（Ｌ）と反応するステップとを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法に関する。
本発明の文脈では、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」（ＨＡＳ）は、少なくとも１つのヒドロキシアルキル基に置換されたデンプン誘導体をいう。したがって、本発明で使用される、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」は、末端炭水化物部分がヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2、および／またはＲ3（簡単にするために式（Ｉ）中にこのように示す。）を含む化合物に限定されないが、末端炭水化物部分および／またはデンプン分子の残りの部分のどこかに存在する少なくとも１つの水酸基がヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2、またはＲ3に置換された化合物（ＨＡＳ’）をいう。
この文脈では、アルキル基は、適切に置換することができる直鎖または分岐状アルキル基であり得る。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、１〜１０個の炭素原子、より好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子、さらにより好ましくは２〜４個の炭素原子を含む。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプンを含むことが好ましいが、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましい。
２以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまた本発明に含まれる。
ＨＡＳ中に含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は、２以上の水酸基を含み得る。好ましい実施形態によれば、ＨＡＳ中に含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は、１つの水酸基を含む。
表現「ヒドロキシアルキルデンプン」には、アルキル基が一置換または多置換された誘導体も含まれる。この文脈では、ＨＡＳが水溶性を維持する場合、アルキル基がハロゲン基、詳細にはフッ素またはアリール基で置換されることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキル基の末端水酸基をエステル化またはエーテル化してもよい。
さらに、アルキルの代わりに、直鎖または分岐置換または非置換アルケン基を使用することもできる。
ヒドロキシアルキルデンプンは、デンプンのエーテル誘導体である。エーテル誘導体に加えて、本発明の文脈では、他のデンプン誘導体を使用することもできる。例えば、エステル化水酸基を含む誘導体が有用である。これらの誘導体は、例えば、２〜１２個の炭素原子を有する非置換モノまたはジカルボン酸の誘導体またはその置換誘導体であり得る。２〜６個の炭素原子を有する非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸誘導体が特に有用である。この文脈では、アセチルデンプン、ブチルデンプン、およびプロピルデンプンが好ましい。
さらに、２〜６個の炭素原子を有する非置換ジカルボン酸誘導体が好ましい。
ジカルボン酸誘導体の場合、ジカルボン酸の第２のカルボキシル基もエステル化されていることが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステル誘導体も本発明の文脈で適切である。
置換モノまたはジカルボン酸のために、置換基は、好ましくは置換アルキル残基について上記と同一のものであり得る。
デンプンのエステル化技術は当分野で公知である（例えば、Ｋｌｅｍｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｃｈａｐｔｅｒ ４．４，Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＩＳＢＮ ３−５２７−２９４８９−９）を参照）。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明の全ての実施形態で最も好ましい。
したがって、本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである上記方法に関する。
ＨＥＳは、主に、分子量分布および置換度によって特徴付けられる。置換度を以下の２つで記載することが可能である。
１．置換度は、全てのグルコース部分（ＤＳ）に関して置換グルコース単量体部分に対して相対的に記載することができる。
２．置換度は、グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基数を記載する、「モル置換」（ＭＳ）として記載することができる。
ＨＥＳ溶液は、重合度、分岐部位の数およびパターン、ならびに置換パターンに関して各分子が他と異なる多分散系組成物として存在する。したがって、ＨＥＳは、異なる分子量の化合物の混合物である。したがって、特定のＨＥＳ溶液は、統計的平均を使用した平均分子量によって決定される。この文脈では、分子数に依存する相加平均としてＭnを計算する。あるいは、Ｍw（重量平均）は、ＨＥＳの質量に依存する単位を示す。
本発明の文脈では、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量（重量平均）は、１〜３００ｋＤａであってよく、平均分子量５〜１００ｋＤａがより好ましい。ヒドロキシエチルデンプンは、さらに、ヒドロエチル基に関して０．１〜０．８のモル置換度およびＣ2：Ｃ6置換比は２〜２０の範囲であり得る。
式（Ｉ）の残基Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3を考慮する限り、化合物（Ｉ）が化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）と反応可能なままであるならば特に制限されない。好ましい実施形態によれば、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、独立して、水素または１〜１０個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基、またはヒドロキシアルカリール基である。水素および１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基が好ましい。アルキル基、アリール基、アラルキル基、および／またはアルカリール基は直鎖または分岐鎖であってよく、適切に置換されていてもよい。
したがって、本発明は、また、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水素または１〜６個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である上記方法に関する。
このように、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、ヒドロキヘキシル基、ヒドロキペンチル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシプロピル基（１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、１−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基など）、ヒドロキシエチル基（１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基など）、またはヒドロキシメチル基であり得る。水素およびヒドロキシエチル基が好ましく、水素および２−ヒドロキシエチル基が特に好ましい。
したがって、本発明は、また、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である上記方法に関する。
本発明によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）中にＺ1基が含まれる、官能基Ｚ1と還元末端との反応を介してヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
本発明の第１の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させるが、還元末端は反応前に酸化されている。
この還元末端の酸化により、末端炭水化物基がラクトン基を含むか、末端炭水化物基が、化学反応条件および／または酸化剤に依存して、カルボキシル基を含む非環式構造を有するヒドロキシアルキルデンプンが誘導される。
本発明の１つの実施形態によれば、その還元末端が酸化されたヒドロキシアルキルデンプンは、ラクトン基を含む化合物とカルボキシル基を含む化合物との混合物として存在する。混合物中で、各化合物は、任意の考え得る比で存在し得る。
したがって、本発明は、また、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前にヒドロキシアルキルデンプンの還元末端を酸化させるため、前記ヒドロキシアルキルデンプンが式（ＩＩａ）：
Figure 2006505635
 および／または式（ＩＩｂ）：
Figure 2006505635
 を有する上記方法に関する。
得られた化合物が上記構造（ＩＩａ）および／または（ＩＩｂ）を有する各方法または方法の組み合わせにしたがって、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端を酸化させることができる。
ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が酸化される全ての適切な方法にしたがって酸化させることができるが、例えば、第１９６２８７０５Ａ１号に記載のアルカリヨウ素液を使用して実施することが好ましい。
したがって、本発明は、また、還元末端がアルカリヨウ素液によって酸化される上記方法に関する。
本発明の第２の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させるが、還元末端が反応前に酸化されていない。
したがって、本発明は、また、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前にヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が酸化されていないため、前記ヒドロキシアルキルデンプンが式（Ｉ）：
Figure 2006505635
 の構造を有する上記方法に関する。
化合物（Ｌ）とヒドロキシアルキルデンプンまたは化合物（Ｄ）とヒドロキシアルキルデンプンとのいずれかの間の化学結合の形成を、官能基Ｚ1とヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によって行う。
官能基Ｚ1として、ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との化学結合を形成可能な各官能基を使用することができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、官能基Ｚ1は、化学構造−ＮＨ−を含む。
したがって、本発明は、また、官能基Ｚ1が構造−ＮＨ−を含む上記方法に関する。
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、官能基Ｚ1は、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する基であり、Ｒ’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基をＮＨ基に直接結合させることができるか、別の実施形態によれば、ＮＨ基への酸素架橋によって結合することができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基を適切に置換することができる。好ましい置換として、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は水素、アルキル基、およびアルコキシ基であり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基がさらにより好ましい。
アルキル基およびアルコキシ基のうち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣ原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に好ましい。
したがって、本発明は、また、Ｒ’が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である上記方法に関する。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、官能基Ｚ1は、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’を有し、Ｒ’’’’は構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ＧはＯまたはＳである）および／または構造単位−ＳＯ2−を含むことが好ましい。より好ましい実施形態によれば、官能基Ｒ’’は、
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 （上式中、Ｇが２つ存在する場合には、Ｇは独立してＯまたはＳである。）
からなる群から選択される。
したがって、本発明は、また、官能基Ｚ1が、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
本発明の目的は、ヒドロキシアルキルデンプンと、化合物（Ｌ）と、必要に応じて化合物（Ｄ）と、さらなる化合物（Ｍ）とを含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を反応生成物として得るために、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な官能基Ｘを含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することにある。
官能基Ｘに関して、さらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙと化学結合を形成することができるなら、特に制限されない。
官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択される場合、官能基Ｘは、化学構造−ＮＨ−を含むことが好ましい。
したがって、本発明は、また、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、官能基Ｘが構造−ＮＨ−を含む上記方法に関する。
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、官能基Ｘは、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する基であり、Ｒ’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基をＮＨ基に直接結合させることができるか、別の実施形態によれば、ＮＨ基への酸素架橋によって結合することができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基を適切に置換することができる。好ましい置換として、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は水素、アルキル基、およびアルコキシ基であり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基がさらにより好ましい。
アルキル基およびアルコキシ基のうち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣ原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に好ましい。
したがって、本発明は、また、Ｒ’が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である上記方法に関する。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、官能基Ｘは、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’を有し、Ｒ’’’’は構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ＧはＯまたはＳである）および／または構造単位−ＳＯ2−を含むことが好ましい。より好ましい実施形態によれば、官能基Ｒ’’は、
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 （上式中、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳである。）
からなる群から選択される。
したがって、本発明は、また、官能基Ｘが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
官能基Ｙがチオ基である場合、官能基Ｘは、好ましくは、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである。）
からなる群から選択される。
したがって、本発明は、また、官能基Ｙが−ＳＨであり、官能基Ｘが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
本発明の１つの実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプンを化合物（Ｄ）と反応させ、得られた反応生成物を化合物（Ｌ）とさらに反応させ、化合物（Ｌ）と反応生成物との間の化学結合を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と反応生成物の一部である化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応によって形成される。
官能基Ｚ2およびＷに関して、所望の化学結合が形成されるなら、特に制限されない。
可能な官能基ＷまたはＺ2として、以下の官能基が特に挙げられる。
Ｃ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ−三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合；
チオ基または水酸基；
アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
１，２−ジオール；
１，２−アミノアルコール；
アミノ基−ＮＨ2または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体（アミノアルキ ル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基など ）；
ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ2または構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシ ルアミノ基の誘導体（ヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミ ノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキサルアルカリールアミノ (hydroxalalkarylamino)基など）；
アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、また はアルカリールオキシアミノ基（それぞれ構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含む）；
カルボニル基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ（式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｍは、例え ば、
−ＯＨまたは−ＳＨ；
アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリー ルオキシ基；
アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリール チオ基；
アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカ ルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基；
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドなどのイミド構造または構造単位Ｏ−Ｎ（式中 、Ｎはヘテロアリール化合物の一部であるか、Ｇ＝ＯおよびＱは存在しない （ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニル、またはトリクロロフェニ ル（ｔｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）などの置換アリール残基を有するア リールオキシ化合物など））を有するヒドロキシルアミンエステルなどの活 性化されたエステル；
であり、Ｑは存在しないかＮＨまたはＳまたはＯなどのヘテロ原子である）；
−ＮＨ−ＮＨ2または−ＮＨ−ＮＨ−；
−ＮＯ2；
ニトリル基；
アルデヒド基またはケト基などのカルボニル基；
カルボキシル基；
−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
ヨウ化ビニル基または臭化ビニル基またはトリフラートなどのビニルハライド基；
−Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
−（Ｃ＝ＮＨ2Ｃｌ）−Ｏアルキル；
−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ2−Ｈａｌ基（ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである）；
−ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ2−；
構造−Ｓ−Ｓ−を含むジスルフィド基；
Figure 2006505635
 基；
Figure 2006505635
 基（上式中、Ｚ2およびＷはそれぞれ上記基の１つと化学結合を形成することができる基である。）。
本発明の好ましい実施形態によれば、ＷおよびＺ2は共に上記基のリスト由来の基である。
本発明の第１の特に好ましい実施形態によれば、Ｚ2またはＷは、チオ基である。この特定の場合、官能基Ｗは、好ましくは、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである。）
からなる群から選択される。
したがって、本発明は、また、官能基Ｗまたは官能基Ｚ2が−ＳＨであり、官能基Ｚ2または官能基Ｗが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである）
からなる群から選択される上記方法に関する。
本発明の第２の特に好ましい実施形態によれば、Ｚ2またはＷは、上記の活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択される。この具体例では、官能基ＷまたはＺ2は、それぞれ化学構造−ＮＨ−を含む。
したがって、本発明は、また、Ｚ2またはＷが上記の活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、官能基ＷまたはＺ2がそれぞれ化学構造−ＮＨ−を含む上記方法に関する。
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、構造−ＮＨ−を含む官能基ＷまたはＺ2は、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する基であり、Ｒ’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基をＮＨ基に直接結合させることができるか、別の実施形態によれば、ＮＨ基への酸素架橋によって結合することができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基を適切に置換することができる。好ましい置換として、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は水素、アルキル基、およびアルコキシ基であり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基がさらにより好ましい。
アルキル基およびアルコキシ基のうち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣ原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に好ましい。
したがって、本発明はまた、ＷまたはＺ2が上記の活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、官能基ＷまたはＺ2がそれぞれＲ’−ＮＨ−（式中、Ｒ’は水素またはメチル基もしくはメトキシ基である）である上記方法に関する。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、官能基ＷまたはＺ2は、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’を有し、Ｒ’’は構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−（ＧはＯまたはＳである。）および／または構造単位−ＳＯ2−を含むことが好ましい。より好ましい実施形態によれば、官能基Ｒ’’は、
Figure 2006505635
 （上式中、Ｇが２つ存在する場合、独立してＯまたはＳである。）
からなる群から選択される。
したがって、本発明はまた、官能基ＷまたはＺ2が、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記方法に関する。
本発明のさらに別の態様によれば、少なくとも１つの官能基Ｘ、Ｚ2、および／またはＷは、所与のさらなる化合物と直接反応することができないが、所望の方法で反応可能なように化学修飾することができる基であり得る。
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基の例として、例えば、酸化によって修飾されてアルデヒド基またはケト基が形成される１，２−アミノアルコールまたは１，２−ジオールが挙げられる。
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基の別の例は、例えば、以下の式：
Figure 2006505635
 の化合物との反応によって修飾されて、例えば、チオ基に反応性を示す以下の式：
Figure 2006505635
 の構造が得られる−ＮＨ2基である。
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基の別の例は、例えば、以下の式：
Figure 2006505635
 の化合物との反応によって修飾されて、例えば、チオ基に反応性を示す以下の式：
Figure 2006505635
 の構造が得られる−ＮＨ2基である。
さらなる化合物との反応の前に修飾される官能基のさらに別の例は、無水ブロモ酢酸またはＮ−スクシンイミジルヨードアセテートと反応するアミノ基である。
本発明の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｌ）は構造Ｚ1−Ｌ’−ＸまたはＺ2−Ｌ’−Ｘを有し、Ｌ’は官能基を分離する有機残基であり、且つ必要に応じて存在せず、この構造は、化合物（Ｄ）がヒドロキシアルキルデンプンと反応するかどうかに依存する。
第１の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）は含まれず、Ｙは、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択される。
この特定の場合、これらのうち、構造Ｚ1−Ｌ’−Ｘ（Ｌ’は存在しない）を有する化合物（Ｌ）として以下の化合物が好ましい。
Figure 2006505635
この具体例では、Ｌ’が存在する場合、Ｌ’は、直鎖または分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールシクロアルキル基、アルカリール基、またはシクロアルキルアリール基であってよく、Ｌ’は、Ｎ、Ｏ、Ｓなどの少なくとも１つのヘテロ原子を含んでよく、Ｌ’を適切に置換し得る。Ｌ’基のサイズを特定の要件に適合させることができる。分離基Ｌ’は、一般に、１〜６０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個まで、より好ましくは１〜１０個、より好ましくは１６個、特に好ましくは１〜４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は、一般に、１〜２０個、好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜４個のヘテロ原子を含む。本発明の特に好ましい実施形態によれば、分離基Ｌ’は、１〜４個の酸素原子を含む。分離基Ｌ’は、例えば、５〜７個までの炭素原子を有する必要に応じて分岐したアルキル鎖、アリール基、またはシクロアルキル基を含み得るか、アルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であり得るアラルキル基、アルカリール基であり得る。さらにより好ましい実施形態によれば、分離基は、１〜２０個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは２〜４個の炭素原子を含むアルキル鎖である。ヘテロ原子が存在する場合、１〜４個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択されるこの特定の場合に関して、これらのうち、構造Ｚ1−Ｌ’−Ｘ（Ｌ’が存在する）を有する化合物（Ｌ）として以下の化合物が好ましい。
Figure 2006505635
Figure 2006505635
第２の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）が含まれる。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）は構造Ｚ1−Ｄ’−Ｗを有し、Ｄ’は官能基を分離する有機残基であり、且つ必要に応じて存在しない。
この特定の場合、これらのうち、構造Ｚ1−Ｄ’−Ｗ（Ｄ’は存在しない。）を有する化合物（Ｄ）として以下の化合物が好ましい。
Figure 2006505635
Ｄ’が存在しない化合物Ｄの具体例は、ＮＨ3である。
この特定の例では、Ｄ’が存在する場合、Ｄ’は、直鎖または分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールシクロアルキル基、アルカリール基、またはシクロアルキルアリール基であってよく、Ｄ’は、Ｎ、Ｏ、Ｓなどの少なくとも１つのヘテロ原子を含んでよく、Ｄ’を適切に置換し得る。Ｄ’基のサイズを特定の要件に適合させることができる。一般に、分離基Ｄ’は、一般に、１〜６０、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は、一般に、１〜２０個、好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜４個のヘテロ原子を含む。本発明の特に好ましい実施形態によれば、分離基Ｄ’は、１〜４個の酸素原子を含む。分離基Ｄ’は、例えば、５〜７個の炭素原子を有する必要に応じて分岐したアルキル鎖、アリール基、またはシクロアルキル基を含み得るか、アルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であり得るアラルキル基、アルカリール基であり得る。さらにより好ましい実施形態によれば、分離基は、１〜２０個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは２〜４個の炭素原子を含むアルキル鎖である。ヘテロ原子が存在する場合、１〜４個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
この特定の場合、構造Ｚ1−Ｄ’−Ｗ（Ｄ’が存在する）を有する好ましい化合物（Ｄ）は、以下である。
Figure 2006505635
Figure 2006505635
化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗおよび官能基Ｙの化学的性質に依存して、特定の要件にしたがって特定の化合物（Ｌ）を使用することができる。
例えば、上で詳述したように、官能基Ｙがチオ基であり、官能基Ｗが構造−ＮＨ−を含む場合、これらのうち、以下の化合物（Ｌ）型が好ましい。
Figure 2006505635
例えば、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、官能基Ｗはチオ基である場合、これらのうち、以下の化合物（Ｌ）型が好ましい。
Figure 2006505635
本明細書の最後の表１では、上記の型の化合物（Ｌ）のいくつかの好ましい例を列挙する。
分離基Ｌ’および／またはＤ’を適切に置換することができる。好ましい置換基は、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩなどのハライドである。
分離基Ｌ’および／またはＤ’は、次の例示する一以上の切断部位を含み、得られた化合物を所定の部位で容易に切断可能である。
Figure 2006505635
ヒドロキシアルキルデンプンに結合することができ、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙと反応可能な官能基Ｘを含み、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択される化合物（Ｌ）の特に好ましい例は、
Figure 2006505635
 であり、化合物（Ｌ）
Figure 2006505635
 が特に好ましい。
ヒドロキシアルキルデンプンに結合することができ、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体が化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と反応可能な官能基Ｗを含み、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）を含む得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応することができ、官能基Ｙがチオ基である化合物（Ｄ）の特に好ましい例は、
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 であり、化合物（Ｄ）
Figure 2006505635
 が特に好ましい。
上記の好ましい化合物（Ｄ）と合わせて、以下の化合物（Ｌ）：
Figure 2006505635
 が好ましく、化合物（Ｌ）
Figure 2006505635
 が特に好ましい。
本発明の第１の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、酸化されていないヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
使用した溶媒または溶媒混合物、反応混合物の温度、圧力、またはｐＨなどの反応条件に依存して、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）の反応生成物を、異なる構造を有し得る酸化していないヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
本発明の好ましい実施形態によれば、水系でこの反応を行う。
本発明の文脈で使用される、用語「水系」は、含まれる溶媒の重量に基づいて、少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％または最大１００重量％の範囲の水を含む溶媒または溶媒混合物をいう。さらなる溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、エタノール、またはメタノールなどの溶媒）が挙げられる。
水系で反応を行い、反応基Ｚ1が上記のＲ’−ＮＨ−基である場合、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、式（ＩＩＩａ）：
Figure 2006505635
 の構造を有し得る。
水系で反応を行い、反応基Ｚ1が上記のＲ’−ＮＨ−基（Ｒ’＝Ｈ）である場合、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、式（ＩＩＩａ）または式（ＩＩＩｂ）：
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 または式（ＩＩＩａ）と式（ＩＩＩｂ）の化合物の混合物であり得る。
反応に使用した化合物（Ｌ）または化合物（Ｄ）の反応条件および／または化学的性質に依存して、式（ＩＩＩａ）の化合物は、赤道面または軸方向にＮ原子と共に存在することができ、両形態の混合物は一定の平衡分布でも存在し得る。
反応に使用した化合物（Ｌ）または化合物（Ｄ）の反応条件および／または化学的性質に依存して、式（ＩＩＩｂ）の化合物は、Ｅ体またはＺ体中にＣ−Ｎ二重結合と共に存在することができ、両形態の混合物は一定の平衡分布でも存在し得る。
したがって、本発明はまた、式（ＩＩＩｂ）もしくは式（ＩＩＩｂ）または式（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）の構造を有する上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
いくつかの場合、式（ＩＩＩａ）の化合物を安定化することが望ましい。これは、特に、式（ＩＩＩａ）の化合物を水溶液中で生成および／または使用する場合である。安定化方法として、式（ＩＩＩａ）の化合物のアシル化が特に好ましく、特にＲ’が水素である場合に好ましい。アシル化試薬として、式（ＩＶａ）：
Figure 2006505635
 の所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる全ての適切な試薬を使用することができる。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、アシル化試薬の一部である残基Ｒａはメチルである。アシル化試薬として、無水カルボン酸、カルボン酸ハライド、およびカルボン酸活性エステルを使用することが好ましい。
０℃から３０℃の範囲、好ましくは２℃から２０℃の範囲、特に好ましくは４℃から１０℃の範囲の温度でアシル化を行う。
したがって、本発明は、また、誘導体が式（ＩＶａ）の構造を有する、上記方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
他の場合、式（ＩＩＩｂ）の化合物を安定化することが望ましい。これは、特に、式（ＩＩＩｂ）の化合物を水溶液中で生成および／または使用する場合である。安定化方法として、式（ＩＩＩａ）の化合物の還元が特に好ましく、特にＲ’が水素である場合に好ましい。還元剤として、式（ＩＶｂ）：
Figure 2006505635
 の所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる全ての適切な試薬を使用することができる。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、還元剤として、ＮａＣＮＢＨ3またはＮａＢＨ4などのホウ化水素を使用する。
４℃から１００℃の範囲、好ましくは１０℃から９０℃の範囲、特に好ましくは２５℃から８０℃の範囲の温度で還元を行う。
したがって、本発明は、また、誘導体が式（ＩＶｂ）の構造を有する、上記方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
本発明は、さらに、式（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）、（ＩＩＩａ）と（ＩＶａ）、（ＩＩＩａ）と（ＩＶｂ）、（ＩＩＩｂ）と（ＩＶａ）、（ＩＩＩｂ）と（ＩＶｂ）、（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）と（ＩＶａ）、（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）と（ＩＶｂ）、（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）と（ＩＩＩａ）、および（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）と（ＩＩＩｂ）の構造を有し、（ＩＩＩａ）および／または（ＩＶａ）は、赤道面または軸方向にＮ原子が存在する構造中に独立して存在することができ、および／または（ＩＩＩｂ）はＥ体またはＺ体中にＣ−Ｎ二重結合と共に存在し得る化合物の混合物に関する。
本発明の第２の好ましい実施形態によれば、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）を、酸化されたヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
この場合、好ましくは、一定量の水（最大１０重量％など）を含み得る極性非プロトン性溶媒を使用する。そのうちで好ましい非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯまたはＤＭＦである。ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端と反応する官能基の化学的性質および他の反応条件に依存して、好ましい反応温度範囲の例は、２０℃（室温）から６５℃、反応時間は、一般に、１分から数時間までおよび数日までの範囲である。
この場合、官能基Ｚ1が上記のＲ’−ＮＨ−基である場合、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、式（Ｖａ）：
Figure 2006505635
 の構造を有し得る。
したがって、本発明は、また、誘導体が式（Ｖａ）の構造を有する、上記方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）および／または化合物（Ｌ）ならびに化合物（Ｍ）との反応が考慮される限り、全ての可能な配列が本発明に含まれる。
本発明の好ましい実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、得られた反応生成物を化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記方法に関する。
本発明の別の実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記方法に関する。
本発明のさらに別の実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる上記方法に関する。
本発明のさらに別の実施形態は、第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる後者の方法に関する。
本発明のさらに別の実施形態は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗと、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記方法に関する。
上記各反応ステップの反応条件を考慮する限り、温度、圧力、ｐＨ、溶媒、または溶媒混合物などの全てのパラメーターを、反応させるべき化合物の特定の要件および化学的性質に適合することができる。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、溶媒として水を単独または少なくとも１つの他の溶媒と組み合わせて使用する。少なくとも１つの他の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、およびエタノールが挙げられる。水以外の好ましい溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、およびエタノールである。この実施形態では、ヒドロキシアルキルデンプンを、酸化されていない還元末端を介して反応させることが好ましい。
ヒドロキシアルキルデンプンを水性溶媒中で化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）と反応させ、且つ化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）がヒドロキシルアミンまたはヒドロアジドである場合、反応温度は、好ましくは５〜４５℃の範囲、より好ましくは１０〜３０℃の範囲、特に好ましくは１５〜２５℃の範囲である。
ヒドロキシアルキルデンプンを水性溶媒中で化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）と反応させ、且つ反応が還元的アミノ化である場合、温度は、好ましくは最大１００℃の範囲、より好ましくは７０〜９０℃の範囲、特に好ましくは７５〜８５℃の範囲である。
一連の反応中に、好ましくは、上記の所与の範囲で温度を変化させることができるか、本質的に一定に保持することができる。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応時間を、特定の要件に適合することができ、一般に、１時間〜７日の範囲である。
化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、反応時間は、好ましくは１時間〜３日、より好ましくは２時間〜４８時間の範囲である。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応が還元的アミノ化である場合、反応時間は、好ましくは２時間〜７日の範囲である。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応のためのｐＨ値を、反応物質の化学的性質などの特定の要件に適合することができる。
化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）がヒドロキシルアミンまたはヒドラジドである場合、ｐＨ値は、好ましくは４．５〜６．５の範囲である。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応が還元的アミノ化である場合、ｐＨ値は、好ましくは８〜１２の範囲である。
少なくとも１つの適切な緩衝液の添加によって、各反応ステップについての反応混合物の適切なｐＨを調整することができる。好ましい緩衝液のうち、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、またはホウ酸緩衝液が挙げられる。
必要に応じて、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応前、化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）との反応前、またはヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物と化合物（Ｌ）との反応前に、少なくとも１つの官能基Ｘを、少なくとも１つの適切な保護基で保護することができる。これに関して、保護された化合物（Ｌ）が、少なくとも１つの官能基Ｘを介して反応することを妨げる、全ての考え得る保護基が可能である。したがって、例えば、反応が行われる溶媒または反応混合物のｐＨから保護すべき官能基Ｘの化学的性質に依存して、保護基を選択することができる。これらのうちで、好ましい保護基は、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、トリアリールメチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメチルトリチル基、ジメチルトリチル基、トリフルオロアセチル基、フタリミン（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｎ）化合物、２−（トリアルキルシリル）エトキシカルボニル化合物、Ｆｍｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチル基、またはトリアルキルシリル基である。
化合物（Ｌ）中に２つ以上の異なる官能基Ｘが存在する場合、少なくとも１つの基を保護することができる一方で、少なくとも１つの他の基を保護しないままにすることができる。
化合物（Ｌ）の反応後、少なくとも１つの保護基を反応生成物中に残すか、当業者に公知の従来の方法などの適切な方法によって除去することができる。２つの異なる官能基Ｘを適切な保護基によって保護する場合、少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）とのさらなる反応に利用可能な少なくとも１つの官能基Ｘを形成するために少なくとも１つの保護基を除去し、化合物（Ｌ）を含む反応生成物をさらなる化合物（Ｍ）と反応させるまで、少なくとも１つの他の官能基を保護したままにすることが可能である。その後、なおさらなる化合物（Ｍ）との反応に利用可能な官能基Ｘを残すために、保護されたままの官能基の保護基を除去することができる。
少なくとも１つの保護基の使用は、２つ以上のヒドロキシアルキルデンプン分子と反応した化合物（Ｌ）または化合物（Ｄ）（すなわち、複数のＨＡＳ置換化合物（Ｌ）または（Ｄ））を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する反応の防止に重要であり得る。しかし、ヒドロキシアルキルデンプンと過剰な化合物（Ｌ）または（Ｄ）との反応によって同一の結果を得ることができる。過剰量の化合物（Ｌ）または（Ｄ）を本発明のプロセスで使用する場合、化合物（Ｌ）または（Ｄ）とヒドロキシアルキルデンプンとのモル比は、好ましくは２〜１００の範囲である。
一旦上記のように各反応ステップの反応生成物が形成されると、少なくとも１つの適切な方法によって反応混合物から単離することができる。必要に応じて、少なくとも１つの適切な方法によって反応生成物を単離前に沈殿させることができる。
反応生成物を最初に沈殿させる場合、例えば、反応混合物を、適切な温度で反応混合物と反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも１つの溶媒または溶媒混合物とを接触させることが可能である。溶媒として水系を使用する本発明の特に好ましい実施形態によれば、反応混合物を、好ましくは−２０℃から＋５０℃の範囲、特に好ましくは０℃から２５℃の範囲の温度でエタノールとアセトンとの混合物（好ましくは同体積である１：１混合物）に接触させる。
１つ以上のステップを含み得る適切なプロセスによって、反応生成物を単離することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、例えばエタノール−アセトン混合液を用いて遠心分離または濾過などの適切な方法によって、第１のステップでは、反応生成物を反応混合物または反応混合物から分離する。第２のステップでは、分離した反応生成物を、透析、遠心分離濾過または加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過、および／または凍結乾燥のような後処理などのさらなる処理に供することができる。さらにより好ましい実施形態によれば、分離した反応生成物を、最初に好ましくは水に対して透析し、生成物の所望のスペックにしたがって反応生成物の溶媒含有量が十分に低くなるまで凍結乾燥させる。２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で凍結乾燥させることができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体、またはヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）と化合物（Ｌ）を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、少なくとも１つの官能基Ｙを含むさらなる化合物（Ｍ）とさらに反応させる。
一般に、化合物（Ｍ）に関して制限はない。好ましくは、本発明の文脈では、化合物（Ｍ）としてポリペプチドを使用する。しかし、他の化合物（Ｍ）（ポリマー、オリゴマー、もしくは単分子化合物、またはこれらの２つ以上の混合物）も可能である。
本発明の文脈で使用される、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合（すなわち、構造−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を有する結合）を介して結合した少なくとも２つのアミノ酸を含む化合物をいう。ポリペプチドは、天然に存在する化合物または天然に存在しないポリペプチドであってよく、後者には、天然に存在するアミノ酸および／または天然に存在しない少なくとも１つのアミノ酸が含まれる。ポリペプチドの骨格（ポリペプチド鎖）は、少なくとも１つの適切な置換基と置換され、それにより少なくとも１つの側鎖を有する。少なくとも１つの官能基Ｙは、ポリペプチド骨格の一部または骨格の少なくとも１つの置換基の一部であってよく、具体的には、ポリペプチド骨格の一部である少なくとも１つの官能基およびポリペプチド骨格の少なくとも１つの置換基の一部である少なくとも１つの官能基を含む実施形態が可能である。
ポリペプチドが考慮される限り、ポリペプチドが少なくとも１つの官能基Ｙを含む場合、制限はない。前記官能基Ｙを、ポリペプチド骨格または骨格の側鎖の一部に直接結合させることができる。側鎖もしくは官能基Ｙのいずれか一方またはその両方は、天然に存在するポリペプチドの一部であり得るか、官能基Ｘとの反応前に天然に存在するポリペプチドまたは少なくとも一部が天然に存在しないポリペプチドに導入することができる。
さらに、ポリペプチドは、少なくとも一部が任意のヒトまたは動物供給源に由来し得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドはヒト供給源に由来する。
ポリペプチドは、サイトカイン、詳細には、エリスロポエチン、ＡＴ ＩＩＩなどのアンチトロンビン（ＡＴ）、インターロイキン、詳細には、インターロイキン２、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、インターロイキン６、および治療用抗体であり得る。
好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、アンチトロンビン（ＡＴ）、好ましくはＡＴ ＩＩＩ（Ｌｅｖｙ ＪＨ，Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ Ａ，Ｚｉｏｍｅｋ ＣＡ，Ｅｃｈｅｌａｒｄ Ｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２７，４（２００１）４０５−４１６；Ｅｄｍｕｎｄｓ Ｔ，Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ ＳＭ，Ｐｏｌｌｏｃｋ Ｊ，Ｈａｎｓｏｎ Ｅ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ Ｒ，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｅ，Ｍａｎａｖａｌａｎ Ｐ，Ｚｉｏｍｅｋ Ｃ，Ｍｅａｄｅ Ｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｊ，Ｃｏｌｅ ＥＳ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｂｌｏｏｄ ９１，１２（１９９８）４６６１−４６７１；Ｍｉｎｎｅｍａ ＭＣ，Ｃｈａｎｇ ＡＣＫ，Ｊａｎｓｅｎ ＰＭ，Ｌｕｂｂｅｒｓ ＹＴＰ，Ｐｒａｔｔ ＢＭ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＢＧ，Ｔａｙｌｏｒ ＦＢ，Ｈａｃｋ ＣＥ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｂ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ ｉｍ−ｐｒｏｖｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｃｈａｌ−ｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｂｌｏｏｄ ９５，４（２０００）１１１７−１１２３；Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ ＳＭ，Ｈａｎ−ｓｏｎ ＥＨ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ Ｒ，Ｚｈａｎｇ Ｋ，Ｍａｎａｖａｌｎ Ｐ，Ｃｏｌｅ ＥＳ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＪＭ，Ｅｄｍｕｎｄｓ Ｔ，Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４，１５（１９９９）１０２６８−１０２７６）である。
別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、ヒトＩＦＮ−β、特に、ＩＦＮ−β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、ＲＥＢＩＦ（登録商標）を参照のこと）およびＩＦＮ−β１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）を参照のこと）である。
さらに好ましいポリペプチドは、ヒトＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）である。例えば、Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｗｏ ｍＲＮＡｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．５：５７５−５８１，１９８６；Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２（１９８６）６１−６５；およびＨｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＮｅｕｐｏｇｅｎR（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ），ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕ−ｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ｉｎ：Ｆｏｒｍｕｌａｌｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ，Ｒｏｄｎｅｙ Ｐｅａｒｌｍａｎ ａｎｄ Ｙ．Ｊｏｈｎ Ｗａｎｇ，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，３０３−３２８を参照。
少なくとも２つの異なるポリペプチドの混合物を使用する場合、少なくとも２つのポリペプチドは以下において異なり得る。例えば、分子量、アミノ酸の数および／または配列、置換基の数および／または化学的性質、またはジスルフィド結合などの適切な化学結合によって結合したポリペプチド鎖数。
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、または化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、好ましくは少なくとも１つの上記プロセスにしたがって単離し、その後少なくとも１つの官能基Ｙを有するポリペプチドと反応させる。本発明の好ましい実施形態によれば、官能基Ｙは、ポリペプチドの炭水化物部分に含まれる。
本発明の文脈では、用語「炭水化物部分」は、ヒドロキシアルデヒドまたはヒドロキシケトンおよびその化学修飾物をいう（Ｒｏｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ，Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９０，Ｖｏｌｕｍｅ ９，ｐａｇｅｓ ２２８１−２２８５およびその参考文献を参照）。さらに、炭水化物部分はまた、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸などの天然に存在する炭水化物部分の誘導体をいう。この用語には、化学的に酸化された天然に存在する炭水化物部分も含まれる。酸化された炭水化物部分の構造は、環状または直鎖であり得る。
炭水化物部分を、ポリペプチド骨格に直接結合させることができる。好ましくは、炭水化物部分は、炭水化物側鎖の一部である。より好ましくは、炭水化物部分は、炭水化物側鎖の末端部分である。
さらにより好ましい実施形態では、炭水化物部分は、炭水化物側鎖のガラクトース残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、下記の末端シアル酸の除去およびその後の酸化による、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物中に含まれる官能基Ｘとの反応に提供することができる。
さらに好ましい実施形態では、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端シアル酸残基に連結する。
末端炭水化物部分の酸化を、化学的または酵素的に行うことができる。
ポリペプチドの炭水化物部分の化学的酸化方法は、当分野で公知であり、過ヨウ素酸塩での処理が挙げられる（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６−１５９２２）。
化学的酸化によって、原則的に、末端に存在するか存在しない任意の炭水化物部分を酸化することが可能である。しかし、厳しい条件（１０ｍＭ過ヨウ素酸塩にて室温で１時間）と対照的な穏やかな条件（１ｍＭ過ヨウ素酸塩、０℃）の選択により、好ましくは、炭水化物側鎖の末端シアル酸を酸化することが可能である。
あるいは、炭水化物部分を酵素で酸化することができる。各炭水化物部分の酸化酵素は当分野で公知であり、例えば、ガラクトースの場合、酵素はガラクトースオキシダーゼである。末端ガラクトース部分の酸化を意図する場合、例えば、炭水化物鎖にシアル酸を結合させることができるように遺伝子操作された哺乳動物細胞中もしくは細胞中で炭水化物鎖にシアル酸を結合させることができる細胞中でポリペプチドが産生された場合に、最終的に末端シアル酸（部分または全部）を除去する必要がある。化学的または酵素的シアル酸除去方法は当分野で公知である（Ｃｈａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ（ｅｄｓ．），１９９６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｃｈａｐｔｅｒ ５ Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌｌ，Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐａｇｅｓ １７５−１７７；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｓｅｒｉｅｓ（ＩＳＢＮ ０−９４７９４６−４４−３））。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチドの官能基はチオ基である。したがって、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、または化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、Ｓ原子が、ポリペプチド中に含まれる任意のチオ基に由来し得るチオエーテル基を介してポリペプチドに結合することができる。
この実施形態の文脈では、化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物をポリペプチドと反応させることが特に好ましい。
したがって、本発明はまた、化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物をポリペプチド中に含まれるチオ基を介してポリペプチドと反応させる上記方法に関する。
したがって、本発明はまた、化合物（Ｌ）とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、酸化された炭水化物部分およびポリペプチド中に含まれるチオ基を介してポリペプチドと反応させる上記方法に関する。
チオ基はそれ自体がポリペプチド中に存在し得る。さらに、適切な方法に従ってポリペプチドにチオ基を導入することが可能である。特に、化学的方法が挙げられる。ポリペプチド中にジスルフィド結合が存在する場合、チオ基を得るために−Ｓ−Ｓ−構造を還元することが可能である。アミノ基を介したポリペプチドと少なくとも２つの異なる官能基（そのうちの一方がアミノ基と反応することができ、他方がＳＨ基またはＳＨ基の前駆体である）を有する化合物との反応によって、ポリペプチド中に存在するアミノ基をＳＨ基に変換することも可能である。アミノ基のこの修飾を、最初にタンパク質を少なくとも２つの異なる官能基（そのうちの一方がアミノ基と反応することができ、他方がＳＨ基である）を有する化合物（Ｌ）と反応させ、次いで、得られた反応生成物を例えば、ＨＡＳおよび化合物（Ｄ）を含むＨＡＳ誘導体（ＳＨ基と反応可能な官能基を含む）と反応させる例と見なすことができる。システインまたは適切なＳＨ官能アミノ酸のポリペプチドへの導入、またはポリペプチド中の別のシステインがジスルフィド結合を形成することをできなくするためのポリペプチドからのシステインの除去などによるポリペプチドの変異によってＳＨを導入することも可能である。
特に好ましいポリペプチドとして、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を使用する。
したがって、本発明はまた、ポリペプチドがエリスロポエチンである上記方法に関する。
ＥＰＯは、任意のヒト（例えば、Ｉｎｏｕｅ，Ｗａｄａ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９９４，Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ａｎｅｍｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１７（２），１８０−４；Ｍｉｙａｋｅ，Ｋｕｎｇ，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，１９７７，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２（１５），５５５８−６４を参照のこと）または別の哺乳動物供給源に由来し得るか、ヒトの腎臓、ヒト胚肝臓または動物、好ましくはサルの腎臓のような天然に存在する供給源からの精製によって得ることができる。さらに、表現「エリスロポエチン」または「ＥＰＯ」は、１つ以上のアミノ酸（例えば、１〜２５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、より好ましくは１個または２個）が他のアミノ酸と交換されており、且つエリスロポエチン活性を示すＥＰＯ変異型も含む（例えば、ＥＰ６４０６１９Ｂ１号を参照）。エリスロポエチン活性の測定は当分野で説明されている（インビトロでの活性の測定については、例えば、Ｆｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７，１２０３ ｆｆ；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓ．，１４０，３２３−３３４を参照のこと；インビボでのＥＰＯ活性の測定については、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２００１，９１１−９１７；Ｐｈ．Ｅｕｒ．２０００，１３１６ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ ｓｏｌｕｔｉｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ，７８０−７８５；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（１９９６／２０００）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，１９９６，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｅｕｒｏｐａ．，８，３７１−３７７；Ｆｉｂｉ，Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ，Ｐａｕｌｙ，Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ．，１９９５，Ｎ− ａｎｄ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｕｔｅｉｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ，８５（５），１２２９−３６を参照；（１日目、２日目、および３日目にＥＰＯおよび修飾ＥＰＯ形態（タンパク質５０ｎｇ／マウスと等量）を雌ＮＭＲＩマウスに注射し、４日目に血液サンプルを採取し、網状赤血球を決定した）。ＥＰＯ活性の測定を試験したさらなる刊行物は、Ｂａｒｂｏｎｅ，Ａｐａｒｉｃｉｏ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｒｉｔｃｈｉｅ，１９９４，Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｓ ａ ｂｉｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１２（４），５１５−２２；Ｂｏｗｅｎ，Ｃｕｌｌｉｇａｎ，Ｂｅｇｕｉｎ，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｖｉｌｌｉｓ，１９９４，Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｕｓｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｗｉｔｈ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｌｅｕｋｅｍｉ，８（１），１５１−５；Ｄｅｌｏｒｍｅ，Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ，Ｇｉｆｆｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｂｏｏｎｅ，Ｅｌｌｉｏｔｔ，１９９２，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４１），９８７１−６；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｏｈｅｄａ，Ｋｕｂｏｎｉｗａ，Ｔｏｍｏｎｏｈ，Ｓｈｉｍｏｎａｋａ，Ｏｃｈｉ，１９９２；Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１），７７０３−９；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ａｋａｉ，Ｋａｗａｎｉｓｈｉ，Ｕｅｄａ，Ｍａｓｕｄａ，Ｓａｓａｋｉ，１９９１，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｏｎ ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３０），２０４３４−９；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｉｎｏｕｅ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｋｕｂｏｔａ，Ｗａｄａ，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈｏｓｈｉ，Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９８９，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（２０），７８１９−２２；Ｋｕｒｔｚ，Ｅｃｋａｒｄｔ，１９８９，Ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｎｅｐｈｒｏｎ．，５１（１），１１−４（Ｇｅｒｍａｎ）；Ｚｕｃａｌｉ，Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，１９８５，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ａｎｄ ｓｉｌｉｃｉｃ ａｃｉｄ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１３（３），８３３−７；Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８３，Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＥＥＦ），ａ ｌａｔｅ ａｃｔｉｎｇ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１（１），１８−３１である。
好ましくは、ＥＰＯを、組換えによって産生する。これには、真核細胞または原核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、またはＥＰＯの組換え産生に都合の良い任意の他の細胞型が含まれる。さらに、ＥＰＯを、トランスジェニック動物（例えば、ミルク、血液などの体液）、トランスジェニックトリの卵（特に、家禽類、好ましくはニワトリ）、またはトランスジェニック植物中に発現することができる。
ポリペプチドの組換え産生は当分野で公知である。一般に、これには、適切な発現ベクターでの宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの産生および宿主細胞からのポリペプチドの精製が可能な条件下での宿主細胞の培養が含まれる。詳細な情報については、例えば、Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｆａｒｂｅｒ，Ｓｍａｒｔ，１９８６，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｔｏ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｂｙ ａ ｒａｐｉｄ ｆｉｖｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｂｌｏｏｄ，６７（１），７１−９；Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７；ＥＰ ６４０ ６１９ Ｂ１ ａｎｄ ＥＰ ６６８ ３５１ Ｂ１を参照。
好ましい実施形態では、ＥＰＯは、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する（欧州特許第１４８６０５Ｂ２号を参照のこと）。
ＥＰＯは、Ｎおよび／またはＯ結合グリコシル化を介してＥＰＯに結合している（すなわち、ＥＰＯはグリコシル化されている）、１つ以上の炭水化物側鎖、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜９個、さらにより好ましくは１〜６個、特に１〜４個、特に好ましくは４個の炭水化物側鎖を含み得る。通常、ＥＰＯが真核細胞中で産生される場合、ポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。したがって、炭水化物側鎖を、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）、昆虫細胞、または酵母細胞中での生合成時にＥＰＯに結合させることができた。グリコシル化ＥＰＯの構造および特性は、当分野で広く研究されている（欧州特許４２８２６７Ｂ１号；欧州特許第６４０６１９Ｂ１号；Ｒｕｓｈ，Ｄｅｒｂｙ，Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｒｒｙ，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒｏｈｄｅ，Ｋａｔｔａ，１９９５，Ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，６７（８），１４４２−５２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９９１，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（４），３３７−４６（Ｒｅｖｉｅｗ）を参照）。
したがって、本発明のヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、ＥＰＯ分子あたり少なくとも１個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜９個、さらにより好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含み得る。ＥＰＯ分子あたりのＨＡＳ分子数を、生成物の加水分解および得られた単糖の誘導体化後のＧＣ−ＭＳを使用した定量的炭水化物組成分析によって決定することができる（Ｃｈａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ（ｅｄｓ．），１９８６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｓｅｒｉｅｓ（ＩＳＢＮ ０−９４７９４６−４４−３），ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｃｈａｐｔｅｒ １，Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ １−３６；Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ ３７−５３，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐａｇｅ ５５−９６を参照のこと）。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ＥＰＯに結合した炭水化物部分は、炭水化物側鎖の一部である。より好ましくは、炭水化物部分は、炭水化物側鎖の末端部分である。さらに好ましい実施形態では、炭水化物部分は、炭水化物側鎖のガラクトース残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、下記のように末端シアル酸の除去およびその後の酸化による、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との反応生成物との反応に提供することができる。さらに好ましい実施形態では、化合物（Ｉ）と（ＩＩ）との反応生成物を、炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端シアル酸残基に結合させる。シアル酸は、下記のように酸化される。
特に好ましくは、このガラクトース残基を、末端シアル酸の除去およびその後の酸化による、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物との官能基Ｘを介した反応に提供することができる。
より好ましくは、このガラクトース残基を、末端シアル酸が除去されない酸化による、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物との官能基Ｘを介した反応に提供することができる。
上記のように、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、ＥＰＯ中に含まれるチオ基と反応させる。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物を、チオ基および炭水化物部分（これらはそれぞれ少なくとも１つのさらなる化合物、好ましくはポリペプチド、より好ましくはエリスロポエチン中に含まれる）と反応させることも可能である。
好ましい実施形態によれば、このＳＨ基を、好ましくは、例えば、ヒドロキシルアミン誘導体（例えば、２−（アミノオキシ）エチルメルカプタンヒドロクロリド）の使用（Ｂａｕｅｒ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３０，９４９）またはヒドラジン誘導体（例えば、チオグルコール酸ヒドラジド）の使用（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４２，３３２）によって酸化された炭水化物部分に結合させることができる。
さらに好ましい実施形態によれば、チオ基を、好ましくはＥＰＯの酸化された炭水化物部分、より好ましくはＥＰＯの酸化された炭水化物側鎖の一部である酸化された炭水化物部分に導入する。
好ましくは、チオ基は、天然に存在するシステインまたは付加システインに由来する。より好ましくは、ＥＰＯは、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有し、天然に存在するシステインはシステイン２９および／または３３である。より好ましい実施形態では、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物をシステイン２９と反応させ、システイン３３を別のアミノ酸と置換する。あるいは、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物、またはさらに化合物（Ｌ）と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｄ）との反応生成物をシステイン３３と反応させ、システイン２９を別のアミノ酸と置換する。
本発明の文脈では、用語「付加システイン」は、ポリペプチド、好ましくはＥＰＯが野生型ポリペプチド中に存在しないシステイン残基を含むことを示す。
本発明のこの態様の文脈では、システインは、ＥＰＯのＮ末端またはＣ末端に付加されたさらなるアミノ酸であり得る。
さらに、天然に存在するアミノ酸をシステインまたは適切に置換されたシステインと置換することによって付加システインを付加することができた。好ましくは、本発明のこの態様の文脈では、ＥＰＯはヒトＥＰＯであり、置換アミノ酸残基はセリン１２６である。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）との反応生成物と、必要に応じて化合物（Ｄ）、さらなる化合物（Ｍ）との反応に関する反応条件については特定の制限はなく、反応条件を特定の要件に調整することができる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、溶媒として水を単独または少なくとも１つの他の溶媒と組み合わせて使用する。少なくとも１つの他の溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、またはエタノールが挙げられる。水以外の好ましい溶媒は、メタノールおよびエタノールである。他の好ましい実施形態によれば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、もしくはエタノール、またはこれらの２つまたはそれ以上の混合物を溶媒として使用する。
例えば、水系でヒドロキシアルキルデンプンを化合物（Ｌ）と反応させる場合、例えば、ヒドロキシエチルデンプンをデンプンの酸化されていない還元末端の反応を介してＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンなどのヒドロキシルアミンと反応させるような場合、且つ反応生成物を、アルデヒド基、ケト基、アセタール基、またはヘミアセタール基を介してポリペプチド、好ましくはエリスロポエチンとさらに反応させる場合、反応温度は、好ましくは４〜３７℃、より好ましくは１０〜３０℃、特に好ましくは１５〜２５℃の範囲である。
さらなる化合物（Ｍ）、好ましくはポリペプチド、特に好ましくはエリスロポエチンを含む反応生成物を、天然および組換えＥＰＯの精製のための公知の手順（例えば、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、またはその組み合わせ）の使用によって単離することができる。１つ以上のステップを含み得る適切なプロセスによって、反応生成物を単離することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、第１ステップにおいて、遠心分離または濾過などの適切な方法によって、エタノール−アセトン混合液を用いて反応生成物を反応混合物または反応混合物との混合物から分離する。第２ステップでは、分離した反応生成物を、透析、遠心分離濾過または加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含むカラムなどによる）、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過、および／または凍結乾燥のような後処理などのさらなる処理に供することができる。１つの好ましい実施形態によれば、分離した反応生成物を、最初に好ましくは水に対して透析し、生成物の所望のスペックにしたがって反応生成物の溶媒含有量が十分に低くなるまで凍結乾燥させる。２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で凍結乾燥させることができる。別の好ましい実施形態によれば、反応生成物を含む反応混合物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含むカラムに供して、例えば遠心分離濾過によって濃縮された溶離物が得られる。
本発明の別の目的は、１つ以上の上記方法によって産生されるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することにある。
したがって、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体において、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
Figure 2006505635
 の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化合物（Ｌ）と反応するステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物（Ｌ）と反応するステップとを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｚ1が、構造−ＮＨ−を含む上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｚ1が、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、構造−ＮＨ−を含む上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、Ｘが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒはメチルである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが−ＳＨであり、前記官能基Ｘが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が上記の活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒはメチルである。）
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されていないため、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）：
Figure 2006505635
 の構造を有する上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されているため、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（ＩＩａ）：
Figure 2006505635
 および／または式（ＩＩｂ）：
Figure 2006505635
 の構造を有する上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、得られた反応生成物を化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得て、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得る上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗと、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）がポリペプチドである上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリペプチドがエリスロポエチンである上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
以後、ＨＡＳ−ＥＰＯ接合体と呼ばれ、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物（Ｌ）、必要に応じて化合物（Ｄ）、およびエリスロポエチンとの反応によって形成されるヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、接合前のエリスロポエチンと比較した場合に改良された生体安定性を示すという利点を有する。さらに、標準的なＢＲＰ−ＥＰＯよりも高い生物活性を示す。これは、主に、このヒドロキシアルキルデンプン誘導体が肝臓および腎臓の除去系によってあまりまたは全く認識されないため、より長期間循環系に存在し続けるという事実に起因する。さらに、ＨＡＳは結合部位特異的であるので、ＨＡＳのＥＰＯへの接合によるＥＰＯのインビボ生物活性の破壊リスクが最小になる。
インビトロ生物活性はＥＰＯ受容体に対する結合親和性のみを測定するので、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体は、組換え未変性ＥＰＯと本質的に同一のインビトロ生物活性を示し得る。インビトロ生物活性の決定方法は、当分野で公知である。
さらに、ＨＡＳ−ＥＰＯは、接合体化の出発物質として使用したＥＰＯ（接合されていないＰＯ）よりも高いインビボ活性を示す。インビボ生物活性の決定方法は、当分野で公知である。
接合されていないＥＰＯのインビボ活性を１００％とした場合、ＨＡＳ−ＥＰＯ接合体は、１１０〜５００％、好ましくは３００〜４００％、または好ましくは１１０〜３００％、より好ましくは１１０〜２００％、より好ましくは１１０〜１８０％、または１１０％〜１５０％、最も好ましくは１１０〜１４０％のインビボ活性を示し得る。
Ａｍｇｅｎの高シアリル化ＥＰＯ（欧州特許第４２８２６７Ｂ１号を参照）と比較して、高シアリル化ＥＰＯのインビボ活性を１００％とした場合、ＨＡＳ−ＥＰＯは、高シアリル化ＥＰＯのインビボ活性の好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、または少なくとも９５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、または少なくとも３００％を示す。より好ましくは、高シアリル化ＥＰＯのインビボ活性の少なくとも９５％を示す。
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体の高インビボ生物活性は、主に、肝臓の除去系による認識が低く、且つより高い分子量により腎臓クリアランスが減少するので、ＨＡＳ−ＥＰＯ接合体が非接合体化ＥＰＯよりも長く循環系に保持されるという事実に由来する。循環系中のＥＰＯのインビボ半減期の決定方法は、当分野で公知である（Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ，Ｌｕｎｎ，Ｄａｖｉｓ，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｓｉｅｋｍａｎ，１９９８，Ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｄｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（３），１１８４−８）。
したがって、現在市販されているＥＰＯ製剤よりも低頻度で投与することができるＨＡＳ−ＥＰＯ接合体が得られることが本発明の大きな利点である。標準的なＥＰＯ製剤が少なくとも３日毎に投与しなければならないのに対して、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体は、好ましくは１週間に２回、より好ましくは１週間に１回投与される。
さらに、本発明の方法は、最終収率が低くなる大規模且つ時間のかかる精製ステップを含まない（例えば、インビボ生物活性が低いか全くないことが公知の低シアリル化ＥＰＯ形態を精製する必要がない）ので、有効なＥＰＯ誘導体を低コストで生成することができるという利点を有する。詳細には、実施例８．１１（ｄ）は、低修飾工程で精製されたＨＥＳ−ＥＰＯが標準ＢＲＰ ＥＰＯの３倍の活性を示すことを証明している。
本発明のさらに別の目的は、治療有効量の本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体を含む薬学的組成物を提供することにある。
さらに、本発明は、治療有効量の本発明のＨＡＳ−ポリペプチド接合体、好ましくはＨＡＳ−ＥＰＯ接合体、より好ましくはＨＥＳ−ＥＰＯ接合体を含む薬学的組成物に関する。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、エリスロポエチン治療で有用な少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、および／またはキャリアをさらに含む。
したがって、本発明は、また、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができる治療有効量のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む薬学的組成物において、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
Figure 2006505635
 の構造を有し、該製造方法が、
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化合物（Ｌ）と反応するステップ、または
式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンとその必要に応じて酸化された還元末端での化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物（Ｌ）と反応するステップを含んでなり、
前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基からなる群から選択され、
前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法が、ヒドロキシアルキルデンプン、化合物（Ｌ）、および必要に応じて化合物（Ｄ）を含む反応生成物をさらなる化合物（Ｍ）と反応させるステップを更に含み、
前記少なくとも１つのさらなる化合物がポリペプチドである、
薬学的組成物に関する。
さらに、本発明は、貧血障害もしくは造血機能障害またはこれらの関連疾患の治療薬の調製のための上述のヒドロキシアルキルデンプン誘導体の使用に関する。
好ましい実施形態によれば、ポリペプチドがアンチトロンビン（ＡＴ）、好ましくはＡＴ ＩＩＩである上記薬学的組成物に関する（Ｌｅｖｙ ＪＨ，Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ Ａ，Ｚｉｏｍｅｋ ＣＡ，Ｅｃｈｅｌａｒｄ Ｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２７，４（２００１）４０５−４１６；Ｅｄｍｕｎｄｓ Ｔ，Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ ＳＭ，Ｐｏｌｌｏｃｋ Ｊ，Ｈａｎｓｏｎ Ｅ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ Ｒ，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｅ，Ｍａｎａｖａｌａｎ Ｐ，Ｚｉｏｍｅｋ Ｃ，Ｍｅａｄｅ Ｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｊ，Ｃｏｌｅ ＥＳ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｂｌｏｏｄ ９１，１２（１９９８）４６６１−４６７１；Ｍｉｎｎｅｍａ ＭＣ，Ｃｈａｎｇ ＡＣＫ，Ｊａｎｓｅｎ ＰＭ，Ｌｕｂｂｅｒｓ ＹＴＰ，Ｐｒａｔｔ ＢＭ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＢＧ，Ｔａｙｌｏｒ ＦＢ，Ｈａｃｋ ＣＥ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｂ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｂｌｏｏｄ ９５，４（２０００）１１１７−１１２３；Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ ＳＭ，Ｈａｎｓｏｎ ＥＨ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ Ｒ，Ｚｈａｎｇ Ｋ，Ｍａｎａｖａｌｎ Ｐ，Ｃｏｌｅ ＥＳ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＪＭ，Ｅｄｍｕｎｄｓ Ｔ，Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４，１５（１９９９）１０２６８−１０２７６）。
他の好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリペプチドがＧ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−βである薬学的組成物に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ポリペプチドがエリスロポエチンである上記の薬学的組成物に関する。
さらなる実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが−ＳＨであり、前記化合物（Ｌ）が一般式Ｚ1−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、Ｌ’は存在しない、上記の薬学的組成物に関する。
好ましい実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物（Ｌ）が一般式Ｚ1−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’は、メチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、Ｌ’は存在しない、上記の薬学的組成物に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙが−ＳＨであり、前記化合物（Ｄ）が一般式Ｚ1−Ｄ’−Ｗの化合物であり、前記化合物（Ｌ）が一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が上記の活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記Ｄ’がＺ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、Ｄ’は存在せず、前記Ｌ’がＺ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、前記Ｌ’は存在しない、上記の薬学的組成物に関する。
さらに別の実施形態によれば、本発明は、官能基Ｙがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物（Ｄ）が一般式Ｚ1−Ｄ’−Ｗの化合物であり、前記化合物（Ｌ）が一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
Figure 2006505635
 （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が上記の活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
Figure 2006505635
Figure 2006505635
 （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
からなる群から選択され、前記Ｄ’がＺ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、前記Ｄ’は存在せず、前記Ｌ’がＺ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、前記Ｌ’は存在しない、上記の薬学的組成物に関する。
特に実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシエチルデンプンを、水性媒体で以下の式：
Figure 2006505635
 の化合物と反応させ、反応生成物をエリスロポエチンと反応させる上記の薬学的組成物に関する。
さらにより好ましい実施形態によれば、本発明は、エリスロポエチンを反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する上記の薬学的組成物に関する。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、エリスロポエチンを部分的に脱シアリル化し、その後反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する上記の薬学的組成物に関する。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、実施例６の完全に還元されたチオ−ＥＰＯに基づいて生成されたヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む薬学的組成物を除く。
上記薬学的組成物は、貧血障害もしくは造血機能障害またはこれらの関連疾患の治療に特に適切である。
本明細書中で使用される、「治療有効量」は、所与の病態および投薬計画に治療効果が得られる量をいう。エリスロポエチンイソ型の投与は、非経口経路によることが好ましい。選択した特定の経路は、治療を受ける病態に依存する。適切なキャリア（ヒト血清アルブミンなど）、適切な希釈剤（緩衝化生理食塩水など）、および／または適切なアジュバントを含む処方物の一部としてエリスロポエチンイソ型の投与を行うことが好ましい。必要な投薬量は、患者のヘマトクリット値を上昇させるのに十分な量であり、治療を受ける病態の重症度および使用する投与方法などに依存して変化する。
本発明の薬学的組成物での治療目的は、好ましくは、６．８ｍｍｏｌ／ｌより多くの血中ヘモグロビン値の増加である。これのために、薬学的組成物を、ヘモグロビン値が０．６ｍｍｏｌ／ｌ／週〜１．６ｍｍｏｌ／ｌ／週との間に増加する方法で投与することができる。ヘモグロビン値が８．７ｍｍｏｌ／ｌを超える場合、好ましくは、ヘモグロビン値が８．１ｍｍｏｌ／ｌ未満になるまで治療を中断するべきである。
本発明の組成物を、好ましくは、皮下、静脈内、または非経口注射に適切な処方物中で使用する。これのために、適切な賦形剤およびキャリアは、例えば、注射用のリン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ＨＳＡ、および水である。組成物を、１週間に３回、好ましくは１週間に２回、より好ましくは１週間に１回、最も好ましくは２週間毎に投与することができる。
好ましくは、０．０１〜１０μｇ／患者体重、より好ましくは０．１〜５μｇ／ｋｇ体重、０．１〜１μｇ／ｋｇ体重、または０．２〜０．９μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．３〜０．７μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．４〜０．６μｇ／ｋｇ体重の量の薬学的組成物を投与する。
一般に、好ましくは投薬あたり１０μｇ〜２００μｇ、好ましくは１５μｇ〜１００μｇの投薬量を投与する。
本発明は、さらに、ヒトまたは動物の治療方法で用いるための本発明のＨＡＳ−ポリペプチドに関する。
本発明は、さらに、貧血障害もしくは造血機能障害またはこれらの関連疾患の治療薬の調製のための本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ接合体の使用に関する。
本発明で使用される化合物（Ｌ）が１つ以上のキラル中心を含む場合、化合物（ＩＩ）はＲ体もしくはＳ体中または各キラル中心に関するラセミ化合物として存在し得る。
本発明で必要に応じて使用される化合物（Ｄ）が１つ以上のキラル中心を含む場合、化合物（Ｄ）はＲ体もしくはＳ体中または各キラル中心に関するラセミ化合物として存在し得る。
本発明は、以下の実施例、表、および図面によってさらに例示されるが、これらは本発明の範囲を決して制限しない。
実施例１．酸化されていない還元末端の還元的アミノ化によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
実施例１．１ ヒドロキエチルデンプンと１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンとの反応
Figure 2006505635
 ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）および５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られた混合物を、８０°Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン溶液への０．８３ｍｍｏｌの１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５℃で３日間行った。
実施例１．２ ヒドロキエチルデンプンと１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンとの反応
Figure 2006505635
 ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）および５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られた混合物を、８０°Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプンへの０．８３ｍｍｏｌの１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５℃で３日間行った。
１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンとＨＥＳとの反応を、Ｇ．Ａｖｉｇａｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４（１９８３）４４９−５０４に記載の過ヨウ素酸塩による反応生成物中の１，２−ジオールの酸化的切断に起因するホルムアルデヒドの定量によって間接的に確認した。
実施例１．３ ヒドロキエチルデンプンと１，４−ジアミノブタンとの反応
Figure 2006505635
 ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１，４−ジアミノブタン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）および５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られた混合物を、８０°Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプンへの０．８３ｍｍｏｌの１，４−ジアミノブタンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５℃で３日間行った。
実施例１．４ ヒドロキエチルデンプンと１−メルカプト−２−アミノエタンとの反応
Figure 2006505635
 ａ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４））を含む５ｍｌ水溶液に、０．８３ｍｍｏｌの１−メルカプト−２−アミノエタン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）および５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）を添加した。得られた混合物を、８０°Ｃで１７時間インキュベートした。１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
ｂ）２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン溶液への０．８３ｍｍｏｌの１−メルカプト−２−アミノエタンおよび５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを２５℃で３日間行った。
実施例２．非酸化還元末端との接合体化によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
実施例２．１ ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
Figure 2006505635
 ０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのカルボヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を添加した。２５℃で１８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
実施例２．２ ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジド（ａｄｅｐｉｃ ｄｉｈｙｄｒａｚｉｄｅ）との反応
Figure 2006505635
 ０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのアジピン酸ジヒドラジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を添加した。２５℃で１８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
実施例２．３ ヒドロキシエチルデンプンと１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジドとの反応
Figure 2006505635
 ０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌの１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を添加した。２５℃で１８時間の撹拌後、反応混合物に８ｍｌの水を添加し、懸濁液を４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。透明な上清を捨て、その後１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍｌの水に再溶解し、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。透明な上清を、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
実施例２．４ ヒドロキシエチルデンプンとＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンとの反応
Figure 2006505635
 Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３（１９９７）ｐ．５４８５−５４９２に記載のように、市販の材料から２工程でＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した。
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（分子量１８，０００Ｄ、ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを添加した。２５℃で１８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
実施例３．酸化還元末端との反応によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
実施例３．１ ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
Figure 2006505635
 ０．１２ｍｍｏｌのオキソ−ＨＥＳ １０／０．４（分子量１０，０００ Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６ ２８ ７０５ Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１５ｍｍｏｌのカルボヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含む１５ｍｌ ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。６５℃で８８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
実施例３．２ ヒドロキシエチルデンプンと１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジドとの反応
Figure 2006505635
 ０．１２ｍｍｏｌのオキソ−ＨＥＳ １０／０．４（分子量１０，０００ Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６ ２８ ７０５ Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１５ｍｍｏｌの１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を含む１５ｍｌ ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。６５℃で８８時間の撹拌後、１６０ｍｌのアセトンとエタノールの冷１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｄ）、凍結乾燥させた。
実施例３．３ ヒドロキシエチルデンプンとヒドラジドとの反応
Figure 2006505635
 １．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ １０／０．４（分子量１０，０００ Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６ ２８ ７０５ Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、０．４７ｍｌ（１５ｍｍｏｌ）のヒドラジドを含む１５ｍｌ ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。４０℃で１９時間の撹拌後、１６０ｍｌのエタノールとアセトンの１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍＬの水に再溶解し、０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
実施例３．４ ヒドロキシエチルデンプンとヒドロキシルアミンとの反応
Figure 2006505635
 Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．に記載のように、市販の材料から２工程でＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した（Ｂｏｔｕｒｙｎ，Ｂｏｕｄａｌｉ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｌｈｏｍｍｅ，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，５４８５）。
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ １０／０．４（分子量１０，０００ Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６ ２８ ７０５ Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、２．０４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを含む１５ｍｌ ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。６５℃で４８時間の撹拌後、１６０ｍｌのエタノールとアセトンの１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、４０ｍＬの水に再溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
実施例３．５ ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジドとの反応
Figure 2006505635
 １．７４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のアジピン酸ジヒドラジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ，Ｄ）を６５℃の２０ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ １０／０．４（分子量１０，０００ Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６ ２８ ７０５ Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、窒素下で滴下した。６０℃で６８時間の撹拌後、２００ｍｌの水に反応混合物を添加した。反応生成物を含む溶液を、０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
実施例３．６ ヒドロキエチルデンプンと１，４−ジアミノブタンとの反応
Figure 2006505635
 １．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ １０／０．４（分子量１０，０００ Ｄ、ＤＳ＝０．４、ドイツ特許第１９６ ２８ ７０５ Ａ１号にしたがって調製）を３ｍｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１．５１ｍｌ（１５ｍｍｏｌ）の１，４−ジアミノブタン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含む１５ｍｌ ＤＭＳＯの混合物に窒素下で滴下した。４０℃で１９時間の撹拌後、１６０ｍｌのエタノールとアセトンの１：１混合液（ｖ／ｖ）に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物（Ａｍｉｎｏ−ＨＥＳ１０ＫＤ／０．４）を回収し、４０ｍＬの水に再溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
実施例４．エリスロポエチンの酸化
実施例８に記載のように酸化エリスロポエチンを生成した。酸化エリスロポエチンとして、実施例８．１１（ｃ）に記載のＥＰＯ−ＧＴ−１を使用した（酸加水分解していない、マイルド過ヨウ素酸塩酸化したＥＰＯ−ＧＴ−１）。
実施例５．ヒドロキシエチルデンプン誘導体と実施例４の酸化エリスロポエチンとの接合体化
実施例５．１ 酸化エリスロポエチンと実施例２．１の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例２．１で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１８ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図１に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例５．２ 酸化エリスロポエチンと実施例２．３の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例２．３で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１８ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。
実施例５．３ 酸化エリスロポエチンと実施例２．４の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例２．４で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１８ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図２に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例５．４ 酸化エリスロポエチンと実施例３．１の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例３．１で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１０ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図３に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例５．５ 酸化エリスロポエチンと実施例３．２の反応生成物との反応
酸化ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を含む２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を、５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調整した。１９μｌのＥＰＯ溶液、実施例３．１で生成された１８μｌのＨＥＳ誘導体溶液（分子量１０ｋＤ；１８．７μｇ／μｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２））を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図３に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例６．エリスロポエチンの還元によるチオ−ＥＰＯの形成
２４１．５μｇのエリスロポエチン（ＥＰＯ−ＧＴ−１、実施例８を参照のこと）を含む５００μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｍｏｒｃａｍｂｅ，ＵＫ）（ｐＨ８．３）を３７℃で１時間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（１０ ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＤＴＴを除去し、その後ホウ酸緩衝液で３回およびリン酸緩衝液で２回洗浄した（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実施例７．架橋化合物を使用したヒドロキシエチルデンプン誘導体とチオエリスロポエチンとの接合体化
以下の各実施例では、架橋化合物としてＮ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）
Figure 2006505635
 を使用した。
実施例７．１ チオエリスロポエチンと実施例２．１の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．１にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図４に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．２ チオエリスロポエチンと実施例２．２の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．２にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．３ チオエリスロポエチンと実施例２．３の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．３にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．４ チオエリスロポエチンと実施例２．４の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例２．４にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図４に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．５ チオエリスロポエチンと実施例１．１の反応生成物および架橋化合物との反応
８０℃で１７時間および２５℃で３日間のインキュベーション条件で実施例１．１にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．６ チオエリスロポエチンと実施例１．３の反応生成物および架橋化合物との反応
８０℃で１７時間および２５℃で３日間のインキュベーション条件で実施例１．３にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加した。透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｄ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によって残存するＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、実施例５にしたがって生成した１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図５に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．７ チオエリスロポエチンと実施例３．１の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例３．１にしたがって生成し、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．８ チオエリスロポエチンと実施例３．２の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例３．２にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．９ チオエリスロポエチンと実施例３．３の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例３．３にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．１０ チオエリスロポエチンと実施例３．４の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例３．４にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．１１ チオエリスロポエチンと実施例３．５の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例３．５にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例７．１２ チオエリスロポエチンと実施例３．６の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例３．６にしたがって生成し、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、９．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２））に溶解した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体に、１０μｌの２．５μｍｏｌ ＡＭＡＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｄ）を含むＤＭＳＯを添加し、透明な溶液を、２５℃で８０分間および４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮機（５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した１３，０００ｒｐｍでの遠心分離濾過によってＡＭＡＳを除去し、リン酸緩衝液で４回および３０分間洗浄した。
残存溶液に、１５μｇのチオＥＰＯ（１μｇ／μｌを含むリン酸緩衝液）を添加し、混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された説明書に記載のように、ＮｕＰＡＧＥ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。ゲルを、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。より高い分子量へのタンパク質バンドの移動によって首尾の良い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布およびタンパク質に結合したＨＥＳ誘導体数に起因する。
実施例８．ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体の予備生成
まとめ
組換えヒトＥＰＯのオリゴサッカリド鎖上の酸化シアル酸残基への部分的な（マイルド過ヨウ素酸塩）ＨＥＳ誘導体（平均分子量１８，０００ダルトン；ヒドロキシエチル置換度０．４）のカップリングによってＨＥＳ−ＥＰＯを合成した。炭水化物構造分析に基づいて、マイルド酸処理ＨＥＳ修飾グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって未修飾ＥＰＯ生成物で見出される鎖と区別不可能なインタクトな中性Ｎ−アセチルラクトサミン鎖型が明らかとなったので、導入された修飾はコアオリゴサッカリド鎖の構造の完全性に影響を与えなかった。得られた結果は、事前にシアル酸を部分的に除去しない修飾に供したＥＰＯ調製物の場合、ＥＰＯ分子あたり少なくとも３つの修飾ＨＥＳ残基が結合することを示す。前者タンパク質の約５０％のシアル酸残基を欠くＥＰＯ変異型は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて類似の見かけ上の高分子量への移動度を示した（ＢＲＰ ＥＰＯ標準について４０ｋＤａに対して６０〜１１０ｋＤａ）。ＨＥＳ修飾ＥＰＯは、室温、ｐＨ３〜１０での標準的なイオン交換クロマトグラフィ条件下で安定である。
正赤血球症（ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃ）マウス系におけるＥＰＯバイオアッセイは、欧州薬局方のＵＶ吸収値を使用したタンパク質測定およびＢＲＰ ＥＰＯ標準調製物に対して較正したＲＰ−ＨＰＬＣ ＥＰＯタンパク質測定法に基づく国際ＢＲＰ ＥＰＯ参照標準と比較した場合、このアッセイおいてＨＥＳ修飾ＥＰＯの比活性（ＩＵ／ｍｇ）が２．５〜３．０倍であることを示す。
実施例８．１ 材料と方法
（ａ）Ｎ−グリコシダーゼでの消化によるＮ結合オリゴサッカリドの遊離
サンプルを、２５単位（製造者の説明書に従う、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の組換えＰＮＧアーゼＦと３７℃で一晩インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質の特定の移動度シフトによって完全な消化をモニタリングした。３倍体積の冷１００％エタノールの添加および−２０℃で少なくとも２時間のインキュベーションによって遊離したＮ−グリカンをポリペプチドから分離した（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。沈殿したタンパク質を、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって取り出した。次いで、ペレットを、５００μｌの氷冷７５％エタノールを含む２つのさらなる洗浄に供した。プールした上清中のオリゴサッカリドを真空遠心分離機（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮機、Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で乾燥させた。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（２５ｍｇまたは１００ｍｇのＨｙｐｅｒＣａｒｂ）を以下のように使用して、使用前にグリカンサンプルを脱塩した。カラムを３×５００μｌの８０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含む０．１％ＴＦＡで洗浄およびその後３×５００μｌの水で洗浄した。サンプルを前に水で最終体積３００μｌ〜６００μｌに希釈し、その後カートリッジにロードし、水で強く洗浄した。０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）を含む１．２ｍｌ（２５ｍｇカートリッジ；１００ｍｇカートリッジの場合、１．８ｍｌ）の２５％アセトニトリル水でオリゴサッカリドを溶離した。溶離したオリゴサッカリドを、２Ｍ ＮＨ4ＯＨで中和し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮機で乾燥させた。いくつかの場合、１００μｇ未満の総（糖）タンパク質サンプル由来の消化混合物の１００ｍｇ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジへの吸着によってＮ−グリコシダーゼ遊離オリゴサッカリドを脱塩した。
（ｂ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ）によるオリゴサッカリドの分析
Ｂｒｕｋｅｒ ＵＬＴＲＡＦＬＥＸ飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）装置を使用した。陽イオンモードおよび陰イオンモード（両方の場合、反射を使用する）におけるＵＶ吸収材料として２，５−ジヒドロキシ安息香酸を使用して未変性脱シアリル化オリゴサッカリドを分析した。ＭＳ−ＭＳ分析のために、選択した親イオンを、レーザー誘起解離（ＬＩＤ）に供し、得られたフラグメントイオンを装置の第２のＴＯＦステージ（ＬＩＦＴ）によって分離した。１μｌで概算濃度１〜１０ｐｍｏｌμｌ-1のサンプル溶液を、等量の各マトリックスと混合した。この混合物を、ステンレススチール製の標的にスポッティングし、分析前に室温で乾燥させた。
実施例８．２ 組換えヒトＥＰＯ（ＥＰＯ−ＧＴ−１）の調製および特徴づけ
記載のようにＥＰＯを組換えＣＨＯ細胞から発現させ（Ｍｕｅｌｌｅｒ ＰＰ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｄｏｒｎｅｒ ＡＪ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、欧州薬局方に記載の方法にしたがって調製物を特徴付けた（Ｐｈ．Ｅｕｒ．４，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ ０１／２００２：１３１６：Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。タンパク質ｎＭｏｌあたりの最終生成物のシアル酸含有量は、１２ｎＭｏｌ（＋／−１．５ｎＭｏｌ）であった。Ｎ結合オリゴサッカリドの構造を、記載のようにＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって決定した（Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，１９９９）。得られたＥＰＯ調製物は、ジ、トリ、およびテトラシアリル化オリゴサッカリド（それぞれ、２〜１２％、１５〜２８％、および６０〜８０％であり、硫酸化およびペンタシアリル化鎖が少量存在していた）を含んでいた。ＥＰＯ調製物の全体的なグリコシル化特性は、国際ＢＲＰ ＥＰＯ標準調製物の特性と類似していた。
組換えＥＰＯの等電点電気泳動パターンは、対応するイソ型を示す国際ＢＲＰ基準ＥＰＯ標準調製物のパターンと類似していた。２５％のＥＰＯタンパク質は、ポリペプチド鎖のＳｅｒ126にＯ−グリコシル化を欠いていた。
実施例８．３ 部分的に脱シアリル化されたＥＰＯ形態の調製
ＥＰＯ ＧＴ−１タンパク質（２．８４ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で８０℃に加熱し、１ｍｌのＥＰＯ溶液あたり１００μｌの１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を添加し、それぞれ５分間、１０分間、および６０分間インキュベーションし続け、異なるシアリル化度のＥＰＯ調製物を得た。ポリペプチドＮ−グリコシダーゼでのオリゴサッカリドの遊離後に０〜４個のシアル酸を有するオリゴサッカリドを定量し、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（２５ｍｇ ＨｙｐｅｒＳｅｐ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ；ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，ＵＫ）を使用した脱塩によってＮ結合鎖を単離した。１Ｎ ＮａＯＨの添加によってＥＰＯ調製物を中和し、液体Ｎ2中で凍結し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
実施例８．４ シアリル化ＥＰＯ形態の過ヨウ素酸塩酸化
３．５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解した１０ｍｇの未処理またはマイルド酸処理ＥＰＯに、１．５ｍｌの０．１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を添加し、混合物を氷浴中で０℃に冷却した；５００μｌの１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、反応混合物を、暗所にて０℃で６０分間保持した。次いで、１０μｌのグリセロールを添加し、インキュベーションを暗所でさらに１０分間継続した。固定角ローターを具備した実験用遠心分離機における製造者の説明書にしたがった３０００ｒｐｍでＶＩＶＡＳＰＩＮ濃縮機（１０，０００ ＭＷＣＯ，ＰＥＳ Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ ＡＧ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した脱塩によって部分酸化ＥＰＯ型を試薬から分離した。液体窒素中での凍結後、ＥＰＯ調製物を最終体積４ｍｌで−２０℃にて保存した。
１００μｇアリコートの部分酸化ＥＰＯ調製物を、Ｎ−グリコシダーゼ処理に供し、記載のようにＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを使用してオリゴサッカリドを単離した。オリゴサッカリドをマイルド酸処理によって脱シアリル化し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析し、記載のようにその保持時間を信頼のおける標準オリゴサッカリドの保持時間と比較した（Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０ ａｎｄ １９９３）。
実施例８．５ ＥＰＯジスルフィドのジチオエリトリトールでの還元
５ｍｇのＥＰＯ−ＧＴ−１を、３０ｍＭジチオエリトリトール（ＤＴＴ）の存在下で５ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１）中にて３７℃で６０分間インキュベートし、４℃のＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮機を使用し、緩衝液を４サイクル交換してＤＴＴを除去した。最終還元ＥＰＯ調製物を液体窒素中で凍結し、−２０℃の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で保存した。
実施例８．６ ＥＰＯタンパク質の測定
欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ４，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ ０１／２００２：１３１６：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にしたがった１ｃｍ光路のキュベット中での２８０ｎｍでのＵＶ吸収の測定によって、ＥＰＯタンパク質を定量的に測定した。さらに、ＲＰ−Ｃ４カラムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣ法の適用によってＥＰＯを定量した（Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４，カタログ番号２１４ＴＰ５４１０，Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ，Ｃａ，ＵＳ）；エリスロポエチンＢＲＰ１参照基準を使用して、ＨＰＬＣ法を較正した（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，Ｃｏｎｓｅｉｌ ｄｅ ｌ’Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｐ．９０７−Ｆ６７０２９，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ Ｃｅｄｅｘ １）。
実施例８．７ ガラクトースオキシダーゼでの脱シアリル化ＥＰＯの酸化
４．４８５ｍｇの完全に脱シアリル化されたＥＰＯを、１６μｌカタラーゼ（６２１４単位／２００ｍｌ）および８０μｌのガラクトースオキシダーゼ（ドクティリウム・デンドロイダス由来の２２５０単位／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））の存在下で２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中でインキュベートした；３７℃で一晩インキュベートした；インキュベーション開始から４時間後およ８時間後に２０μｌのガラクトースオキシダーゼを２回添加した。
実施例８．８ バイオアッセイ用のＥＰＯサンプルの調製
過ヨウ素酸塩またはガラクトースオキシダーゼ酸化ＥＰＯタンパク質調製物の活性化されたＨＥＳとのインキュベーション物からのＥＰＯの精製
ＥＰＯサンプルの精製（未反応ＨＥＳ誘導体の除去）を室温で行った。ＥＰＯインキュベーション混合物（約５ｍｇのＥＰＯタンパク質）を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｎ−モルホリンプロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ］を含む蒸留水（ｐＨ８．０））で１０倍希釈し、流速０．５ｍｌ／分で１０カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａで平衡化した３ｍｌ Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａコード番号１７−１０１４−０３、ロット番号２２０２１１）を含むカラムにアプライした。６〜８ＣＶの緩衝液Ａ（流速＝０．８ｍｌ／分）でカラムを洗浄し、流速０．５ｍｌ／分で緩衝液Ｂ（２０ｍＭモルホリンエタンスルホン酸［ＭＥＳ／ＮａＯＨ］、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む蒸留水（ｐＨ６．５））の使用によって溶離した。２８０ｎｍのＵＶ吸収によってＥＰＯを検出し、約６ｍｌで溶離した。３ＣＶの緩衝液Ｃ（ｐＨ６．５に調整した２０ｍＭ ＭＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌを含む蒸留水）の使用によってカラムを再生し、１０ＣＶの緩衝液Ａの使用によって再平衡化した（流速０．７ｍｌ／分）。
サンプルあたりそれぞれ３回の遠心分離サイクルを使用したＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮機およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程から得たＥＰＯ溶離物の緩衝液交換を行った；サンプルをＰＢＳで２ｍｌに調整し、−２０℃で保存した。
使用条件下で塩基性ＥＰＯ形態がＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合せず、未反応ＨＥＳ誘導体と共に通過したので、ＨＥＳ修飾に供した２５％未満の部分脱シアリル化およびその後マイルド過ヨウ素酸塩酸化ＥＰＯ形態のみがＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶離物から得られた。
実施例８．９ パルスドアンペロメトリー検出器を用いた高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）
精製未変性および脱シアリル化オリゴサッカリドを、パルスドアンペロメトリー検出器（ＰＡＤ）と組み合わせたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（０．４×２５ｃｍ）を備えたＤｉｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，ＵＳＡ）を使用した高ｐＨ陰イオン交換（ＨＰＡＥ）クロマトグラフィによって分析した（Ｓｃｈｒｏｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。検出器のポテンシャル（Ｅ）およびパルス幅（Ｔ）は、以下であった。Ｅ１：＋５０ｍＶ、Ｔ１：４８０ｍｓ；Ｅ２：＋５００ｍＶ，Ｔ２：１２０ｍｓ；Ｅ３：−５００ｍＶ，Ｔ３：６０ｍｓ、および出力範囲は５００〜１５００ｎＡであった。次いで、オリゴサッカリドを、１００％溶媒Ａで平衡化したＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムに注入した。脱シアリル化オリゴサッカリドのために、４０分間の溶媒Ｂの直線勾配（０〜２０％）およびその後の５分間の２０〜１００％の溶媒Ｂの直線的増加の適用によって溶離した（流速：１ｍｌ／分）。溶媒Ａは０．２Ｍ ＮａＯＨを含む蒸留水であり、溶媒Ｂは０．６Ｍ ＮａＯＡｃを含む溶媒Ａからなる。未変性オリゴサッカリドのために、カラムを１００％溶媒Ｃ（０．１Ｍ ＮａＯＨを含む蒸留水）で平衡化し、４８分間の溶媒Ｄの直線的勾配（０〜３５％）およびその後の１０分間の３５〜１００％の溶媒Ｄの直線増加の適用によって溶離した（流速：１ｍｌ／分）。溶媒Ｄは、０．６Ｍ 酢酸ナトリウムを含む溶媒Ｃからなる。
実施例８．１０ ＧＣ−ＭＳによるＮ−グリカン、ＨＥＳ修飾Ｎ−グリカン、およびＥＰＯタンパク質のモノサッカリド組成分析
メタノリシス、Ｎ−再アセチル化、およびトリメチルシリル化後の対応するメチルグリコシドとしてモノサッカリドをＧＣ／ＭＳによって分析した（Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｆ．（１９８２）Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，３３６−３４１）。３０ｍＤＢ５キャピラリーカラムを具備した陽イオンＥＩモードで運転するＦｉｎｎｉｇａｎＧＣＱイオントラップ質量分析器（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって分析を行った。温度プログラム：８０℃の等温で２分間、その後１０℃／分で３００度まで。
保持時間および特徴的な断片化パターンによってモノサッカリドを同定した。較正されていない電子的ピーク積分結果を定量に使用した。フラノイド型およびピラノイド型のアノメリシティ（ａｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）および／または存在に起因する１つを超えたピークが得られたモノサッカリドを、全ての主なピークの付加によって定量した。内部標準化合物として０．５μｇのミオイノシトールを使用した。
実施例８．１１ 結果
実施例８．１１（ａ）マイルド酸処理（部分脱アシル化）ＥＰＯ−ＧＴ−１のＮ−グリカンの特徴づけ
５分間、１０分間、または６０分間のマイルド酸処理に供したＥＰＯ−ＧＴ−１調製物を、図７に示すＮ−グリコシダーゼとのインキュベーションによるＮ結合オリゴサッカリドの遊離前および遊離後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｎ結合オリゴサッカリドを、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤオリゴサッカリドマッピングに供した（図８）。未処理ＥＰＯ−ＧＴ−１が３個または４個のシアル酸残基を有する９０％を超えるＮ結合オリゴサッカリドを含む一方で、マイルド酸の存在下での５分間のインキュベーション後では４０％未満の炭水化物鎖が３個または４個のシアル酸残基を有していた。脱シアリル化Ｎ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより、未処理ＥＰＯ−ＧＴ−１について検出された中性オリゴサッカリドの比が明らかとなり、５分間、１０分間、または６０分間の酸処理に供した調製物では安定なままである。脱シアリル化グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより、タンパク質のマイルド酸処理後に９０％を超える近位フコースが存在することが明らかとなった。
実施例８．１１（ｂ）過ヨウ素酸塩処理ＥＰＯ−ＧＴ−１の特徴づけ
予め酸に５分間および１０分間供したマイルド過ヨウ素酸処理ＥＰＯ形態または処理していないＥＰＯ形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度を図１０で比較する。シアル酸の過ヨウ素酸塩活性化に使用した条件は、ＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを変化させなかった（図７と比較）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によるシアル酸の酸化により、オリゴサッカリドがより早い溶離時間にシフトされた（図８および１１の比較）。
実施例８．１１（ｃ）ＨＥＳ修飾ＥＰＯ誘導体の特徴づけ
（ａａ）実施例２．４にしたがって生成されたヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体ＸでのＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＨＥＳ修飾の保持時間
４００μｇのヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘを２０μｇのＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ（マイルド過ヨウ素酸塩酸化前に酸加水分解されていないマイルド過ヨウ素酸塩酸化ＥＰＯ）を含む２０μＬの０．５Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）に添加し、３０分後、２時間後、４時間後、および１７時間後に液体窒素中でのサンプルの凍結によって反応をそれぞれ停止させた。その後サンプルをさらなる分析まで−２０℃で保存した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加し、サンプルを９０℃に加熱し、ＳＤＳゲルにアプライした。図１２に示すように、インキュベーション時間の増加により、タンパク質のより高い分子量へのシフトが増加した。ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘの存在下での１７時間のインキュベーション後、分子量標準の位置に基づいて、６０ｋＤａと１１ｋＤａとの間の領域に移動したクーマシー染色タンパク質バンドの拡散が検出された（図１２の左部を参照のこと）。Ｎ−グリコシダーゼでの処理中、ほとんどのタンパク質が脱Ｎグリコシル化ＥＰＯの位置に向かってシフトした（図１２の右のゲルを参照のこと；矢印ＡはＮ−グリコシダーゼの移動位置を示し、矢印Ｂは脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯの移動位置を示す；２８ＫＤａと３６ＫＤａとの間の分子量標準領域中に認められる拡散タンパク質バンドは、おそらくＨＥＳおよび分子のＯ−グリコシル化部位によって修飾されたＥＰＯ形態を示す）。Ｎ−グリコシダーゼの特異性を考慮して、この結果から、ＨＥＳ修飾が実際にＥＰＯタンパク質のグリカンの過ヨウ素酸塩酸化シアル酸残基で起こると結論付けた。
（ｂｂ）ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体の特徴づけ
ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体Ｉ（マイルド過ヨウ素酸塩酸化後のＥＰＯ−ＧＴ−１（すなわち、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ）を起源とする）、ＩＩ（５分間の酸加水分解およびマイルド過ヨウ素酸塩酸化に供したＥＰＯ−ＧＴ−１に由来する）、ＩＩＩ（１０分間の酸加水分解およびマイルド過ヨウ素酸塩酸化に供したＥＰＯ−ＧＴ−１に由来する）を、上記のように合成した。コントロールインキュベーション（Ｋ）は、等量の未修飾ＨＥＳを添加した同一の緩衝液条件下で未修飾ＥＰＯ−ＧＴ−１を含んでいた。インキュベーション混合物を、ＨＥＳ−ＥＰＯ誘導体のその後の生化学分析のためのさらなる精製に供した。
インキュベーション物であるＨＥＳ−ＥＰＯ接合体Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩならびにコントロールインキュベーションＫを、イオン交換カラムでを通過すると予想される過剰な未反応のＨＥＳ試薬を除去するために、「材料と方法」（実施例８．８）に記載のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製工程に供した。前に酸処理したサンプルＩＩおよびＩＩＩ中に含まれる大量の塩基性ＥＰＯ形態のために、本発明者らは、これらのインキュベーション由来の大量の修飾ＥＰＯ生成物が通過すると予想した。図１３に示すように、サンプルＩ由来のほとんど全てのＥＰＯ材料がＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに保持される一方で、高塩濃度で溶離した画分中には約２０〜３０％のサンプルＩＩＩおよびＩＩしか回収されなかった。高塩濃度での通過物および溶離画分中のＨＥＳ誘導体Ｘとのインキュベーション由来の全てのタンパク質材料は、コントロールＥＰＯと比較した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて見かけ上より高い分子量を示した。
ＨＥＳ修飾ＥＰＯをより詳細に特徴付けるために、サンプルＡおよびＫ（図１１を参照のこと）を、過ヨウ素酸塩酸化形態ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａと比較した。サンプルを、Ｎ−グリコシダーゼ処理に供し、図１４ａおよび１４ｂに示すように、Ｎ−グリカンの遊離により、標準ＥＰＯ調製物のＯ−グリコシル化および非グリコシル化ＥＰＯ形態の位置に２つの低分子量バンドが得られた。サンプルＡの場合、２８ＫＤａの分子量標準の位置に移動したさらなるバンドが検出され、このＥＰＯ変異型のＯ−グリカンでのＨＥＳ修飾が示唆される（実施例８．１１（ｃ）（ａａ）を参照のこと）。このバンド（およびＮ−グリコシル化ＥＰＯの高ＨＥＳ修飾高分子量形態、図１４ａおよび１４ｂを参照のこと）は、サンプルのマイルド酸加水分解後に消失し、これは、エリスロポエチンの過ヨウ素酸塩酸化シアル酸残基でＨＥＳ修飾が起こるという見解と一致する。
Ｎ−グリコシダーゼインキュベーション混合物のアリコートを、オリゴサッカリドからシアル酸残基（およびシアル酸結合ＨＥＳ誘導体）を完全に除去することができる条件下で加水分解し、中和後混合をその脱塩のために小Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムに吸着させた。カラムを水で強く洗浄し、その後結合した中性オリゴサッカリドを０．１％のトリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリル水で溶離した。得られたオリゴサッカリドを、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳに供した。サンプルＡ，ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ、およびサンプルＫ由来の脱シアリル化オリゴサッカリド画分のスペクトルにより、ｍ／ｚ＝１８１０Ｄａ（２触角型）、２１７５＝３触角型、２５４０＝４触覚型、２９０６＝４触角型＋１Ｎ−アセチルラクトサミン反復、および３２７１＝４触角型＋２Ｎ−アセチルラクトサミン反復での複合体型のオリゴサッカリドについて同一の分子量が示された；シアル酸除去に供した酸加水分解条件に寄与するフコース（−１４６）およびガラクトース（−１６２）の消失に対応する小シグナルが検出された（ＭＡＬＤＩ−図１７、１８、および１９を参照のこと）。
並行実験では、Ｎ−グリコシダーゼ消化混合物を１ｍｌ ＲＰ−Ｃ１８カートリッジ上に吸着させ（オリゴサッカリドを事前に酸加水分解しない）、０．１％ＴＦＡを含む５％アセトニトリル水で溶離した；これらの条件下で、ＥＰＯタンパク質はＲＰ−材料上に完全に保持され、オリゴサッカリドを、０．１％ＴＦＡを含む５％アセトニトリル水でカラムから洗浄した。脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯタンパク質を、０．１％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル水で溶離した。Ｎ−グリコシダーゼ処理サンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ、およびサンプルＫのＲＰ−Ｃ１８工程由来のオリゴサッカリド画分を中和し、上記のＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを使用した脱塩に供した。単離オリゴサッカリドを、グルカンからシアル酸を定量的に除去することができる条件下でのマイルド酸処理前（図１５を参照のこと）および処理後にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッピングに供した（図１６を参照のこと）。
ＨＥＳ修飾サンプルＡから得た未変性材料についてのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロフィールにより、オリゴサッカリドについては僅かなシグナルしか示さなかったが、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ誘導オリゴサッカリドは図１１と同一のグリカンプロフィールを示した（マイルド過ヨウ素酸塩処理後にＥＰＯ−ＧＴ−１と名づけたサンプル）。コントロールＥＰＯサンプル（Ｋ）から得たオリゴサッカリドの溶離プロフィールにより、予想パターンが得られた（図８中のプロフィールと比較）。比較のために、比較および参照標準として、国際ＢＲＰ−ＥＰＯ標準の未変性オリゴサッカリドプロフィールが含まれる。
マイルド酸加水分解後、全てのオリゴサッカリド調製物は、本研究で出発材料として使用したＥＰＯ調製物についての方法に記載の２、３、および４触角複合物型炭水化物鎖の予想される定性的および定量的組成を有する中性オリゴサッカリド構造（図１６を参照のこと）と同一の溶離プロフィールを示した。この結果は、ＥＰＯサンプルのＨＥＳ修飾によりＮ−グリコシダーゼによるＥＰＯ−タンパク質から脱離されたＨＥＳ誘導体の共有結合が得られ、脱シアリル化炭水化物に公知のマイルド酸処理条件を使用してＮ−グリカンを除去するので酸に不安定であることを証明する（図１４ａ＋ｂを参照のこと）。
（ｃｃ）ＧＣ−ＭＳによるＨＥＳ−ＥＰＯおよびＨＥＳ−ＥＰＯ Ｎ−グリカンのモノサッカリド組成分析
分子のＮ−グリカンでのＥＰＯのＨＥＳ修飾をさらに確認するために、ＥＰＯサンプルをＮ−グリコシダーゼで消化し、ＥＰＯタンパク質をＲＰ−Ｃ１８カートリッジに吸着させる一方で、上記のようにオリゴサッカリド材料を洗浄した。表２に示すように、システイン残基のＨＥＳ修飾に供したＥＰＯタンパク質およびＥＰＯサンプルＡ２のオリゴサッカリド画分のみでグルコースおよびヒドロキシエチル化グルコース誘導体が検出された。
実施例８．１１（ｄ）ＨＥＳ修飾ＥＰＯの生物活性のインビボアッセイ
欧州薬局方に記載の手順にしたがって正赤血球症マウス系指標におけるＥＰＯ−バイオアッセイを行った；ＥＰＯアッセイを行った実験では、国際ＢＲＰ ＥＰＯ参照基準調製物を使用した。ＨＥＳ修飾ＥＰＯＡ２調製物のために、２９４，６００単位／ｍｇＥＰＯタンパク質の比活性平均値が測定され、これは、活性アッセイのために得たサンプル中に含まれる国際ＢＲＰ ＥＰＯ参照基準調製物と比較した場合に約３倍の比活性を示す。
研究結果を、表３にまとめる。
実施例１〜８の参考文献
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Ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｐｈ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．
Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２ Ｊｕｎ；２０３（２）：２８１−９

Ｓｃｈｒｏｔｅｒ Ｓ，Ｄｅｒｒ Ｐ，Ｃｏｎｒａｄｔ ＨＳ，Ｎｉｍｔｚ Ｍ，Ｈａｌｅ Ｇ，Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ．
Ｍａｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ５２．
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｏｃｔ．１５；２７４（４２）：２９８６２−７３
実施例９．組換えＥＰＯの産生
（Ａ）哺乳動物細胞での産生
以下のようにＣＨＯ細胞中に組換えＥＰＯを産生した。
ヒトＥＰＯｃＤＮＡを保有するプラスミドを、真核生物発現ベクター（ｐＣＲ３およびその後ｐＣＲＥＰＯと呼ぶ）にクローン化した。記載の標準的な手順を使用して部位特異的誘発を行った（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ １，３／４−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ＩＩＩ−ＶＩＩ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ（ｘ） ａｎｄ ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ（ｘ） ｍｏｔｉｆｓ ｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ −Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−ｔｒａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（４７），３０９８５−３０９９４）。
リン酸カルシウム沈殿法を使用してヒトＥＰＯまたはそのアミノ酸変異型（例えば、Ｃｙｓ−２９→Ｓｅｒ／ＡｌａまたはＣｙｓ−３３→Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ−１２６→Ａｌａなど）を安定に発現するＣＨＯ細胞を作製し、記載のように硫酸Ｇ４１８を使用して選択した（Ｇｒａｂｅｎｇｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．）。トランスフェクションから３日後、細胞を１：５で継代し、１０％ＦＢＳおよび１．５ｇ／リットル硫酸Ｇ４１８を含むＤＭＥＭで選択した。
この選択手順を使用して、通常、１００〜５００個のクローンが生存し、さらに２〜３週間選択培地で増殖させた。コンフルエントまで成長した単層の細胞培養上清を、ウェスタンブロット分析およびＩＥＦ／ウェスタンブロット分析によってＥＰＯ発現レベルを分析した。
スピナーフラスコまたは２１個の灌流リアクター中で安定なサブクローンからＥＰＯが産生された。公開されたプロトコールにしたがって下記の種々のクロマトグラフィ手順の組み合わせを使用して、異なる量のＮｅｕＡｃ（例えば、２〜８個、４〜１０個、８〜１２個のＮｅｕＡｃ残基）を有するＥＰＯの異なる糖形態を単離した。
文献
Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ａｎｄ ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｓｐｅｃｉｆｙ ｔｈｅｉｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ−ｔｈｅ Ｇｏｌｇｉ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７４（５１），３６１０７−１６；Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｐｏｈｌ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．，１６（２），８１−９７；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｈａｕｓｅｒ，１９９９，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６５（５），５２９−５３６；Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ−ｔｙｐｅ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（１−３），１７−２５。
Ｂ）昆虫細胞中での産生
上記文献に記載の多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターの調節下でのヒトＥＰＯｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスベクターでの細胞の感染後に、昆虫細胞株ＳＦ９およびＳＦ２１から組換えヒトＥＰＯを産生した。
無血清培養培地で成長させた細胞を、２×１０6または２×１０7細胞／ｍＬの細胞密度で感染させ、細胞培養上清中のＥＰＯ力価を毎日決定した。Ｂｌｕｅセファロースクロマトグラフィ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのイオン交換クロマトグラフィ、および最後にＣ4相でのＲＰ−ＨＰＬＣによってＥＰＯを精製した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端配列決定によって産物の純度をチェックした。公開された手順にしたがって、詳細な炭水化物の構造分析（ＮおよびＯ−グリコシル化）を行った。
文献
Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｈｏｆｅｒ，Ｎｉｍｔｚ，Ｊａｇｅｒ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９３，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｓｆ２１ ｃｅｌｌｓ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１５（１），１８９−９７；Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７。
実施例１０．反応性ＨＥＳ誘導体の形成
１．ＳＨ反応性ＨＥＳ
１．１ ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂを形成するためのＥＭＣＨとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応
Figure 2006505635
 ０．１４４ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓに付与されたドイツ特許第１９６２８７０５Ａ１号）を、０．３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で３４ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＥＭＣＨ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む１．５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。６０℃で１９時間の撹拌後、反応混合物を１６ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。記載のように沈殿物を遠心分離によって回収し、３ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、再度沈殿させた。遠心分離および真空乾燥によってＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂを得た。チオ−ＥＰＯとの接合反応を、実施例１１の２．２に記載する。
代替方法
この反応では、スペーサーによって分離されたヒドラジドおよびマレイミド官能基を示す全ての架橋剤を使用することができる。Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されているこの分子群のさらなる例を表１に示す；「Ａ」で示す。さらに、マレイミド官能基の代わりに活性化されたジスルフィド官能基を示す別の架橋剤群も使用することができる。
１．２ ＨＥＳグリコシルアミンのハロゲンアセトアミド誘導体
ａ）グリコシルアミン形成1
１ｍｇのＨＥＳ１２Ｋ Ｄサンプルを、３ｍＬの飽和重炭酸アンモニウムに溶解した。次いで、３０℃で１２０時間のインキュベーション中の溶液の飽和を維持するために、さらなる固体重炭酸アンモニウムを添加した。アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｃを、反応混合物の直接凍結乾燥によって脱塩した。
（1Ｍａｎｇｅｒ，Ｗｏｎｇ，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ，Ｄｗｅｋ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１０７３３−１０７４０；Ｍａｎｇｅｒ，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ，Ｄｗｅｋ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１０７２４−１０７３２）
ｂ）無水クロロ酢酸でのグリコシルアミンＣのアシル化
１ｍｇのアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｃサンプルを、１ｍＬの１Ｍ重炭酸ナトリウムに溶解し、氷上で冷却した。これに無水クロロ酢酸結晶（約５ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温に加温した。ｐＨをモニタリングし、ｐＨが７．０未満に低下した場合にさらなる塩基を添加した。室温で２時間後、塩基の第２のアリコートおよび無水物を添加した。６時間後、生成物クロロアセトアミド−ＨＥＳＤ１（Ｘ＝Ｃｌ）を、混合ベッドＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＭＢ−３（Ｈ）（ＯＨ）イオン交換樹脂への通過によって脱塩した。
ｃ）無水ブロモ酢酸でのグリコシルアミンのアシル化2
無水ブロモ酢酸をＴｈｏｍａｓ3に記載のように調製した。１ｍｇのアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｃサンプルを０．１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、氷上で冷却し、５ｍｇ無水ブロモ酢酸を添加した。反応混合物をゆっくり室温にし、溶液を３時間撹拌した。反応混合物を、−２０℃の１ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合液に添加した。記載のように沈殿物を遠心分離によって回収し、０．１ｍＬ ＤＭＦに再溶解し、再度沈殿させた。遠心分離および真空乾燥によってブロモアセトアミド−ＨＥＳＤ２（Ｘ＝Ｂｒ）を得た。チオ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１１の１．２に記載されている。
（2Ｂｌａｃｋ，Ｋｉｓｓ，Ｔｕｌｌ，Ｗｉｔｈｅｒｓ，１９９３，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２５０，１９５； 3Ｔｈｏｍａｓ，１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｅｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４６，３６２）
ｄ）対応するヨウ素誘導体Ｄ３（Ｘ＝Ｉ）をＤ２について記載のように合成した。無水ブロモ酢酸の代わりに、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテートを使用し、全ての工程を暗所で行った。
Figure 2006505635
代替方法
アミノ基のアシル化のために、例えば、
−ブロミドまたはクロリド
−エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、置換フェノールを有するエステル（ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、トリクロロフェノールなど））などの他の活性形態のハロゲン酸を使用することができる。
さらに、スペーサーによって分離されたアミノ反応基およびハロゲンアセチル官能基を有する全ての架橋剤を使用することができる。その例は、ＳＢＡＰである。この分子および他の分子は、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。これらを、表１で「Ｄ」で示す。ハロゲンアセトアミド−ＨＥＳ誘導体を単離しないチオ−ＥＰＯでのアミノ−ＨＥＳのライゲーションのための架橋剤としての使用については、実施例１１、１２の備考を参照。
１．３ アミノ−ＨＥＳＥのハロゲンアセトアミド誘導体1
ａ）アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅを得るための１，４−ジアミノブタンとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応4
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを３ｍＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１．５１ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）の１，４−ジアミノブタンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。４０℃で１９時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿物（アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ）を遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
Figure 2006505635
（4Ｓ．Ｆｒｉｅ，Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ，Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｍｂｕｒｇ，１９９８）
ｂ）上記１．３のクロロアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｄ１に記載のように、クロロアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｆ１を調製した。
ｃ）上記１．３のブロモアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｄ２に記載のように、ブロモアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｆ２（Ｘ＝Ｂｒ）を調製した。チオ−ＥＰＯでの接合反応は、実施例１１の１．２に記載されている。
ｄ）対応するヨード−誘導体Ｆ３（Ｘ＝Ｉ）を、そのチオ−ＥＰＯとの反応前に単離しない。実験は、実施例１１の１．１に記載されている。
代替方法
上記１．２を参照のこと。
２．ＣＨＯ反応性ＨＥＳ
２．１ ヒドラジド−ＨＥＳ
Figure 2006505635
ａ）ヒドラジドとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応。１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で０．４７ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）のヒドラジンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。４０℃で１９時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｊを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、０．５％（ｖ／ｖ）のトリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の２．２に記載されている。
Figure 2006505635
ｂ）アジピン酸ジヒドラジドとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応
１．７４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のアジピン酸ジヒドラジドを６５℃の２０ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、３ｍＬ無水ＤＭＳＯに溶解した１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、窒素下で滴下した。６０℃で６８時間の撹拌後、反応混合物を２００ｍＬの水に添加した。Ｌを含む溶液を、０．５％（ｖ／ｖ）のトリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の２．２に記載されている。
代替方法
さらに、２つのヒドラジド基が任意のスペーサーによって分離されている、誘導体を使用することができる。
３．さらなるアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ誘導体ＩおよびＨ1
０．１ｍＬの飽和炭酸アンモニウム中の１ｍｇの各ハロゲンアセトアミドサンプルの溶解によってＤまたはＦのアンモニア分解を個別に行った。次いで、３０℃で１２０時間のインキュベーション中の溶液の飽和を維持するために、さらなる固体炭酸アンモニウムを添加した。反応混合物を、−２０℃の１ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。記載のように沈殿物を遠心分離によって回収し、０．０５ｍＬの水に溶解し、再度沈殿させた。遠心分離および真空乾燥によって生成物アミノＨＥＳ ＨまたはＩを得た。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の４．１に記載されている。
Figure 2006505635
Figure 2006505635
４．ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋ
Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．に記載のように、市販の材料から２工程でＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した5。１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、３ｍＬ無水ジエチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で２．０４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。６５℃で４８時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｋを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の３．１に記載されている。
（5Ｂｏｔｕｒｙｎ，Ｂｏｕｄａｌｉ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｌｈｏｍｍｅ，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，５４８５）
代替方法
さらに、２つのヒドロキシルアミン基が２つのスペーサーによって分離されている誘導体を使用することがきでる。
５．チオ−ＨＥＳ１２ＫＤ
５．１ オキソ−ＨＥＳ１２ＫＤへの添加
Figure 2006505635
 １．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを、３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１．１６ｇ（１５ｍｍｏｌ）のシステアミンを含む１５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。４０℃で２４時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｍを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、０．５％（ｖ／ｖ）のトリエチルアミン水溶液に対して２日間および水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。酸化グリコ−ＥＰＯとの接合反応は、実施例１２の２．１に記載されている。
代替方法
アミノ基およびチオ官能基が任意のスペーサーで分離されている誘導体を使用することができる。さらに、誘導体中のアミノ基を、ヒドラジン、ヒドラジド、またはヒドロキシルアミンに置換することができる。チオ官能基を、例えば、ジスルフィドまたはトリチル誘導体の形態で保護することができる。しかし、この場合、接合体化の前にＭに類似の化合物を遊離させるさらなる脱保護工程を行わなければならない。
５．２ アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、Ｈ、またはＩの修飾
ａ）ＳＡＴＡ／ＳＡＴＰの修飾
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、Ｈ、またはＩを、３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１３９ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）のＳＡＴＡを含む５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。室温で２４時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｎを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍヒドロキシルアミンを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中にて室温で２時間脱保護を行い、生成物Ｏを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対する透析によって精製した。実施例１２の２．１に記載の接合反応の直前に脱保護反応を行った。
Figure 2006505635
ｂ）ＳＰＤＰでの修飾
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、Ｈ、またはＩを、３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、窒素下で１８７ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）のＳＰＤＰを含む５ｍＬのＤＭＳＯの混合物に滴下した。室温で２４時間の撹拌後、反応混合物を１６０ｍＬのエタノールとアセトンとの１：１混合物に添加した。沈殿生成物Ｐを遠心分離によって回収し、４０ｍＬの水に溶解し、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、凍結乾燥させた。
１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．５ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）あたり１２ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む溶液にて室温で３０分間脱保護を行い、生成物Ｑを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対する透析によって精製した。実施例１２の２．１に記載の接合反応の直前に脱保護反応を行った。
代替方法
遊離形態または保護形態のいずれかでのアミノ基からチオ基への変換のために、いくつかの試薬が利用可能である。修飾後、生成物を単離することができる。あるいは、架橋剤の使用が許容されているので、好ましくは精製工程後に接合反応のためにこれらを直接使用することができる。チオ−ＨＥＳ誘導体の単離および保存のために、保護形態でのチオ−ＨＥＳ誘導体の合成は有用であり得る。これについて、任意のスペーサーで分離された活性エステル官能基およびチオエステル官能基を有するＳＡＴＡに類似する全ての誘導体を使用することができる。この群のさらなるメンバーであるＳＡＴＰは表１で見出され、「Ｈ」で示す。ＳＰＤＰに類似の誘導体は、任意のスペーサーによって分離された活性エステル官能基およびジスルフィド官能基を有し得る。これらの基のさらなるメンバーは、表１に見出され、「Ｆ」で示す。さらなるアナログ誘導体は、任意のスペーサーによって分離されたトリチル誘導体として保護された活性エステル官能基およびチオ官能基を有し得る。
実施例１１．チオ−ＥＰＯとの接合反応
１．チオ−ＥＰＯとハロゲンアセトアミド修飾ＳＨ反応性ＨＥＳとの反応
１．１ 例示的プロトコール１
ＮＨＳ活性エステルおよびヨードアセトアミド基（例えば、ＳＩＡ）を含む架橋剤を使用した、チオＥＰＯとアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、またはＩ）の接合6
（6Ｃｕｍｂｅｒ，Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，Ｆｏｘｗｅｌｌ，Ｒｏｓｓ，Ｔｈｏｒｐｅ，１９８５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１２，２０７）
材料
Ａ．ホウ酸緩衝液。組成は、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）、５ｍＭ ＥＤＴＡであった。
Ｂ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）。
Ｃ．アミノＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、Ｈ、またはＩ。１ｍｇ／ｍＬを含むホウ酸緩衝液として調製した。
Ｄ．架橋剤ストック溶液：１４ｍｇＳＩＡを、１ｍＬ ＤＭＳＯに溶解した。
Ｅ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム（２×５ｍＬベッド体積）（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
Ｆ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｇ．チオＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ１を含むホウ酸緩衝液。
Ｈ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
方法
１００μＬのＳＩＡ溶液を、４００μＬのアミノＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ溶液に添加し、室温で０．５時間震盪しながら反応させた。微量濃縮機を使用した１４０００×ｇで６０分間のサンプルの遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した。遠心分離後、サンプルをホウ酸緩衝液でその元の体積まで増加させ、このプロセスを２回以上繰り返した。残りの溶液を、１ｍＬのチオＥＰＯ溶液に添加し、反応混合物を室温で１６時間インキュベートした。過剰なヨードアセトアミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度１０ｍＭのシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムにアプライし、クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングした。タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
代替方法
この反応では、スペーサーによって分離されたスクシンイミド官能基またはスルホスクシンイミド官能基およびヨードアセトアミド官能基を有する全ての架橋剤を使用することができる。さらなる例は、表１で見出される。これらを「Ｃ」で示し、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。
１．２ 例示的プロトコール２
チオＥＰＯ１とＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２、Ｆ２、またはヨードアセトアミドＤ３との接合7
材料
Ａ．リン酸緩衝液。組成は、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、５ｍＭ ＥＤＴＡであった。
Ｂ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）。
Ｃ．ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２。１０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝液として調製した。
Ｄ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム（２×５ｍＬベッド体積）（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．チオＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ１を含むリン酸緩衝液。
（7ｄｅ Ｖａｌａｓｃｏ，Ｍｅｒｋｕｓ，Ａｎｄｅｒｔｏｎ，Ｖｅｒｈｅｕｌ，Ｌｉｚｚｉｏ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，ｖａｎ Ｅｄｅｎ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｓｎｉｐｐｅ，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３，９６１）
方法
１ｍＬのＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２溶液および１ｍＬのチオＥＰＯ溶液を合わせ、反応混合物を室温で４８時間インキュベートした。過剰なブロモアセトアミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度１０ｍＭのシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムにアプライし、クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングした。タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
代替方法
ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ−ブロモアセトアミドＤ２の単離の代わりに、アミノＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、Ｉ）を、スクシンイミド官能基およびブロモアセトアミド官能基を介して架橋剤と結合させることができる（上記１．１を参照のこと）。ＳＢＡＰは、この架橋剤群のメンバーであり、表１で見出される（「Ｄ」で示す）。
２．チオ−ＥＰＯとマレイミド修飾ＳＨ反応性ＨＥＳとの反応
２．１ 例示的プロトコール４
チオ−ＥＰＯとマレイミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂとの接合体化
材料
Ａ．マレイミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂ：１０ｍｇ／ｍＬを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｂ．チオＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯを含むリン酸／ＮａＣＩ緩衝液
Ｃ．リン酸／ＮａＣＩ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣＩ（ｐＨ７．０）
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
方法
１ｍＬのＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂ溶液および１ｍＬのチオＥＰＯ１溶液を合わせ、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度１０ｍＭのシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にアプライし、１ｍＬの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングした。タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
２．２ 例示的プロトコール１２
ＮＨＳ活性化エステルおよびマレイミド基（例えば、ＳＭＣＣ）を含む架橋剤を使用したチオＥＰＯとアミノＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、Ｉ）との接合体化
材料
Ａ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１０（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｂ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
Ｃ．アミノＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、またはＩ）。１０ｍｇ／ｍＬを含むＰＢＳ緩衝液として調整する。
Ｄ．ＳＭＣＣ溶液：１ｍｇ ＳＭＣＣを５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。
Ｅ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム（２×５ｍＬベッド体積）（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
Ｆ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｇ．チオＥＰＯ１溶液：５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ１を含むリン酸緩衝液。
方法
５０μＬのＳＭＣＣ溶液に４００μＬのアミノＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ溶液を添加し、反応混合物を撹拌しながら室温で８０分間および４６℃で１０分間反応させた。１４０００×ｇで６０分間の微量濃縮機による反応混合物の遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した。ＰＢＳ緩衝液で体積を４５０μＬにし、プロセスを２回以上繰り返した。最後の遠心分離後、残りの溶液をＰＢＳで４５０μＬにし、１ｍＬのチオＥＰＯ溶液に添加し、反応混合物を室温で１６時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度１０ｍＭのシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムにアプライした。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
代替方法
この反応では、スペーサーで分離されたスクシンイミド官能基またはスルホスクシンイミド官能基、およびマレイミド官能基を有する全ての架橋剤を使用することができる。Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されているこの分子群のさらなる例は、表１で見出され、これらを「Ｅ」で示す。マレイミド官能基の代わりに活性化されたジスルフィド官能基を有するさらなる架橋剤群が存在する。接合体化にこれらの架橋剤を使用することもできる。しかし、接合体のジスルフィド結合は、還元条件下で切断可能である。この群のメンバーを、表１で「Ｆ」を使用して示す。第３の架橋剤群は、ＳＨ反応基としてマレイミド官能基の代わりにビニルスルホン官能基を使用する。この「ＳＶＳＢ」群のメンバーを、表１で「Ｇ」を使用して示す。
実施例１２．酸化ＥＰＯとの接合反応
１．グリコ−ＥＰＯの酸化
１．１ メタ過ヨウ素酸ナトリウムでのグリコ−ＥＰＯの酸化：例示的プロトコール５
材料
Ａ．グリコ−ＥＰＯ溶液：１０ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む酢酸緩衝液。
Ｂ．メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液：新たに調製した１０ｍＭまたは１００ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムを含む酢酸緩衝液。暗所に保持。これらの溶液を使用して、酸化混合物中の過ヨウ素酸ナトリウムの最終濃度は、それぞれ１ｍＭまたは１０ｍＭである。
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｄ．グリセロール
Ｅ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
方法
全ての工程を暗所で行った。
１ｍＬの冷グリコ−ＥＰＯ溶液に、０．１ｍＬの冷メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加し、暗所で１時間酸化反応を進行させた。酸化すべきグリコ−ＥＰＯがシアル酸残基を含む場合、酸化条件は、１ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム、０℃である。さもなければ、１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムを室温で使用する。酸化を停止させるために、最終濃度１５ｍＭのグリセロールを添加し、０℃で５分間インキュベートした。過剰な試薬および副生成物を、微量濃縮機を使用した１４０００×ｇで６０分間の生成物の遠心分離によって除去した。遠心分離後、サンプルを次の修飾工程で使用する緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）でその元の体積までにした。このプロセスを２回以上繰り返した。
１．２ グリコ−ＥＰＯの酵素酸化：例示的プロトコール６
ＥＰＯの酵素酸化を本発明のいずれかに記載されている（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６−１５９２２）。
２．ヒドラジン／ヒドラジド−誘導体との接合体化
２．１ 例示的プロトコール７
ヒドラジドおよびマレイミド官能基を含む架橋剤（例えば、Ｍ2Ｃ2Ｈ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した酸化グリコ−ＥＰＯとチオ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｍ、Ｏ、またはＱとの接合体化
材料
Ａ．Ｍ2Ｃ2Ｈストック：新たに調製した１０ｍｇ／ｍＬ Ｍ2Ｃ2Ｈを含むＤＭＳＯ
Ｂ．６．１．１．由来の酸化グリコ−ＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む酢酸緩衝液
Ｃ．チオ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｍ、Ｏ、またはＱ：１０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸／ＮａＣＩ緩衝液。
Ｄ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｅ．リン酸／ＮａＣＩ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）
Ｆ．微量濃縮機：ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３（ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｇ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）
Ｈ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｉ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
方法
Ｍ2Ｃ2Ｈストック溶液を、１ｍＬの酸化グリコ−ＥＰＯに最終濃度１ｍＭまで添加し、撹拌しながら室温で２時間反応させた。微量濃縮機を使用した１４０００×ｇで６０分間のサンプルの遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した。遠心分離後、サンプルをリン酸／ＮａＣＩ緩衝液で元の体積にし、このプロセスを２回以上繰り返した。Ｍ2Ｃ2Ｈ修飾グリコ−ＥＰＯに１ｍＬのチオ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｍ、Ｏ、またはＱ溶液を添加し、反応混合物を室温で１６時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュベーション終了時のシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にアプライし、１ｍＬの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
手順の注釈
ヒドラゾン付加物は、極端なｐＨであまり安定ではない。低ｐＨでの処理を含む適用のために、ヒドラジンの３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含むＰＢＳでの処理によりヒドラゾンを還元した。ほとんどの適用については、この付加的な工程は不必要である。
２．２ 例示的プロトコール８
酸化グリコ−ＥＰＯとヒドラジド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｌとの直接接合体化
材料
Ａ．６．１．１．由来の酸化グリコ−ＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む酢酸緩衝液
Ｂ．ヒドラジド−ＨＥＳ１８ＫＤ ＬまたはＪ：１０ｍｇ／ｍＬを含む酢酸緩衝液
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
方法
１ｍＬのヒドラジド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｌ溶液および１ｍＬの酸化グリコ−ＥＰＯ溶液を合わせ、反応混合物を撹拌しながら室温で１６時間反応させた。反応混合物を、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にアプライし、１ｍＬの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。接合化の結果を図２４に示す。認められた分子シフトにより、接合体化が成功したことが証明された。スメアは、ＨＥＳの異種性に起因する。図２５は、ＨＥＳが炭水化物側鎖の炭水化物部分に接合したことを証明する。
手順の注釈
ヒドラゾン付加物は、極端なｐＨであまり安定ではない。低ｐＨでの処理を含む適用のために、ヒドラジンの３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含むＰＢＳでの処理によりヒドラゾンを還元した。ほとんどの適用については、この付加的な工程は不必要である。
３．ヒドロキシルアミン誘導体との接合体化8
３．１ 例示的プロトコール９
酸化グリコ−ＥＰＯとヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋとの接合体化
材料
Ａ．６．１．１．由来の酸化グリコ−ＥＰＯ溶液：５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯを含む酢酸緩衝液
Ｂ．ヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋ：１０ｍｇ／ｍＬを含む酢酸緩衝液
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｆ．ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
（8Ｒｏｓｅ，１９９４，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，３０）
方法
１ｍＬのヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋ溶液および１ｍＬの酸化グリコ−ＥＰＯ溶液を合わせ、反応混合物を撹拌しながら室温で１６時間反応させた。反応混合物を、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にアプライし、１ｍＬの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。接合化の結果を図２４に示す。レーン２の認められた分子シフトにより、接合体化が成功したことが証明された。スメアは、ＨＥＳの異種性に起因する。図２５は、ＨＥＳが炭水化物側鎖の炭水化物部分に接合したことを証明する。
実施例１３．ガラクトースオキシダーゼ処理ＥＰＯ Ｎ−グリカンの特徴づけ
組換えＥＰＯまたは部分脱シアリル化ＥＰＯ形態（制限されたマイルド酸加水分解によって作製）を、カタラーゼの存在下にて３７℃で３０分間ガラクトースオキシダーゼとインキュベートし、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中にて３７℃で４時間インキュベートした。５０μｇアリコートのＥＰＯを取り出し、その後ポリペプチドＮ−グリカナーゼでのタンパク質の処理によって反応の進行をモニタリングした。
遊離Ｎ結合オリゴサッカリド（脱Ｎグリコシル化ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出によってモニタリングする）を、シアル酸の除去の前後に上記のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッピングに供した（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３／１９９４；Ｓｃｈｌｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで認められた典型的なシフトによって各ＥＰＯオリゴサッカリド中の酸化ガラクトース残基の定量を行い、オリゴサッカリド混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳによっても評価した。
実施例１４．ＨＡＳ修飾ＥＰＯの特徴づけ
未反応ＥＰＯおよびＨＡＳ−前駆体分子からのＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態の分離を、例えば、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４／５４または類似のゲル濾過媒体を使用したゲル濾過によって行った。あるいは、Ａｆｆｉｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ）に結合させたモノクローナル抗体を含む４ｍＬカラムでのＥＰＯの免疫親和性単離およびその後のゲル濾過による未修飾ＥＰＯの分離（例えば、２０ｋＤａと２００ｋＤａとの間の相対分子量の球状タンパク質を分離することができるマトリックスを使用する）によって、未反応のＨＡＳを除去した。
クーマシーブリリアントブルーでのゲル染色時の未修飾ＥＰＯと比較したその高分子量の検出によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１２．５または１０％アクリルアミドゲルを使用）によってＨＡＳ修飾ＥＰＯを同定した。組換えヒトＥＰＯに対して惹起したポリクローナル抗体を使用したサンプルのウェスタンブロット分析によっても、ＨＡＳ修飾ＥＰＯポリペプチドのより高い分子量が同定された。
その首尾の良いポリペプチドＮ−グリカンを有するＥＰＯタンパク質からの除去により、ＥＰＯ形態のＮ−グリカン修飾が証明された（３７℃で１６時間２５単位／ｍｇＥＰＯタンパク質を使用したＲｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている組換えＮ−グリコシダーゼ）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、約２０ｋＤａのＮ−グリコシダーゼ処理未修飾ＥＰＯの移動位置へＥＰＯタンパク質が典型的にシフトした。
未反応の脱Ｎグリコシル化ＥＰＯと比較したその移動位置の検出による脱Ｎ−グリコシル化生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度によって、Ｓｅｒ１２６での１脱シアリル化およびガラクトースオキシダーゼ処理ＥＰＯ Ｏ−グリカンの修飾が証明された。必要に応じて、修飾ＥＰＯを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析前にＣ８相でのＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。組換えヒトＥＰＯに対して惹起したポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロットにおけるＯ−グリカンのβ消失およびＥＰＯの脱Ｏ−グリコシル化形態の検出によってもＥＰＯのＨＡＳ Ｏ−グリカン修飾を分析した。
実施例１５．ＥＰＯおよび修飾ＥＰＯ形態の定量
ＥＰＯ形態を、欧州薬局方に記載のＵＶ測定（２０００，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ ｓｏｌｕｔｉｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ，１３１６，７８０−７８５）によって定量し、国際ＢＲＰ参照ＥＰＯ標準と比較した。あるいは、ＲＰ−Ｃ４カラムならびに較正のための２０、４０、８０、および１２０μｇのＢＲＰ標準ＥＰＯ参照調製物を使用した２５４ｎｍでの吸光度を使用したＲＰ−ＨＰＬＣによってＥＰＯ濃縮物を測定した。
実施例１６．ＨＥＳ修飾組換えヒトＥＰＯのインビトロ生物活性
Ｋｒｙｓｔａｌに記載のエリスロポエチン生物活性アッセイを使用して、活性について精製ＨＥＳ修飾ＥＰＯを試験した（Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８４，Ｅｘｐ．Ｈｅａｍａｔｏｌ．，１１，６４９−６６０）。
塩酸フェニルヒドラジンでの処理によってＮＭＲＩマウスに貧血を誘導し、脾臓細胞を回収し、記載のように使用した（Ｆｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７，１２０３ ｆｆ．）。ＥＰＯの希釈物を、３×１０5細胞／ウェルと共に９６ウェルマイクロタイタープレート中でインキュベートした。加湿雰囲気下（５％ＣＯ2）における３７℃で２４時間後、細胞を、１μＣｉの3Ｈ−チミジン／ウェルで４時間標識した。組み込まれた放射能を、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。比較のために国際参照ＥＰＯ標準（ＢＲＰ標準）を使用した。
あるいは、ＥＰＯ感受性細胞株ＴＦ−１を使用したインビトロアッセイによって、ＥＰＯ生物活性を測定した（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓ．，１４０．３２３−３３４）。指数関数的に成長した細胞を無成長因子で洗浄し、ＥＰＯの連続希釈物の存在下でさらに４８時間インキュベートした。Ｍｏｓｍａｎｎに記載のＭＴＴ還元アッセイの使用によって細胞増殖を評価した（Ｍｏｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３）。
実施例１７．ＥＰＯおよびＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態のインビボ活性の測定
上記用量のＥＰＯまたは修飾ＥＰＯ形態を投与した動物の４日後の網状赤血球の増加の測定によって、正赤血球症マウスにおけるインビボ活性測定を行った。赤血球増加症マウスアッセイにおいてＷＨＯ ＥＰＯ標準に対して較正したＢＲＰ ＥＰＯ標準を使用してアッセイを行った。ＥＰＯサンプルを、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水で希釈した。
０．５ｍｌのＥＰＯ試験溶液を含むダルベッコ緩衝化生理食塩水（１００、８０、４０、または２０ＩＵ／ｍｌのＢＲＰ標準ＥＰＯに等価なＥＰＯタンパク質に対応する）を、動物に皮下感染させた。注射から４日後に血液サンプルを採取し、アクリジンオレンジで網状赤血球を染色し、血液サンプル採取から５時間以内の３０，０００個の総血球の計数によるフローサイトメトリーによって網状赤血球を定量した（Ｐｈ．Ｅｕｒ，２０００，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ ｓｏｌｕｔｉｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ，１３１６，ｐａｇｅｓ ７８０−７８５）および欧州薬局方（１９９６／２０００，ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ２００２）を参照のこと）。
実施例１８．インビボ半減期の測定
ウサギに所定量の未修飾またはＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態を静脈内注射した。所定の時間で血液サンプルを採取し、血清を調製した。インビトロバイオアッセイまたは市販のＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡによって血清エリスロポエチンレベルを測定した。
実施例１９．インビボ薬物動態学
マウス：各動物に、３００ＩＵ ＥＰＯ／ｋｇを皮下投与した。処置から７日後、各動物のヘマトクリットを測定した。修飾ＥＰＯで処置した全動物のうちの９匹でヘマトクリットの実質的な増加が認められ、未処理ＥＰＯの比較的短い半減期に照らして予想される結果であった。修飾ＥＰＯ処置群のヘマトクリット変化の平均は、未処理ＥＰＯ群およびコントロール群のそれと有意に異なっていた。
ウサギ：２００または８００ｎｇ／ｋｇ体重までに相当する未修飾またはＨＡＳ修飾ＥＰＯの単回用量でウサギを処置した。２、６、１６、２４、および４８時間後、血漿濃度の測定のための市販のＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡの使用によって血液サンプルを分析した。Ｚｅｔｔｌｍｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４， ２１１５３−２１１５９に記載のように、平均血漿ＥＰＯ濃度を測定し、平均初期半減期（α期）および最終半減期（β期）を、記載のＥＬＩＳＡ値から計算した。
文献：
Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ，Ｌｕｎｎ，Ｒｉｓｉｎｇｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９９９，Ａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｅｘｈｉｂｉｔｉｓ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｉｔｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２４７７３−２４７７８。
実施例２０．ＨＥＳ修飾組換えヒトＩＬ−２のインビトロ活性の評価
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ５４でのゲル濾過によって修飾ＩＬ２を回収した。対応する画分のアリコートを滅菌濾過し、ＩＬ２依存性マウスＣＴＬＬ−２細胞株の使用によってＩＬ２生物活性を測定した（Ｇｉｌｌｉｓ，Ｆｅｒｍ，Ｏｎ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９７８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２０，２０２７−２０３２）。活性を、国際参照ＩＬ２標準調製物と比較した。
Figure 2006505635
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実施例５．１にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。 レーンＢ：実施例５．１による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＣ：ＥＰＯ出発材料。 実施例５．３にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。 レーンＡ：実施例５．３による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＢ：ＥＰＯ出発材料。 レーンＣ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。 実施例５．４および５．５にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。 レーンＢ：実施例５．４による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＣ：実施例５．５による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＤ：ＥＰＯ出発材料。 実施例７．１および７．４にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。 レーンＢ：実施例７．４による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＣ：実施例７．１による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＤ：ＥＰＯ出発材料。 実施例７．２、７．３、７．５、および７．６にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。 レーンＢ：実施例１．３ｂ）に基づいた実施例７．６による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＣ：実施例１．１ｂ）に基づいた実施例７．５による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＤ：実施例１．３ａ）に基づいた実施例７．６による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＥ：実施例１．１ａ）に基づいた実施例７．５による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＦ：実施例７．２による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＧ：実施例７．３による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＫ：ＥＰＯ出発材料。 実施例７．７、７．８、７．９、７．１０、７．１１、および７．１２にしたがって産生されたＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｄ）；タンパク質マーカーの分子量（ｋＤ）（上から下）：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４、および１７。 レーンＢ：実施例７．１１による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＣ：実施例７．１０による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＤ：実施例７．７による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＥ：実施例７．８による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＦ：実施例７．１２による接合体化後の粗タンパク質。 レーンＧ：ＥＰＯ出発材料。 レーンＫ：実施例７．９による接合体化後の粗タンパク質。 ５分間＝レーン２；１０分間＝レーン３；６０分間＝レーン４、および非処理ＥＰＯ＝レーン１のマイルド酸処理に供したＥＰＯ−ＧＴ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｎ−グリカンの除去後のＥＰＯの移動度のシフトを示す（＋ＰＮＧＡＳＥ）。 未処理のＥＰＯならびに、マイルド酸加水分解条件下で５分間、１０分間、および６０分間インキュベートしたＥＰＯから単離したオリゴサッカリドのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターンを示す図である。ローマ数字Ｉ〜Ｖは以下の溶離位置を示す：Ｉ＝脱シアリル化２触角（ｄｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造、ＩＩ＝トリシアリル化３触角構造（２つの異性体）；ＩＩＩ＝テトラシアル化４触角構造＋２Ｎ−アセチルラクトサミン反復、ＩＶ＝テトラシアリル化４触角構造＋１Ｎ−アセチルラクトサミン反復；Ｖ＝テトラシアリル化４触角構造＋Ｎ−アセチルラクトサミン反復なし。１−４シアル酸を含まないか含むオリゴサッカリド構造の溶離領域を、角括弧で示す。 脱シアリル化後のＮ結合オリゴサッカリドのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを示す図である。Ｎ−アセチルノイラミン酸の溶離位置を以下に示す。以下の数字１〜９は、以下の標準オリゴサッカリドの溶離位置を示す：１＝２触角；２＝３触角（２〜４異性体）、３＝３触角（２〜６異性体）；４＝４触角；５＝３触角＋１反復；６＝４触角＋１反復、７＝３触角＋２反復、８＝４触角＋２反復、および９＝４触角＋３反復。 シアリン酸残基の過ヨウ素酸塩酸化に供したマイルド処理および非処理ＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。１＝酸処理を使用しない過ヨウ素酸塩酸化；２＝５分間酸処理した過ヨウ素酸塩酸化；３＝過ヨウ素酸塩酸化および１０分間の酸処理；４＝酸処理を使用しない過ヨウ素酸塩酸化；５＝過ヨウ素酸および酸処理を使用しないＢＲＰ ＥＰＯ標準。 非処理ＥＰＯおよびマイルド酸加水分解条件下で５分間および１０分間インキュベートし、その後過ヨウ素酸塩処理したＥＰＯから単離した未変性オリゴサッカリドのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターンを示す図である。１−４シアル酸を含まないか含むオリゴサッカリド構造の溶離領域を、角括弧１〜５で示す。 ＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＨＥＳ修飾の経時時間のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。２０μｇアリコートのＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａを、ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体と３０分間、２時間、４時間、および１７時間反応させた。レーン１＝反応時間３０分；レーン２＝反応時間２時間；レーン３＝反応時間４時間；レーン４＝反応時間１７時間；レーン５＝ＨＥＳ修飾しないＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ。左の図は、ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体の存在下でのインキュベーション時間の増加に伴うＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａの移動度のシフトを示す（流速１ｍｌ・ｍｉｎ-1）。Ｘ：レーン１＝反応時間３０分；レーン２＝反応時間２時間；レーン３＝反応時間４時間、レーン４＝反応時間１７時間；レーン５＝ＨＥＳ修飾を行ったＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ。右の図は、Ｎ−グリコシダーゼでの処理後の同一サンプルの分析を示す。 ＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。各１％の通過物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）および高塩濃度での１％の画分溶離物を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮機で濃縮し、サンプル緩衝液を含むゲルにロードした。クーマシーブルーによってＥＰＯタンパク質を染色した。Ａ＝サンプルＩ；Ｂ＝サンプルＩＩ；Ｃ＝サンプルＩＩＩ；Ｋ＝コントロールＥＰＯ−ＧＴ−１；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、およびＫ１は、通過画分を示す；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、およびＫ２は、高塩濃度で溶離した画分を示す。 Ｎ−グリコシダーゼの存在下で消化して、Ｎ結合オリゴサッカリドを除去したＨＥＳ修飾ＥＰＯサンプルＡ２（図１３を参照のこと）、コントロールＥＰＯサンプルＫ２、およびＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ ＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。全てのＥＰＯサンプルは、Ｏ−グルカンを欠くか含む低分子量形態に移動度がシフトした。脱Ｎ−グリコシル化後のＨＥＳ修飾ＥＰＯサンプルＡ２についてＯ−グリコシル化と非グリコシル化タンパク質との比が低いバンドが認められ、おそらくＯ−グリカン残基のシアル酸でのＨＥＳ修飾を示す約３０ｋＤａの拡散タンパク質バンドが検出された（アスタリスクによって強調した矢印を参照のこと）。 非処理またはＮ−グリコシダーゼの存在下で消化して、Ｎ結合オリゴサッカリドを除去した、ＨＥＳ修飾ＥＰＯサンプルＡ２（図１３を参照のこと）、コントロールＥＰＯサンプルＫ２およびＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ（図１４ａを参照のこと）のマイルド酸加水分解後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｎ−グリコシダーゼ処理前（Ａ２）および処理後（Ａ）の両高分子量形態（矢印を有するか有さない括弧を参照のこと）は、サンプルの酸処理後に消滅した。比較のために泳動したＢＲＰ ＥＰＯ標準は、マイルド酸処理に供さなかった。 ＨＥＳ修飾サンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ、および未修飾ＨＥＳとインキュベートしたコントロールＥＰＯサンプル（Ｋ）から遊離したＮ結合オリゴサッカリド物質のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す図である。ローマ数字Ｉ〜Ｖは以下の溶離位置を示す：Ｉ＝ジシアリル化２触角構造、ＩＩ＝トリシアリル化３触角構造（２つの異性体）；ＩＩＩ＝テトラシアル化４触角構造＋２Ｎ−アセチルラクトサミン反復、ＩＶ＝テトラシアリル化４触角構造＋１Ｎ−アセチルラクトサミン反復；Ｖ＝テトラシアリル化４触角構造＋Ｎ−アセチルラクトサミン反復なし。図８および１１の説明で報告されたジ、トリ、およびテトラシアリル化Ｎ−グリカンの溶離領域を、角括弧で示す。 ＨＥＳ修飾サンプルＡ、ＥＰＯ−ＧＴ−Ａ、および未修飾ＨＥＳとインキュベートしたコントロールＥＰＯサンプル（Ｋ）から遊離したＮ結合オリゴサッカリド物質のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す図である。標準オリゴサッカリド混合物の保持時間を以下に示す：以下の数字１〜９は、以下の標準オリゴサッカリドの溶離位置を示す：１＝２触角；２＝３触角（２〜４異性体）、３＝３触角（２〜６異性体）；４＝４触角；５＝３触角＋１反復；６＝４触角＋１反復、７＝３触角＋２反復、８＝４触角＋２反復、および９＝４触角＋３反復。 図１７〜２３は、ＨＥＳ修飾ＥＰＯおよびコントロールＥＰＯ調製物から単離した酵素遊離および化学的に脱シアリル化したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトルを示す図である。ｍ／ｚ１８０９．７、２１７４．８、２５３９．９、２９０５．０、および３２７０．１（［Ｍ＋Ｎａ」+）での主なシグナルは、ＭＳ分析のためのサンプル脱シアリル化に使用した酸加水分解条件に起因するフコースまたはガラクトースの喪失による弱いシグナルを伴う０、１つ、または２つのＮ−アセチルラクトサミン反復を有さない２触角から４触角複合体型Ｎ−グリカン構造に対応する。図１７は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＨＥＳ修飾ＥＰＯＡ２の脱シアリル化オリゴサッカリドである。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ ＧＴ−１−Ａの脱シアリル化オリゴサッカリド。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ Ｋ２の脱シアリル化オリゴサッカリド。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：５分間の酸加水分解に供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：１０分間の酸加水分解に供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：６０分間の酸加水分解に供したＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴサッカリド。 ２つのＨＥＳ−ＥＰＯ接合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 ｍｗ：マーカー レーン１：例示的プロトコール８によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ：ＥＰＯをヒドラジド−ＨＥＳ １２ＫＤＬと接合させる。 レーン２：例示的プロトコール９によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ：ＥＰＯをヒドロキシルアミノＨＥＳ １２ＫＤＫと接合させる。 Ｃ：コントロール（非接合ＥＰＯ）；上のバンドはＥＰＯ二量体を示す。 ＨＡＳ修飾ＥＰＯ形態のポリペプチドＮ−グリコシドでの消化を示すことによる炭水化物側鎖の炭水化物部分にＨＥＳを接合することを示す図である。 レーン１：Ｎ−グリコシダーゼでの消化後に例示的プロトコール８によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ。 レーン２：Ｎ−グリコシダーゼでの消化後に例示的プロトコール９によって生成されたＨＥＳ−ＥＰＯ。 レーン３：ＢＲＰ ＥＰＯ標準 レーン４：Ｎ−グリコシダーゼでの消化後のＢＲＰ ＥＰＯ標準 ｍｗ：マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｌｏｗ ｒａｎｇｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ １６１−０３０５，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）

Claims (52)

  1. ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法であって、該ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式（Ｉ）
    Figure 2006505635
     の構造を有し、
    式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化合物（Ｌ）と反応するステップ、または
    式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物（Ｌ）と反応するステップを含んでなり、
    前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
    前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
    前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、およびチオ基からなる群から選択される、
    ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法。
  2. Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である請求項１に記載の方法。
  3. Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項２に記載の方法。
  4. 前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記官能基Ｚ1が、構造−ＮＨ−を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記Ｚ1が、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
  7. 前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、構造−ＮＨ−を含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記Ｘが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
  9. 前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記官能基Ｘが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  10. 前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  12. 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）：
    Figure 2006505635
     の構造を有する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（ＩＩａ）：
    Figure 2006505635
     および／または式（ＩＩｂ）：
    Figure 2006505635
     の構造を有する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  14. 前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
    得られた反応生成物を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
    請求項１〜９および１２〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
    化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
    請求項１〜９および１２〜１４のいずれかに記載の方法。
  17. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
    前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
    請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  18. 前記第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
    前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗと、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
    化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）が、ポリペプチドである請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項２０に記載の方法。
  22. ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
    Figure 2006505635
     の構造を有し、該製造方法が、
    式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物（Ｌ）を反応させるステップ、または
    式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端で化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物（Ｌ）を反応させるステップを含み、
    前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
    前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
    前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基からなる群から選択される、
    ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  23. Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である請求項２２に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  24. Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が、独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である請求項２３に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  25. 前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項２２〜２４のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  26. 前記官能基Ｚ1が、構造−ＮＨ−を含む請求項２２〜２５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  27. 前記Ｚ1が、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択される請求項２６に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  28. 前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、構造−ＮＨ−を含む請求項２２〜２７のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  29. 前記Ｘが、
    Figure 2006505635
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択される請求項２８に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  30. 前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記官能基Ｘが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択される請求項２２〜２７のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  31. 前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択される請求項２２〜３０のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  32. 前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択される、請求項２２〜３０のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  33. 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）：
    Figure 2006505635
     の構造を有する請求項２２〜３２のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  34. 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物（Ｄ）または化合物（Ｌ）との反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式（ＩＩａ）：
    Figure 2006505635
     および／または式（ＩＩｂ）：
    Figure 2006505635
     の構造を有する請求項２２〜３２のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  35. 前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項３４に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  36. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
    得られた反応生成物を化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
    請求項２２〜３０および請求項３３〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  37. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
    化合物（Ｌ）を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと、さらなる化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
    請求項２２〜３０および３３〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  38. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
    前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2と化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗとの反応を介して化合物（Ｌ）と反応させて第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
    請求項２２〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  39. 前記第２のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、請求項３８に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  40. 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｚ1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物（Ｄ）と反応させて第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
    前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物（Ｄ）中に含まれる官能基Ｗおよび化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｚ2との反応を介して化合物（Ｌ）と反応させ、
    化合物（Ｌ）を、前記第１のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物（Ｌ）中に含まれる官能基Ｘと化合物（Ｍ）中に含まれる官能基Ｙとの反応を介してさらなる化合物（Ｍ）と反応させる、
    請求項２２〜３５のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  41. 前記少なくとも１つのさらなる化合物（Ｍ）が、ポリペプチドである請求項２２〜４０のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  42. 前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項４１に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
  43. ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を治療有効量含む薬学的組成物であって、該ヒドロキシアルキルデンプンが、式（Ｉ）
    Figure 2006505635
     の構造を有し、該製造方法が、
    式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物（Ｌ）を反応させるステップ、または
    式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物（Ｄ）との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と、化合物（Ｌ）を反応させるステップを含んでなり、
    前記化合物（Ｄ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1と、少なくとも１つの官能基Ｗを含み、
    前記化合物（Ｌ）が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Ｗと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｚ2を含み、さらなる化合物（Ｍ）の官能基Ｙと反応可能な少なくとも１つの官能基Ｘを含み、
    前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基からなる群から選択され、
    前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法が、ヒドロキシアルキルデンプンと、化合物（Ｌ）と、必要に応じて化合物（Ｄ）を含む反応生成物をさらなる化合物（Ｍ）と反応させるステップをさらに含んでなり、少なくとも１つの前記さらなる化合物がポリペプチドである、薬学的組成物。
  44. 前記ポリペプチドが、ＡＴ ＩＩＩである請求項４３に記載の薬学的組成物。
  45. 前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項４３に記載の薬学的組成物。
  46. 前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ1−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、またはＬ’は存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
  47. 前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ1−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
    Figure 2006505635
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリール、またはシクロアルキルアリールである。）
    からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択され、Ｌ’はＺ1およびＸと架橋する有機鎖であるか、またはＬ’は存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
  48. 前記官能基Ｙが、−ＳＨであり、前記化合物（Ｄ）が、一般式Ｚ1−Ｄ’−Ｗの化合物であり、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
    Figure 2006505635
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒはメチルである。）
    からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択され、前記Ｄ’が、Ｚ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、または前記Ｄ’は存在せず、前記Ｌ’が、Ｚ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、または前記Ｌ’が存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
  49. 前記官能基Ｙが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物（Ｄ）が、一般式Ｚ1−Ｄ’−Ｗの化合物であり、前記化合物（Ｌ）が、一般式Ｚ2−Ｌ’−Ｘの化合物であり、前記官能基Ｚ1が、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択され、前記官能基Ｘが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択され、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、−ＳＨであり、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである。）
    からなる群から選択されるか、前記官能基Ｗまたは前記官能基Ｚ2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Ｚ2または前記官能基Ｗが、
    Figure 2006505635
     （上式中、ＧはＯまたはＳであり、Ｇが２つ存在する場合には、独立してＯまたはＳであり、Ｒ’はメチルである。）
    からなる群から選択され、前記Ｄ’が、Ｚ1およびＷと架橋する有機鎖であるか、または前記Ｄ’は存在せず、前記Ｌ’が、Ｚ2およびＸと架橋する有機鎖であるか、または前記Ｌ’は存在しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の薬学的組成物。
  50. 前記ヒドロキシエチルデンプンを、水性媒体中で下記式：
    Figure 2006505635
     の化合物と反応させ、反応生成物をエリスロポエチンと反応させる請求項４３に記載の薬学的組成物。
  51. 前記エリスロポエチンを前記反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する請求項５０に記載の薬学的組成物。
  52. 前記エリスロポエチンを部分的に脱シアリル化し、その後前記反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する請求項５０に記載の薬学的組成物。
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