JP2014525742A - タンパク質のシアリル化の、迅速且つ正確な分析 - Google Patents

タンパク質のシアリル化の、迅速且つ正確な分析 Download PDF

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Abstract

本発明は、糖タンパク質のシアリル化の分析を行うための方法及びキットに関する。糖タンパク質の試料を、三つの条件下:β-ガラクトシダーゼを用いる条件下、β-ガラクトシダーゼ+α-シアリダーゼを用いる条件下、及び酵素を用いない条件下で別々にインキュベートする。酵素処理の後、パルス電流検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC PAD)を、試料中の総ガラクトース、非シアリル化ガラクトース及び培地中の外因性ガラクトースの量的測定を行うために使用する。前記値の測定は、糖タンパク質のシアリル化の百分率を推定することを可能にする。

Description

タンパク質のシアリル化を分析するための分析方法を、本明細書中に記載する。
多くのタンパク質は、それらの生物学的機能のためにグリコシル化を必要とする。多くの場合、末端の、グリコシル鎖の「キャッピング」炭水化物は、シアル酸残基である。シアル酸は、N-結合型ノイラミン酸及びO-結合型ノイラミン酸のファミリーを含む。N-結合型シアル酸は、ノイラミン酸のアミノ残基へ、アセチル部分又はグリコリル部分を結合することによって形成され、それぞれ、N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)及びN-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)を形成する。ノイラミン酸のアミノ基がヒドロキシル部分で置換されている場合、これは、3-デオキシ-D-グリセロ-D-ガラクト-2-ノヌロソン酸(KDN)をもたらす。メチル基、アセチル基、ラクトイル基、硫酸基又はリン酸基で、Neu5Ac、Neu5Gc、又はKDNのヒドロキシル基の内の一つ又は複数を置換することにより、O-結合型シアル酸が形成される。したがって、シアル酸の大規模且つ多様な集団が存在している。
さらに、これらの改質に起因する多数の生物学的機能のため、一般的に、タンパク質のシアリル化を分析することに対する、かなりの関心が存在する。シアリル化は、タンパク質バイオ治療薬の薬物動態及び有効性のために、重要となりうる。したがって、いくつかの分析方法が、糖タンパク質のシアル酸含有量を評価するために開発されてきた。例えば、抗体に基づくアッセイを、特定の炭水化物部分を同定するために使用することができる。末端シアル酸残基を、目的の糖タンパク質から酵素的に取り外すことができ、また、HPLCにより分析することができる。しかしながら、これらの方法のそれぞれは欠点を有しており、通常は、純粋な試料又は高濃度を必要とする。バイオ医薬品業界により使用される従来の方法は、低い精度、高いデータのばらつきに苦しんでおり、そのような方法は、マトリックス干渉のために、複雑な培養培地と一緒に使用することができない。本明細書に記載された方法は、そのような欠点を克服し、タンパク質シアリル化の正確且つ再現可能な定量化を提供する。
まとめると、本明細書に記載された方法は、次の二つの工程を含む:(1)酵素反応を使用して、糖タンパク質由来のガラクトース及びシアル酸残基を加水分解する工程及び(2)イオン交換クロマトグラフィー法を使用して、ガラクトース残基を分離及び定量化する工程。末端シアル酸残基が、α-(2-3,6,8,9)-シアリダーゼ(α-シアリダーゼ)によって放出される一方、この方法の酵素的部分は、特定のエキソ-グリコシダーゼ、β-(1-4)-ガラクトシダーゼ(β-ガラクトシダーゼ)による、露出した(キャッピングされていない)末端ガラクトース残基の放出を伴う。消化の前に、試料を少なくとも三つの管に分割する。第一の管、反応Aは、バックグラウンド試料であり、酵素反応緩衝液のみを含む。第二の管、反応Bは、シアル酸によりキャッピングされていない全てのガラクトース残基を切断するβ-ガラクトシダーゼと反応させる。第三の管、反応Cは、ノイラミニダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼの両方を用いて共消化させる。ノイラミニダーゼ酵素はキャッピングシアル酸を除去し、β-ガラクトシダーゼが、露出したガラクトース残基の全てを切断することを可能にする。次に、パルス電流検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC PAD)を用いて、三つの試料中に存在するガラクトースの量を決定する。培地中に存在する任意の遊離ガラクトースを考慮しながら(反応A)、キャッピングされていないガラクトース(即ち、反応B)と総ガラクトース(即ち、反応C)の比を用いて、ガラクトース残基のキャッピングパーセントを計算する。
Dionex Technical Note 21、Optimal Settings for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates Using the Dionex ED40 Electrochemical Detector、Dionex(1998) Dionex Technical Note 20、Analysis of Carbohydrates by High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD)、Dionex Corp. (2000)
タンパク質のシアリル化を分析するための方法を本明細書に記載する。
タンパク質のシアリル化含有量を測定するための方法であって、(a)分析のためのタンパク質を調製するステップ、(b)調製したタンパク質を酵素的に処理するステップであって、(i)少なくとも一つのタンパク質試料を培地試料とすること(反応A)、(ii)少なくとも一つのタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼを加えること(反応B)、(iii)少なくとも一つの他のタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼを加えること(反応C)を含む、調製したタンパク質を複数のタンパク質試料に分割することと、複数のタンパク質試料をインキュベートすることとを含むステップ、並びに(c)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数のタンパク質試料を分析するステップ、(d)複数のタンパク質試料について炭水化物含有量を測定するステップ、並びに(e)タンパク質についてのシアリル化パーセントを計算するステップを含む方法も記載する。
(f)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の陽性対照及び陰性対照を分析するステップ、(g)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の標準物質を分析するステップ、並びに(h)複数のタンパク質試料と複数の標準物質及び複数の対照とを比較するステップをさらに含む方法も記載する。
タンパク質のシアリル化含有量を測定するためのHPAEC-PADクロマトグラフィーの使用であって、(a)分析のためのタンパク質を調製するステップ、(b)調製したタンパク質を酵素的に処理するステップであって、(i)少なくとも一つのタンパク質試料を培地試料とすること(反応A)、(ii)少なくとも一つのタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼを加えること(反応B)、(iii)少なくとも一つの他のタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼを加えること(反応C)を含む、調製したタンパク質を複数のタンパク質試料に分割することと、複数のタンパク質試料をインキュベートすることを含むステップ、並びに(c)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数のタンパク質試料を分析するステップ、(d)複数のタンパク質試料について炭水化物含有量を測定するステップ、並びに(e)タンパク質についてのシアリル化パーセントを計算するステップを含む使用も記載する。
(f)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の陽性対照及び陰性対照を分析するステップ、(g)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の標準物質を分析するステップ、並びに(h)複数のタンパク質試料と複数の標準物質及び複数の対照とを比較するステップをさらに含む使用も記載する。
任意のタンパク質のシアリル化含有量を測定するためのキットであって、所定の量のガラクトシダーゼ及びシアリダーゼを含む複数の容器を含む少なくとも一つの容器と、任意選択で、少なくとも一つのバッファー組成物、陽性対照試料、陰性対照試料、及び炭水化物標準物質を含む容器と、タンパク質のシアリル化含有量を測定する方法を記載した指示書であって、(a)分析のためのタンパク質を調製するステップ、(b)調製したタンパク質を酵素的に処理するステップであって、(i)少なくとも一つのタンパク質試料を培地試料とすること(反応A)、(ii)少なくとも一つのタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼを加えること(反応B)、(iii)少なくとも一つの他のタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼを加えること(反応C)を含む、調製したタンパク質を複数のタンパク質試料に分割することと、複数のタンパク質試料をインキュベートすることとを含むステップ、(c)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数のタンパク質試料を分析するステップ、(d)複数のタンパク質試料について炭水化物含有量を測定するステップ、並びに(e)タンパク質についてのシアリル化パーセントを算出するステップの記述を含む指示書とを含むキットも記載する。
(f)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の陽性対照及び陰性対照を分析するステップ、(g)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の標準物質を分析するステップ、並びに(h)複数のタンパク質試料の結果と複数の標準物質の結果とを比較するステップをさらに含むキットも記載する。
反応A、反応B及び反応C、並びにそれぞれの反応から得られるデータの概略図である。シアリル化キャッピングパーセントは、それぞれ、反応C及び反応B並びに反応C及び反応Aの差の商から求めることができる。式1を参照。 反応Cにおいて消化されたrecAlpha-1試料についての典型的なクロマトグラムを示す図である。ガラクトースについての溶出時間は、約14分〜16分の範囲である。 脱イオン水に対して透析されたか又は10kDaのスピンフィルタで遠心分離されたかのいずれかであった、上流のrecAlpha-1試料の比較を示す図である。不純物は透析した試料中に残っていたが、ほとんど完全に10kDaのスピンフィルタにより除去された。 recAlpha-1培養培地から上流の賦形剤を検出することができ、ガラクトースピーク付近に共溶出しうることを示す図である。パネルAにおいて、スピンフィルタのクリーンアップ後に、いくつかの試料におけるガラクトースピークのそばに溶出する賦形剤のピークが示されている。反応B試料について、不純物ピークは、ガラクトースピークから決定されたベースラインであり、統合されていない。パネルBにおいて、プロセスの不純物ピークは、反応C試料と共溶出する。この場合、ガラクトースピークの面積に統合されるのを防ぐために、上記のように不純物ピークを分割する必要がある。 方法の特異性を、糖タンパク質由来の中性単糖及びアミノ単糖の混合物を分析することにより、確認した。 典型的なガラクトース標準曲線の例。
本明細書中に記載の方法を用いて分析されうるタンパク質の例は、α1-プロテイナーゼ阻害剤(α1-アンチトリプシンとしても知られている)である。α1-プロテイナーゼ阻害剤は、凝固及び炎症に関与するプロテアーゼ酵素から細胞を保護するのに関与している、天然に存在するセルピン糖タンパク質である。α-1プロテアーゼ阻害剤の非存在であるα1-アンチトリプシン欠損症は、気腫及び慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの呼吸器疾患につながる。したがって、α-1プロテアーゼ阻害剤の欠乏に関連する病気を治療するための、バイオ治療薬としてα-1プロテアーゼ阻害剤を使用することに対する関心が存在する。組換えα-1プロテイナーゼ阻害剤(recAlpha-1)を、末端シアル酸(N-アセチルノイラミン酸)により部分的に又は完全にキャッピングされたN-結合型グリカン炭水化物構造を有するPerC6細胞株による分泌のために、設計した。末端シアル酸の量の減少は、recAlpha-1の血清半減期を低減することが示されている。したがって、治療薬としての機能又は有効性を調査する場合、recAlpha-1中のシアル酸によりキャッピングされたガラクトース残基のパーセントを知ることが重要である。
(実施例)
(実施例1)
分析及び酵素消化のための試料調製
糖タンパク質のシアリル化含有量の測定方法は、本明細書に記載されている。その方法は、炭水化物部分の酵素的加水分解のためのタンパク質試料の調製から始まる。したがって、タンパク質濃度を調整すること、酵素に干渉する可能性のある、溶解塩、緩衝液、他のタンパク質、炭水化物、賦形剤などの溶液成分を除去することを含む酵素反応に適合した条件下に、タンパク質を持ち込まなければならない。本明細書において使用されるように、用語「調製された」又は語句「分析のためのタンパク質を調製すること」は、酵素加水分解に干渉する可能性のある溶液成分を除去し、タンパク質溶液を脱イオン水でアッセイのための最適な濃度に希釈する方法を記述している。
少なくとも二つの非限定的な例示的な方法：(1)脱イオン水に対する透析又は(2)遠心ろ過(スピンろ過とも呼ばれる)を使用して、分析のためのタンパク質からタンパク質溶液成分を調製することができる。両方の場合において、目的の分析物タンパク質を保持しながら、低分子量種を除去するために、特定の分子量カットオフ(MWCO)を有する半透膜を用いた。有用なMWCOの範囲は、1kDa、2.5kDa、5kDa、10kDa、20kDa、50kDa、100kDa、250kDa及び500kDaを含む。透析手順において、タンパク質を透析膜へ挿入し、4℃で少なくとも4時間、過剰の脱イオン水又は適切な緩衝液及び/又は塩溶液に対して透析した。
あるいは、透析を行う代わりに、タンパク質試料を、遠心ろ過によって酵素的消化のために調製することができる。遠心ろ過の間、タンパク質溶液を、特定のMWCOを有する半透膜に対して遠心分離した。MWCO未満の分子量を有する溶液成分は、遠心分離中にフィルタを通過し、一方、タンパク質及びより高い分子量種は、保持される。典型的に、半透膜を通過する水のために、タンパク質溶液はスピンろ過中に濃縮された。一般的に、非限定的な例として、10kDaのスピンフィルタを、タンパク質試料を調製するために、製造者の指示にしたがって使用した。
酵素消化の前に、タンパク質試料をまた、それらがアッセイの直線範囲内になるように、脱イオン水を用いて、1.0〜1.5mg/mLの濃度まで希釈した。試料を希釈した後、各条件(即ち、A、B及びC)についての少なくとも一つの反応を構築した。調製したタンパク質溶液を、酵素的脱グリコシル化のために少なくとも三つの試料に分割した。図1を参照。反応Aは、バックグラウンド対照(外因性ガラクトースを制御するための)であった。この反応は、酵素反応のための緩衝液のみから構成されており、タンパク質分析物を含む培地中に存在しうる炭水化物のための対照として役立つ。反応Bは、β-ガラクトシダーゼを含み、これは、シアリル化されていない炭水化物基を加水分解するが、シアリル基を用いて「キャッピングされた」ものを加水分解しない。反応Cは、α-シアリダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼの両方を含んでいた。この反応において、α-シアリダーゼは、キャッピングシアリル部分を加水分解し、次に、β-ガラクトシダーゼが炭水化物基の全てを加水分解できるようにした。この組み合わされたα-シアリダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ反応において、全てのグリコシル化(即ち、シアリル化及び非シアリル化)をタンパク質から除去し、一方、β-ガラクトシダーゼ反応においては、キャッピングされていない(シアリル化されていない)炭水化物基を除去した。三つの反応条件についての構成要素をTable 1(表1)に示す。
別々の反応物を、消化される試料の数に基づく倍数単位で調製した。各消化について、45μLの試料を三つの別々の管へ添加した。その後、20μLの適切な酵素反応物A、B又はCを、その反応型について示された管へ添加し、37℃で、サーモミキサー上で加熱し、2.5時間〜4時間の間、適度に振盪した。反応を、5分間90℃でインキュベートすることによりクエンチした。
消化が完了した後、バイアル中で30μLの試料及び20μLの0.02mg/mLのデオキシリボース標準物質を組み合わせ、完全に混合することにより、試料をクロマトグラフィー分析のために調製した。試料を、次に、10℃でHPLCオートサンプラー上に置き、実施例2に記載のクロマトグラフィー法を用いて行った。
(実施例2)
クロマトグラフ手法
パルス電流検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAE-PAD)分析を、シングルポンプ、10℃に設定された温度調節したオートサンプラー及び電気化学検出ユニットを備えたDionex ICS-3000イオンクロマトグラフィーシステム(Dionex、サニーベール、カリフォルニア州)を用いて行った。使い捨ての金(Au)電極を、パルス電流検出(PAD)のために使用した(Dionex製品番号060139)。試料分析のために使用される波形は、Dionex Technical Note 21に基づき、これは、Table 2(表2)に示すように、炭水化物のPADのために最適な設定について説明している。Dionex Technical Note 21、Optimal Settings for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates Using the Dionex ED40 Electrochemical Detector、Dionex(1998)を参照。
インラインCarboPac PA10 4×50mmガードカラム(Dionex製品番号046115)、及び、脱シアリル化タンパク質と結合し、カラムへの吸着を防止するための4×50mmアミノトラップカラム(Dionex製品番号046112)を備えた、Dionex CarboPac PA10 4×250mm陰イオン交換カラム(Dionex製品番号046110)を用いて、クロマトグラフィーを行った。
20mMのNaOHを含む第一の移動相(A)を、30分間、1mL/分の流速で無勾配分離のために使用した(最初の実行時間が28分であったが、100%移動相Aでの再平衡化のためのより多くの時間を与えるための展開中に30分へ延長した)。500mMのNaOHを含む第二の移動相(B)を、カラム溶出、カラムクリーニング及び電極クリーニングのために使用した。A移動相及びB移動相を使用するランプの洗浄を含むクロマトグラフィー溶出法を、Table 3(表3)に示す。試料注入体積は、20μLであった。データ分析を、Chromeleon(登録商標)6.8クロマトグラフィーデータ分析システムソフトウェア(Dionex)を用いて行った。
(実施例3)
標準物質、対照、キャリブレーション及びシステム適合性
8pmol〜1.5nmolの直線範囲内で連続的に希釈した、既知量の10mMガラクトース標準物質(BioAssay Systems、EGAL-100)を参考に、ガラクトース濃度を定量した。方法の開発中に、カラム性能及びシステム性能を確保するために、試料注入の前に、各点の単回注入を行った。図6を参照。
単糖2-デオキシ-D-リボース(デオキシリボース)を内部標準として用いた。当量のデオキシリボースを、電極性能を監視するために、全てのタンパク質試料、標準物質及び対照へ加えた。PADの性質に起因する、検出器の応答の違いを補正するために内部標準を使用し、それは注入から注入に発生し得る。全ての試料についてのガラクトースピークの面積を、デオキシリボース面積により割ることにより補正した。
陽性対照を、アッセイを行う度にアッセイの精度を確保するために使用した。これは、酵素機能を監視し、適切な試料の取り扱いを確保するために必要であった。対照反応物は、市販のウシシアリル化フェツイン及びアシアロフェツイン標準物質(それぞれ、Sigma F3004及びA4781)の1対1混合物であった。個別に、シアリル化フェツインは、99%を超えるキャッピング百分率を有し、アシアロフェツインは、0%のキャッピングパーセントを有する。等しい割合で混合された場合、フェツインについてのキャッピング(シアリル化)率は、50%±3%であるはずである。フェツイン対照を、等分され、-70℃で凍結させた大規模なバッチとして調製し、個々の試料を解凍し、一式の試料を消化し、本明細書に記載の方法を用いて実行する度に、対照として使用した。
分析法の性能を確保するシステム適合性実験を、実行を通して電極性能及びカラム性能を監視するために、実行の開始時に注入され、12回の試料注入ごとにグループ化され(即ち、デュプリケート中二つの試料)、実行の最後に注入されたガラクトース及びデオキシリボースの混合物を用いて監視した。典型的なクロマトグラフィーの実行のための一連の実験をTable 4(表4)に示す。
(実施例4)
結果の補正及び計算
代表的なクロマトグラムを図2に示す。全ての試料注入の面積を、デオキシリボースの面積により補正した。デオキシリボースのピークの面積によりガラクトースのピークの面積を割ることによって補正を行った。この補正された数は、次に、シアリル化パーセントを計算するために用いた。この百分率を計算するために、キャッピングされていないガラクトース対総ガラクトース比を、式1を用いて決定した:
キャッピングパーセントを計算するために、ガラクトース面積を、デオキシリボース面積で割って、補正されたガラクトース面積を得た。補正された面積を用いて、試料の重複注入のそれぞれについて、キャッピングパーセントを計算した。反応Bについて測定した補正されたガラクトース面積を、反応Cから決定される補正されたガラクトース面積から差し引き、この値はシアリルキャッピングされたガラクトースの量に相当する。反応Aについて決定した補正されたガラクトース面積を、次に、反応Cについて測定された、補正されたガラクトース面積から差し引き、この値は、総ガラクトース(即ち、キャッピングされたもの及びキャッピングされていないもの)に相当する。キャッピングされたガラクトース(C-B)を、総ガラクトース(C-A)により割り、100を乗じることにより、シアリルキャッピングの百分率を得た。代表的なデータをTable 5(表5)に示す。
システム適合性を、実行を通した電極性能及びカラム性能を監視するために、実行の開始時及び実行の終了時に注入したガラクトース及びデオキシリボースの混合物を用いて監視した。報告された平均キャッピングパーセントを、重複注入からの補正された面積から決定した。反応Bにおけるガラクトースピーク面積が8pmol標準物質におけるガラクトースピーク面積よりも小さい場合、キャッピングパーセントは、計算の分子において、8pmol標準物質のガラクトースピーク面積に基づいて計算された「＞[キャッピング]%」(即ち、「〜より大きい」)として報告された。テーリング係数(Chromeleon(登録商標)ソフトウェアにおいて「非対称性」と呼ばれる)、理論段数、及び分解能の計算を、Dionexデータ収集ソフトウェアにより実施し、決定した。残りのシステム適合性基準の計算を、手動で決定した。代表的なシステム適合性パラメータをTable 6(表6)に示す。
システム適合性アッセイの許容基準をTable 7(表7)に示す。
(実施例5)
試料の化学量論/酵素反応及び消化時間
酵素反応率を最適化するために、酵素対タンパク質の比率を分析した。β-ガラクトシダーゼ酵素は、＞3ユニット/mLの活性で(比活性＞6ユニット/mg)製造者により提供され、一方、α-シアリダーゼ酵素は、5ユニット/mLの活性(135ユニット/mgでの比活性)を有する。各酵素の量をそれぞれ4μLで一定に維持し、反応における0.012ユニットのβ-ガラクトシダーゼ及び0.02ユニットのα-シアリダーゼに相当し、一方、タンパク質の量は、540〜2160pmolに変化させた。分析された試料は、1.4mg/mLの濃度で、細胞培養上澄み液中、緩衝液交換され、ろ過されたrecAlpha-1であった。試料を、Table 8(表8)に示すように調製した。
各recAlpha-1反応化学量論及び消化時点について、ガラクトースクロマトグラフのピーク面積を分析し、キャッピングパーセントを決定した。結果の要旨をTable 9(表9)に示し、これは、キャッピング値が、いかなる化学量論的条件でも変化しないことを実証している。元の反応化学量論(例えば、2.2×10-5ユニット/pmolタンパク質)を、製造者の推奨に基づいて推定した。しかしながら、これらの結果は、タンパク質濃度が4倍に増加した場合であっても、酵素はベンダーの推奨条件で過剰になりうることを示している。化学量論のこの広い動的な範囲を考えると、「中点」化学量論的条件(即ち、約1.1×10-5ユニット/pmolタンパク質)を、手順を簡素化し、酵素コストを最小限に抑え、試料調製において、十分な頑健性を可能にするために選択した。
反応化学量論も、1日目に反応中4μLの酵素を使用して調製した上流recAlpha-1試料(RAD-0637)についてのキャッピング結果と、2日目(14日後)に2μLの酵素を用いて調製した上流recAlpha-1試料(RAD-0637)についてのキャッピング結果とを比較することにより、実験した。実験の結果は、2μLの酵素量及び4μLの酵素量について同じキャッピング値を示し、2μLの酵素は、反応が完了するまで進行するのに十分であったことを示唆しており、上記の観察結果(Table 10(表10))と一致している。
(実施例6)
内部標準
このHPAEC-PAD法において、内部標準を、各注入中の電流検出固有の変動に起因するガラクトースのピーク面積を正規化するために使用した。当初は、二つの内部標準を実験した:ガラクトサミン及びデオキシリボース。両方の内部標準は適切に機能し、ガラクトースと十分に異なる時間に両方とも溶出し、定量に干渉しなかった。ガラクトサミンが適切に機能したが、システム性能を監視するためにより広範な許容基準を必要とする、ピーク面積中の一部の不整合が観察された。そのため、デオキシリボースを内部標準として選択した。さらに、デオキシリボースは、一般的に、電流検出法のための業界基準として使用されている。デオキシリボースピークについての面積は長い注入シーケンス全体であまり変動性を示さず、より厳しい許容基準の下で使用することができる。
展開中、デオキシリボース面積の原因不明の増加又は減少の複数の例が観察された。しかしながら、これらの同じ試料において、デオキシリボース面積の増加又は減少の後に、ガラクトースピークの逆の変化が起こった(Table 11(表11))。
典型的に、ピーク面積の変動は、電極による応答の差として説明することができた。これが事実である場合には、両方のピークが増加又は減少することが予想される。実験を、デオキシリボースを三つの試料に加えたが混合しないで行った。試料をHPAEC-PADにより分析し、次に除去し、試料及び内部標準の混合を確実にするためにボルテックスした。試料を次に再注入した。これらの実験の結果は、面積の変動が試料及び内部標準の不十分な混合に起因することを示す。これは、内部標準液及び試料の間に、層別化が発生する可能性があり、ユーザは、オートサンプラーのトレイへ置く前に、十分に反応を混ぜる必要があることを示唆している。これらの実験からの結果を、Table 12(表12)にまとめる。
(実施例7)
酵素ベンダーの比較
反応速度及びガラクトース定量に対するβ-ガラクトシダーゼ及びシアリダーゼ酵素の質の重要性を考え、四つの異なるベンダーのβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼ酵素を比較した。その目的は、正確な応答を提供するだろう反応速度の妥当性を評価すること、及び主要なベンダーの酵素が商業的に入手できなくなった場合のバックアップベンダーを確立することである。選択したベンダーは、Sigma、Glyko-Prozyme、New England BioLabs及びQA Bioであった。QA Bioの酵素を、本明細書に記載の大部分の実験について使用した。酵素反応が応答を得られなかった場合に、Sigmaを排除した。二つの別々の実験においてβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼの両方を用いて処理された試料(即ち、α-シアリダーゼ活性が検出不能であった)のように、ガラクトースピーク面積が、β-ガラクトシダーゼを用いて処理した試料についての面積と同じであった場合、Glyko-Prozymeも選択肢として排除した。New England BioLabs及びQA Bio酵素を比較する直接対決させる実験を、同じ日に調製し、行った。結果はまた、QA Bio酵素を用いて消化した同じ試料を用いた以前の日のデータと比較した。二つの酵素のパーセント差はごくわずかであり、いくつかの試験実行についての相対標準偏差(%RSD)は、New England BioLabsのβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼ酵素はQA Bioに匹敵し、QA Bio酵素が商業的に使用できなくなった場合に、バックアップベンダーとして使用することができることを示した。実験結果をTable 13(表13)にまとめる。
(実施例8)
試料の種類及び調製
上流のタンパク質試料が、細胞培養培地由来の5mg/mLのガラクトースを含有する可能性があることを考えると、試料調製方法は、培地由来の過剰のガラクトースの大部分だけではなく、他の干渉する可能性のある賦形剤を除去するために、開発された。このクリーンアップのみでは、全てのプロセス不純物を除去するのに十分ではなかったので、追加のクリーンアップを、キャッピング法調製の一部として行わなければならない。迅速なクリーンアップの二つの方法を評価した:脱イオン水に対する透析及び10kDaの遠心スピンろ過。
実験は、緩衝液交換したrecAlpha-1試料を利用した。この実験において、別の試料を同時に10kDaのスピンフィルタを用いてクリーニングしている間に、試料を4時間脱イオン水に対して透析した。両方の試料を、次に、キャッピング法により分析した。実験からの結論は、透析よりも10kDaのスピンフィルタは不純物を除去するのにより有効であり、有意に増加したターンアラウンドタイムで、一度に最大30個の試料の調製を可能にするということであった。反応C(β-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼ)を用いた消化を含む、両方のクリーンアップ手順のクロマトグラムを、図3に示す。スピンろ過した試料を、脱イオン水を用いて再構築し、その結果として、透析した試料よりも低い濃度を有する。微量のガラクトースはクリーンアップ後に存在しうるが、全てのバックグラウンドピーク(即ち、反応A)を、その後、汚染物質のピーク面積を差し引くことによって、キャッピングパーセントの計算で説明した。
また、細胞培養上澄み液由来のいくつかの賦形剤は、ガラクトースピークのすぐ後に溶出し、場合によっては、ガラクトースピークの上のピークショルダーとして現れることも観察された(図4を参照)。そのような特定の残留賦形剤が10kDaのスピンフィルタにより除去できない場合、この不純物の存在は、「ドロップダウン」統合を行い、不純物ピークを統合しないことにより、ガラクトースピーク面積から除外した。
(実施例9)
特異性
特異性は、不純物、分解生成物、マトリックスなどとして存在することが予想されうる成分の存在下で、分析物を評価するための方法の能力である。市販の中性単糖及びアミノ単糖の混合物を調製し、HPAEC-PADにより混合物を分析することにより、方法の特異性を決定した。評価した糖は、フコース、ガラクトサミン、グルコサミン及びガラクトースであった。糖を、保持時間を確認するために個々に分析し、次に、特異性を決定するために混合物として分析した(図5)。単糖の分離は、Dionex Technical Note 20に見られるものに匹敵しており、ガラクトースは三つ全ての他の単糖の後に溶出した。Dionex Technical Note 20、Analysis of Carbohydrates by High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD)、Dionex Corp. (2000)を参照。さらに、高度に不純な試料、即ち、細胞培養上澄み液について、任意の干渉賦形剤が存在していたかどうか、及びそれらが試料調製を介して除去されたかどうかを評価するために、バックグラウンドレベルを分析した。
(実施例10)
直線性
HPAEC PADシアリル化アッセイの直線性は、所定の範囲内の分析物濃度又は分析物含有量に直接比例する試験結果を得るための能力である。さらに、直線性試験からの範囲を、直線性、精度及び手順により達成可能な精度の許容度を確認するために用いた。方法の直線性を、8pmol〜1.5nmolの最適な範囲のガラクトース標準検量曲線を作成することによって、評価した(図6)。定量分析の係数(回帰係数)は、8pmol〜1.5nmolの範囲で0.99以上だった。回帰残差も分析し、その範囲においてバイアスされていないことが示された。検量線を2nmolまで拡張し、許容可能な直線性を維持することができるが、検量線の下端における精度の損失を伴う。最適な検量線範囲を、異なるシステム、カラム及びDionex ICS-3000使い捨て金電極を用いて、異なる日にわたって監視した。Table 14(表14)は、これらの結果をまとめている。
(実施例11)
定量限界
HPAEC PADシアリル化アッセイの定量限界(LOQ)は、適切な精度及び正確さで定量的に測定することができる、試料中の分析物の最低量を示す。定量法のLOQを計算するためのいくつかの方法が存在する。一つの方法は、傾きの平均で割ったy-切片の標準偏差に基づく。別の方法は、クロマトグラムの視覚的分析に基づく。第一に、アッセイのLOQを、典型的なクロマトグラムのシグナル対ノイズ比に基づいて計算した。具体的には、クロマトグラムの1分間の水平領域のノイズレベルを測定し、ピーク高さの点で、LOQを得るために10倍した。ピーク高さを、次に、較正曲線のピーク高さに基づいて、pmol量に変換した。ノイズレベルの結果を、同様の応答を得た較正曲線と比較した(Table 15(表15)を参照)。このノイズレベルを、異なる6日間にわたって、2つの異なるICS-3000システムを用いて得た。これらの結果は、別の日のノイズレベルは、同様の結果(±0.02)が得られ、約8pmolの標準レベルにあったことを示している(0.12nC×分の差、これは、約70nC×分で、1500pmol標準物質の高さと比較して、軽微であった)。
クロマトグラムノイズレベルが、機器間で異なりうるため、LOQもまた異なる方法で計算した。Table 14(表14)中の値、具体的には、平均の傾き(0.0283)により割り、10を乗じたy-切片(0.0577)の標準偏差に基づき、LOQは20pmolであると計算された。定量限界を計算する二つの方法は、LOQが約8〜20pmolであったことを示唆する。
(実施例12)
方法の精度
方法の精度を、既知の標準物質及び実験的に測定された結果の間の一致により測定した。基準となる「ゴールドスタンダード」は存在しないため、市販のシアリル化フェツイン標準物質及びアシアロフェツイン標準物質の等量混合物を用いて、方法の精度を測定した。シアリル化ウシフェツイン標準物質及びアシアロフェツイン標準物質を、280nmでUV吸光度(即ち、A280)により決定されるのと等しい濃度に調製した。標準物質を個々に分析し、その後、1:1の比率で調製し、分析した。シアリル化フェツイン標準物質は、99.4%のキャッピングパーセントを有していたが、一方、アシアロフェツイン標準物質は、反応Cよりも僅かに高い反応Bにおけるガラクトースの量のために、1.2%のキャッピングパーセントの結果を有していた。これらの知見に基づいて、フェツイン混合対照の予想されるキャッピング百分率は、約50%であろう。フェツイン混合物についての実際の結果は、複数回の実行の平均に基づいて、49.3%であることが確立された。実験の結果をTable 16(表16)にまとめる。A280の測定に起因するばらつき又は精度の正確な導出を行うことはできないが、これらの結果は、この方法が数パーセント点以内で正確であったことを示す。さらに、このフェツイン対照を、異なる日に室内再現精度(Intermediate Precision)研究の一部として分析し(以下のTable 18(表18)及びTable 19(表19)を参照)、3%の相対標準偏差(%RSD)を有することが示された。このような対照の使用は、アッセイが行われる度に推奨される。
(実施例13)
再現性
アッセイの再現性を、所定の条件下で、短い時間間隔の間に、その方法から得られた結果の一貫性を保つために評価した。6回の繰り返し注入全体のrecAlpha-1細胞培養上澄み液試料を用いて、その方法の再現性を測定した。バックグラウンド試料(即ち、反応A)は以前に分析されており、いかなる干渉ガラクトースも含まないことが示されているので、この試料は分析しなかった。6回の反復注入全体のガラクトサミン面積、ガラクトース面積及びキャッピングパーセントについて、相対標準偏差を測定した。結果をTable 17(表17)にまとめ、それは、ガラクトサミン面積で補正したもの及び補正していないものの両方を示している。データは、再現性が約0.20%であると示している。
(実施例14)
室内再現精度
再現性の研究に加えて、室内再現精度分析は、いくつかの追加要素:異なる日数、異なる機器設定及び異なる試料調製を組み込んだ。異なる三つの日に、三つの異なる濃度で、キャッピング分析のための下流プロセス展開recAlpha-1試料(RAD-5904)を調製することにより、その方法の室内再現精度を調べた。分析のために、異なるDionex ICS-3000クロマトグラフィーシステム、使い捨て電極、アミノトラップカラム、ガードカラム及び分析カラムを使用した。結果は、試料の相対標準偏差(RSD)が0.25%であることを示している。さらに、三分析日にわたって調製したフェツイン対照のキャッピング百分率も比較した。フェツイン対照のRSDは、2.99%であった。recAlpha-1試料及びフェツイン対照の室内再現精度の結果を、それぞれTable 18(表18)及びTable 19(表19)にまとめる。面積は、重複実行から平均し、補正しなかった。
(実施例15)
頑健性
アッセイの頑健性を、方法のパラメータ又は試料の取り扱いにおける小さいが、意図的な変動による影響を受けないままにする能力の尺度である。オートサンプラーの安定性、酵素反応時間、酵素量、及びマトリックス干渉などのいくつかの異なる要因を、いくつかのセットの実験において意図的に変化させた。
オートサンプラー中の試料の安定性
10℃でオートサンプラーへの注入を待っている試料が、結果の質を損なうかどうかを判断するために、HPLCオートサンプラー条件(即ち10℃)で、48時間にわたり試料の安定性を調べることによって、頑健性を判断した。オートサンプラーで保持された単独で調製した試料を、様々な間隔で注入し、ガラクトース量のピーク応答を各時点について測定した。結果をTable 20(表20)にまとめ、0.23%の相対標準偏差値を示し、これは、室内再現精度から決定された相対標準偏差と一致している。ガラクトサミンピーク面積により補正した結果及び補正しない結果の両方を示す。これらのデータは、キャッピングの結果に影響を与えずに、注入前の最大48時間オートサンプラーへ試料を保持することができることを示している。
酵素反応時間
異なる酵素バッチについての反応の異なる速度における変動の説明を見つけるために、1〜4時間、酵素反応時間を変えることによって、頑健性も実験した。試料を、1、2.5及び4時間の時点でインキュベートし、それぞれを分析した。結果をTable 21(表21)にまとめ、それは、三つの反応時間についてキャッピングパーセントが類似していたが、1時間の消化試料は、より長い反応よりも僅かに低かったことを示している。これらのデータに基づいて、2.5時間の消化は、完了まで反応を実行するのに十分であることが測定された。その方法が二つの酵素の反応速度に依存することを考えると、1時間の反応時間における比較的低いキャッピングパーセント結果は、シアリダーゼ酵素が律速工程であったことを示している。
マトリックス干渉
賦形剤及びマトリックス干渉は、特異性の項で取り上げたが、マトリックススパイク研究を、上流マトリックスが結果をバイアスしないことを保証するために行った。異なるマトリックスを含む血漿由来のAlpha-1(PD Alpha-1)試料を、細胞培養培地へ加え、本明細書に記載した方法を用いて、キャッピングパーセントを測定した。CDM4PERMAB(商標)培地(Hyclone)、Pluronic(登録商標)F-68(BASF)、Antifoam-C(Dow Corning(登録商標))及び様々な細胞培養培地などの、実験のために選択された培地は、上流の展開実験に使用される最高レベルの添加剤を含んでいた。血漿由来のAlpha-1を、0.5mg/mLの濃度で培地へ加えた。試料を次に、緩衝液を20mMのリン酸塩pH7へ交換した後に10kDaのスピンろ過という典型的なクリーンアップ手順を用いて調製した。培養培地へ加えたPD Alpha-1のキャッピングパーセントを、細胞培養培地へ加えなかったPD Alpha-1についてのキャッピング結果と比較した(Table 22(表22)を参照)。その結果は、培地へ加えたPD Alpha-1についての99.4%のキャッピングパーセント及び、培地へ加えなかったPD Alpha-1についての99.2%(平均)のキャッピングパーセントを示し、これは、この方法に関連付けられた室内再現精度の範囲内であった。これらの結果は、試料が適切なクリーンアップ工程を経た後で、細胞培養培地はアッセイに干渉しないことを示している。
まとめ
展開及び事前に審査した実験から得られた結果をTable 23(表23)にまとめる。上記の研究に基づいて、この方法を、タンパク質試料におけるキャッピング率の測定のために最適化した。このアッセイのために測定した直線性、LOQ、精度、正確さ、及び頑健性パラメータは、この方法は一貫性があり、正確で、信頼性があったことを示している。

Claims (6)

  1. タンパク質のシアリル化含有量を測定するための方法であって、
    (a)分析のためのタンパク質を調製するステップ、
    (b)調製したタンパク質を酵素的に処理するステップであって、
    (i)少なくとも一つのタンパク質試料を培地試料とすること(反応A)、
    (ii)少なくとも一つのタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼを加えること(反応B)、
    (iii)少なくとも一つの他のタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼを加えること(反応C)
    を含む、調製したタンパク質を複数のタンパク質試料に分割することと、
    複数のタンパク質試料をインキュベートすることと
    を含むステップ、並びに
    (c)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数のタンパク質試料を分析するステップ、
    (d)複数のタンパク質試料について炭水化物含有量を測定するステップ
    を含む、タンパク質のシアリル化含有量を測定するための方法。
  2. (f)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の陽性対照及び陰性対照を分析するステップ、
    (g)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の標準物質を分析するステップ、並びに
    (h)複数のタンパク質試料と複数の標準物質及び対照とを比較するステップ
    をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  3. タンパク質のシアリル化含有量を測定するためのHPAEC-PADクロマトグラフィーの使用であって、
    (a)分析のためのタンパク質を調製するステップ、
    (b)調製したタンパク質を酵素的に処理するステップであって、
    (i)少なくとも一つのタンパク質試料を培地試料とすること(反応A)、
    (ii)少なくとも一つのタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼを加えること(反応B)、
    (iii)少なくとも一つの他のタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼを加えること(反応C)
    を含む、調製したタンパク質を複数のタンパク質試料に分割することと、
    複数のタンパク質試料をインキュベートすることと
    を含むステップ、並びに
    (c)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数のタンパク質試料を分析するステップ、
    (d)複数のタンパク質試料について炭水化物含有量を測定するステップ、並びに
    (e)タンパク質についてのシアリル化パーセントを計算するステップ
    を含む使用。
  4. (f)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の陽性対照及び陰性対照を分析するステップ、
    (g)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の標準物質を分析するステップ、並びに
    (h)複数のタンパク質試料と複数の標準物質及び対照とを比較するステップ
    をさらに含む、請求項3に記載の使用。
  5. 任意のタンパク質のシアリル化含有量を測定するためのキットであって、
    所定の量のガラクトシダーゼ及びシアリダーゼを含む複数の容器を含む少なくとも一つの容器と、
    任意選択で、少なくとも一つのバッファー組成物、陽性対照試料、陰性対照試料、及び炭水化物標準物質を含む容器と、
    タンパク質のシアリル化含有量を測定する方法を記載した指示書であって、
    (a)分析のためのタンパク質を調製するステップ、
    (b)調製したタンパク質を酵素的に処理するステップであって、
    (i)少なくとも一つのタンパク質試料を培地試料とすること(反応A)、
    (ii)少なくとも一つのタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼを加えること(反応B)、
    (iii)少なくとも一つの他のタンパク質試料に少なくともβ-ガラクトシダーゼ及びα-シアリダーゼを加えること(反応C)
    を含む、調製したタンパク質を複数のタンパク質試料に分割することと、
    複数のタンパク質試料をインキュベートすることと
    を含むステップ、並びに
    (c)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数のタンパク質試料を分析するステップ、
    (d)複数のタンパク質試料について炭水化物含有量を測定するステップ、並びに
    (e)タンパク質についてのシアリル化パーセントを計算するステップ
    の記述を含む指示書と
    を含むキット。
  6. (f)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて陽性対照及び陰性対照を分析するステップ、
    (g)HPAEC-PADクロマトグラフィーを用いて複数の標準物質を分析するステップ、並びに
    (h)複数のタンパク質試料の結果と複数の標準物質の結果とを比較するステップ
    をさらに含む、請求項5に記載のキット。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE038020T2 (hu) * 2011-07-14 2018-09-28 Grifols Sa Fehérje-szializáció gyors és pontos analízise
CN106324234B (zh) * 2016-08-08 2018-05-22 上海睿康生物科技有限公司 修饰的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用
CN107045019B (zh) * 2016-09-30 2019-08-16 中国医学科学院输血研究所 一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法
CN110346500B (zh) * 2018-04-04 2021-11-30 青岛大学附属医院 一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法
CN109329713B (zh) * 2018-12-01 2022-04-22 西华大学 一种降解牦牛肉中n-羟乙酰神经唾液酸的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005538941A (ja) * 2002-04-25 2005-12-22 トランスカリヨティック セラピーズ インコーポレーテッド α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療
JP2006505635A (ja) * 2002-09-11 2006-02-16 フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法
JP2008539413A (ja) * 2005-04-26 2008-11-13 レイモンド， エー． ドウェック， 自動化糖鎖フィンガープリント戦略
JP2011516080A (ja) * 2008-04-07 2011-05-26 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 糖タンパク質の組換え生産の方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8039208B2 (en) * 2005-04-26 2011-10-18 National Institute For Bioprocessing Research And Training Limited (Nibrt) Automated strategy for identifying physiological glycosylation markers(s)
US20110086362A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Massachusetts Institute Of Technology High-Throughput Method for Quantifying Sialylation of Glycoproteins
HUE038020T2 (hu) * 2011-07-14 2018-09-28 Grifols Sa Fehérje-szializáció gyors és pontos analízise

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005538941A (ja) * 2002-04-25 2005-12-22 トランスカリヨティック セラピーズ インコーポレーテッド α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療
JP2006505635A (ja) * 2002-09-11 2006-02-16 フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法
JP2008539413A (ja) * 2005-04-26 2008-11-13 レイモンド， エー． ドウェック， 自動化糖鎖フィンガープリント戦略
JP2011516080A (ja) * 2008-04-07 2011-05-26 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 糖タンパク質の組換え生産の方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6016001262; Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ，　Ａ　ｅｔ　ａｌ．: 'Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｏ-ｇｌｙｃａｎｓ　ｉｎ　ＧｌｙＣＡＭ-１，　ａｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ-ｄｅｒｉｖｅｄ　ｌｉｇａｎｄ　ｆｏｒ　Ｌ-ｓｅｌｅｃｔｉｎ' Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７０，　Ｎｏ．２０, 1995, ｐｐ．１２０３５-１２０４７ *
JPN6016001265; Ｌｅｉｂｉｇｅｒ，　Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．: 'Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ-ｌｉｎｋｅｄ　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｏｆ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＩｇＧ：　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ａｎｔｉｇｅ' Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．３３８, 1999, ｐｐ．５２９-５３８ *
JPN7016000067; Ｂｈａｖａｎａｎｄａｎ，　Ｖ．Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．: 'Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ　ｂｏｕｎｄ　ｓｉａｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｍｕｃｉｎ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｔｈａｔ　ｒｅａｃｔｓ　ａｓ　''ｆｒｅｅ' Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８，　Ｎｏ．１１, 1998, ｐｐ．１０７７-１０８６ *

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