TR201809082T4 - Protei̇n si̇ali̇lasyonun hizli ve doğru anali̇zi̇ - Google Patents
Protei̇n si̇ali̇lasyonun hizli ve doğru anali̇zi̇ Download PDFInfo
- Publication number
- TR201809082T4 TR201809082T4 TR2018/09082T TR201809082T TR201809082T4 TR 201809082 T4 TR201809082 T4 TR 201809082T4 TR 2018/09082 T TR2018/09082 T TR 2018/09082T TR 201809082 T TR201809082 T TR 201809082T TR 201809082 T4 TR201809082 T4 TR 201809082T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- reaction
- protein
- sample
- galactose
- gal
- Prior art date
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 88
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 88
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims abstract description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 166
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 claims description 34
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 27
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 31
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 abstract description 18
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 101
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 68
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 28
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 25
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 25
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 9
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 7
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 108010044715 asialofetuin Proteins 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 4
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241001068914 Melicope knudsenii Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004263 amino monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012517 data analytics Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000010799 enzyme reaction rate Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000004730 pulsed amperometry Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 238000010971 suitability test Methods 0.000 description 1
- 238000011003 system suitability test Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012783 upstream development Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- G01N2333/938—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. beta-galactosidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Buluş gluko-proteinlerin sialilasyonunun analizine yönelik yöntemler ve kitler ile ilgilidir. Gluko-proteinin numuneleri üç koşul altında ayrı ayrı inkübe edilir: beta-galaktosidaz ile, beta-galaktosidaz + alfa-siyalidaz ile ve bir enzim olmadan. Enzim işleminden sonra, darbeli amperometrik deteksiyonu (HPAEC PAD) içeren yüksek performanslı anyon değişimi kromatografisi numunedeki toplam galaktozun, ortamdaki siyalikleşmemiş galaktozun ve ekzojen galaktozun miktarının belirlenmesine yönelik kullanılır. Söz konusu değerlerin belirlenmesi gluko-proteinin sialilasyon yüzdesinin sonucunu çıkarmayı olanaklı kılar.
Description
Tarifname
PROTEIN SIALILASYONUN HIZLI VE DOGRU ANALIZI
TEKNIK SAHA
Burada protein sialilasyonunu analiz etmeye yönelik analitik yöntemler açiklanir.
ARKAPLAN
Birçok protein biyolojik fonksiyonuna yönelik olarak glikosilasyon gerektirir. Çogunlukla
glikosilik zincirlerin terminal, “kapama", karbonhidratlari siyalik asit kalintilaridir. Siyalik
asitler bir N- ve O-bagli nöraminik asitler ailesini içerir. N-bagli siyalik asitler asetil veya
glikol kisimlari nöraminik asitdin amino kalintisi ile baglayarak olusturulur, sirasiyla N-
asetilnöraminik asiti (NeuSAc) ve N-glikolnöraminik asiti (NeuSGc) olusturur. Nöraminik
amino grubu hidroksil kismi ile degistirildiginde, bu 3-deoksi-D-glisero-D-galakto-Z-
nonulosonik asit (KDN) olusturur. O-bagli siyalik asitler NeuSAc, NeuSGc veya KDN
hidroksil gruplarinin bir veya daha fazlasinin metil, asetil, laktol, sülfat veya fosfat gruplari
ile degistirilmesi ile olusturulur. Dolayisiyla siyalik asitlerin büyük ve çesitli bir
popülasyonu ortaya çikar.
Ayrica, genel olarak bu modifikasyonlara bagli çok sayida biyolojik fonksiyon nedeniyle
protein sialilasyonunu analiz etmeye önemli ilgi bulunur. Sialilasyon farmakokinetikler ve
protein biyoterapötiklerinin etkililigi bakimindan önemli olabilir. Dolayisiyla, siyalik asitin
glikoproteinlerini degerlendirmek amaciyla birçok analitik yöntem gelistirilmistir. Örnegin,
antikor bazli çalismalar özel karbonhidrat kisimlari belirlemek üzere kullanilabilir.
Terminal siyalik asit kalintilari ilgili glikoproteinden enzimatik bir sekilde ayrilabilir ve
HPLC ile analiz edilebilir. Ancak, bu yöntemlerin her birinin sakincasi bulunur ve tipik
olarak saf numuneler veya yüksek konsantrasyonlar gerektirir. Biyofarmasötik sektörü
tarafindan kullanilan klasik yöntemlerde düsük dogruluk, yüksek veri degiskenligi
sorunlari görülür ve matris enterferansi nedeniyle karisik kültür ortami ile kullanilamaz.
Burada açiklanan yöntem bu tür sorunlari çözer ve dogru ve tekrarlanabilir miktarda
protein sialilasyonu saglar.
Genel olarak, burada açiklanan yöntem iki adimi içerir: [1] galaktoz ve siyalik asit
kalintilarini glikoproteinlerden hidrolize etmek amaciyla bir enzimatik reaksiyon kullanilir
ve [2] galaktoz kalintilarini ayirmak ve miktarini belirlemek amaciyla bir iyon-degisim
kromatogrofisi yöntemi kullanilir. Yöntemin enzimatik kismi açiga çikan (kapatilmamis)
terminal galaktoz kalintilarinin spesifik ekso-glikosidaz, ß-(1-4]-galaktosidaz (ß-
galaktosidaz] ile salimini içerir, bununla beraber terminal siyalik asit kalintilari (it-[2-
3,6,8,9]-siyalidaz (OL-siyalidaz) ile salinir. Parçalanmadan önce, bir numune en az üç tüpe
ayrilir. Birinci tüp, Reaksiyon A bir alt yapi örnegidir ve sadece enzim reaksiyon tamponlari
içerir. Ikinci tüp, Reaksiyon B'dir, siyalik asitler ile kapatilmayan tüm galaktoz kalintilarini
bölen ß-galaktosidaz ile reaksiyona girer. Üçüncü tüp, Reaksiyon C nörominidaz ve B-
galaktosidaz ile birlikte parçalanir. Nöraminidaz enzim kapama siyalik asitleri ortadan
kaldirir ve açiga çikan tüm galaktoz kalintilarini bölmek üzere ß-galaktoza izin verir. Sonra
üç numunede bulunan galaktoz miktarini belirlemek üzere Darbeli Amperometrik
Deteksiyonlu Yüksek Performansli Anyon degisimi kromatografisi (HPAEC PAD) kullanilir.
Kapatilmamis galaktozun (baska bir deyisle [Reaksiyon B) toplam galaktoza (baska bir
deyisle Reaksiyon C] orani galaktoz kalintilarinin yüzde kapatilmasini hesaplamak üzere
kullanilir, bununla beraber ortamda bulunan tüm serbest galaktozu da ifade eder
KISA AÇIKLAMA
Burada bir proteinin sialilasyonunu analiz etmeye yönelik analitik yöntemler açiklanir.
Ayrica asagidakileri içeren sialilasyon içerigini belirlemeye yönelik bir yöntem açiklanir: [a]
bir proteini analize hazirlama; [b] asagidakileri içeren hazirlanan proteine enzimatik islem
yapma: hazirlanan proteini birçok asagidakileri içeren birçok protein numunesine bölme:
protein numunesine en az ß-galaktosidaz ekleme (Reaksiyon B); [iii] en az bir diger protein
numunesine en azindan ß-galaktosidaz ve a-siyalidaz ekleme (Reaksiyon C] ve birçok
numunesini inkübe etme ve birçok protein numunesine bir deoksiriboz standardi ekleme
ve (c) birçok protein numunesini HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak analiz etme; [d]
reaksiyon A, reaksiyon B ve reaksiyon C'nin birçok protein numunesine yönelik bir galaktoz
içerigi belirleme ve (e) denklem 1'i kullanarak proteine yönelik bir sialilasyon yüzdesi
hesaplama:
Reaksi'yon C (Toplam Gal) - Reaksiyon B (Kaplanmayan Gal)
Kaplama Yüzdesi ('-ii)= x 100
Reaksiyon C (Toplam Gal) . Reaksiyon A (ortamdaki Gal)
burada reaksiyon A (ortamdaki Gal), reaksiyon B [Kapanmayan Gal) ve reaksiyon C [Toplam
Gal) deoksirihoz alani ile bölünen reaksiyonlar A, B ve C'nin düzeltilen galaktoz alanlaridir.
Ayrica asagidakileri içeren bir yöntem açiklanir (f) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak
birçok pozitif ve negatif kontrolü analiz etme; (g) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak
birçok standardi analiz etme ve [h] birçok protein numunesini birçok standart ve kontrol
ile karsilastirma.
Ayrica asagidakileri içeren bir proteinin sialilasyon içerigini belirlemeye yönelik HPAEC-
PAD kromatografisinin kullanimi açiklanir: [a] bir proteni analize hazirlama; (b)
asagidakileri içeren hazirlanan proteine enzimatik islem yapma: hazirlanan proteini birçok
asagidakileri içeren birçok protein numunesine bölme: [i] bir ortam numunesi olarak en az
bir protein numunesi (Reaksiyon A): (ii) en az bir protein numunesine en az ß-galaktosidaz
ekleme (Reaksiyon B]; [iii] en az bir diger protein numunesine en azindan ß-galaktosidaz
ve (x-siyalidaz ekleme (Reaksiyon C] ve birçok numunesini inkübe etme ve birçok protein
numunesine bir deoksirihoz standardi ekleme ve [C] birçok protein numunesini HPAEC-
PAD kromatografisini kullanarak analiz etme; (d) reaksiyon A, reaksiyon B ve reaksiyon
C'nin birçok protein numunesine yönelik bir galaktoz içerigi belirleme ve [e] denklem 1'i
kullanarak proteine yönelik bir sialilasyon yüzdesi hesaplama:
Reaksiyon C (Toplam Gal) - Reaksiyon B (Kaplanmayan Gal)
Kaplama Yiizdesi m): x 100
Reaksiyon C (Toplam Gal) - Reaksiyon A (ortamdaki Gal)
burada reaksiyon A (ortamdaki Gal), reaksiyon B [Kapanmayan Gal) ve reaksiyon C [Toplam
Gal) deoksirihoz alani ile bölünen reaksiyonlar A, B ve C'nin düzeltilen galaktoz alanlaridir.
Ayrica asagidakileri içeren kullanim açiklanir: (f) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak
birçok pozitif ve negatif kontrolü analiz etme; (g) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak
birçok standardi analiz etme ve (h) birçok protein numunesini birçok standart ve kontrol
ile karsilastirma.
Ayrica asagidakileri içeren herhangi bir proteinin sialilasyon içerigini belirlemeye yönelik
bir kit açiklanir: galaktosidaz ve siyalidazin önceden ölçülen miktarlarini içeren birçok kabi
içeren en az bir kap,- istege bagli olarak en az bir tampon bilesimi, bir pozitif kontrol örnegi,
bir negatif kontrol örnegi içeren kaplar ve karbonhidrat standartlari ve asagidakilerin
açiklamalarini içeren bir proteinin sialilasyon içerigini belirlemeye yönelik bir yöntemi
açiklayan talimatlar: (a) bir proteni analize hazirlama; [b] asagidakileri içeren hazirlanan
proteine enzimatik islem yapma: hazirlanan proteini birçok asagidakileri içeren birçok
protein numunesine bölme: (i) bir ortam numunesi olarak en az bir protein numunesi
B); (iii) en az bir diger protein numunesine en azindan ß-galaktosidaz ve oi-siyalidaz ekleme
deoksiriboz standardi ekleme ve (C) birçok protein numunesini HPAEC-PAD
kromatografisini kullanarak analiz etme; (d) reaksiyon A, reaksiyon B ve reaksiyon C'nin
birçok protein numunesine yönelik bir galaktoz içerigi belirleme ve (e) denklem 1'i
kullanarak proteine yönelik bir sialilasyon yüzdesi hesaplama:
Reaksiyon C (Toplam Gal) - Reaksiyon B (Kaplanmayan Gal)
Kaplama Yüzdesi (°.i)= x 100
Reaksiyon C (Toplam Gal) - Reaksiyon A (ortamdaki Gal)
burada reaksiyon A (ortamdaki Gal), reaksiyon B [Kapanmayan Gal) ve reaksiyon C [Toplam
Gal) deoksiriboz alani ile bölünen reaksiyonlar A, B ve C'nin düzeltilen galaktoz alanlaridir.
Ayrica asagidakileri içeren bir kit açiklanir: [f] HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak bir
pozitif ve negatifkontrolü analiz etme; (g) l-lPAEC-PAD kromatografisini kullanarak birçok
standardi analiz etme ve [h] birçok protein numunesini birçok standardin sonuçlari ile
karsilastirma.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
SEKIL 1 Reaksiyon A, B ve C'nin bir semasini ve her ilgili reaksiyondan elde edilen
verileri gösterir. Sialilasyon kapama yüzdesi sirayla Reaksiyonlar C ve B ve
Reaksiyonlar C ve A'daki farklarin oranindan belirlenebilir. Bakiniz Denklem 1.
SEKIL 2Reaksiy0n C'de parçalanan reCAlfa-l numunesine yönelik tipik bir
kromatogrami gösterir. Yaklasik 14 ila 16 dakikada galaktoz araligina yönelik
elüsyon süreleri.
SEKIL 3 deiyonize suya karsi diyaliz edilmis veya bir 10 kDa spin filtrede santrifüj
edilmis bir akis yukari recAlfa-l numunesinin bir karsilastirmasini gösterir.
Safsizliklar diyaliz edilen numunede kalmistir, fakat 10 kDa spin filtresi ile
neredeyse tamamen çikarilmistir.
SEKIL 4 recAlfa-l kültür ortamindan akis yukari eksipiyanlarin tespit edilebildigini
ve galaktoz pike yakin birlikte ayrisabildigini gösterir. Panel A'da spin filtre
temizlemeden sonra bazi numunelerdeki galaktoz pike yakin ayrisan bir eksipiyan
piki gösterilir. Reaksiyon B numunelerinde, safsizlik piki galaktoz pikinden çözünen
baz hattidir ve entegre edilmez. Panel B'de, proses safsizlik piki bir Reaksiyon C
numunesi ile birlikte ayrismaz. Bu durumda, safsizlik piki galaktoz pikinin alani ile
entegre edilmesini önlemek üzere yukarida gösterildigi gibi ayrilmalidir.
SEKIL 5Yöntem spesifitesi glikoproteinlerden elde edilen bir nötr ve amino
monosakarit karisimini analiz ederek dogrulanmistir.
SEKIL 6 Tipik bir galaktoz standart egrisi örnegi.
DETAYLI AÇIKLAMA
Burada açiklanan yöntemi kullanarak analiz edilebilen bir proteinin bir örnegi alfa 1-
proteinaz inhibitörüdür (ayrica alfa 1-antitripsin olarak da bilinir). Alfa 1-proteinaz
inhibitörü hücreleri pihtilasmada ve inflamasyonda bulunan proteaz enzimlerinden
korumada yer alan dogal olarak olusan serpin glikoproteindir. Alfa-1 proteaz inhibitörünün
bulunmamasi, alfa 1-antitripisin eksikligi amfizem ve kronik obstrüktif akciger hastaligi
eksikligi ile ilgili hastaliklari tedavi etmek üzere bir biyoterapötik olarak alfa-1 proteaz
inhibitörü kullanmaya ilgi bulunmaktadir. Rekombinant alfa-1 proteinaz inhibitörü
kapanan N-bagli glikan karbonhidrat yapilari ile PerC6 hücre hatti ile salgilamaya yönelik
gelistirilmistir. recAlfa-l'in serum yari ömrünü azaltmak üzere terminal siyalik asitlerin
miktarinda bir azalma gösterilmistir. Dolayisiyla, bir terapötik ilaç olarak fonksiyonunu
veya etkililigini arastirirken recAlfa-l'de salik asitler ile kapanan galaktoz kalintilarinin
yüzdesini bilmek önemlidir.
ÖRNEKLER
Örnek 1: Analiz ve Enzimatik Parçalanmaya yönelik Numune Preparasyonu
Burada bir glikoproteinin sialilasyon içeriginin belirlenmesine yönelik bir yöntem açiklanir.
Yöntem, karbonhidrat kisimlarinin enzimatik hidrolizine yönelik bir protein numunesinin
preparasyonu ile baslar. Dolayisiyla, protein konsantrasyonunu ayarlanmasini, enzim ile
etkilesime girebilen çözünmüs tuzlar, tamponlar, diger proteinler, karbonhidratlar,
eksipiyanlar, vb. gibi solüsyon bilesenlerinin çikarilmasi ile uyumlu kosullara
olusturulmalidir. Burada kullanildigi üzere, “hazirlanan" terimi veya “analize yönelik bir
proteini hazirlama" ifadesi enzimatik hidroliz ile etkilesime girebilen solüsyon
bilesenlerinin çikarilmasi ve protein solüsyonunun deiyonize su ile çalismaya yönelik bir
optimal konsantrasyona seyreltilmesi prosesini açiklar.
Analize yönelik proteinlerden protein solüsyonu bilesenlerini hazirlamak üzere en az iki
sinirlayici olmayan örnek yöntemi kullanilabilir: (1) deiyonize suya karsi diyaliz veya (2)
santrifüjlü filtrasyon [spin filtrasyonu olarak da adlandirilir). Her iki durumda, ilgili analit
proteinini korumanin yani sira daha düsük moleküler agirlikli türleri çikarmak üzere
belirtilen bir moleküler agirligi ayirma siniri (MWCO) ile bir yari geçirgen
membrankullanilmistir. Yararli MWCO araliklari 1 kDa, 2.5 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa,
SOkDa, 100 kDa, 250 kDa ve 500 kDa'yi içerir. Diyaliz prosedüründe, protein bir diyaliz
membrana yerlestirilir ve en az 4 saat boyunca 4 °C'de deiyonize suya veya uygun tampon
ve/veya tuz solüsyonu fazlasina karsi diyaliz edilir.
Alternatif olarak, diyalize edilmek yerine, bir protein numunesi santrifüjlü filtrasyon ile
enzimatik parçalanmaya yönelik hazirlanabilir. Santrifüjlü filtrasyon sirasinda, protein
solüsyonu bir belirlenen MWCO ile yari geçirgen membrana karsi santrifüj edilmistir.
MWCO'dan daha düsük moleküler agirliklara sahip solüsyon bilesenleri santrifüjleme
sirasinda filtreden geçer, bununla beraber protein ve daha yüksek moleküler agirlik türleri
tutulur. Tipik olarak, protein solüsyonu, yari geçirgen membrandan geçen su nedeniyle,
Spin filtrasyonu sirasinda konsantre edilmistir. Genellikle, sinirlayici olmayan bir örnek
olarak, protein numunesini hazirlamaya yönelik olarak üreticinin talimatlarina göre bir 10
kDa spin filtre kullanilmistir.
Enzimatik parçalanmadan önce, protein numuneleri ayrica deiyonize su ile 1.0 ila 1.5
mg/mL'lik bir konsantrasyona seyreltilmistir bu sekilde çalismanin dogrusal araligi içinde
yer alirlar. Numuneler seyreltildikten sonra, her kosula yönelik en az bir reaksiyon (baska
bir deyisle A, B ve C] düzenlenmistir. Hazirlanan protein solüsyonu enzimatik
deglikozilasyona yönelik en az üç numuneye bölünmüstür. Bakiniz Sekil 1. Reaksiyon A
arka plan kontrolüydü (ekzojen galaktozu kontrol etmek üzere). Bu reaksiyon sadece
enzimatik reaksiyonlara yönelik tamponlardan olusur ve protein analiti içeren ortamda
bulunabilen karbonhidratlara yönelik bir kontrol islevi olarak kullanilir. Reaksiyon B,
siyaliklesmemis karbonhidrat gruplari hidrolize etmeyen ß-galaktosidazi içermistir, fakat
siyalil gruplar ile "kapanmis" olanlari içermemistir. Reaksiyon C hem oi-siyalidaz hem de [3-
galaktosidaz içermistir. Bu reaksiyonda, a-siyalidaz kapama siyalil kisimlarini hidrolize
etmistir, bu sonra ß-galaktosidazin karbonhidrat gruplarin tümünü hidrolize etmesini
olanakli kilmistir. Bu kombine (x-siyalidaz ve ß-galaktosidaz reaksiyonunda, tüm
glikosilasyon [baska bir deyisle siyaliklesmis ve siyaliklesmemis) proteinden çikarilmistir,
bununla beraber ß-galaktosidaz reaksiyonunda, sadece kapanmamis (siyaliklesmemis)
karbonhidrat gruplar çikarilmistir. Üç reaksiyon kosuluna yönelik bilesenler Tablo 1'de
gösterilir.
Tablo 1: Glikosilaz Reaksiyon Kosullari
Galaktosidaz Siyalidaz ß-(1-4)-
Reaksiyon ::31513126 Reaksiyon Reaksiyon Galaktosidaz :-[glizîligfigö
ll Tamponu [uL) Tamponu (uL) (uL) y ll
A-Arkaplan 12 4 4 0 0
B-ß-galaktosidaz 10 4 4 2 0
C-ßi-gal'aktosidaz 8 4_ 4 2 2
d-siyalidaz
Ayri reaksiyonlar parçalanacak numunelerin sayisina bagli olarak çok sayida
hazirlanmistir. Her parçalanmada, üç ayri tüpe 45 uL'lik numune eklenmistir. Ardindan,
uygun enzim reaksiyonu A, B veya C'nin 20 pL'si 0 reaksiyon türüne yönelik belirtilen tüpe
eklenmis ve 37 °C'de bir termo karistirici üstünde, hafifçe çalkalanarak, 2.5 saat ila 4 saat
boyunca isitilmistir. Reaksiyon, 90 °C'de 5 dakika boyunca inkübasyon ile söndürülmüstür.
Parçalanmalar tamamlandiktan sonra, numuneler 30 uL'lik numune ile 20 uL 0.02 mg/mL
deoksiriboz standardi bir viyal içinde birlestirerek ve iyice karistirarak kromatografik
analizlere yönelik hazirlanmistir. Numuneler sonra 10 °C'de bir HPLC otomatik numune
alma Cihazina yerlestirilmistir ve Örnek 2'de açiklanan kromatografik yöntem kullanilarak
çalistirilmistir
Örnek 2: Kromatografik Yöntem
Darbeli Amperometrik Deteksiyonlu Yüksek Performansli Anyon Degisimi Kromatografisi
cihazlari ve elektrokimyasal deteksiyon üniteleri (Dionex, Sunnyvale, CA] olan Dionex [CS-
3000 iyon kromatografisi sistemleri üstünde gerçeklestirilmistir [Dionex, Sunnyvale, CA).
Darbeli amperometrik deteksiyonuna [PAD] yönelik olarak tek kullanimlik altin (Au)
elektrotlari kullanilmistir [Dionex Prod. No. 060139). Numune analizine yönelik kullanilan
dalga formu Tablo 2'de gösterildigi gibi karbonhidratlarin PAD'ine yönelik optimal ayarlari
açiklayan dionex Teknik Not 21'e göre yapilmistir. Bakiniz Dionex Technical Note 21,
Optima] Settings for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates Using the Dionex
ED40 Electrochemical Detector, Dionex (1998].
Tablo 2: Karbonhidrat Numunelerin PAD'ine yönelik Dioneks Önerilen Optima] Dalga Formu
Ayarlari
Süre Potansiyel [V] Entegrasyon
0.20 +0.1 Baslangiç
0.40 +0.1 Son
0.41 -0.2
0.42 0.2
0.43 +06
0.44 -0.1
0.50 -0.1
Kromatografi, siyaliklestirilmemis proteini baglamak ve sütuna adsorpsiyonunu önlemek
bir 4 x 50 mm Amino Yakalama sütunu (Dionex Ürün No. 046112] olan Dionex CarboPac
gerçeklestirilmistir.
Birinci mobil faz (A) 20 mM NaOH içeriyordu ve 30 dakika boyunca 1 mL/dakika akis
oraninda izokratik ayrima yönelik kullanilmistir (baslangiç çalisma süresi 28 dakikaydi
fakat %100 mobil faz A'da tekrar dengelemeye yönelik daha fazla zaman saglamak üzere
gelistirme sirasinda 30 dakikaya uzatilmistir]. Ikinci mobil faz (B) 500 mM NaOl-l içeriyordu
ve sütun elüsyonu, sütun temizleme ve elektrod temizlemesine yönelik kullanilmistir. A ve
B mobil fazlarini kullanarak yükleme yikamayi kromatografik elüsyon yöntemi Tablo 3'te
gösterilmistir. Numune enjeksiyon hacmi 20 uL'ydi. Veri analizleri Chromeleon® 6.8
Chromatography Data Analysis System yazilimi (Dionex) kullanilarak yapilmistir.
Tablo 3: HPAE-PAD Kromatografisi Elüsyon Yöntemi
Süre (dakika) % A (20 mM NaOH] % B (
19.5 0,0 100
.0 100 0.0 -
.0 100 0.0 -
Örnek 3: Standartlar, Kontroller, Kalibrasyon ve Sistem Uygunlugu
Galaktoz konsantrasyonun miktari 8 pmol ila 1.5 nmol arasindaki bir dogrusal aralikta seri
bir sekilde seyreltilen bir 10 mM galaktoz standardinin (BioAssay Systems, EGAL-100)
bilinen miktarlarina göre belirlenmistir. Yöntem gelistirme sirasinda, sütun ve sistem
performansini saglamak üzere numune enjeksiyonlarindan önce her noktanin tek bir
enjeksiyonu yapilmistir. Bakiniz Sekil 6.
Monosakarit Z-deoksi-D-riboz (deoksiriboz) bir dahili standart olarak kullanilmistir.
Elektrot performansini izlemek üzere deoksiribozun bir esdeger miktari tüm protein
numunelerine, standartlarina ve kontroller eklenmistir. PAD yapisi nedeniyle,
enjeksiyondan enjeksiyona ortaya çikabilen detektör tepkisindeki farklari düzeltmek üzere
dahili standart kullanilmistir. Tüm numunelerin galaktoz pikinin alani galaktoz alanini
deoksiriboz alanina bölerek düzeltilmistir.
Her seferinde çalismanin dogrulugunu saglamak üzere pozitifbir kontrol kullanilmistir. Bu
enzim fonksiyonunun izlenmesini ve dogru numune islenmesini gerektirmistir. Kontrol
reaksiyonu ticari olarak bulunan bovin siyaliklesmis fetuin ve asialo fetuin standardindan
fetuin %99'dan fazla bir kapama yüzdesine sahipti ve asialo fetuini %0'lik bir kapama
yüzdesine sahipti. Esit oranlarda karistirildiginda, fetuinin kapama (sialilasyon) orani%50
± %3 olmaliydi. Fetuin kontrolü alikotlanmis, -70 °C'de dondurulmus tek bir parti olarak
hazirlanmistir ve bir numune dizisi her parçalandigmda burada açiklanan yöntemler
kullanilarak tek bir numune çözülmüs ve kullanilmis ve çalistirilmistir.
Analitik yöntemin performansini saglamak üzere bir çalismanin baslangicinda enjekte
edilen ve her 12 numune enjeksiyonu parantez içine alinan (baska bir deyisle kopya olarak
2 numune) ve çalisma boyunca elektrot ve sütun performansini izlemek üzere çalismanin
sonunda enjekte edilen bir galaktoz ve deoksiriboz karisimini kullanarak bir sistem
uygunlugu deneyi izlenmistir. Tipik bir kromatografik çalismaya yönelik deney dizisi Tablo
4'te gösterilir.
Tablo 4: Tipik Kromatografi Çalisma Sirasi
Numune Içerik Tekrar Enjeksiyon Hacmi [piL]
1 Tampon Boslugu a 3 20
2 Yüksek Kons. Std-Sistem Uygunlugu 3 20
3 Düsük Kons. Std b 1 20
4 Yüksek Kons. Std b 1 20
Enzim Boslugu L' 1 20
6 Fetuin Reaksiyon B *1 1 20
7 Fetuin Reaksiyon C d 1 20
8 Fetuin Reaksiyon B 11 1 20
9 Fetuin Reaksiyon C a' 1 20
Yüksek Kons. Std-Sistem Uygunlugu b 1 20
11 Tampon Boslugu 0' 1 20
12 Numune 1-Reaksiy0n A 1 20
13 Numune 1-Reaksiyon B 1 20
14 Numune 1-Reaksiy0n C 1 20
Numune 1-Reaksiy0n A 1 20
16 Numune 1-Reaksiyon B 1 20
17 Numune 1-Reaksiy0n C 1 20
18 Tampon Boslugu " 1 20
19 Numune 2-Reaksiy0n A 1 20
Numune Z-Reaksiyon B 1 20
Tablo 4: Tipik Kromatografi Çalisma Sirasi
Numune Içerik Tekrar Enjeksiyon Hacmi (uL)
21 Numune 2-Reaksiy0n C 1 20
22 Numune 2-Reaksiyon A 1 20
23 Numune 2-Reaksiy0n B 1 20
24 Numune 2-Reaksiy0n C 1 20
Yüksek Kons. Std-Sistem Uygunlugu b 1 20
26 Tampon Boslugu '7 1 20
N N 1 20
N + 1 Yüksek Kons. Std-Sistem Uygunlugu '1 3 20
N + 2 Yikama - '
içerir). Ek kör enjeksiyon sütunun temiz ve dengelenmis olmasini saglamak üzere gerekli olabilir.
Sütun temizligini degerlendirmek üzere ikinci kör enjeksiyonun kullanilmasi önerilir. Bir kör
enjeksiyon her 6 numune enjeksiyonunda veya gerektiginde daha kisa sürede gerçeklestirilmelidir
(Tampon Körlük).
b Düsük Konsantrasyon Standardi 8 pmol galaktozdu ve Yüksek Konsantrasyon Standardi 1500 pmol
galaktozdu. Bu çalisma standartlari, numune sonuçlarinin çalismaya yönelik en düsük ve en yüksek
konsantrasyonlarin dogrusal araligi içinde olmasini saglamayi amaçliyordu. 1500 pmol çalisma
kontrolü de elektrot ve sütun performansini izlemek üzere çalisma boyunca bir sistem uygunlugu
kontrolü [örnegin, Yüksek Konsantrasyonlu Standard-Sistem Uygunlugu] olarak kullanilmistir ve
her 12 numuneli enjeksiyon çalismalari (baska bir deyisle dört A, B ve C numune setleri] parantez
içine alinmalidir.
C Bos Enzim enzimleri içeren bir enjeksiyondu [baska bir deyisle ß-galaktosidaz ve a-siyalidaz) ve
bir protein numunesi olmayan tamponlar [baska bir deyisle, bir protein analiti olmayan Reaksiyon
d Bovin fetuin (siyaliklesmis ve asialo fetuinin bir 1 : 1 karisimi] sialilasyona yönelik bir pozitif kontrol
olarak kullanilmistir.
Örnek 4: Sonuçlarin Düzeltmesi ve Hesaplamasi
Sekil 2'de bir temsili kromatogram gösterilir. Tüm numune enjeksiyonlarinin alanlari
deoksiriboz alani ile düzeltilmistir. Düzeltmeler galaktoz pikinin alanini deoksiriboz pikinin
alani ile bölerek gerçeklestirilmistir. Bu düzeltilen rakam sonra sialilasyon yüzdesini
hesaplamak üzere kullanilmistir. Bu yüzdeyi hesaplamak üzere, kapanmamis galaktozun
toplama galaktoza orani Denklem 1 kullanilarak hesaplanmistir:
Reaksiyon C (Toplam Gal) - Reaksiyon B (Kaplanmayan Gal)
Kaplama Yüzdesi (M: :4 100
Reaksiyon C (Toplam Gal) - Reaksiyon A (ortamdaki Gal)
burada reaksiyon A [ortamdaki Gal), reaksiyon B (Kapanmayan Gal) ve reaksiyon C [Toplam
Gal) deoksiriboz alani ile bölünen reaksiyonlar A, B ve C'nin düzeltilen galaktoz alanlaridir.
Kapama yüzdesini hesaplamak üzere, galaktoz alani düzeltilen galaktoz alanlarini vermek
üzere deoksiriboz alani ile bölünmüstür. Kapama yüzdesi düzeltilen alanlari kullanarak bir
numunenin çift enjeksiyonlarinin her birine yönelik hesaplanmistir. Reaksiyon B'ye yönelik
ölçülen düzeltilen galaktoz alani Reaksiyon C'den belirlenen düzeltilen galaktoz alanindan
çikarilmistir, bu deger sialil kapanan galaktoz miktarina karsilik gelir. Reaksiyon A'ya
yönelik düzeltilen galaktoz alani Reaksiyon C'ye yönelik ölçülen düzeltilen galaktoz
alanindan çikarilmistir, bu deger toplam galaktoza karsilik gelir [baska bir deyisle kapanan
ve kapanmayan]. Kapanan galaktoz [C - B) toplam galaktoza (C - A] bölünmüstür ve siyalil
kapama yüzdesini vermek üzere 100 ile çarpilmistir. Temsili veriler Tablo 5'de gösterilir.
Tablo 5: Temsili Galaktoz Kapama Verisi
Deoksiriboz Galaktoz Düzeltilen Ka ama Ortalama
Numune Alani (nC x Alani (nC x Alani [nC x Yüigdesi Kapama
Reaksiyon B
Reaksiyon C
Reaksiyon B
Bir çalismanin baslangicinda ve çalisma boyunca elektrot ve sütun performansini izlemek
üzere çalismanin sonunda enjekte edilen bir galaktoz ve deoksiriboz karisimini kullanarak
sistem uygunlugu deneyi izlenmistir. Bildirileri ortalama kapama yüzdesi çift
enjeksiyonlardan düzeltilen alanlardan hesaplanmistir. Reaksiyon B'deki galaktoz pik alani
8 pmol standardindan galaktoz pik alaninda daha az oldugunda, bu durumda kapama
yüzdesi hesaplamanin numeratöründeki 8 pmol standardinin galaktoz pik alanina göre
hesaplanarak ">[kapama]%" [baska bir deyisle "daha fazla") olarak bildirilmistir.
Kuyruklama faktörünün hesaplamasi [Chrome1e0n® yaziliminda “asimetri” olarak
adlandirilir), teorik plakalar ve çözünürlük Dionex veri alma yazilimi ile gerçeklestirilmistir
ve belirlenmistir. Kalan sistem uygunlugu kriterlerine yönelik hesaplamalarmanuel olarak
belirlenmistir. Temsili sistem uygunluk parametreleri Tablo 6'de gösterilir.
Tablo 6: Temsili Sistem Uygunlugu Parametre Hesaplamalari
Numune Deuksiripuz Deoksiribgz Deoksiriboz Teorik Tîteiiîiiîisairsi'buggsi Deoksiriboz. Alani Assiiiîlgitizzx Degklisziiiîgioz 3::::
Asimetrisi Çozunurlugu Plakalar (dakika) (nC x dakika) dakika) Tufulrna 2 Alani
Suresi
Sistem uygunlugu çalisma kabul kriterleri Tablo 7'de gösterilir.
Tablo 7: Sistem Uygunlugu Çalisma Kabul Kriterleri
Sistem Uygunluguna yönelik Parametreler Kriter
Numunedeki deoksiribozun tutulma süresinin yüksek ve düsük
konsantrasyon standardinin ortalamasindaki deoksiribozun ±5%
tutulma süresine göre yüzde farki
Baslangiç çalisma kontrolünün [yüksek konsantrasyon standardi]
ve parantezleme çalisma kontrolü enjeksiyonlari (baska bir deyisle
yüksek konsantrasyon standardi sistem uygunlugu enjeksiyonlari]
galaktoz alaninin yüzde farki
Çift recAlfa-l numunesinin kapama %'sinin fark yüzdesi ±2%
.. belirlenen
Onceden belirlenen kontrol % kapama sonucu ile beklenen %
degerin
kapama sonucunun yüzde farki.
Kuyruklama Faktörü [baska bir deyisle, Asimetri)* 1 ±0.2
Teorik Plakalar* 22000
Çözünürlük* 28.5
Kuyruklama Faktörü her numune enjeksiyonuna yönelik deoksiriboz piki
kullanarak belirlenmistir.
Örnek 5: Numune/Enzimatik Reaksiyonlarin Stokiyometrisi ve Parçalanma Süresi
Enzim reaksiyon oranini iyilestirmek amaciyla, enzimin proteine orani analiz edilmistir. [3-
galaktosidaz enzimi üretici tarafindan >3 Ünite/mL'de (spesifik aktivite >6 Ünite/mg)
saglanir, bununla beraber a-Siyalidaz enzimi bir 5 Ünite/mL'lik aktiviteye sahiptir [spesifik
aktivite 135 Ünite/Maide). Her enzimin miktari her biri 4 uL'de sabit tutulmustur, bu
reaksiyonda 0.012 Ünite ß-galaktosidaza ve 0.02 Ünite a-siyalidaza karsilik gelir, bununla
beraber protein miktari 540 ila 2160 pmol arasinda degismistir. Analiz edilen numuneler
1.4 mg/mL'lik bir konsantrasyonda hücre kültürü üst fazinda bir tampon degistirilen ve
filtrelenen recAlfa-l'di. Numuneler Tablo 8'de gösterildigi gibi hazirlanmistir.
Tablo 8: Reaksiyon Stokiyometrisi
Numune RAD0906 Reaksiyon Reaksiyon Eklemesinden Sonra
Hacmi (uL) Hacmi (uL) Numune Konsantrasyonu (mg/mL)
20 0.7
40 20 0.9
80 20 1.1
Her recAlfa-l reaksiyonu stokiyometrisi ve parçalanma süresi noktasinda, galaktoz
kromatografik pik alani analiz edilmistir ve kapama yüzdesi belirlenmistir. Sonuçlarin bir
özeti Tablo 9'da gösterilmistir, bu kapama degerinin stokiyometrik kosullarin herhangi
birine yönelik degismedigini gösterir. Orijinal reaksiyon stokiyometrisi (örnegin, 2.2 x 10-
Ünite/pmol proteini) üreticinin tavsiyelerine göre hesaplanmistir. Ancak, bu sonuçlar,
protein konsantrasyonu 4 kat arttiginda bile enzimlerin saticinin önerdigi kosullarda asiri
olabilecegini ortaya koyar. Stokiyometrinin bu genis dinamik araligi göz önünde
bulunduruldugunda, prosedürü basitlestirmek, enzim maliyetini en aza indirmek ve
numune preparasyonunda yeterli saglamlik saglamak amaciyla bir "orta-nokta"
stokiyometrik kosul [baska bir deyisle, yaklasik 1.1 x 10-5 Ünite/pmol protein) seçilmistir.
Tablo 9: recAlfa-l Reaksiyon Stokiyometri Sonuçlari
Protein Pmteiî' Numune 3' . Siyalidaz ß' . Siyalidaz Galakmz
(pmol) Hacmi Türü galailIKtfisidaz [ünite] galaktosidaz [ünite /pmol) Alani I(nC %Kapama
Ortalama 96.6
Std Sapma 0.15
Reaksiyon stokiyometrisi ayrica reaksiyonda enzimin 4 iiL'si kullanilarak 1. Günde ve 2
uL'si kullanilarak, 2. Günde (14 gün sonra) hazirlanan bir akis yukari recAlfa-l numunesine
uL ve 4 iiL enzim miktarlarina yönelik ayni kapama degerlerini gösterir, enzimin 2 pL'sinin
tamamlanmaya devam etmek üzere reaksiyona yönelik yeterli, yukaridaki açiklama ile
tutarli oldugunu (Tablo 10) ortaya koyar.
Tablo 10: Enzim Miktari Sonuçlari
Analiz Tarihi Enzim hacmi (pL) Kapama Yüzdesi
1. gün 4 97.4
2. gün 2 97.2
Örnek 6: Dahili Standart
Bu HPAEC-PAD yönteminde, her enjeksiyonda amperometrik deteksiyonun yapisal
degiskenligi nedeniyle pik alanini normallestirmek üzere bir dahili standart kullanilmistir.
Ilk olarak, iki dahili standart test edilmistir: galaktosamin ve deoksiriboz. Her iki dahili
standart yeterince kullanilmistir ve bazen galaktozdan yeterli ölçüde ayrismistir ve miktar
tayini ile karismamistir. Galaktosamin yeterli ölçüde islev görmesine ragmen, pik alanlarda
sistem performansini izlemek üzere daha kapsamli kabul kriterleri gerektiren bazi
tutarsizliklar gözlenmistir. Sonuç olarak, deoksiriboz dahili standart olarak seçilmistir.
Ayrica, deoksiriboz amperometrik deteksiyon yöntemlerine yönelik bir sektör standardi
olarak yaygin bir sekilde kullanilir. Deoksiriboz pik alanina yönelik alanlar uzun enjeksiyon
dizileri boyunca daha az degiskenlik göstermistir ve daha siki kabul kriterleri altinda
kullanilabilir.
Gelistirme sirasinda, deoksiriboz alaninda birçok açiklanmayan artis veya azalis örnegi
gözlenmistir. Ancak, bu numunelerde, deoksiriboz alaninda bir artis veya azalisin ardindan
galaktoz pik alaninda karsit degisiklik gözlenmistir (Tablo 11].
Tablo 11: Gözlenen Deoksiriboz Pik Alaninda Degisiklikler
Numune Adi Deoksiriboz Alani [nC x Galaktoz Alani (nC x
Fetuin, Reaksiyon B 3.724 11.858
Fetuin, Reaksiyon C 3.940 25.019
Fetuin, Reaksiyon B 5.482 8.363
Fetuin, Reaksiyon C 5.179 17.452
Reaksiyon A 3.855 0.082
Reaksiyon B 3'885 0548
Reaksiyon C 3991 11560
Reaksiyon A 4589 0089
Reaksiyon B 4'483 &406
Reaksiyon C 4540 10227
Tipik olarak, pik alandaki dalgalanmalar elektrot ile tepkide farkliliklar olarak açiklanabilir.
Bu durumda, her iki pik degerin artmasi veya azalmasi beklenir. Deoksiribozun üç
numuneye eklendigi fakat karistirilmadigi bir deney yapilmistir. Numuneler HPAEC-PAD ile
analiz edilmis, sonra numunenin ve dahili standardin karistirilmasini saglamak üzere
çikarilmis ve vortekslenmistir. Sonra numuneler tekrar enjekte edilmistir. Bu deneylerin
sonuçlari alanlardaki dalgalanmanin numunenin ve dahili standardin yetersiz
karistirilmasindan kaynaklandigini gösterir. Bu dahili standart solüsyon ile numune
arasinda stratifikasyon meydana gelebilecegi ve kullanicilarin bir otomatik numune alma
Cihazi tepsisine yerlestirmeden önce reaksiyonu yeterince karistirmasi gerektigini ortaya
koyar. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar Tablo 12'de özetlenmistir.
Tablo 12: Deoksiriboz Pik Alani Dalgalanmalarina Neden Olan Yetersiz
karistirmanin Onaylanmasi
Deoksiriboz Alani (nC Galaktoz Alani (nC
Numune Preparasyon x dakika) x dakika)
Reaksiyon C Karistirma yok 3.172 22-260
Fetuin
Reaksiyon C Karistirma yok 2.460 17-247
Reaksiyon C sonra
Fetuin Karistirmadan 4933 12440
Reaksiyon C sonra
(3 sonra
Örnek 7: Enzim Satici Karsilastirmasi
B-galaktosidaz ve siyalidaz enzim kalitesinin reaksiyon oranina ve galaktoz miktarina
önemi göz önünde bulundurularak, dört farkli saticinin ß-Galaktosidaz ve oi-siyalidaz
enzimleri karsilastirilmistir. Amaç dogru bir tepki saglayan reaksiyon oraninin yeterliligini
ölçmek ve ana satici enzimlerinin artik ticari olarak bulunmamasi durumunda bir yedek
satici olusturmaktir. Seçilen saticilar Sigma, Glyko-Prozyme, New England BioLabs ve QA
Bio'ydu. QA Bio enzimleri burada açiklanan deneylerin çogunda kullanilmistir. Bir enzim
reaksiyonu bir yanit vermediginde Sigma çikarilmistir. Ayrica Glyko-Prozyme, galaktoz pik
alanlari iki farkli deneyde ß-galaktosidaz ile islenen numuneler ile hem ß-galaktosidaz hem
de a-siyalidaz ile islenen numunelerde ayni oldugunda çikarilmistir (baska bir deyisle, 0(-
siyalidaz aktivitesi tespit edilemeyen düzeydeydi]. New England BioLabs ve QA Bio
enzimlerini karsilastiran kafa kafaya deneyler hazirlanmistir ve ayni günde yapilmistir.
Sonuçlar ayrica QA Bio enzimleri ile parçalanan ayni numuneler ile önceki günlere ait
veriler ile karsilastirilmistir. Iki enzim arasindaki fark yüzdeleri önemsizdi ve birçok
deneme çalismasina yönelik ilgili standart sapma [%RSD] New England BioLabs ß-
Galaktosidaz ve a-siyalidaz enzimlerinin QA Bio ile karsilastirilabilir oldugunu ve QA Bio
enzimlerinin artik ticari olarak bulunmamasi durumunda bir yedek satici olarak
kullanilabildigini ortaya koymustur. Deney sonuçlari Tablo 13'de özetlenmektedir.
Tablo 13: QA Bio veya New England BioLabs Enzimleri kullanilarak
Parçalanan Numunelerin Sonuçlari
Numune Analiz Tarihi Enzim Üreticisi Kapama Yüzdesi
Fetuin 1_ gün QA Bio 49.5
Fetuin 5. gün QA BIO 52.1
Fetuin 5, gün New England BioLabs 52.8
Ortalama 51.5
Std Sapma 1.74-
RAD0637 1. gün QA Bio 97.4
RAD0637 15. gün QA Bio 97.2
RAD0637 15, gün New England BioLabs 97.6
Ortalama 97.4
Std Sapma 0.20
Örnek 8: Numune Türü ve Preparasyon
Akis yukari protein numuneleri hücre kültürü ortamindan 5 mg/mL galaktoz içerebildigi
göz Önünde bulunduruldugunda, ortamdan diger potansiyel olarak etkilesen eksipiyanlarin
yani sira fazla galaktozu çikarmak üzere bir numune preparasyon yöntemi gelistirilmistir.
Tek basina bu temizleme tüm proses safsizliklarini çikarmak üzere yeterli degildi, bu
yüzden kapama yöntemi preparasyonun parçasi olarak ek temizleme yapilmaliydi. Iki hizli
temizleme yöntemi degerlendirilmistir: deiyonize suya karsi diyaliz ve 10 kDa santrifüjlü
spin filtreleme.
Deney bir tamponu degistirilen recAlfa-l numunesi kullanmistir. Bu deneyde, bir numune
deiyonize suya karsi 4 saat boyunca diyaliz edilmistir bununla beraber bir baska numune
bir 10 kDa spin filtresi kullanilarak es zamanli bir sekilde temizlenmistir. Her iki numune
sonra kapalama yöntemi ile analiz edilmistir. Deney, safsizliklarin çikarilmasinda 10 kDa
spin filtrelerinin diyalizden daha etkili oldugu ve önemli ölçüde artan bir dönüs süresinde,
bir defada 30 numuneye kadar preparasyonu olanakli kildigi sonucunu ortaya koymustur.
Reaksiyon C ile parçalanmayi (ß-galaktosidaz ve a-siyalidaz] içeren her iki temizleme
prosedürünün kromatogramlari Sekil 3'te gösterilir. Spin filtrelenen numune deiyonize su
ile tekrar olusturulmustur ve sonuç olarak diyaliz edilen numuneden daha düsük bir
konsantrasyona sahiptir. Temizlemeden sonra az miktarda galaktoz bulunabilmesine
ragmen, tüm alt yapi pik alanlari (baska bir deyisle Reaksiyon A) kontamine pik alani
çikararak sonradan kapama hesaplama yüzdesine yönelik açiklanmistir.
Ayrica hücre kültürü üst fazlarindan bazi eksipiyanin galaktoz pik alanindan hemen sonra
ayristigini ve bazi durumlarda galaktoz pik alaninda bir pik destegi olarak göründügünü
durumlarda, bu safsizligin bulunmasi "asagi açilir" entegrasyonunu gerçeklestirerek ve
safsizlik pik alanini entegre etmeyerek galaktoz pik alanindan çikarilmistir.
Örnek 9: Spesifisite
Spesifisite yöntemin safsizliklar, degradasyon ürünleri, matrisler, vb. gibi bulunmasi
beklenebilen bilesenlerin varliginda analiti degerlendirme özelligidir. Yöntemin
spesifisitesi ticari olarak bulunan nötr ve amino monosakaritlerin bir karisimini
hazirlayarak ve karisimi HPAEC-PAD ile analiz ederek belirlenmistir. Degerlendirilen
sekerler fükoz, galaktosamin, glukosamin ve galaktozdu. Sekerler tutulma sürelerini
dogrulamak üzere ayri ayri analiz edilmistir ve sonra spesifisiteyi belirlemek üzere bir
karisim olarak analiz edilmistir (Sekil 5). Monosakaritlerin ayrimi Dionex Teknik Not 20'de
görülen ile karsilastirilabilir düzeydeydi, burada galaktoz diger üç monosakaritten sonra
ayrisir. Bakiniz Dionex Technical Note 20, Analysis of Carbohydrates by High Performance
Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD),
Dionex Corp. [2000). Ayrica, yüksek düzeyde saf olmayan numunelerde, baska bir deyisle
hücre kültürü üst fazlarinda, alt yapi düzeyleri herhangi bir etkilesen eksipiyan bulunup
bulunmadigini ve onlarin numune preparasyonu yoluyla çikarilip çikarilmadigini
degerlendirmek üzere analiz edilmistir.
Örnek 10: Lineerite
HPAEC PAD sialilasyonu çalismasinin lineeritesi belirli bir aralik içindeki analit
konsantrasyonu veya içerigi ile dogru orantili test sonuçlari elde etme özelligiydi. Ayrica,
lineerite çalismasindan elde edilen bir aralik prosedür ile elde edilebilen lineerite, dogruluk
ve kesinlik derecesini dogrulamak üzere kullanilmistir. Yönteme yönelik lineerite 8 pmol ila
1.5 nmol arasinda bir optimal aralikta bir galaktoz standart kalibrasyon egrisini
hazirlayarak degerlendirilmistir (Sekil 6). Determinasyon katsayisi (regresyon katsayisi) 8
pmol ila 1.5 nmol araliginda 0.99 veya daha fazlaydi. Ayrica regresyon kalintilari analiz
edilmistir ve bu aralikta egilimli olmayacak sekilde gösterilmistir. Kalibrasyon egrisi 2
nmol'a kadar uzatilabilir ve kalibrasyon egrisinin alt ucunda dogruluk kaybi ile kabul
edilebilir lineeriteyi korur. Optima] kalibrasyon egrisi araligi farkli tarihlerde, farkli
sistemleri, sütunlar] ve Dionex lCS-3000 tek kullanimlik altin elektrotlari kullanarak
incelenmistir. Tablo 14 bu sonuçlari özetler.
Tablo 14: Alti Kalibrasyon Egrisine yönelik R-kareli, Egim ve y-keseninin
Analiz Tarihi Araç R2 Egim y-kesen
Örnek 11: Tayin Siniri
HPAEC PAD sialilasyon çalismasinin tayin siniri [LOQ] uygun kesinlik ve dogruluk ile
miktari belirlenebilen bir numunedeki analitin en düsük miktarini gösterir. Bir miktar
tayini yönteminin LOQ'yu hesaplamanin birkaç yolu bulunur. Bir yöntem y-keseninin
standart sapmasinin ortalama egime bölünmesine dayanir. Bir diger yöntem
kromatogramin görsel analizine dayanir. Ilk olarak çalismanin LOQ'su tipik bir
kromatogramin sinyal-gürültü oranina göre hesaplanmistir. Spesifik olarak,
kromatogramin 1 dakikalik yatay bölgesindeki gürültü düzeyi pik yükseklik bakimindan
LOQ'yi vermek üzere ölçülmüs ve 10 ile çarpilmistir. Sonra pik yükseklik kalibrasyon
standartlarinin pik yüksekligine bagli olarak pmol miktarlarina dönüstürülmüstür. Gürültü
düzeyi sonuçlari benzer tepki veren bir kalibrasyon standardi ile karsilastirilmistir (bakiniz
Tablo 15). Gürültü düzeyi iki farkli lCS-3000 sisteminde alti farkli günde elde edilmistir. Bu
sonuçlar farkli günlerdeki gürültü düzeylerinin benzer sonuçlar [±0.02) verdigini ve
yaklasik olarak 8 pmol standart düzeyde oldugunu ortaya koymustur [0.12 nC x dakika
farki, bu yaklasik olarak 70 nC x dakika'daki 1500 pmol standart yüksekligi ile
karsilastirildiginda önemsizdi).
Tablo 15: 8 pmol Galaktoza yönelik Alti Analizin Gürültü Düzeyinin
Karsilastirmasi
Analiz Ara Gürültü Düzeyi Farki x Standart Pik Yükseklik 8
Tarihi ç 10 (an dakika] pmol galaktoz
Ortalama 0.24 0.36
Kromatogram gürültü düzeyi araçtan araca degisebildiginden, LOQ da farkli bir sekilde
hesaplanmistir. Tablo 14'teki degerlere ve spesifik olarak ortalama egim [0.0283] ile
bölünen ve 10 ile çarpilan y-keseninin (0.0577) standart sapmasina göre, LOQ 20 pmol
olarak hesaplanmistir. Tayin sinirini hesaplamaya yönelik iki yöntem LOQ'nun yaklasik 8
ila 20 pmol oldugunu ortaya koymustur.
Örnek 12: Yöntem Dogrulugu
Yöntemin dogrulugu bilinen bir standart ile deneysel olarak ölçülen sonuçlar arasindaki bir
anlasma ile belirlenmistir. Bir referans olarak hizmet veren hiçbir “altin standart”
olmadigindan, yöntemin dogrulugu ticari olarak bulunan siyaliklesmis ve asialo fetuin
standartlari kullanilarak belirlenmistir. Siyaliklesmis bovin fetuin standardi ve asialo fetuin
standardi 280 nm*de [baska bir deyisle, A280) UV absorbansi ile belirlendigi gibi esit
konsantrasyonlarda hazirlanmistir. Standartlar ayri ayri analiz edilmistir, sonra 121 oranda
hazirlanmis ve analiz edilmistir. Siyaliklesmis fetuin standardi %99.4'lük bir kapama
yüzdesine sahipti, bununla beraber Reaksiyon B'deki galaktoz miktarinin Reaksiyon C'deki
galaktoz miktarindan biraz daha yüksek olmasi nedeniyle %1.2'1ik bir kapama yüzdesi
sonucuna sahipti. Bu sonuçlara dayanarak, fetuin karisim kontrolünün beklenen kapama
yüzdesi yaklasik %50'ydi. Fetuin karisimina yönelik gerçek sonuç çok sayida çalismanin
ortalamasina göre %493 olarak belirlenmistir. Deneyden elde edilen sonuçlar Tablo 16'de
özetlenmistir. Azgoölçümünden kaynaklanan degiskenligin veya dogrulugun tam sapmasi
yapilamamasina ragmen, bu sonuçlar bu yöntemin birkaç yüzde noktasi dahilinde dogru
oldugunu ortaya koyar. Ayrica, bu fetuin kontrolü farkli günlerde ara kesinlik çalismalarinin
parçasi olarak analiz edilmistir (bakiniz Tablo 18 ve Tablo 19, asagida] ve %3'lük bir bagil
standart sapmaya [% RSD] sahip olacak sekilde gösterilmistir. Çalisma her yapilisinda bu
tür bir kontrolün kullanilmasi önerilir.
Tablo 16: HPAEC-PAD Yönteminin Dogrulugunu Belirlemeye yönelik Fetuin
Standartlarinin Sonuçlari
Fetuin Reaksiyon Galaktoz Alani (nC Kapama Geri Kazanim
x dakika] Yüzdesi Yüzdesi
Asialo A 0
Asialo C 27.301
Siyaliklesmis A 0
Siyaliklesmis C 28.808
Reaksiyon A 0
Reaksiyon C 27.657
Örnek 13: Tekrarlanabilirlik
Çalismanin tekrarlanabilirligi açiklanan kosullar altinda kisa bir zaman araligi boyunca
yöntemde elde edilen sonuçlarin tutarliligi bakimindan degerlendirilmistir. Yöntemin
tekrarlanabilirligi alti çoklu enjeksiyon boyunca bir recAlfa-l hücre kültürü üst faz
numunesi kullanilarak belirlenmistir. Bu numune önceden analiz edilmis ve herhangi bir
etkilesim galaktozu içermeyecek sekilde gösterilmemis oldugundan alt yapi numunesi
(baska bir deyisle, Reaksiyon A) analiz edilmemistir. Ilgili standart sapma alti çoklu
enjeksiyon boyunca galaktosamin alanina, galaktoz alanina ve kapama yüzdesine yönelik
belirlenmistir. Sonuçlar Tablo 17'de gösterilmistir ve hem galaktosamin alani ile
düzeltilmis hem de düzeltme olmadan gösterilir. Veri tekrarlanabilirlik yaklasik %020
olacak sekilde gösterilir.
Tablo 17: Yöntemin Tekrarlanabilirligi
Numune Alan Galaktoz Düzeltilen Ka ama ?iliiîiîtigiif
Enjeksiyon Reaksiyon Galaktosamin Alani (nC Alani (nC x Yügdesi Ka ama
No. (nc x dakika) x dakika] dakika) ..p .
Yuzdesi
96.8 96.5
96.8 96.6
96.6 96.5
96.5 96.2
96.4 96.5
96.3 96.5
Ortalama Sadece 96.6 96.5
Std Sapma Sadece 0.19 0.11
Örnek 14: Ara Kesinlik
Tekrarlanabilirlik çalismanin yani sira, ara kesinlik analizi birkaç ek faktörü içermistir:
farkli günler, farkli araç kurulumu ve farkli numune preparasyonu içermistir. Yöntemin ara
kesinligi üç farkli günde ve üç farkli konsantrasyonda kapama analizine yönelik akis asagi
proses gelistirme recAlfa-l numunesinin (RAD-5904] hazirlanmasi ile arastirilmistir.
Analizlere yönelik olarak, farkli Dionex [CS-3000 kromatografi sistemleri, tek kullanimlik
elektrotlar, amino yakalama sütunlari, koruma sütunlari ve analitik sütunlar kullanilmistir.
Sonuçlar numunenin ilgili standart sapmasini (RSD) %025 olarak gösterir. Ayrica, üç analiz
günü boyunca hazirlanan fetuin kontrolünün kapama yüzdeleri de karsilastirilmistir. Fetuin
kontrolünün RSD'si %2.99'du. recAlfa-l numunelerinin ve fetuin kontrolünün ara kesinligi
sirayla Tablo 18 ve Tablo 19'da özetlenir. Alanlarin ortalamasi çift çalismalardan
alinmistir ve düzeltilmemistir.
Tablo 18: recAlfa-l'e yönelik Ara Kesinlik Sonuçlari
Numune Hacmi [uL] Reaksiyon Alan (nC x dakika) Kapama Yüzdesi
1. gün
B 0.525
C 12.073
40 B 0.7035
40 C 15.756
80 B 0.4335
80 C 9.48
2. gün
B 0.491
C 12.0425
40 B 0.6645
40 C 15.396
80 B 0.3745
80 C 9.7415
3. gün
B 0.554
C 13.161
40 B 0.708
40 C 17.434
80 B 0.417
80 C 9.298
Ortalama 95.7
Std Sapma 0.24
3. gün
Tablo 19: Fetuin Kontrolüne yönelik Ara Kesinlik Sonuçlari
Fetuin Reaksiyonu Alan (nC x dakika] Kapama Yüzdesi
1. gün
B 14.1 19
C 29.281
B 13.679
C 27.002
B 18.683
C 36.676
Ortalama 50.1
Std. Sapma 1.50
Örnek 15: Saglamlik
Çalismanin saglamligi yöntem parametrelerinde veya numune islemesindeki küçük fakat
kasitli varyasyonlardan etkilenmeden kalma kapasitesinin bir önlemidir. Otomatik numune
alma cihazi stabilitesi, enzim reaksiyon süresi, enzim hacmi ve matris etkilesimi gibi birçok
farkli faktör birkaç deney dizisinde kasitli olarak degistirilmistir.
Otomatik Numune Alma Cihazindaki Numune Stabilitesi
Saglamlik, otomatik numune alma cihazinda 10 °C'de enjeksiyon bekleyen numunenin
sonuçlarin kalitesi ile uzlasip uzlasmayacagi belirlemek üzere HPLC otomatik numune alma
cihazi kosullarinda (baska bir deyisle, 10 °C) 48 saat boyunca numune stabilitesinin
arastirilmasi ile belirlenmistir. Otomatik numune alma cihazinda tutulan tek basina
hazirlanmis bir numune çesitli araliklar ile enjekte edilmistir ve galaktoz miktarlarinin pik
tepkisi her süre noktasina yönelik belirlenmistir. Sonuçlar Tablo 20'de özetlenir ve ara
kesinlikten belirlenen ilgili standart sapma ile tutarli, %0.23'lük bir ilgili standart sapma
gösterir. Sonuçlar hem galaktosamin pik alani ile düzeltilmis hem de düzeltme olmadan
gösterilir. Bu veriler, numunelerin kapama sonuçlarini etkilemeden enjeksiyondan önce en
fazla 48 saat boyunca numunelerin numune alma cihazinda tutulabilecegini gösterir.
Tablo 20: Otomatik Numune Alma Cihazindaki Numune Stabilitesine yönelik Sonuçlar
Galaktosamin Galaktoz Düzeltilen Ka ama Düzeltilen
Reaksiyon Alani (an Alani (nC Alani (nC x Yüzdesi Kapama
dakika) x dakika) dakika] Yüzdesi
96.4 96.4
0.59 1.27 0.14
0.10 0.23
4.01 3.34 5.28
Enzim Reaksiyon Süresi
Ayrica saglamlik farkli enzim partilerine yönelik reaksiyonun farkli oranlarinda
degiskenlige yönelik bir açiklama bulmak üzere enzimatik reaksiyon süresini 1 ila 4 saat
arasinda degistirerek incelenmistir. Bir numune 1, 2.5 ve 4 saatlik süre noktalarinda inkübe
edilmis ve her biri analiz edilmistir. Sonuçlar Tablo 21'de özetlenir ve kapama yüzdesinin
üç reaksiyon süresi boyunca benzer olmasina ragmen, bir saat parçalanan numunenin daha
uzun reaksiyonlarda çok az daha düsük oldugunu gösterir. Bu verilere dayanarak, 2.5
saatlik parçalamanin reaksiyonun sonuna kadar çalismasina yönelik yeterli oldugu
belirlenmistir. Yöntemin iki enzimin reaksiyon oranina bagli oldugu göz önünde
bulunduruldugunda, 1 saatlik reaksiyon süresindeki daha düsük kapama yüzdesi siyalidaz
enziminin oran-sinirlama adimi oldugunu ortaya koyar.
Tablo 21: Enzim Reaksiyon Süresine yönelik Sonuçlar
Hacmi (uL)
03003003
Reaksiyon
Reaksiyon Galaktoz Alani Kapama
Süresi (3) (nC x dakika) Yüzdesi
1 0.740
1 20.617
2.5 0.638
2.5 18.817
4 0.647 96.8
Tablo 21: Enzim Reaksiyon Süresine yönelik Sonuçlar
Numune Reaksi on Reaksiyon Galaktoz Alani Kapama
Hacmi (uL) y Süresi (5) [nC x dakika] Yüzdesi
40 C 4 20.323
Matris Etkilesimi
Eksipiyan ve matris etkilesimi spesifite bölümünde açiklanmasina ragmen, akis yukari
matrisin sonuçlari etkilememesini saglamak amaciyla bir matris tutturma çalismasi
yapilmistir. Farkli matrisleri içeren bir plazma derive edilen Alfa-1 [PD Alfa-1) numunesi
hücre kültürü ortamina eklenmistir.ve kapama yüzdesi burada açiklanan yöntem
kullanilarak ölçülmüstür. Deneye yönelik seçilen ortam akis yukari gelistirme deneylerinde
kullanilan CDM4PERMABTM ortami [Hyclone), Pluronic® F-68 (BASF), Antifoam-C (Dow
C0rning®) ve çesitli hücre kültürü ortami gibi en yüksek katki maddeleri düzeyini
içermistir. A1fa-1'den derive edilen plazma 0.5 mg/mL konsantrasyondaki ortama
eklenmistir. Sonra numune 10 kDa spin filtrelemenin izledigi 20 mM fosfat, pH 7'ye
degistiren tipik tampon temizleme prosedürü kullanilarak hazirlanmistir. Kültür ortamina
eklenen PD Alfa-1 kapama yüzdesi hücre kültürü ortamina eklenen PD Alfa-1 kapama
sonuçlari ile karsilastirilmistir [bakiniz Tablo 22). Sonuçlar ortama eklenen PD Alfa-1'e
yönelik %99.4'lük bir kapama yüzdesi ve ortama eklenmeyen PD Alfa-l'e yönelik %99.2'1ik
bir kapama yüzdesi gösterir, bu deger bu yöntem ile iliskili ara kesinlik içinde iyiydi. Bu
sonuçlar numunelere uygun temizleme adimlari yapildiktan sonra hücre kültürü ortaminin
çalisma ile etkilesime girmedigini gösterir.
Tablo 22: Matris Etkilesimine yönelik Sonuçlar
Numune Reaksiyon Düzeltilen Alan Kapama Yüzdesi
PD Alfa-1 (kültür ortaminda) A B 0.012 99.4
PD Alfa-1 (kültür ortaminda] C 1.064
PD Alfa-1, Gün 1 A 0.000
PD Alfa-1, Gün 1 B 0.020 99.0
PD Alfa-1, Gün 1 C 2.132
PD Alfa-1, Gün 2 A 0.000
PD Alfa-1, Gün 2 B 0.017 99.3
PD Alfa-1, Gün 2 C 2.330
Kisa Açiklama
Gelistirme ve ön yeterlik deneylerinden elde edilen sonuçlar Tablo 23'te
özetlenir. Yukarida çalismalara göre, bu yöntem protein numunelerindeki kapama oraninin
belirlenmesine yönelik iyilestirilmistir. Bu çalismaya yönelik belirlenen lineerite, LOQ,
kesinlik, dogruluk ve saglamlik parametreleri bu yöntemin tutarli, dogru ve güvenilir
oldugunu gösterir.
Tablo 23: Yöntem Parametrelerinin Özeti
Parametreler Deney Sonuçlar
Pik alani ile galaktozun alt
Aralik Protein konsantrasyonunun 515 mg /mL
çalisma araligi
Tekrarlanabilirlik Ayni gunde/ayn' araçta am %020 RSD
numune kopyasi
Üç güne, iki sütuna, üç .
. . reCAlpha-l numunelerine
Ara Kesinlik elektro.“ V? lk' [CS 3000 yönelik %025 RSD; fetuin
sistemine gore hesaplanan kontrolüne yönelik %2 99
Önceden belirlenen degere
Dogruluk ortalama fetuin degerinin %97-103 geri kazanim
yakinligi
o 10 °C'de 48 saat boyunca .
Saglamlik numune stabilitesi Etkl yok
Enzim reaksiyon süresi 2 ila 4 Etki yok
Glikoprotein
Islem yok - Siyalidaz+
Galaktosidaz Galaktosidaz
HPAEC-PAD HPAEC-PAD HPAEC-PAD
Ortam içinde Gal p Gal y Toplam Gal
ZOD'IEWE) I( '
Galaktoz
zonicicg ;Z igiîloqilsxoâüjl.
Deoksiriboz
zoqugsaoaa l G
Claims (4)
1. Bir proteinin sialilasyon içerigini belirlemeye yönelik asagidaki adimlari ihtiva eden bir yöntem: (a) analize yönelik bir proteinin hazirlanmasi; (b) hazirlanan proteini asagidaki islemle enzimatik olarak isleme: hazirlanan proteinin asagidakileri ihtiva eden bir dizi protein numunesine bölünmesi (i) bir ortam numunesi olarak en az bir protein numunesi (Reaksiyon A): (Reaksiyon B]; numunesine eklenmesi (Reaksiyon C): ve bir dizi protein numunesinin inkübe edilmesi; ve bir dizi protein numunesine bir deoksiriboz standardinin eklenmesi; ve (c) HPAEC-PAD kromatografisi kullanarak bir dizi protein numunesinin analiz edilmesi; galaktoz içeriginin belirlenmesi; ve hesaplanmasi: Reaksiyon C (Toplam Gal) - Reaksiyon B (Kaplanmayan Gal) Kaplama Yüzdesi (iv): x 100 Reaksiyon C (Toplam 631) - Reaksiyon A (onamdaki Gal) burada reaksiyon A [ortamdaki Ga1], reaksiyon B [Kapanmayan Gal) ve reaksiyon C reaksiyon A, B ve C'nin düzeltilen galaktoz alanlaridir.
2. lstem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi ayrica asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: (f) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak bir dizi pozitif ve negatif kontrolün analiz edilmesi; (g) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak bir dizi standardin analiz edilmesi; ve (li) bir dizi protein numunesinin bir dizi standart ve kontrol ile karsilastirilmasi.
3. Asagidakileri ihtiva eden, bir proteinin sialilasyon içerigini belirlemeye yönelik HPAEC-PAD kromatografisinin kullanimi: hazirlanan proteinin asagidakileri ihtiva eden bir dizi protein numunesine bölünmesi (i) bir ortam numunesi olarak en az bir protein numunesi (Reaksiyon A]; (Reaksiyon B); (iii) en azindan ß-galaktosidazin ve oi-siyalidazin en az bir diger protein numunesine eklenmesi (Reaksiyon (3); ve bir dizi protein numunesinin inkübe edilmesi; ve bir dizi protein numunesine bir deoksiriboz standardinin eklenmesi; ve (c) HPAEC-PAD kromatografisi kullanarak bir dizi protein numunesinin analiz edilmesi; galaktoz içeriginin belirlenmesi; ve hesaplanmasi: Reaksiyon C (Toplam Gal) . Reaksiyon B (Kaplanmayan Gal) Kaplama Yüzdesi (M: x 100 Reaksiyon C (Toplam Göl) - Reaksiyon A (ortamdaki Gal) burada reaksiyon A [ortamdaki Gal], reaksiyon B [Kapanmayan Gal) ve reaksiyon C reaksiyon A, B ve C'nin düzeltilen galaktoz alanlaridir. 5
4. istem 3'e göre sunulan kullanim olup, özelligi ayrica asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: (f) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak bir dizi pozitif ve negatif kontrolün analiz edilmesi; 10 (g) HPAEC-PAD kromatografisini kullanarak bir dizi standardin analiz edilmesi; ve (li) bir dizi protein numunesinin bir dizi standart ve kontrol ile karsilastirilmasi.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161507643P | 2011-07-14 | 2011-07-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201809082T4 true TR201809082T4 (tr) | 2018-07-23 |
Family
ID=47557705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/09082T TR201809082T4 (tr) | 2011-07-14 | 2012-07-05 | Protei̇n si̇ali̇lasyonun hizli ve doğru anali̇zi̇ |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9260743B2 (tr) |
| EP (1) | EP2733218B1 (tr) |
| JP (1) | JP2014525742A (tr) |
| KR (1) | KR101864468B1 (tr) |
| CN (1) | CN103635590A (tr) |
| AR (1) | AR087175A1 (tr) |
| AU (1) | AU2012285696B2 (tr) |
| BR (1) | BR112013033883B1 (tr) |
| CA (1) | CA2837981C (tr) |
| CL (1) | CL2013003713A1 (tr) |
| ES (1) | ES2675511T3 (tr) |
| HU (1) | HUE038020T2 (tr) |
| IL (1) | IL229828A (tr) |
| MX (1) | MX344407B (tr) |
| MY (1) | MY163078A (tr) |
| PL (1) | PL2733218T3 (tr) |
| PT (1) | PT2733218T (tr) |
| RU (1) | RU2605900C2 (tr) |
| SG (1) | SG10201500002XA (tr) |
| TR (1) | TR201809082T4 (tr) |
| UY (1) | UY34195A (tr) |
| WO (1) | WO2013011178A1 (tr) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HUE038020T2 (hu) * | 2011-07-14 | 2018-09-28 | Grifols Sa | Fehérje-szializáció gyors és pontos analízise |
| CN106324234B (zh) * | 2016-08-08 | 2018-05-22 | 上海睿康生物科技有限公司 | 修饰的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用 |
| CN107045019B (zh) * | 2016-09-30 | 2019-08-16 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法 |
| CN110346500B (zh) * | 2018-04-04 | 2021-11-30 | 青岛大学附属医院 | 一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法 |
| CN109329713B (zh) * | 2018-12-01 | 2022-04-22 | 西华大学 | 一种降解牦牛肉中n-羟乙酰神经唾液酸的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ536361A (en) * | 2002-04-25 | 2008-05-30 | Shire Human Genetic Therapies | Treatment of alpha-galactosidase a deficiency |
| EP1400533A1 (en) * | 2002-09-11 | 2004-03-24 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
| US8039208B2 (en) * | 2005-04-26 | 2011-10-18 | National Institute For Bioprocessing Research And Training Limited (Nibrt) | Automated strategy for identifying physiological glycosylation markers(s) |
| ATE447715T1 (de) * | 2005-04-26 | 2009-11-15 | Nat Inst For Bioproc Res And T | Automatische glykofingerabdruck-strategie |
| WO2009126564A1 (en) * | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Bayer Healthcare Llc | Methods of recombinant production of glycoproteins |
| US20110086362A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Massachusetts Institute Of Technology | High-Throughput Method for Quantifying Sialylation of Glycoproteins |
| HUE038020T2 (hu) * | 2011-07-14 | 2018-09-28 | Grifols Sa | Fehérje-szializáció gyors és pontos analízise |
-
2012
- 2012-07-05 HU HUE12815322A patent/HUE038020T2/hu unknown
- 2012-07-05 PL PL12815322T patent/PL2733218T3/pl unknown
- 2012-07-05 AU AU2012285696A patent/AU2012285696B2/en active Active
- 2012-07-05 MY MYPI2013702595A patent/MY163078A/en unknown
- 2012-07-05 JP JP2014519588A patent/JP2014525742A/ja active Pending
- 2012-07-05 TR TR2018/09082T patent/TR201809082T4/tr unknown
- 2012-07-05 KR KR1020147003822A patent/KR101864468B1/ko active IP Right Grant
- 2012-07-05 EP EP12815322.8A patent/EP2733218B1/en active Active
- 2012-07-05 US US14/232,783 patent/US9260743B2/en active Active
- 2012-07-05 PT PT128153228T patent/PT2733218T/pt unknown
- 2012-07-05 RU RU2013154278/10A patent/RU2605900C2/ru active
- 2012-07-05 CA CA2837981A patent/CA2837981C/en active Active
- 2012-07-05 WO PCT/ES2012/070501 patent/WO2013011178A1/es active Application Filing
- 2012-07-05 BR BR112013033883-0A patent/BR112013033883B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-07-05 SG SG10201500002XA patent/SG10201500002XA/en unknown
- 2012-07-05 CN CN201280033128.7A patent/CN103635590A/zh active Pending
- 2012-07-05 ES ES12815322.8T patent/ES2675511T3/es active Active
- 2012-07-05 MX MX2014000378A patent/MX344407B/es active IP Right Grant
- 2012-07-12 UY UY0001034195A patent/UY34195A/es active IP Right Grant
- 2012-07-13 AR ARP120102538A patent/AR087175A1/es active IP Right Grant
-
2013
- 2013-12-05 IL IL229828A patent/IL229828A/en active IP Right Grant
- 2013-12-24 CL CL2013003713A patent/CL2013003713A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2733218A4 (en) | 2015-03-25 |
| PL2733218T3 (pl) | 2018-08-31 |
| US20140162299A1 (en) | 2014-06-12 |
| JP2014525742A (ja) | 2014-10-02 |
| CA2837981C (en) | 2020-08-18 |
| EP2733218A1 (en) | 2014-05-21 |
| NZ618889A (en) | 2015-08-28 |
| UY34195A (es) | 2013-02-28 |
| KR20140060289A (ko) | 2014-05-19 |
| RU2013154278A (ru) | 2015-06-20 |
| MX344407B (es) | 2016-12-14 |
| AR087175A1 (es) | 2014-02-26 |
| MY163078A (en) | 2017-08-15 |
| HUE038020T2 (hu) | 2018-09-28 |
| CA2837981A1 (en) | 2013-01-24 |
| IL229828A (en) | 2016-09-29 |
| SG10201500002XA (en) | 2015-02-27 |
| RU2605900C2 (ru) | 2016-12-27 |
| BR112013033883A2 (pt) | 2017-02-14 |
| BR112013033883B1 (pt) | 2020-11-03 |
| PT2733218T (pt) | 2018-07-04 |
| MX2014000378A (es) | 2014-03-31 |
| ES2675511T3 (es) | 2018-07-11 |
| AU2012285696A1 (en) | 2013-05-09 |
| KR101864468B1 (ko) | 2018-06-04 |
| AU2012285696B2 (en) | 2015-12-10 |
| CN103635590A (zh) | 2014-03-12 |
| CL2013003713A1 (es) | 2014-08-08 |
| EP2733218B1 (en) | 2018-05-30 |
| WO2013011178A1 (es) | 2013-01-24 |
| US9260743B2 (en) | 2016-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5552421B2 (ja) | エキソグリコシダーゼを用いるｎ−グリカンの特性決定法 | |
| TR201809082T4 (tr) | Protei̇n si̇ali̇lasyonun hizli ve doğru anali̇zi̇ | |
| JP2012515922A (ja) | ＣＨＯ細胞由来の糖タンパク質産物におけるガラクトース−α−１，３−ガラクトース含有Ｎ−グリカン | |
| EP2930241A1 (en) | Novel recombinant factor c and method for producing same, and method for measuring endotoxin | |
| EP3341735B1 (en) | Means and methods for monitoring inflammation | |
| WO2001094941A2 (en) | Diagnostic methods for pompe disease and other glycogen storage diseases | |
| JP3631495B2 (ja) | 糖タンパク質のグリコシル化の特性表示方法および糖タンパク質の生物学的利用能のインビトロ測定方法 | |
| US20100041071A1 (en) | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid | |
| AU2013347260B2 (en) | Purification of recombinant human galactocerebroside beta-galactosidase (rhGALC) | |
| US20040048387A1 (en) | Method of detecting saccharified albumin | |
| EP2839290B1 (de) | Verfahren zur präsymptomatischen diagnostik von zöliakie und glutensensitivität | |
| NZ618889B2 (en) | Rapid and accurate analysis of protein sialylation | |
| Ghosh et al. | Acid hydrolysis conditions for quantification of meningococcal X polysaccharide in a pentavalent vaccine using HPAEC-PAD/ESI-MS | |
| Zuniga-Banuelos et al. | Immunoglobulin A Carries Sulfated N-glycans Primarily at the Tailpiece Site—An Oxonium-Ion-Guided Approach for Site-Specific N-glycan Identification | |
| US20180112202A1 (en) | PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN GALACTOCEREBROSIDE B-GALACTOSIDASE (rhGALC) | |
| WO2019045649A1 (en) | METHODS FOR ENRICHING MESENCHYMAL STEM CELLS | |
| Krabbi | Biochemical Diagnosis of Classical Galactosemia and Mucopolysaccharidoses in Estonia | |
| Hurum et al. | Rapid Screening of Sialic Acids in Glycoproteins by HPAE-PAD | |
| WO2015055841A2 (en) | Method | |
| MXPA98000690A (en) | Procedure for the characterization of glycoprotein glicosilation, as well as for the in vitro determination of the biodisponibility of glicoprotei |