BR112013033883B1 - método para determinar o teor de sialilação de uma proteína, e, uso de cromatografia hpaec-pad - Google Patents
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MÉTODO PARA DETERMINAR O TEOR DE SIALILAÇÃO DE UMA PROTEÍNA, USO DE CROMATOGRAFIA HPAEC-PAD, E, KIT Métodos e kits para a análise da sialilação de glucoproteínas . As amostras de glucoproteína se incubam por separado em três condições: com beta-galactosidase, com beta-galactosidase +alfa-sialidase, e sem enzima. Após o tratamento enzimático, se determinam quantitativamente mediante cromatografia de intercâmbio aniônico de alta resolução com detecção amperométrica pulsada (HP AEC PAD) a galactose total na amostra, a galactose no sialilada e a galactose exógena do meio. A determinação de estes valores permite deduzir a porcentagem de sialilação da glucoproteína.
Description
[0001] No presente documento descrevem-se métodos analíticos para analisar a sialilação de proteínas.
[0002] Muitas proteínas requerem glucosilação para sua função biológica. Frequentemente, os carboidratos terminais, “de recobrimento” (“capping”) de cadeias glucosílicas são resíduos de ácido siálico. Os ácidos siálicos compreendem uma família de ácidos neuramínicos enlaçados a N e a 0. Os ácidos siálicos enlaçados a N são formados enlaçando restos de acetila ou glucosila ao resíduo amino do ácido neuramínico, formando ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac) e ácido N-glucolilneuramínico (Neu5Gc), respectivamente. Se o grupo amino do neuramínico é substituído por um resto hidroxila, isto produz ácido 3-desoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulosônico (KDN). Os ácidos siálicos enlaçados a O são formados mediante as substituições de um ou mais dos grupos hidroxila de Neu5Ac, Neu5Gc ou KDN por grupos metila, acetila, lactoíla, sulfato ou fosfato. Por conseguinte, existe uma população grande e diversa de ácidos siálicos.
[0003] Adicionalmente, existe um interesse considerável em analisar a sialilação de proteínas, em geral, devido às numerosas funções biológicas atribuídas a estas modificações. A sialilação pode ser importante para a farmacocinética e a eficácia da bioterapêutica de proteínas. Consequentemente, desenvolveram-se vários métodos analíticos para avaliar o teor de ácido siálico de glucoproteínas. Por exemplo, pode-se utilizar ensaios à base de anticorpos para identificar restos de carboidratos particulares. Os resíduos de ácido siálico terminais podem ser separados enzimaticamente da glucoproteína de interesse e analisar se mediante HPLC. Todavia, cada um destes métodos apresenta defeitos e habitualmente requer amostras puras ou altas concentrações. Os métodos convencionais utilizados pela indústria farmacêutica sofrem de pouca precisão, alta variabilidade dos dados e não podem ser utilizados com meios de cultivo complexos devido à interferência da matriz. O método descrito no presente documento supera ditos defeitos e proporciona uma quantificação precisa e reprodutível da sialilação de proteínas.
[0004] Coletivamente, o método descrito no presente documento compreende duas etapas: (1) utiliza-se uma reação enzimática para hidrolisar os resíduos de galactose e ácido siálico das glucoproteínas; e (2) utiliza-se um método de cromatografia de intercâmbio iônico para separar e quantificar os resíduos de galactose. A parte enzimática do método implica a liberação dos restos de galactose terminais expostos (não recobertos) mediante a exo- glucosidase específica, β-(l-4)-galactosidase (β-galactosidase), enquanto que os resíduos de ácido siálico terminais são liberados por α (2-3, 6, 8, 9) - sialidase (oc-sialidase). Antes da digestão, divide-se uma amostra entre, pelo menos, três tubos. O primeiro tubo, Reação A, é uma amostra de fundo e compreende somente os tampões de reação enzimática. O segundo tubo, Reação B, faz-se reagir com β-galactosidase que cliva todos os resíduos de galactose que não estão recobertos por ácidos siálicos. O terceiro tubo, Reação C, é co-digerido tanto com neuraminidase quanto com β- galactosidase. A enzima neuraminidase elimina os ácidos siálicos de recobrimento e permite que a β-galactosidase clive todos os resíduos galactose expostos. Em seguida utiliza-se cromatografia de intercâmbio aniônico de alta resolução com detecção amperométrica pulsada (HPAEC PAD) para determinar a quantidade de galactose presente nas três amostras. A proporção de galactose no recobrimento (ou seja, Reação B) com respeito a galactose total (ou seja, Reação C) é utilizada para calcular a porcentagem de recobrimento de resíduos de galactose, ao tempo que se explica também qualquer galactose livre presente nos meios (Reação A)
[0005] No presente documento descrevem-se métodos para analisar a sialilação de uma proteína.
[0006] Também se descreve um método para determinar o teor de sialilação de uma proteína que compreende: (a) preparar uma proteína para a análise; (b) tratar enzimaticamente a proteína preparada, que compreende: dividir a proteína preparada em uma pluralidade de amostras de proteína que compreendem (i) pelo menos uma amostra de proteína como amostra dos meios (Reação A); (ii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase a, pelo menos, uma amostra de proteína (Reação B) ; (iii) adicionar, pelo menos, β- galactosidase e cc-sialidase a, pelo menos, uma amostra de proteína diferente (Reação C) ; e incubar a pluralidade de amostras de proteína; e (c) analisar a pluralidade de amostras de proteína utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (d) determinar um teor de carboidratos para a pluralidade de amostras de proteína; e (e) calcular uma porcentagem de sialilação para a proteína.
[0007] Também se descreve um método que compreende adicionalmente (f) analisar uma pluralidade de controles positivos e negativos utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (g) analisar uma pluralidade de padrões utilizando cromatografia HPAEC-PAD; e (h) comparar a pluralidade de amostras de proteína com a pluralidade de padrões e controles.
[0008] Também se descreve a utilização de cromatografia HPAEC- PAD para determinar o teor de sialilação de uma proteína, que compreende: (a) preparar uma proteína para a análise; (b) tratar enzimaticamente a proteína preparada, que compreende: dividir a proteína preparada em uma pluralidade de amostras de proteína que compreendem (i) pelo menos uma amostra de proteína como amostra dos meios (Reação A); (ii) adicionar, pelo menos, β- galactosidase a, pelo menos, uma amostra de proteína (Reação B) ; (iii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase e ot-sialidase a, pelo menos, uma amostra de proteína diferente (Reação C) ; e incubar a pluralidade de amostras de proteína; e (c) analisar a pluralidade de amostras de proteína utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (d) determinar um teor de carboidratos para a pluralidade de amostras de proteína; e (e) calcular uma porcentagem de sialilação para a proteína.
[0009] Também se descreve a utilização que compreende adicionalmente: (f) analisar uma pluralidade de controles positivos e negativos utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (g) analisar uma pluralidade de padrões utilizando cromatografia HPAEC-PAD; e (h) comparar a pluralidade de amostras de proteína com a pluralidade de padrões e controles.
[00010] Também se descreve um kit para determinar o teor de sialilação de qualquer proteína que compreende: pelo menos um recipiente que compreende uma pluralidade de recipientes que compreendem quantidades medidas previamente de uma galactosidase e uma sialidase; opcionalmente, recipientes que contêm, pelo menos uma composição tampão, uma amostra de controle positivo, uma amostra de controle negativo e padrões de carboidratos, e instruções que descrevem um método para determinar o teor de sialilação de uma proteína, que compreende descrições de: (a) preparar uma proteína para a análise; (b) tratar enzimaticamente a proteína preparada, que compreende: dividir a proteína preparada em uma pluralidade de amostras de proteína que compreendem (i) pelo menos uma amostra de proteína como amostra dos meios (Reação A); (ii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase a, pelo menos, uma amostra de proteína (Reação B) ; (iii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase e ot-sialidase a, pelo menos, uma amostra de proteína diferente (Reação C) ; e incubar a pluralidade de amostras de proteína; e (c) analisar a pluralidade de amostras de proteína utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (d) determinar um teor de carboidratos para a pluralidade de amostras de proteína; e (e) calcular uma porcentagem de sialilação para a proteína.
[00011] Também se descreve um kit que compreende adicionalmente: (f) analisar um controle positivo e negativo utilizando cromatografia HPAEC- PAD; (g) analisar uma pluralidade de padrões utilizando cromatografia HPAEC-PAD; e (h) comparar os resultados da pluralidade de amostras de proteína com os resultados da pluralidade de padrões.
[00012] A figura 1 mostra um esquema das Reações A, B e C, e os dados que são obtidos a partir de cada reação respectiva. A porcentagem de recobrimento mediante sialilação pode ser determinada a partir do quociente das diferenças nas Reações C e B e Reações C e A, respectivamente. Veja-se a equação 1.
[00013] A figura 2 mostra um cromatograma típico para uma amostra de recAlpha-1 digerida na Reação C. Os tempos de eluição para galactose variam entre aproximadamente 14 e 16 minutos.
[00014] A figura 3 amostra uma comparação de uma amostra de recAlpha-1 a montante que foi dialisada contra água deionizada ou foi centrifugada em um filtro de centrifugação de 10 kDa. Na amostra dialisada ficavam impurezas, porém foram eliminadas quase totalmente pelo filtro de centrifugação de 10 kDa.
[00015] A figura 4 demonstra que os excipientes a montante de meios de cultivo recAlpha-1 podem ser detectados e podem ser coeluídos próximo do pico de galactose. No painel A, mostra-se um pico de excipiente que é eluído próximo ao pico de galactose em algumas amostras depois da limpeza do filtro de centrifugação. Para as amostras da Reação B, o pico de impureza é resolvido inicialmente do pico de galactose e não se integra. No painel B, o pico de impureza do processo é coeluído com uma amostra da Reação C. Neste caso, o pico de impureza deve ser dividido como se mostrou anteriormente para evitar que seja integrado com a área do pico de galactose.
[00016] A figura 5. A especificidade do método foi confirmada analisando uma mistura de monossacarídeos neutros e aminomonossacarídeos derivados de glucoproteínas.
[00017] A figura 6. Exemplo de uma curva padrão de galactose típica.
[00018] Um exemplo de uma proteína que pode ser analisada utilizando o método descrito no presente documento é o inibidor de alfa 1- proteinase (também conhecido como alfa 1-antitripsina). O inibidor de alfa 1- proteinase é uma glucoproteína serpina de origem natural que está implicada na proteção das células de enzimas protease implicadas na coagulação e na inflamação. A ausência de inibidor de alfa-1 proteinase, deficiência de alfa 1- antitripsina, conduz a transtornos respiratórios tais como enfisema e doença pulmonar obstrutiva crônica (EPOC). Por conseguinte, existe um interesse na utilização de inibidor de alfa-1 proteinase como bioterapêutico para tratar doenças relacionadas com a deficiência do inibidor de alfa-1 proteinase. O inibidor de alfa-1 proteinase recombinante (recAlpha-1) foi concebido para secreção pela linha celular PerCó com estruturas de carboidrato glicano enlaçadas a N que estão parcial ou totalmente recobertas por ácidos siálicos terminais (ácidos N-acetilneuramínicos). Uma diminuição da quantidade de ácidos siálicos terminais demonstrou reduzir a meia vida de recAlpha-1 em soro. Portanto, é importante conhecer a porcentagem de resíduos de galactose recobertos mediante ácidos siálicos em recAlpha-1 quando se investiga sua função ou eficácia como fármaco terapêutico.
[00019] No presente documento descreve-se um método para a determinação do teor de sialilação de uma glucoproteína. O método começa com a preparação de uma amostra de proteína para hidrólise enzimática dos restos de carboidrato. Por conseguinte, a proteína deve ser posta em condições compatíveis com as reações enzimáticas, incluindo ajustar a concentração de proteína, eliminar componentes da solução tais como sais dissolvidos, tampões, outras proteínas, carboidratos, excipientes, etc., que poderiam interferir com a enzima ou enzimas. Tal como se utiliza no presente documento, o termo “preparado/a” ou a frase “preparar uma proteína para a análise” descreve o processo de eliminar componentes da solução que poderiam interferir na hidrólise enzimática e diluir a solução de proteínas a uma concentração ótima para o ensaio com água deionizada.
[00020] Pelo menos podem ser utilizados dois métodos exemplares não limitativos para preparar componentes da solução de proteínas a partir de proteínas para a análise: (1) diálise contra água deionizada ou (2) filtração centrífuga (também chamada filtração por centrifugação). Em ambos os casos, utilizou-se uma membrana semipermeável com um limite de corte de peso molecular (MWCO) especificado para eliminar espécies de peso molecular mais baixo enquanto se retinha a proteína analito de interesse. Os intervalos de MWCO úteis incluem 1 kDa, 2,5 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 50 kDa, 100 kDa, 250 kDa e 500 kDa. No procedimento de diálise, a proteína foi inserida em uma membrana de diálise e foi dialisada contra um excesso de água deionizada ou tampão adequado e/ou solução salina durante, pelo menos, 4 horas a 4°C.
[00021] Como alternativa, em lugar de ser dialisada, uma amostra de proteína pode ser preparada para a digestão enzimática mediante filtração centrífuga. Durante a filtração centrífuga, a solução de proteína foi centrifugada contra uma membrana semipermeável com um MWCO especificado. Os componentes da solução com pesos moleculares abaixo do MWCO passam através do filtro durante a centrifugação, enquanto que a proteína e as espécies de peso molecular mais alto são retidas. Habitualmente, a solução de proteína é concentrada durante a filtração por centrifugação, devido a que a água passa através da membrana semipermeável. Geralmente, como exemplo não limitativo, utilizou-se um filtro de centrifugação de 10 kDa, conforme as instruções do fabricante, para preparar a amostra de proteína.
[00022] Antes da digestão enzimática, as amostras de proteína também foram diluídas a uma concentração de 1,0 a 1,5 mg/ml com água deionizada, de modo que estivessem dentro do intervalo linear do ensaio. Uma vez que as amostras foram diluídas, pelo menos se realizou uma reação para cada condição (ou seja, A, B e C). A solução de proteína preparada foi dividida, pelo menos em três amostras para desglucosilação enzimática. Veja-se a figura 1. A Reação A era o controle de fundo (para controlar a galactose exógena). Esta reação está composta somente por os tampões para as reações enzimáticas e serve como controle para carboidratos que podem existir no meio que compreende o analito de proteína. A Reação B continha β-galactosidase, que hidrolisava grupos carboidratos não sialilados, porém não aqueles que estavam “recobertos” com grupos sialila. A Reação C continha tanto α-sialidase como β-galactosidase. Nesta reação, a α-sialidase hidrolisava os restos sialila de recobrimento, o que permitia em seguida à β-galactosidase hidrolisar todos os grupos carboidrato. Nesta reação combinada de α-sialidase e β-galactosidase, toda a glucosilação (ou seja, sialilada e não sialilada) foi eliminada da proteína, enquanto que na reação de β-galactosidase, somente foram eliminados os grupos carboidratos não recobertos (não sialilados). Os componentes para as três condições de reação se mostra na tabela 1.
[00023] As diferentes reações foram preparadas múltiplas vezes com base ao número de amostras a digerir. Para cada digestão, adicionou-se 45 pl de amostra a três tubos diferentes. Posteriormente, adicionou-se 20 pl da enzima de reação apropriada A, B ou C ao tubo indicado para esse tipo de reação e se aqueceu em um termomisturador a 37°C, agitando moderadamente, durante entre 2,5 horas e 4 horas. A reação foi inativada mediante incubação a 90 °C durante 5 minutos.
[00024] Uma vez completadas as digestões, as amostras foram preparadas para as análises cromatográficas combinado 30 pl de amostra e 20 pl de padrão de desoxirribose a 0,02 mg/ml em um frasco e misturando minuciosamente. As amostras foram colocadas a seguir em um processador de amostras automático de HPLC a 10°C e foram processadas utilizando o método cromatográfico descrito no Exemplo 2.
[00025] Foram realizadas análises por cromatografia de intercâmbio aniônico de alta resolução com detecção amperométrica pulsada (HPAE-PAD) em sistemas de cromatografia iônica Dionex ICS-3000 com bombas únicas, processadores automáticos de amostras com termostato ajustados a 10°C, e unidades de detecção eletroquímica (Dionex, Sunnyvale, CA). Foram utilizados eletrodos de ouro (Au) dessecáveis para a detecção amperométrica pulsada (PAD) (Dionex No. de Prod. 060139). A forma de onda utilizada para a análise da amostra se baseava na Ficha Técnica 21 de Dionex, que descreve ajustes ótimos para PAD de carboidratos tal como se amostra na tabela 2. Veja-se a Ficha Técnica 21 de Dionex, Optimal Settings for Pulsed Amporémmetric Detection of Carbohydrates Using the Dionex ED40 Electrochemical Detector [Ajustes ótimos para detecção amperométrica pulsada de carboidratos utilizando o detector eletroquímico Dionex ED40], Dionex (1998).
[00026] A cromatografia foi realizada utilizando uma coluna de intercâmbio iônico CarboPac PAIO 4 x 250 mm de Dionex (Dionex No. de Prod. 046110) com uma pré-coluna em linha CarboPac PAIO 4 % 50 mm (Dionex No. de Prod. 046115), e uma coluna AminoTrap de 4 % 50 mm (Dionex No. de Prod. 046112) para unir-se à proteína desialilada e impedir sua adsorção à coluna.
[00027] A primeira fase móvel (A) continha NaOH 20 mM e foi utilizada para a separação isocrática a uma vazão de 1 ml/min durante 30 minutos (O tempo de execução inicial era de 28 minutos porém foi ampliado para 30 minutos durante o desenvolvimento para deixar mais tempo para o reequilíbrio a 1 OOo/o da fase móvel A). A segunda fase móvel (B) continha NaOH 500 mM e foi utilizada para a eluição da coluna, limpeza da coluna e limpeza do eletrodo. O método de eluição cromatográfica, incluindo a lavagem em rampa utilizando as fases móveis A e B se mostra na tabela 3. O volume de injeção de amostra era de 20 µl. Foi realizada a análise de dados utilizando o software Chromeleon® 6.8 Chromatography Data Analysis System ( Dionex).
[00028] A concentração de galactose foi quantificada em referência a quantidades conhecidas de um padrão de galactose 10 mM (BioAssay Systems, EGAL-100) que foi diluído sucessivamente em um intervalo linear de 8 pmol a 1,5 nmol. Durante o desenvolvimento do método, foi realizada uma única injeção de cada ponto antes das injeções de amostra para garantir o rendimento da coluna e o sistema. Veja-se a figura 6.
[00029] O monossacarídeo 2-desoxi-D-ribosa (desoxirribose) foi utilizado como padrão interno. Uma quantidade equivalente de desoxirribose foi adicionada a todas as amostras de proteína, padrões e controles para monitorizar o rendimento do eletrodo. Devido à natureza da PAD, utilizou-se o padrão interno para corrigir as diferenças na resposta do detector, que podem ser produzidas de injeção a injeção. A área do pico de galactose para todas as amostras foi corrigida dividindo a área de galactose pela área de desoxirribose.
[00030] Utilizou-se um controle positivo para garantir a precisão do ensaio cada vez que era realizado. Isto requeria monitorar a função enzimática e assegurar o manejo apropriado da amostra. A reação de controle era uma mistura 1 a 1 de fetuina sialilada bovina e padrão de asialofetuina disponível no mercado (Sigma F3004 e A4781, respectivamente). Individualmente, a fetuina sialilada tem uma porcentagem de recobrimento acima de 99% e a asialofetuina tem uma porcentagem de recobrimento de 0%. Quando se misturam em proporções iguais, a proporção de recobrimento (sialilação) para fetuina deve ser de 50% ± 3%. O controle de fetuina foi preparado como um grande lote que se dividiu em alíquotas, foi congelado a -70°C e uma amostra individual foi descongelada e utilizada como controle cada vez que se digeriu um jogo de amostras e se processou utilizando os métodos descritos no presente documento.
[00031] Foi monitorizado um experimento de idoneidade do sistema para assegurar o rendimento do método analítico utilizando uma mistura de galactose e desoxirribose que se injetou no começo de uma série, e foram categorizadas cada 12 injeções de amostra (ou seja, 2 amostras por duplicação), e ao final da série para monitorizar o rendimento do eletrodo e a coluna durante toda a série. Os diferentes experimentos para uma série cromatográfica típica se mostra na tabela 4.
[00032] Na figura 2 mostra-se um cromatograma representativo. As áreas de todas as injeções de amostra foram corrigidas mediante a área de desoxirribose. As correções foram realizadas dividindo a área do pico de galactose pela área do pico de desoxirribose. Este número corrigido foi utilizado a seguir para calcular a porcentagem de sialilação. Para calcular esta porcentagem, determinou-se a proporção de galactose não recoberta com respeito a galactose total utilizando a equação 1:
[00033] Para calcular a porcentagem de recobrimento, a área galactose foi dividida pela área de desoxirribose para dar áreas de galactose corrigidas. A porcentagem de recobrimento foi calculada para cada uma das injeções por duplicação de uma amostra utilizando as áreas corrigidas. A área de galactose corrigida medida para a Reação B restou da área de galactose corrigida determinada a partir da Reação C; este valor corresponde à quantidade de galactose recoberta com sialila. A área de galactose corrigida determinada para a Reação A restou a seguir continuação da área de galactose corrigida medida para a Reação C; este valor corresponde à galactose total (ou seja, recoberta e sem recobrir). A galactose recoberta (C - B) foi dividida pela galactose total (C - A) e foi multiplicada por 100 para dar a porcentagem de recobrimento com sialila. Os dados representativos são mostrados na tabela 5.
[00034] A idoneidade do sistema foi se monitorizada utilizando uma mistura de galactose e desoxirribose que se injetou ao começo de uma série e no final da série para monitorizar o rendimento do eletrodo e a coluna durante toda a série. A porcentagem de recobrimento médio descrito foi determinada a partir das áreas corrigidas de injeções por duplicação. Se a área do pico de galactose na Reação B fosse menor que a área do pico de galactose no padrão de 8 pmol, então a porcentagem de recobrimento foi descrita como “>% de [recobrimento]” (ou seja, “maior que”) calculado com base na área do pico de galactose do padrão de 8 pmol no numerador do cálculo. Realizou-se o cálculo do fator de cola (chamado “assimetria” no software Chromeleon®), placas teóricas e resolução e determinou-se mediante o software de aquisição de dados de Dionex. Os cálculos para os restantes critérios de idoneidade do sistema foram determinados de forma manual. Os parâmetros de idoneidade do sistema representativos são mostrados na tabela 6.
[00035] Os critérios de aceitação do ensaio de idoneidade do sistema são mostrados na tabela 7
[00036] Para otimizar a velocidade da reação enzimática, analisou-se a proporção de enzima com respeito a proteína. A enzima β-galactosidase é administrada pelo fabricante a uma atividade de >3 Unidades/ml (atividade específica >6 Unidades/mg), enquanto que a enzima GC-sialidase tem uma atividade de 5 Unidades/ml (atividade específica a 135 Unidades/mg). A quantidade de cada enzima se manteve constante a 4 pl cada una, a correspondente a 0,012 Unidades de β-galactosidase e 0,02 Unidades de - sialidase na reação, enquanto que a quantidade de proteína variava de 540 a 2160 pmol. As amostras analisadas eram uma recAlpha-1 intercambiada com tampão e filtrada em sobrenadante de cultivo celular a uma concentração de 1,4 mg/ml. As amostras foram preparadas tal como se mostra na tabela 8.
[00037] Para cada estequiometria de reação e ponto temporal de digestão de recAlpha-1, analisou-se a área do pico cromatográfico de galactose e determinou-se a porcentagem de recobrimento. Na tabela 9 mostra-se um resumo dos resultados, que demonstram que o valor de recobrimento não muda para nenhuma das condições estequiométricas. A estequiometria de reação original (por exemplo, 2,2 % 1CT5 unidades /pmol de proteína) foi estimada com base nas recomendações do fabricante. Contudo, estes resultados indicam que as enzimas podem ser excessivas nas condições recomendadas pelo provedor, inclusive quando a concentração de proteína foi aumentada 4 vezes. Dado este amplo intervalo dinâmico de estequiometria, selecionou-se uma condição estequiométrica “de ponto médio” (ou seja, aproximadamente 1,1 % 1CT5 Unidades/pmol de proteína) para simplificar o procedimento, minimizar o custo da enzima e permitir a suficiente robustez na preparação da amostra.
[00038] A estequiometria da reação também foi examinada comparando os resultados do recobrimento para uma amostra de recAlpha-1 a montante (RAD-0637) preparada o Dia 1 utilizando 4 pl de enzima na reação e o Dia 2 (14 dias mais tarde), utilizando 2 pl de enzima. Os resultados do experimento mostram o mesmo valor de recobrimento para as quantidades enzimáticas de 2 pl e 4 pl, o que indicava que 2 pl de enzima eram suficientes para que a reação continuasse até completar-se, o que era coerente com a observação anterior (tabela 10).
[00039] Neste método de HPAEC-PAD, utilizou-se um padrão interno para normalizar a área do pico de galactose devido à inerente variabilidade da detecção amperométrica em cada injeção. Inicialmente, ensaiou-se dois padrões internos: galactosemina e desoxirribose. Ambos os padrões internos funcionavam adequadamente e ambos eram eluídos em momentos suficientemente diferentes da galactose e não interferiam na quantificação. Ainda a galactosemina se comportasse adequadamente, observou-se algumas incoerências nas áreas do pico que requereriam critérios de aceitação mais amplos para monitorizar o rendimento do sistema. Por conseguinte, a desoxirribose foi selecionada como padrão interno. Adicionalmente, a desoxirribose é utilizada habitualmente como padrão na indústria para métodos de detecção amperométrica. As áreas para o pico de desoxirribose mostravam menos variabilidade durante as largas sequências de injeção e podiam ser usadas com critérios de aceitação mais estreitos.
[00040] Durante o desenvolvimento, observaram-se vários casos de aumentos ou diminuições sem explicação da área de desoxirribose. Conduto, nestas mesmas amostras, a um aumento ou diminuição da área de desoxirribose seguia a troca oposta do pico de galactose (tabela 11).
[00041] Habitualmente, as flutuações da área do pico podiam ser explicadas como diferenças da resposta por parte do eletrodo. Se este fosse o caso, podia-se esperar que ambos picos aumentassem ou diminuíssem. Foi realizado um experimento em se adicionou desoxirribose a três amostras porém não se misturou. As amostras foram analisadas mediante HPAEC- PAD, em seguida foram retiradas e agitadas em vórtice para garantir a mistura da amostra e o padrão interno. A seguir foram reinjetadas as amostras. Os resultados destes experimentos mostram que a flutuação das áreas resulta da mistura insuficiente da amostra e do padrão interno. Isto sugere que pode se produzir a estratificação entre a solução de padrão interno e a amostra e os usuários devem misturar a reação suficientemente antes de colocá-la na bandeja do processador automático de amostras. Os resultados destes experimentos se resumem na tabela 12.
[00042] Dado o caráter crítico da qualidade das enzimas β- galactosidase e sialidase para a velocidade da reação e a quantificação da galactose, se compararam enzimas β-galactosidase e cc-sialidase de quatro provedores diferentes. O objetivo era calibrar a aptidão da velocidade da reação que proporcionará uma resposta adequada e estabelecer um provedor suplente no caso em que as enzimas do provedor principal já não estejam disponíveis no mercado. Os provedores selecionados foram Sigma, Glyko- Prozyme, New England BioAbs e QA Bio. As enzimas de QA Bio foram utilizadas para a maioria dos experimentos descritos no presente documento. Sigma foi eliminada quando uma reação enzimática não produziu nenhuma resposta. Glyko-Prozyme também foi eliminado como opção quando as áreas do pico de galactose foram iguais para amostras tratadas com β-galactosidase a aquelas amostras tratadas tanto com β-galactosidase como com α-sialidase em dois experimentos diferentes (ou seja, a atividade de -sialidase era indetectável). Preparou-se experimentos comparativos diretos que comparavam as enzimas de New England BioAbs e QA Bio e eles foram realizados no mesmo dia. Os resultados foram comparados também com dados de dias anteriores com as mesmas amostras digeridas com enzimas de QA Bio. As diferenças porcentuais entre as duas enzimas eram desprezíveis e o desvio padrão relativo (% de DER) para as várias séries de ensaios indicavam que as enzimas β-galactosidase e α-sialidase de New England BioAbs eram comparáveis às de QA Bio e podiam ser usadas como provedor suplente no caso em que as enzimas de QA Bio já não estejam disponíveis no mercado. Os resultados experimentais se resumem na tabela 13.
[00043] Dado que as amostras de proteína a montante podem conter 5 mg/ml de galactose de meios de cultivo celular, desenvolveu-se um método de preparação da amostra para eliminar a maioria do excesso de galactose dos meios, assim como outros excipientes potencialmente interferentes. Esta limpeza só não era suficiente para eliminar todas as impurezas do processo, e assim deve ser realizada uma limpeza adicional como parte da preparação para o método de recobrimento. Avaliaram-se dois métodos de limpeza rápida: diálise contra água deionizada e filtração em filtro de centrifugação a 10 kDa.
[00044] O experimento utilizava uma amostra de rec Alpha-1 intercambiada com tampão. N experimento, foi dialisada uma amostra contra água deionizada durante 4 horas enquanto que outra amostra foi limpa simultaneamente utilizando um filtro de centrifugação de 10 kDa. Ambas as amostras foram analisadas a seguir mediante o método de recobrimento. A conclusão do experimento era que os filtros de centrifugação de 10 kDa eram mais efetivos na eliminação de impurezas que a diálise e permitem a preparação de até 30 amostras de uma vez, com um tempo de execução significativamente aumentado. Os cromatogramas de ambos os procedimentos de limpeza que implicavam digestão com a Reação C (β-galactosidase e OC- sialidase) são mostrados na figura 3. A amostra filtrada por centrifugação foi reconstituída com água deionizada e, por conseguinte, tinha uma menor concentração que a amostra dialisada. Ainda que quantidades vestigiais de galactose possam seguir estando presentes depois da limpeza, todos os picos de fundo (ou seja, Reação A) foram contados posteriormente no cálculo da porcentagem de recobrimento restando a área do pico contaminado.
[00045] Também se observou que algum excipiente ou excipientes dos sobrenadantes do cultivo celular se eluem pouco depois do pico de galactose e, em alguns casos, aparecem como um rebordo do pico no pico de galactose (veja-se a figura 4). Em ditos casos onde alguns excipientes residuais não podem ser eliminados mediante o filtro de centrifugação de 10 kDa, a presença desta impureza foi excluída da área do pico de galactose realizando integração “descendente” e não integrando o pico de impureza.
[00046] A especificidade é a capacidade do método de avaliar o analito em presença de componentes que se pode esperar que estivessem presentes, tais como impurezas, produtos de degradação, matrizes, etc. A especificidade do método foi determinada preparando uma mistura de monossacarídeos neutros e aminomonossacarídeos disponíveis no mercado e analisando a mistura mediante HPAEC-PAD. Os açúcares avaliados eram fucose, galactosemina, glucosamina e galactose. Os açúcares foram analisados individualmente para confirmar os tempos de retenção e, a seguir, foram analisados como uma mistura para determinar a especificidade (figura 5). A separação de monossacarídeos era comparável à observada na Ficha Técnica 20 de Dionex, onde a galactose é eluída depois dos outros três monossacarídeos. Veja-se a Ficha Técnica 20 de Dionex, “Analysis of Carbohydrates by High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amporémmetric Detection” [Análise de carboidratos mediante cromatografia de intercâmbio aniônico de alta resolução com detecção amperométrica pulsada] (HPAE-PAD), Dionex Corp. (2000). Adicionalmente, para amostras altamente impuras, isto é, sobrenadantes de cultivo celular, os níveis de fundo foram analisados para avaliar se quaisquer excipientes interferentes estavam presentes e se foram eliminados mediante preparação da amostra.
[00047] A linearidade do ensaio de sialilação HPAEC PAD é sua capacidade para obter resultados do ensaio que sejam diretamente proporcionais à concentração ou teor de analito em um intervalo dado. Adicionalmente, um intervalo derivado do estudo de linearidade foi utilizado para confirmar o grau aceitável de linearidade, exatidão e precisão alcançável mediante o procedimento. A linearidade para o método foi avaliada preparando uma curva de calibração padrão de galactose com um intervalo ótimo de 8 pmol a 1,5 nmol (figura 6). O coeficiente de determinação (coeficiente de regressão) era de 0,99 ou Maior para o intervalo de 8 pmol a 1,5 nmol. Os residuais de regressão também foram analisados e mostraram não estar tendentes nesse intervalo. A curva de calibração pode ser ampliada até 2 nmol e manter uma linearidade aceitável, porém com uma perda de exatidão no extremo inferior da curva de calibração. O intervalo da curva de calibração ótima foi monitorizado em diferentes datas, utilizando diferentes sistemas, colunas e eletrodos de ouro dessecáveis de Dionex ICS-3000. A tabela 14 resume estes resultados.
[00048] O limite de quantificação (LDC) do ensaio de sialilação HPAEC PAD indica a quantidade mais baixa de analito em uma amostra que pode se determinar quantitativamente com precisão e exatidão adequadas. Há maneiras de calcular o LDC de um método quantitativo. Um método se baseia no desvio padrão da ordenada na origem dividida pelo declive médio. Outro método se baseia na análise visual do cromatograma. Em primeiro lugar, calculou-se o LDC do ensaio com base na proporção sinal com respeito a ruído de um cromatograma típico. Especificamente, o nível de ruído em uma região horizontal de 1 minuto do cromatograma foi medido e foi multiplicado por 10 para dar o LDC em termos de altura do pico. A altura do pico foi convertida a seguir nas quantidades em pmol com base na altura do pico dos padrões de calibração. Os resultados do nível de ruído foram comparados com um padrão de calibração que produzia uma resposta similar (veja-se a tabela 15). O nível de ruído foi obtido em seis dias diferentes em dois sistemas ICS- 3000 diferentes. Estes resultados indicam que os níveis de ruído em dias diferentes deram resultados similares (±0,02) e estavam aproximadamente no nível do padrão de 8 pmol (diferença de 0,12 nC % min, que era insignificante em comparação com a altura do padrão de 1500 pmol a aproximadamente 70 nC x min).
[00049] Dado que o nível de ruído do cromatograma pode variar de instrumento a instrumento, o LDC foi calculado também de uma maneira diferente. Com base nos valores na tabela 14 e especificamente na desvio padrão da ordenada na origem (0,0577) dividida pelo declive médio (0,0283) e multiplicada por 10, calculou-se que o LDC era de 20 pmol. Os dois métodos de cálculo do limite de quantificação sugerem que LDC era de aproximadamente 8 a 20 pmol.
[00050] A exatidão do método foi determinada mediante a concordância entre um padrão conhecido e os resultados medidos experimentalmente. Dado que não há nenhum “padrão de ouro” que sirva como referência, a exatidão do método foi determinada utilizando uma mistura a partes iguais de padrões de fetuina sialilada e asialofetuina disponíveis no mercado. O padrão de fetuina bovina sialilada e o padrão de asialofetuina foram preparados em concentrações iguais segundo o determinado mediante absorbância UV a 280 nm (ou seja, A280). Os padrões foram analisados individualmente, a seguir preparados em uma proporção 1:1 e analisados. O padrão de fetuina sialilada tinha uma porcentagem de recobrimento de 99,4% enquanto que o padrão de asialofetuina tinha uma porcentagem de recobrimento de 1,2%, devido a que a quantidade de galactose na Reação B é ligeiramente superior à Reação C. Com nestes descobrimentos, a porcentagem de recobrimento esperado para a mistura de fetuina de controle seria de aproximadamente 50%. Estabeleceu-se que o resultado real para a mistura de fetuina era de 49,3% com base na média de múltiplas séries. Os resultados para o experimento foi resumido na tabela 16. Ainda que não se possa realizar a derivação de variabilidade ou exatidão exata a partir da medição a A280, estes resultados indicam que este método era exato dentro de uns poucos pontos de porcentagem. Adicionalmente, este controle de fetuina foi analisado como parte dos estudos de precisão intermeios em dias diferentes (veja-se a tabela 18 e a tabela 19, mais adiante), e mostrou ter um desvio padrão relativo (% de DER) de 3%. A utilização de dito controle é recomendada cada vez que se realiza o ensaio.
[00051] A repetibilidade do ensaio foi avaliada para a coerência dos resultados obtidos do método durante um curto intervalo do tempo nas condições prescritas. A repetibilidade do método foi determinada utilizando uma amostra de sobrenadante de cultivo celular de recAlpha-1 em seis injeções duplicadas. A amostra de fundo (ou seja, a Reação A) não foi analisada, dado que esta amostra havia sido analisada previamente e havia mostrado não conter nenhuma galactose interferente. O desvio padrão relativo foi determinado para a área de galactosemina, a área de galactose e a porcentagem de recobrimento nas seis injeções duplicadas. Os resultados foram resumidos na tabela 17 e são mostrados tanto corrigidos mediante a área de galactosemina quanto sem correção. Os dados mostram que a repetibilidade é de aproximadamente 0,20%.
[00052] Além do estudo de repetibilidade, a análise de precisão intermediária incorporava vários fatores adicionais: Dias diferentes, ajuste de instrumentos diferente e diferente preparação da amostra. A precisão intermediária do método foi investigada preparando uma amostra de recAlpha-1 de desenvolvimento do processo a jusante (RAD-5904) para análise de recobrimento em três dias diferentes e a três concentrações diferentes. Para as análises, foram utilizados diferentes sistemas de cromatografia Dionex ICS-3000, eletrodos dessecáveis, colunas AminoTrap, pré colunas e colunas analíticas. Os resultados mostram que o desvio padrão relativo (DER) da amostra é de 0,25%. Adicionalmente, as porcentagens de recobrimento do controle de fetuina preparado nos três dias de análise também foram comparados. A DER do controle de fetuina era de 2,99%. Os resultados para a precisão intermediária de amostras de recAlpha-1 e o controle de fetuina são resumidos na tabela 18 e na tabela 19, respectivamente. As áreas foram rateadas a partir de séries por duplicação e não foram corrigidas.
[00053] A robustez do ensaio é uma medida de sua capacidade para não ser afetado por pequenas, porém deliberadas, variações nos parâmetros do método ou o manejo da amostra. Foram modificados deliberadamente vários fatores diferentes em uns poucos conjuntos de experimentos, tais como estabilidade do processador automático de amostras, tempo de reação da enzima, volume de enzima e interferência da matriz.
[00054] Estabilidade da amostra no processador automático de amostras
[00055] A robustez foi determinada examinando a estabilidade da amostra durante 48 horas nas condições do processador automático de amostras de HPLC (ou seja, 10°C) para determinar se a amostra que espera a injeção no processador automático de amostras a 10°C comprometeria a qualidade dos resultados. Uma amostra preparada individualmente contida no processador automático de amostras foi injetada a diversos intervalos e foi determinada a resposta de pico das quantidades de galactose para cada ponto temporal. Os resultados se resumem na tabela 20 e mostram um valor de desvio padrão relativo de 0,23%, coerente com o desvio padrão relativo determinado a partir da precisão intermediária. Os resultados são mostrados tanto corrigidos mediante a área do pico de galactosemina quanto sem correção. Estes dados indicam que as amostras podem manter-se no processador automático de amostras durante até 48 horas antes da injeção sem afetar aos resultados de recobrimento.
[00056] A robustez também foi examinada modificando o tempo da reação enzimática de 1 a 4 horas para explicar a variabilidade em diferentes velocidades de reação para diferentes lotes de enzima. Incubou-se uma amostra a pontos temporais de 1, 2,5 e 4 horas e analisou-se cada uma. Os resultados são resumidos na tabela 21 e mostram que ainda que a porcentagem de recobrimento fosse similar para os três tempos de reação, a amostra de digestão de uma hora era ligeiramente inferior às reações mais largas. Com base nestes dados, determinou-se que uma digestão de 2,5 horas é suficiente para que se realize a reação até se completar. Dado que o método depende da velocidade de reação de duas enzimas, os resultados de porcentagem de recobrimento inferior no tempo de reação de 1 hora indicam que a enzima sialidase era a etapa limitante da velocidade.
[00057] Interferência da matriz
[00058] Ainda que a interferência do excipiente e da matriz tenha sido abordada na secção de especificidade, realizou-se um estudo de enriquecimento da matriz para garantir que a matriz a montante no produz uma tendência dos resultados. Uma amostra de Alpha-1 obtida de plasma (PD Alpha-1) que contem diferentes matrizes foi adicionada aos meios de cultivo celular e a porcentagem de recobrimento foi medida utilizando o método descrito no presente documento. Os meios selecionados para o experimento continham o nível mais alto de aditivos utilizado em experimentos de desenvolvimento a montante, tais como meios CDM4PERMAB™ (Hyclone), Pluronic® F-68 (BASF), Antifoam-C (Dow Coming®), e diversos meios de cultivo celular. Adicionou-se Alpha-1 obtida de plasma aos meios a uma concentração de 0,5 mg/ml. A amostra foi preparada a seguir utilizando o procedimento de lavagem habitual de intercâmbio com tampão em fosfato 20 mM, pH 7 seguido de filtração por centrifugação a 10 kDa. A porcentagem de recobrimento da PD Alpha-1 adicionada aos meios de cultivo foi comparada com os resultados de recobrimento para PD Alpha-1 que não se havia adicionado aos meios de cultivo celular (veja-se a tabela 22). Os resultados mostram uma porcentagem de recobrimento de 99,4% para PD Alpha-1 adicionada aos meios e de 99,2% (media) para PD Alpha-1 não adicionada aos meios, o que estava dentro da precisão intermediária associada a este método. Estes resultados indicam que os meios de cultivo celular não interferem no ensaio depois de que as amostras se tenham sido submetido às etapas de limpeza apropriadas.
[00059] Os resultados obtidos a partir dos experimentos de desenvolvimento e pré-qualificação são resumidos na tabela 23.
[00060] Com base nos estudos anteriores, este método foi otimizado para a determinação da taxa de recobrimento em amostras de proteína. Os parâmetros de linearidade, LDC, precisão, exatidão e robustez determinados para este ensaio mostram que este método era coerente, preciso e confiável.
Claims (4)
1. Método para determinar o teor de sialilação de uma proteína, caracterizadopelo fato de que compreende: (a) preparar uma proteína para a análise; (b) tratar enzimaticamente a proteína preparada que compreende: dividir a proteína preparada em uma pluralidade de amostras de proteína, que compreendem (i) pelo menos uma amostra de proteína como amostra dos meios (Reação A); (ii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase a, pelo menos, uma amostra de proteína (Reação B); (iii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase e α-sialidase a, pelo menos, uma amostra de proteína diferente (Reação C); e incubar a pluralidade de amostras de proteína; e adicionar um padrão de desoxirribose à pluralidade de amostras de proteína; e (c) analisar a pluralidade de amostras de proteína utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (d) determinar um teor de galactose para a pluralidade de amostras de proteína da reação A, reação B e reação C; e (e) calcular uma porcentagem de sialilação para a proteína utilizando a equação 1:
em que a reação A (Gal nos meios), reação B (Gal sem recobrir) e reação C (Gal total) são as áreas de galactose corrigidas das reações A, B e C, medidas como a área de galactose dividida pela área de desoxirribose.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (f) analisar uma pluralidade de controles positivos e negativos utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (g) analisar uma pluralidade de padrões utilizando cromatografia HPAEC-PAD; e (h) comparar a pluralidade de amostras de proteína com a pluralidade de padrões e controles.
3. Uso de cromatografia HPAEC-PAD, caracterizado pelo fato de que é para determinar o teor de sialilação de uma proteína, que compreende: (a) preparar uma proteína para a análise; (b) tratar enzimaticamente a proteína preparada, que compreende: dividir a proteína preparada em uma pluralidade de amostras de proteína, que compreendem (i) pelo menos uma amostra de proteína como amostra dos meios (Reação A); (ii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase a, pelo menos, uma amostra de proteína (Reação B); (iii) adicionar, pelo menos, β-galactosidase e a-sialidase a, pelo menos, uma outra amostra de proteína (Reação C); e incubar a pluralidade de amostras de proteína; e adicionar um padrão de desoxirribose à pluralidade de amostras de proteína; e (c) analisar a pluralidade de amostras de proteína utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (d) determinar um teor de galactose para a pluralidade de amostras de proteína da reação A, reação B e reação C; e (e) calcular uma porcentagem de sialilação para a proteína utilizando a equação 1:
em que a reação A (Gal nos meios), reação B (Gal sem recobrir) e reação C (Gal total) são as áreas de galactose corrigidas das reações A, B e C, medidas como a área de galactose dividida pela área de desoxirribose.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que compreende ainda: (f) analisar uma pluralidade de controles positivos e negativos utilizando cromatografia HPAEC-PAD; (g) analisar uma pluralidade de padrões utilizando cromatografia HPAEC-PAD; e (h) comparar a pluralidade de amostras de proteína com a pluralidade de padrões e controles.
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