CN110068638B - 一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法 - Google Patents

一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法。该方法采用二氧化钛柱分离技术实现了血清中复杂鞘脂组学的样品制备步骤，包括中性鞘脂与酸性鞘脂的分离，酸性鞘脂与糖鞘脂的分离。本发明能将中性鞘脂、糖鞘脂和酸性鞘脂(如磷酸化鞘脂和硫苷脂)分离，因此在质谱中实现了去除高丰度中性鞘脂对其它微量甚至痕量鞘脂(糖鞘脂和磷酸化鞘脂)的定性及定量。本发明的二氧化钛富集法，从临床标本中检测出8个生物标志物，其中包括中性鞘脂中的神经酰胺、酸性鞘脂中的S1P和C1P、以及糖鞘脂。而这8个生物标志物，可以将早期和中晚期病人很好的区分。

Description

一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法
技术领域
本发明涉及生物样品分离领域，特别涉及一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法。
背景技术
肺癌是世界上癌症死亡的主要原因，其发病率呈逐年上升趋势，其病死率在各类肿瘤中居首位。但由于其早期病变缺乏明显、特异的临床表现，难于发现，大多数患者就诊时已是中晚期，延误了最佳治疗时机。由于不易取得病理组织，常延误诊治，这就对临床诊断肺癌的方法手段提出更高要求。肺癌主要有两种类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)(1)。NSCLC占肺癌的80-85％且存活率非常低，所有阶段的5年总生存期(OS)仅为约15％(2)。因此，灵敏度高、专属性的NSCLC的临床标志物确定，对患者能及时接受干预并预防，对预防癌症进展至关重要(3)。鞘脂(Sphingolipid)是一类以鞘氨醇为骨架的复杂化合物，广泛存在细胞膜上。随着研究的深入，鞘脂与疾病之间的关联研究越来越多，其中包括各类肿瘤，代谢病，自身免疫病等(表1)。目前国内外对鞘脂类研究较多的是其在肿瘤发病机制及治疗中的应用，而在疾病的诊断方面的研究较少。近年来鞘脂组学可以与基因组或蛋白质组相媲美，甚至超过他们。调控肿瘤细胞生长及转移的活性鞘脂主要有神经酰胺(ceramide,Cer)、鞘氨醇(sphingosine,Sph)、鞘氨醇-1-磷脂(sphingosine-1-phosphate,S1P)、神经酰胺-1-磷脂(ceramide-1-phosphate,C1P)以及糖鞘脂(glycosphingolipids,GSLs)，它们构成了一个重要的代谢平衡体，被称为鞘脂变阻器(Cer-sph-S1P)。其中Cer和Sph具有抑制细胞生长、促进细胞凋亡的作用；而S1P、C1P和GSLs则具有促进细胞增殖、分化的作用(4)。上调的S1P与其受体S1PR1(是具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体)形成S1P-S1PR1轴可促进癌细胞增殖，迁移和侵袭；并在调节淋巴细胞成熟，迁移和运输方面具有重要作用(5)。
表1.在癌症中差异表达或产生的鞘脂酶和鞘酯代谢物
Figure BDA0002067071630000021
近年来，鞘脂代谢在耐药产生中的作用逐渐被重视，前期研究表明Cer转化为S1P后可介导各种癌症进展(12)(13)。从癌症基因组图谱(TCGA)、基因表达综合数据库(GEO)和Oncomine三种在线数据库的统计结果发现：S1P，C1P，sulfatide和糖鞘脂合成酶SPHK1，CERK和UGCG在非小细胞肺癌患者中特异性高表达。Kaplan-Meier生存分析表明：SPHK1的高表达与肺癌患者的预后不良正相关。但是：由于磷酸化鞘脂类成分S1P，C1P的磷酸化修饰在质谱中的低电离效率和源内裂解，以及糖鞘脂的结构多样性及在体液中的低丰度，导致磷酸化、硫酸化和糖鞘脂的分析在鞘脂组学研究中是一项巨大挑战。为解决这些特殊修饰鞘脂类检测困难的这个技术挑战，我们开发了一种方法来全面提高这些鞘脂的检测灵敏度，即选用二氧化钛(TiO2)技术来特异性富集酸性鞘脂和糖鞘脂。
参考文献：
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发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法。
本发明提供一种通过二氧化钛特异性富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，并联用Thermo Q Extractive MS高分辨质谱技术，从而实现检测血清中微量甚至痕量的酸性鞘脂及糖鞘脂。该方法所遵循的原理为：磷酸基团(C1P，S1P)或者硫酸基团(Sulfatide)阴离子通过桥接作用与二氧化钛配位。糖鞘脂(羧基和α-OH基团)通过螯合作用与二氧化钛配位。高负电荷的唾液酸(糖苷脂)，含有羧酸和羟基官能团(α-OH)，可能通过多个位点与TiO2分子相互作用，类似于多齿结合，其中羧酸和羟基团体发挥关键作用。而未修饰的鞘脂类(如Cer和Sph)不会结合。
目前二氧化钛的应用主要在于磷酸肽的富集；而并未有应用于鞘脂富集中。此种方法采用二氧化钛柱分离技术实现了血清中复杂鞘脂组学的样品制备步骤，包括中性鞘脂与酸性鞘脂的分离，酸性鞘脂与糖鞘脂的分离。影响二氧化钛对鞘脂吸附的因素有很多，但其中洗脱条件是主要因素，包括洗脱液pH、组成及离子强度。其中pH通过改变质子从而进行二氧化钛洗脱效果的调节。因此本发明通过开发了一种二氧化钛富集方法来全面提高酸性鞘脂和糖鞘脂的检测灵敏度。并应用这种富集与高分辨质谱(LC-MS)联用技术，来测定非小细胞肺癌患者和健康个体血清中鞘脂类成分的差异。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，包括如下步骤：
(1)取人血清，加入甲醇和氯仿后，再加入C12-硫苷酯溶液，超声波室温震荡，40～60℃温育过夜，进行第一次提取，获得提取液；
步骤(1)中，人血清、甲醇、氯仿、C12-硫苷酯溶液的体积比为(3～5)：1000：(30～50)：1；优选为5：1000：50：1；
所述的C12-硫苷酯溶液中C12-硫苷酯的浓度为2.5μM。
步骤(1)中所述的超声波室温震荡的时间为30秒；
优选的，步骤(1)中所述的温育的温度为48℃；
(2)将提取液放冷至室温后加入氢氧化钾甲醇溶液并在37℃水浴振荡2小时；放冷至室温加乙酸中和；离心，取上清，获得上清A；
步骤(2)中所述的氢氧化钾甲醇溶液与人血清的体积比为0.5～1.5：1；优选为1.5：1；
所述的氢氧化钾甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为1M；
步骤(2)中所述的离心的条件为3000～3800rpm高速离心10分钟；优选为3000rpm高速离心10分钟；
(3)沉淀加入甲醇，氯仿和异丙醇超声震荡混匀后，离心，取上清，获得上清B；
步骤(3)中所述的甲醇，氯仿和异丙醇的体积比为0.5～1：1～2：0.5～1；优选为1：2：1；
所述的甲醇，氯仿和异丙醇的总用量为2mL；
步骤(3)中所述的超声震荡的时间为30秒；
步骤(3)中所述的离心的条件为3000～3800rpm高速离心10分钟；优选为3000rpm高速离心10分钟；
(4)沉淀加入氯仿和水，轻轻震荡分层后，离心，取下层，并与上清A和上清B合并，离心干燥，制得总脂类样品；
步骤(4)中所述的氯仿和水的体积比为1：1；
所述的氯仿和水的总用量为2mL；
步骤(4)中所述的离心的条件为3000～3800rpm高速离心15分钟；优选为3000rpm高速离心15分钟；
步骤(4)中所述的离心干燥的温度为4℃。
(5)二氧化钛小柱：将二氧化钛粉末置于带有筛板，上下端具塞的、无填料的固相萃取小柱中，制得二氧化钛小柱；用上样缓冲液冲洗二氧化钛小柱6～8次；
步骤(5)中所述的上样缓冲液为0.6％乙酸，2％甲酸和2％乙腈溶液，pH为0.8～1.2，其中，百分比是指体积百分比；优选为pH为1.0。
(6)上样：将步骤(4)制备的总脂类样品用样品溶解缓冲液超声溶解之后，离心；将溶解后的样品滴加入二氧化钛小柱中，上下颠倒混匀；轻度离心后收集洗脱液，离心干燥，获得中性鞘脂；
步骤(6)中所述的样品溶解缓冲液为氯仿：甲醇：水＝6：3：0.5，v/v；pH为0.8～1.2，优选为pH为1.0。
所述的样品溶解缓冲液的用量为200μL；
步骤(6)中所述的超声溶解的时间为30～60秒；优选为30秒；
步骤(6)中所述的离心的条件为10000～12000rpm、4℃离心15～30分钟；优选为12000rpm、4℃离心15分钟；
步骤(6)中所述的上下颠倒混匀的时间为2～5分钟；优选为5分钟；
步骤(6)中所述的轻度离心的条件为1000～1200rpm轻度离心1分钟；优选为1000rpm轻度离心1分钟；
(7)糖鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅰ加入步骤(6)洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，获得糖鞘脂；
步骤(7)中所述的洗脱缓冲液Ⅰ为乙腈：水：甲酸＝40～60：40～60：1，v/v；pH为2.8～3.2；优选＝60：40：1，pH为3.0；
所述的洗脱缓冲液Ⅰ的用量为500μL；
步骤(7)中所述的离心的条件为1000～1200rpm离心1分钟；优选为1000rpm离心1分钟；
(8)磷酸化和硫酸化鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅱ加入步骤(7)洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，所得为磷酸化和硫酸化鞘脂类成分，即酸性鞘脂；
步骤(8)中所述的洗脱缓冲液Ⅱ为先加入氨水溶液调节pH为碱性10～11，混匀后加入乙腈：水：甲酸＝20～80：80～20：0.5，v/v；优选为80：20：0.5，pH为11；
所述的洗脱缓冲液Ⅱ的用量为500μL；
步骤(8)中所述的离心的条件为1000～1200rpm离心1分钟；优选为1000rpm离心1分钟；
(9)对中性鞘脂、酸性鞘脂和糖鞘脂分别进行超高效液相-高分辨质谱分析。
步骤(9)中，
液相色谱方法建立在液相-高分辨质谱。使用Hyperil Gold C18色谱柱(100x2.1mm,1.9um；Thermo Fisher)，柱温为40℃，流速为0.30ml/min，进样量为1μL。色谱柱：Hyper Gold C18柱(100*2.1,1.9μm,Thermo)。流动相为：A为甲醇：水：甲酸＝6：4：0.2(v/v)，10mM乙酸铵，B为甲醇：异丙醇：甲酸＝6：4：0.2(v/v)，10mM乙酸铵，流速0.30mL/min。
流动相梯度，如下所示：
Time(min) A％ B％
0 100 0
3 90 10
5 60 40
5.3 45 55
8 40 60
8.5 20 80
10.5 20 80
16 10 90
19 10 90
22 0 100
22.1 100 0
质谱方法建立在QExactive(Thermo Fisher)系统，脂质组学质谱方法采用Fullscan/data-depend ms2Top20分析模式，ESI模式正负谱分析。喷雾电压+3500V/-3000V，鞘气为40arb，辅助气为10arb，离子传输管温度320℃，辅助气加热温度为350℃；Full scan一级全扫分辨率为70000，质量范围为100-1500m/z；data depend ms2二级分辨率为17500，top 20，碰撞能量分别为10、20、40eV，质量范围为70-1500m/z。正负离子交换扫描模式。
一组用于非小细胞肺癌早期诊断的鞘脂标志物，包括：S1P(d18:0)、S1P(d18:1)，C1P(d14：1/16：0)、C1P(d14：1/24：0)，GlcCer(q40：3)、GlcCer(q29：2)，Cer(d14：1/20：0)、Cer(d14：1/20：1(OH))；
一种非小细胞肺癌的肿瘤诊断试剂盒，包括上述所述的鞘脂标志物。
本发明的机理是：
本发明选择了二氧化钛作为磷酸化、硫酸化鞘脂和糖鞘脂的特异富集，该方法是建立在负电性的磷酸根、硫酸根和羧基/α-羟基与正电性的二氧化钛连接方式的不同来进行鞘脂分离的一项技术。过渡态金属离子Ti4+能够与电子供体，如磷、硫、氧等原子以配位键结合。磷酸化和硫酸化鞘脂由于强负电荷的产生，从而在TiO2上亲和力强，必须采用强洗脱液才能被洗脱；糖鞘脂的酸性较磷酸根和硫酸根相比较弱，因此与TiO2的结合力较弱；因此达到将磷酸化和硫酸化鞘脂、糖鞘脂和中性鞘脂特异分离的效果。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次从血清中检测到了硫苷脂(Sulfatide)；
(2)本方法能将中性鞘脂、糖鞘脂和酸性鞘脂(如磷酸化鞘脂和硫苷脂)分离，因此在质谱中实现了去除高丰度中性鞘脂对其它微量甚至痕量鞘脂(糖鞘脂和磷酸化鞘脂)的定性及定量。此方法通量高，灵敏度高(可检测>300个鞘脂类成分)、重复性良好(R>0.99)。是一种无论从数量还是从种类上，挖掘到最多鞘脂组数据的有效方法，我们推测其可应用于非标记定量鞘脂组学的技术转化研究。
(3)本发明的二氧化钛富集法，从临床标本中检测出8个生物标志物，其中包括中性鞘脂中的神经酰胺、酸性鞘脂中的S1P和C1P、以及糖鞘脂。而这8个生物标志物，可以将早期和中晚期病人很好的区分。
附图说明
图1是检测用TiO2富集法富集的酸性鞘脂的灵敏度。
图2是用拟定的8个早期诊断标志物在癌症进程中的ROC曲线图；其中，中性鞘脂(神经酰胺)是指Cer(d14：1/20：0)，Cer(d14：1/20：1(OH)；糖鞘脂是指GlcCer(q40：3)和GlcCer(q29：2)；酸性鞘脂(CIP)是指C1P(d14：1/16：0)，C1P(d14：1/24：0)；酸性鞘脂(SIP)是指S1P(d18:0)和S1P(d18:1)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。
所述的二氧化钛(50μg)购自Glygen(Columbia，MD)公司。
所述的高分辨质谱为Thermo QExractive高分辨质谱合用戴安3000液相系统；
所述的液相为Ultimate 3000LC(Thermo Fisher)；
所述的三重四级杆质谱为型号TSQ Quantis(Thermo Fisher Scientific,US)；
所述的乙腈和甲醇均为LC-MS级，购自Thermo fisher(Thermo FisherScientific，US)，
所述的甲酸，乙酸，异丙醇，氯仿和氨均为LC级，购自Thermo fisher(ThermoFisher Scientific，US)。
所述的内标C12硫苷脂购自Avanti公司。
所述的其他化学品(氢氧化钾)均为分析试剂级。
所述的水均使用Milli-Q系统(Millipore Ltd.，Watford，UK)制备蒸馏水。
所述的玻璃管均为顶部垫有聚四氟乙烯垫子的硼硅酸盐玻璃管。
实施例1
利用二氧化钛制备血清中鞘脂样品的方法，包括如下步骤：：
(1)每个病人血清取50μL并转移到玻璃管中。加入1.0mL甲醇和0.5mL氯仿后，加入10μL C12-硫苷酯溶液(2.5μM)，超声波室温震荡30秒。将混合物在48℃温育过夜(第一次提取)。
(2)放冷至室温后加入75μL氢氧化钾甲醇溶液(1M)并在37℃水浴振荡2小时。放冷至室温加乙酸中和。3000rpm高速离心10分钟，取上清。
(3)沉淀加入0.5mL甲醇，1.0mL氯仿和0.5mL异丙醇超声30秒震荡混匀后，3000rpm高速离心10分钟，取上清。
(4)沉淀加入氯仿和水各1mL，轻轻震荡分层后，3000rpm离心15分钟，取下层并于第二步和第三步上清合并，4℃离心干燥，制得总脂类样品。
(5)二氧化钛小柱。将二氧化钛粉末置于带有筛板，上下端具塞的无填料的固相萃取小柱中，制得二氧化钛小柱。用上样缓冲液(0.6％乙酸，2％甲酸和2％乙腈溶液，pH约为1.0)冲洗二氧化钛小柱6～8次。
(6)上样。将第四步制备的总脂类样品用200μL样品溶解缓冲液(氯仿：甲醇：水＝6：3：0.5，v/v；pH为1.0)超声溶解30秒之后，12000rpm、4℃离心15分钟。将溶解后的样品滴加入二氧化钛小柱中，上下颠倒混匀5分钟。1000rpm轻度离心1分钟后收集洗脱液离心干燥。所得为中性脂类及鞘脂类成分。
(7)糖鞘脂洗脱。将500μL洗脱缓冲液Ⅰ(乙腈：水：甲酸＝60：40：1，v/v；pH为3.0)加入二氧化钛小柱中，1000rpm离心1分钟取洗脱液，重复2次。合并洗脱液并干燥，所得为糖鞘脂类成分。
(8)磷酸化和硫酸化鞘脂洗脱。将500μL洗脱缓冲液Ⅱ(先加入0.5％氨水溶液混匀后加入乙腈：水：甲酸＝80：20：0.5，v/v；pH为11)加入二氧化钛小柱中，1000rpm离心1分钟取洗脱液，重复2次。合并洗脱液并干燥。所得为磷酸化和硫酸化鞘脂类成分。
(9)鞘脂代谢物超高效液相-高分辨质谱检测。将第六步至第七步的样品分别用液相-高分辨质谱检测。
液相色谱方法建立在液相-高分辨质谱。使用Hyperil Gold C18色谱柱(100x2.1mm,1.9um；Thermo Fisher)，柱温为40℃，流速为0.30ml/min，进样量为1μL。色谱柱：Hyper Gold C18柱(100*2.1,1.9μm,Thermo)。流动相为：A为甲醇：水：甲酸＝6：4：0.2(v/v)，10mM乙酸铵，B为甲醇：异丙醇：甲酸＝6：4：0.2(v/v)，10mM乙酸铵，流速0.30mL/min。
流动相梯度，如下所示：
Time(min) A％ B％
0 100 0
3 90 10
5 60 40
5.3 45 55
8 40 60
8.5 20 80
10.5 20 80
16 10 90
19 10 90
22 0 100
22.1 100 0
质谱方法建立在QExactive(Thermo Fisher)系统，脂质组学质谱方法采用Fullscan/data-depend ms2Top10分析模式，ESI模式正负谱分析。喷雾电压+3500V/-3000V，鞘气为40arb，辅助气为10arb，离子传输管温度320℃，辅助气加热温度为350℃；Full scan一级全扫分辨率为70000，质量范围为100-1500m/z；data depend ms2二级分辨率为17500，top 20，碰撞能量为10、20、40ev，质量范围为70-1500m/z。正负离子交换扫描模式。
(10)使用Lipid Search软件(Thermo ScientificTMLipidSearchTM)定性分析LC/MS原始数据。
Lipid Search软件可测定所有脂类成分。能通过化学关系测试，色谱协方差测试来识别电荷载体(如加氢加钠峰)，并通过包括同位素信息重建光谱。其中关键参数设置包括同位素模型项中的聚糖模型，最大电荷状态为2，以及±5ppm误差范围作为精确质量标准。以5.0的信噪比过滤MS峰并解析成单个离子种类。使用预期的同位素分布，电荷状态信息和保留时间，所有与单一化合物(例如，双质子化离子，三重质子化离子和所有相关同位素异构体)相关的离子物质总计，并且使用单一同位素质量计算化合物。通过使用该信息，生成样品中所有峰的列表，其中丰度由色谱峰面积表示。
(11)三重四级杆(QQQ)用于鞘脂类成分定量。
1)方法学验证：
(a)标准曲线制定：在SPL(鞘脂，sphingolipid)提取之前将加入内标中以确定线性。用9个浓度倍比稀释以制定标准曲线。通过线性回归构建的校准曲线的相关系数(R2>0.99)验证线性。通过检测限(LOD，信噪比SNR≈3)和定量限(LOQ，SNR≈10)进一步校准曲线中的最低浓度。
(b)二氧化钛制备样品重复性评估。通过一天内制备6次样品分析的结果确定日内精确度，同时基于连续三天制备9次样品来确定日间精确度。计算样品中鞘脂水平的相对标准偏差(RSD)以获得精确度。
(c)二氧化钛富集回收率评估。基于比较在三个不同水平的内标浓度加入样品中提取。将提取之前和之后内标的信号响应来检查回收率。在每个浓度水平上，制备六个重复的样品，共计18个样品。计算平均回收率和RSD以验证二氧化钛的富集效率。
2)基于二氧化钛联合三重四级杆质谱(TiO2-QQQ)的方法对血清中鞘脂类成分进行了定量分析。
表2显示6条校准曲线在宽动态范围(超过2个数量级)上表现出良好的线性(R2≥0.9977)。该方法被证明对于基于LOD(范围为0.005至3.34nM)和LOQ(范围为0.0167至16.7nM)的完整SPL组进行同时定量是高度灵敏的。结果表明，样品中所有定量SPL水平的RSD均低于注射精度测试中的6％，并且在日内和日间精密度方面达到了令人满意的RSD中值(3.79％和3.96％)，证明了可接受的精度这种方法用于量化SPL。在稳定性测试的结果中(表2)，样本中大约90％的SPL显示其水平的RSD小于10％，QC样本中超过90％的SPL的整体水平的RSD小于15％。处理。So(d17：1)，S1P(d17：1)，C1P(d18：0)，Cer(18：1/12：0)，SM(d18：1/12：0)和GlcCer(d18：1/12：0)分别为87.05％，83.72％，81.70％，100.15％，99.42％和92.40％。在所有加标水平下，所有IS的回收率的RSD值均小于5％。在各个SPL的相加和确定量之间出现了良好的相关性，例如拟合方程斜率(在0.95和1.08之间)和高相关系数(R2≥0.991)。这些证据表明我们的方法适用于量化单个SPL(5-500pmol)的质量含量的变化(表2)。
表2.二氧化钛富集法的标准曲线方程，相关系数(R2)，线性范围，LOD，LOQ和内标回收率。
Figure BDA0002067071630000111
其中，#低浓度(800nM)；&中浓度(1000nM)；*高浓度(1200nM)。
(12)二氧化钛富集方法用于发现非小细胞肺癌及健康人血清中新的鞘脂标志物。通过使用第十一步验证的方法定量分析非小细胞肺癌及健康人血清中的鞘脂。使用本发明的方法，根据高分辨率MS和MS/MS数据，SPL与综合SPL数据库的匹配以及SPL标准的确认，确定样本中的SPL。结果，从来自非小细胞肺癌患者和健康个体的总血清的合并样品中鉴定出总共432个SPL。其中包括：108种神经酰胺(Cer)，75种鞘氨醇(Sph)，36种鞘氨醇碱(Spha)；25种鞘磷脂(SM)，25种鞘氨醇1-磷酸(S1P)；22种神经酰胺1-磷酸(C1P)；19个硫苷脂(Sulfatide)；糖鞘脂包括34种葡萄糖糖基神经酰胺(GlcCer)；20半乳糖神经酰胺(GalCer)；34个半乳糖神经酰胺(LacCer)；11种脑苷脂；23种糖苷脂(GM)。中性鞘酯(包括神经酰胺、鞘氨醇、鞘氨醇碱共219种)是血清中最多样化的鞘脂，其次是酸性鞘酯(鞘氨醇-1-磷酸，神经酰胺-1-磷酸，鞘磷脂和硫苷脂共91种)和糖鞘脂(共122种)。通过计算三类鞘脂(中性鞘酯、酸性鞘酯和糖鞘酯共12种亚型)的总量显示了鞘脂的总体分布。结果，在非小细胞肺癌血清中的Cer远远低于正常人血清，而S1P，C1P和糖鞘脂类则呈相反的顺序。
表3二氧化钛富集法对中性鞘脂、酸性鞘脂和糖鞘脂的检出率差异
Subclass of SPLs Cer Sph S1P C1P SM Sulfatide GM
unenrichment 77 60 5 7 12 0 10
TiO<sub>2</sub>enrichment 108 75 25 22 25 19 23
(13)基于代谢通路的血清鞘脂代谢产物分析。结果表明，在NSCLC患者中产生C14-16神经酰胺(由神经酰胺合成酶CERS5/6选择性地产生)和从C1P水解将增加并且由SM产生并且GluCer/GalCer将减少。有趣的是，Cer(d14：1/20：1(OH))，Cer(d14：1/26：0)，Cer(d14：2/20：1(OH))，Cer(d14：2/20：1)，Cer(d14：2/22：1(OH))，特别是Cer(d14：2/20：1)(增长倍数19.71)实际上在非小细胞肺癌患者中显著增加。虽然CERS1(神经酰胺合成酶1)和CERS4(神经酰胺合成酶4)在肺癌中上调，但其饱和产物Cer(d18：0/15：0)，Cer(d18：0/h17：0)和Cer(d18：0/14：0)略有下降(增长倍数从0.45到0.5)，而不饱和神经酰胺如Cer(d18：1/12：0)和Cer(d18：1/25：0)显著增加(增长倍数分别为16.8和6.8)。它们的磷酸化产物C1P(d18：0/22：0(OH))随后轻度下降(增长倍数0.67)，归因于组织中SGPP2(鞘氨醇-1-磷酸水解酶)的mRNA含量增加超过5倍。单羟基和三羟基(mOH，tOH)特长链C28-32神经酰胺显著增加(Cer(m23：6)，Cer(t28：3)，Cer(m32：0)，Cer(m24：6)，Cer(m29：2)，Cer(m31：2)，Cer(d28：1))；其中，Cer(m31：2)的增长倍数为32。
CERK(神经酰胺激酶)和SGMS(鞘磷脂合成酶)分别将神经酰胺转化为C1P和鞘磷脂(SM)。CERK虽然变化不大，而其产物C1P显着增加(C1P(d29：0)，C1P(d14：1/16：0)，C1P(d14：1/24：0)的增长倍数分别为3.26，2.81和2.14)。SGMS减少超过2倍，其产生的长链和多羟基(≥3)SM包括SM(q32：4)，SM(t26：2)和SM(q37：0)急剧下降(增长倍数0.15)分别为0.36和0.46)。
神经酰胺通过UGCG(葡萄糖神经酰胺合成酶)产生葡萄糖神经酰胺(GlcCer)的前体。UGCG在NSCLC患者中过表达，并且其产生的GluCer也在血清SPL中上调(GlcCer(q40：3)和GlcCer(q29：2)FC为1.46和2.04)。然后将葡糖神经酰胺从早期高尔基体转运至远端高尔基体区室，以通过B4GALT6(β-1,4-半乳糖基转移酶6)合成乳糖苷神经酰胺(LacCer)，随后合成糖鞘脂，糖鞘脂为质膜的主要组成脂质。随着B4GALT6在NSCLC患者中增加，其产生的乳糖神经酰胺LacCer(d14：2/18：0(OH))也被增加了一倍(倍数2.0)。
Cer被神经酰胺酶(ASAH1-3)水解，产生鞘氨醇(Sph)。尽管ASAH1急剧减少，而ASAH3在NSCLC患者中轻度增加，因此Sph的产生显著增加(So(d23：2)的倍数为42.6)，其被SPHK1(鞘氨醇激酶1)磷酸化以产生S1P，其与具有七个跨膜域的G蛋白偶联受体S1PR1-5(也称为S1P1-5)结合，以自分泌或旁分泌方式在各种癌细胞中引发促存活信号传导。S1P被S1P磷酸酶(SGPL)快速代谢为乙醇胺-1-磷酸和十六烷醇。SPHK过度表达并且S1P表达也大量增加。
硫苷脂(Sulfatide)由高度特异性、晚期高尔基体定位的3'-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸半乳糖神经酰胺磺基转移酶(GAL3ST1-4)合成，其负责GalCer分子中半乳糖残基的3-O-硫酸化。产生半乳糖神经酰胺(GalCer)和硫苷脂的UGT8(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶8)和GAL3ST1在NSCLC患者中异常过表达。然而，与健康个体相比，他们产生的硫苷脂在NSCLC患者的血清SPL中急剧下降，可能是因为其特异性水解酶芳基硫酸酯酶A(ARSA)在NSCLC患者中也高表达。
我们对照该方法对于2个S1P[S1P(d18:0)和S1P(d18:1)]，2个C1P[C1P(d14：1/16：0)，C1P(d14：1/24：0)]，2个GSL[GlcCer(q40：3)和GlcCer(q29：2)]和2个Cer[Cer(d14：1/20：0)，Cer(d14：1/20：1(OH)]，这8个潜在生物标志物预测了模型的灵敏度和特异性。灵敏度值范围为87％至100％，特异性值为67％至100％，而曲线下面积(AUC)值范围为0.8至1.000(图2)。因此，这8个鞘脂标志物作为联合生物标志物能很好地将非小细胞肺癌患者和健康人区分开。
优选的，步骤(2)中，放冷至室温后加入75μL氢氧化钾甲醇溶液(1M)并在37℃水浴振荡2小时；目的是为了去除甘油磷脂的干扰。
优选的，步骤(6)，(7)，(8)使用的分离策略中优化了以下两点：
1)富集时间优化
人血清中的鞘脂类成分富集在富集柱上以优化富集时间(2分钟，5分钟，和10分钟)。通过使用质谱检测二氧化钛的富集能力。结果，鞘脂的富集率从2分钟到5分钟之间显著增加。超过5分钟时，结合能力没有明显变化。同时，富集5分钟后，富集能力呈上样剂量依赖性。结果表明，富集时间不应少于2分钟。随着富集时间的增加，线性变得更好。然而，10分钟后，总鞘脂类尤其是酸性鞘脂明显减少，这可能归因于在较长时间后富集后损失更多的鞘脂。考虑到损失率，5分钟是优化的富集时间。
2)三段分离策略
设计三个步骤以分别富集的中性鞘脂、酸性鞘脂和糖鞘脂。在第一步，将总脂类成分加载到TiO2柱上。此部分是基于鞘脂的pKa选择富集缓冲液。Ti4+带正电荷，更容易与负离子结合；磷酸根和硫酸根带有很强的负电性，因此与Ti4+结合紧密。如果结合缓冲液的pH低于N-聚糖的pKa。中性鞘脂在TiO2柱上不保留，而酸性鞘脂和糖鞘脂分别以螯合和桥接方式连接到TiO2上面，酸性鞘脂的结合力更强。用强酸性缓冲液(pH 1.0)洗脱中性鞘脂。第二个步骤中，逐渐加入pH 3.0的缓冲液。由于糖鞘脂与TiO2的结合是桥接方式，这种结合力不如螯合牢固，因此此步骤将洗脱糖鞘脂。此步骤中，富集柱仍然是酸性的。在第三步，通过加入碱性洗脱缓冲液(pH 11.0)将从TiO2上富集的酸性鞘脂类成分洗脱。
优选的，步骤10中，碰撞能量为10、20、40ev，是为了减少磷酸化和硫酸化鞘脂的源内裂解。
检测用TiO2富集法富集的酸性鞘脂的灵敏度，如图1所示，结果发现：采用TiO2富集法显著提高了酸性鞘脂的检测灵敏度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）取人血清，加入甲醇和氯仿后，再加入C12-硫苷酯溶液，超声波室温震荡，40～60℃温育过夜，进行第一次提取，获得提取液；
其中，人血清、甲醇、氯仿、C12-硫苷酯溶液的体积比为3～5：1000：30～50：1；
（2）将提取液放冷至室温后加入氢氧化钾甲醇溶液并在37℃水浴振荡2小时；放冷至室温加乙酸中和；离心，取上清，获得上清A；
其中，氢氧化钾甲醇溶液与人血清的体积比为0.5～1.5：1；
（3）沉淀加入甲醇，氯仿和异丙醇超声震荡混匀后，离心，取上清，获得上清B；
其中，甲醇，氯仿和异丙醇的体积比为0.5～1：1～2：0.5～1；
（4）沉淀加入氯仿和水，轻轻震荡分层后，离心，取下层，并与上清A和上清B合并，离心干燥，制得总脂类样品；
其中，氯仿和水的体积比为1：1；
（5）二氧化钛小柱：将二氧化钛粉末置于带有筛板，上下端具塞的、无填料的固相萃取小柱中，制得二氧化钛小柱；用上样缓冲液冲洗二氧化钛小柱6～8次；
其中，上样缓冲液为0.6% 乙酸，2% 甲酸和2% 乙腈溶液，pH为0.8～1.2；
（6）上样：将步骤（4）制备的总脂类样品用样品溶解缓冲液超声溶解之后，离心；将溶解后的样品滴加入二氧化钛小柱中，上下颠倒混匀；轻度离心后收集溶液，离心干燥，获得中性鞘脂；
其中，样品溶解缓冲液为氯仿：甲醇：水=6：3：0.5，pH为0.8～1.2；
（7）糖鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅰ加入步骤（6）洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，获得糖鞘脂；
其中，洗脱缓冲液Ⅰ为乙腈：水：甲酸=40～60：40～60：1，pH为2.8～3.2；
（8）磷酸化和硫酸化鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅱ加入步骤（7）洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，所得为磷酸化和硫酸化鞘脂类成分，即酸性鞘脂；
其中，洗脱缓冲液Ⅱ为先加入氨水溶液调节pH为碱性10～11，混匀后加入乙腈：水：甲酸=20～80：20～80：0.5；
（9）对中性鞘脂、酸性鞘脂和糖鞘脂分别进行超高效液相-高分辨质谱分析；
液相的条件：色谱柱：Hyper Gold C18柱；流动相为：A为甲醇：水：甲酸=6：4：0.2，v/v，10mM乙酸铵，B为甲醇：异丙醇：甲酸=6：4：0.2，v/v，10mM乙酸铵，流速0.30mL/min。
2.根据权利要求1所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：
步骤（1）中，人血清、甲醇、氯仿、C12-硫苷酯溶液的体积比为5：1000：50：1；
步骤（2）中所述的氢氧化钾甲醇溶液与人血清的体积比为1.5：1；
步骤（3）中所述的甲醇，氯仿和异丙醇的体积比为1：2：1。
3.根据权利要求1所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：
步骤（5）中所述的上样缓冲液为0.6% 乙酸，2% 甲酸和2% 乙腈溶液，pH为1.0；
步骤（6）中所述的样品溶解缓冲液为氯仿：甲醇：水=6：3：0.5，pH为1.0；
步骤（7）中所述的洗脱缓冲液Ⅰ为乙腈：水：甲酸=60：40：1，pH为3.0；
步骤（8）中所述的洗脱缓冲液Ⅱ为先加入氨水溶液调节pH为碱性11，混匀后加入乙腈：水：甲酸=80：20：0.5。
4.根据权利要求1中所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的C12-硫苷酯溶液中C12-硫苷酯的浓度为2.5μM；
步骤（2）中所述的氢氧化钾甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为1M；
步骤（3）中所述的甲醇，氯仿和异丙醇的总用量为2mL；
步骤（4）中所述的氯仿和水的总用量为2mL。
5.根据权利要求1中所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：
步骤（6）中所述的样品溶解缓冲液的用量为200μL；
步骤（7）中所述的洗脱缓冲液Ⅰ的用量为500μL；
步骤（8）中所述的洗脱缓冲液Ⅱ的用量为500μL。
6.根据权利要求1中所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的超声波室温震荡的时间为30秒；
步骤（1）中所述的温育的温度为48℃；
步骤（3）中所述的超声震荡的时间为30秒；
步骤（4）中所述的离心干燥的温度为4℃；
步骤（6）中所述的超声溶解的时间为30～60秒。
7.根据权利要求1中所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的离心的条件为3000～3800rpm高速离心10分钟；
步骤（3）中所述的离心的条件为3000～3800rpm高速离心10分钟；
步骤（4）中所述的离心的条件为3000～3800rpm高速离心15分钟；
步骤（6）中所述的离心的条件为10000～12000rpm、4℃离心15～30分钟；
步骤（6）中所述的上下颠倒混匀的时间为2～5分钟；
步骤（6）中所述的轻度离心的条件为1000～1200 rpm轻度离心1分钟；
步骤（7）中所述的离心的条件为1000～1200 rpm离心1分钟；
步骤（8）中所述的离心的条件为1000～1200 rpm离心1分钟。
8.根据权利要求1中所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的离心的条件为3000rpm高速离心10分钟；
步骤（3）中所述的离心的条件为3000rpm高速离心10分钟；
步骤（4）中所述的离心的条件为3000rpm高速离心15分钟；
步骤（6）中所述的离心的条件为12000rpm、4℃离心15分钟；
步骤（6）中所述的上下颠倒混匀的时间为5分钟；
步骤（6）中所述的轻度离心的条件1000 rpm轻度离心1分钟；
步骤（7）中所述的离心的条件为1000 rpm离心1分钟；
步骤（8）中所述的离心的条件为1000 rpm离心1分钟。
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