KR20140060289A - 단백질 시알릴화의 신속하고 정확한 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당단백질의 시알릴화를 분석하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 상기 당단백질 샘플은 하기 3개의 조건하에서 개별적으로 배양된다: β-갈락토시다제로, β-갈락토시다제 + α-시알리다제로, 및 효소 없이. 상기 효소 처리 후, 펄스식 전기화학 검출기를 갖는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC PAD)는 상기 샘플에서 총 갈락토오스, 시알릴화되지 않은 갈락토오스 및 배지에서 외인성 갈락토오스의 정량적 결정을 위해 사용된다. 상기 값의 결정은 상기 당단백질의 시알릴화의 퍼센트를 추론하는 것을 가능하게 만든다.

Description

단백질 시알릴화의 신속하고 정확한 분석방법 {RAPID AND ACCURATE ANALYSIS OF PROTEIN SIALYLATION}
본 발명은 단백질 시알릴화 (sialylation)를 분석하기 위한 분석방법에 관한 것이다.
많은 단백질은 이들의 생물학적 기능을 위해 당화 (glycosylation)를 요구한다. 종종, 글리코실 사슬 (glycosylic chain)의 말단, "캡핑 (capping)", 탄수화물은 시알산 진기 (sialic acid resides)이다. 시알산은 N- 및 O-연결된 뉴라민산 (neuraminic acids)의 족을 포함한다. N-연결된 시알산은, 뉴라민산의 아미노산에 아세틸 또는 글리콜일 모이어티 (moieties)를 연결시켜, 각각 N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac) 및 N-글리콜일뉴라만산 (Neu5Gc)을 형성하여 형성된다. 만약 뉴라민의 아미노 그룹이 하이드록실 모이어티로 치환된다면, 이것은 3-데옥시-D-글리세로-D-갈락토-2-노눌로소닌산 (nonulosonic acid) (KDN)을 산출한다. O-연결된 시알산은 메틸, 아세틸, 락토일, 설페이트, 또는 포스페이트 그룹으로 Neu5Ac, Neu5Gc, 또는 KDN의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 치환시켜 형성된다. 따라서, 시알산의 많고 다양한 집단이 존재한다.
더군다나, 이들 변형에 따른 다수의 생물학적 기능 때문에, 일반적으로, 단백질 시알릴화를 분석하는데 상당한 관심이 있다. 시알릴화는 약동학적 (pharmacokinetic) 및 단백질 생물학적 치료 (protein biotherapeutics)의 효과에 대해 중요할 수 있다. 결과적으로, 여러 가지 분석 방법은 당단백질 (glycoproteins)의 시알산 함량을 평가하도록 개발되어 왔다. 예를 들어, 항체-계 분석 (antibody-based assays)은 특정 탄수화물 모이어티 (carbohydrate moieties)를 확인하는데 사용될 수 있다. 말단 시알산 잔기는 관심의 당단백질로부터 효소적으로 탈착될 수 있고, HPLC에 의해 분석될 수 있다. 그러나, 이들 방법의 각각은 결점을 가지며, 통상적으로 순수 샘플 또는 고 농도를 요구한다. 생약학적 산업에 의해 사용된 통상의 방법은 낮은 정확도, 높은 데이터 가변성 (variability)으로부터 어려움을 겪고 있고, 이들은 매트릭스 간섭 (matrix interference)에 기인하여 복합 배양 배지 (complex culture media)로 사용될 수 없다. 본 발명에 기술된 방법은 이러한 결점을 극복하고, 단백질 시알릴화의 정확하고 재생가능한 정량을 제공한다.
전체적으로, 본 발명에 기재된 방법은 두 개의 단계를 포함한다: (1) 효소 반응은 상기 당단백질로부터 갈락토오스 및 시알산 잔기를 가수분해하는데 사용되고; 및 (2) 이온-교환 크로마토그래피 방법은 갈락토오스 잔기를 분리 및 정량화하는데 사용된다. 상기 방법의 효소적 부분은 특이적 엑소-글리코시다제 (exo-glycosidase), β-(1-4)-갈락토시다제 (galactosidase) (β-갈락토시다제)에 의해 노출된 (캡핑되지 않은) 말단 갈락토오스 잔기의 방출을 포함하고, 반면에 상기 말단 시알산 잔기는 α-(2-3,6,8,9)-시알리다제 (sialidase) (α-시알리다제)에 의해 방출된다. 소화 이전에, 샘플은 적어도 세 개의 튜브 중에 분할된다. 제1 튜브, 반응 A는 대조구 샘플이고, 효소 반응 버퍼만을 포함한다. 제2 튜브, 반응 B는 시알산에 의해 캡핑되지 않는 모든 갈락토오스 잔기를 절단하는 β-갈락토시다제와 반응된다. 제3 튜브, 반응 C는 뉴라미니다제 (neuraminidase) 및 β-갈락토시다제 모두로 공-소화된다. 상기 뉴라미니다제 효소는 캡핑 시알산을 제거하고, β-갈락토시다제로 노출된 갈락토오스 잔기 모두를 절단을 허용한다. 펄스식 전기화학 검출기 (Pulsed Amperometric Detection)를 갖는 고성능 음이온-교환 크로마토그래피(HPAEC PAD)는 그 다음 상기 세 개의 샘플에 존재하는 갈락토오스의 양을 결정하는데 사용된다. 총 갈락토오스 (즉, 반응 C)에 대한 캡핑되지 않는 갈락토오스 (즉, 반응 B)의 비는 갈락토오스 잔기의 캡핑 퍼센트를 계산하는 반면, 또한 상기 배지 (반응 A)에 존재하는 어떤 자유 갈락토오스를 설명하는데 사용된다.
본 발명에 기재된 방법은 단백질의 시알릴화를 분석하기 위한 방법이다.
또한, 하기 단계를 포함하는 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 방법은 개시된다: (a) 분석을 위한 단백질을 제조하는 단계; (b) (i) 배지 샘플로서 적어도 하나의 단백질 샘플을 제공하는 단계 (반응 A); (ii) 적어도 하나의 단백질 샘플에 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계 (반응 B); (iii) 적어도 하나의 다른 단백질 샘플에 α-시알리다제, 및 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계를 포함하는 복수의 단백질 샘플로 상기 제조된 단백질을 분할하는 단계, 및 복수의 단백질 샘플을 배양시키는 단계를 포함하는 상기 제조된 단백질을 효소적으로 처리하는 단계; 및 (c) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 단백질 샘플을 분석하는 단계; (d) 복수의 단백질 샘플에 대한 탄수화물 함량을 결정하는 단계; 및 (e) 상기 단백질에 대한 퍼센트 시알릴화를 계산하는 단계.
또한 하기 단계를 더욱 포함하는 방법은 개시된다: (f) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 양 및 음의 대조구를 분석하는 단계; (g) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 표준을 분석하는 단계; 및 (h) 상기 복수의 단백질 샘플과 복수의 표준 및 대조구를 비교하는 단계.
또한, 하기 단계를 포함하는 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 HPAEC-PAD 크로마토그래피의 용도는 개시된다: (a) 분석을 위한 단백질을 제조하는 단계; (b) (i) 배지 샘플로서 적어도 하나의 단백질 샘플을 제공하는 단계 (반응 A); (ii) 적어도 하나의 단백질 샘플에 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계 (반응 B); (iii) 적어도 하나의 다른 단백질 샘플에 α-시알리다제, 및 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계를 포함하는 복수의 단백질 샘플로 상기 제조된 단백질을 분할하는 단계, 및 복수의 단백질 샘플을 배양시키는 단계를 포함하는 상기 제조된 단백질을 효소적으로 처리하는 단계; 및 (c) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 단백질 샘플을 분석하는 단계; (d) 복수의 단백질 샘플에 대한 탄수화물 함량을 결정하는 단계; 및 (e) 상기 단백질에 대한 퍼센트 시알릴화를 계산하는 단계.
또한 하기 단계를 더욱 포함하는 용도는 개시된다: (f) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 양 및 음의 대조구를 분석하는 단계; (g) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 표준을 분석하는 단계; 및 (h) 상기 복수의 단백질 샘플과 복수의 표준 및 대조구를 비교하는 단계.
또한 하기 요소를 포함하는 어떤 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 키트는 개시된다: 미리측정된 양의 갈락토시다제 및 시알리다제를 포함하는 복수의 용기; 선택적으로, 적어도 하나의 버퍼 조성물, 양의 대조구 샘플, 음의 대조구 샘플 및 탄수화물 표준을 함유하는 용기를 포함하는 적어도 하나의 용기; 및 하기 단계들의 설명을 포함하는, 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 방법을 설명하는 지시서: (a) 분석을 위한 단백질을 제조하는 단계; (b) 하기 단계를 포함하는 상기 제조된 단백질을 효소적으로 처리하는 단계: (i) 배지 샘플로서 적어도 하나의 단백질 샘플을 제공하는 단계 (반응 A); (ii) 적어도 하나의 단백질 샘플에 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계 (반응 B); (iii) 적어도 하나의 다른 단백질 샘플에 α-시알리다제, 및 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계를 포함하는 복수의 단백질 샘플로 상기 제조된 단백질을 분할하는 단계, 및 상기 복수의 단백질 샘플을 배양시키는 단계; 및 (c) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 상기 복수의 단백질 샘플을 분석하는 단계; (d) 복수의 단백질 샘플에 대한 탄수화물 함량을 결정하는 단계; 및 (e) 상기 단백질의 퍼센트 시알릴화를 계산하는 단계.
또한 하기 단계를 더욱 포함하는 키트는 개시된다: (f) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 양 및 음의 대조구를 분석하는 단계; (g) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 표준을 분석하는 단계; 및 (h) 상기 복수의 단백질 샘플과 복수의 표준 및 대조구를 비교하는 단계.
도 1은 반응 A, B, 및 C의 개략도를 나타내고, 데이터는 각각 개별의 반응으로부터 얻어진다. 시알릴화 캡핑 퍼센트는 각각 반응 C 및 B 및 반응 C 및 A에서 차이의 몫으로부터 결정될 수 있다. 수학 식 1을 참조.
도 2는 반응 C에서 소화된 recalpha-1 샘플에 대한 통상적 크로마토그램을 나타낸다. 갈락토오스에 대한 용출 시간 (Elution times)은 대략 14 내지 16 분의 범위이다.
도 3은 탈이온수에 대한 투석되거나 또는 10 kDa 스핀 필터 (spin filter)에서 원심분리되는 업스트림 recalpha-1 샘플의 비교를 나타낸다. 불순물은 상기 투석된 샘플에서 남지만, 10 kDa 스핀 필터에 의해 거의 전체적으로 제거된다.
도 4는 recalpha-1 배양 배지로부터 업스트림 부형제 (excipient)가 검출될 수 있고, 상기 갈락토오스 피크 근처에서 공-용출되는 것을 입증한다. 패널 A에 있어서, 부형제 피크가 스핀 필터를 마무리한 후 몇몇 샘플에서 갈락토오스 피크 다음에 용출되는 것을 나타낸다. 반응 B 샘플에 대하여, 상기 불순물 피크는 상기 갈락토오스 피크로부터 기선 (baseline) 해소되고, 통합되지 않는다. 패널 B에 있어서, 상기 공정 불순물 피크는 반응 C 샘플과 공-용출된다. 이러한 경우에 있어서, 상기 불순물 피크는 상기 갈락토오스 피크의 면적에 통합된 것으로부터 이를 제외한 것으로 상기에서 보여준 바와 같이 분리되어야 한다.
도 5는 방법 특이성 (Method specificity)이 당단백질로부터 유도된 중성 및 아미노 단당류들 (monosaccharides)의 혼합물을 분석하여 확인된다.
도 6은 통상적 갈락토오스 표준 곡선의 예이다.
본 발명에 기재된 방법을 사용하여 분석될 수 있는 단백질의 예는 알파 1-단백질분해효소 억제제 (proteinase inhibitor) (또한 알파 1-항트립신으로 알려짐)이다. 알파 1-단백질분해효소 억제제는 응고 (clotting) 및 염증 (inflamation)에서 포함된 단백질분해 효소로부터 세포를 보호하는데 포함된 천연적으로 발생하는 세르핀 당단백질 (serpin glycoprotein)이다. 알파-1 단백질분해효소 억제제의 부재인, 알파 1-항트립신 결핍은 폐기종 (emphysema) 및 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease) (COPD)와 같은 호흡기 질환 (respiratory disorder)을 유발한다. 따라서, 알파-1 단백질분해효소 억제제 결핍과 연관된 질병을 치료하기 위한 생물학적 치료로서 알파-1 단백질분해효소 억제제를 사용하는데 관심이 있다. 재조합 알파-1 단백질 분해 억제제 (recalpha-1)는 말단 시알산 (N-아세틸뉴라민산)에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 캡핑된 N-연결된 글리칸 탄수화물 구조로 PerC6 세포주에 의한 분비 (secretion)를 위해 설계된다. 상기 말단 시알산의 양의 감소는 recalpha-1의 혈청 반감기를 감소하는 것으로 나타낸다. 따라서, 치료적 약제로서 이의 기능 또는 효능을 조사하는 경우, recalpha-1에서 시알린산에 의해 캡팽된 갈락토오스 잔기의 퍼센트를 아는 것은 중요하다.
실시 예
실시 예 1: 분석 및 효소적 소화를 위한 샘플 제조
당단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 방법은 여기에 기재된다. 상기 방법은 탄수화물 모이어티의 효소 가수분해를 위한 단백질 샘플의 제조로 시작한다. 따라서, 상기 단백질은 상기 단백질 농도를 조정하는 단계, 상기 효소를 방해할 수 있는, 용해된 염, 버퍼, 다른 단백질, 탄수화물, 부형제, 등과 같은 용액 성분을 제거하는 단계를 포함하는 효소 반응과 호환가능한 조건으로 가져와야 한다. 본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "제조된" 또는 문구 "분석을 위한 단백질을 제조하는"은 효소 가수분해를 방해할 수 있는 용액 성분을 제거하는 공정, 및 탈이온수로 단백질 용액을 분석하기 위한 최적 농도로 희석하는 단계의 공정을 설명한다.
적어도 2개의 비-제한 대표 방법: (1) 탈이온수에 대한 투석 (dialysis) 또는 (2) 원심 여과 (centrifugal filtration) (또한 스핀 여과라 함)은 분석을 위한 단백질로부터 단백질 용액 성분을 제조하는데 사용될 수 있다. 두 경우에 있어서, 특정된 분자량 차단 (molecular weight cut-off) (MWCO)을 갖는 반-투과막 (semi-permeable membrane)은 관심의 분석물 단백질을 보유하는 동안, 저-분자량 종을 제거하는데 사용된다. 유용한 MWCO 범위는 1 kDa, 2.5 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 50kDa, 100 kDa, 250 kDa, 및 500 kDa을 포함한다. 상기 투석 절차에 있어서, 상기 단백질은 투석막으로 삽입되고, 4 ℃에서 적어도 4 시간 동안 과량의 탈이온수 또는 적절한 버퍼 및/또는 염 용액에 대하여 투석된다.
선택적으로, 투석 대신, 단백질 샘플은 원심 여과에 의해 효소적 소화 동안 제조될 수 있다. 원심 여과 동안, 상기 단백질 용액은 특정된 MWCO를 갖는 반-투과막에 대하여 원심분리된다. 상기 MWCO 이하인 분자량을 갖는 용액 성분은 원심분리동안 필터를 통과하는 반면, 상기 단백질 및 고 분자량 종은 보유된다. 통상적으로, 상기 단백질 용액은 반 투과막을 통과하는 물 때문에, 스핀 여과 (spin filtration) 동안 농축된다. 일반적으로, 비-제한 예로서, 10 kDa 스핀 필터는 상기 단백질 샘플을 제조하기 위한 제조자의 지시에 따라 사용된다.
효소 소화 전에, 단백질 샘플은 또한 이들이 분석의 선형 범위 (linear range) 이내에 있도록 하기 위하여 탈이온수로 1.0 내지 1.5 mg/mL의 농도로 희석된다. 샘플이 희석된 때, 각 조건에 대한 적어도 하나의 반응 (즉, A, B, 및 C)는 구성된다. 상기 제조된 단백질 용액은 효소적 탈-당화에 대한 적어도 3개의 샘플로 분할된다. 도 1 참조. 반응 A는 (외인성 (exogenous) 갈락토오스에 대해 대조하기 위한) 대조구이다. 이러한 반응은 상기 효소적 반응을 위한 오직 버퍼로 이루어지고, 상기 단백질 분석물 (analyte)을 포함하는 배지에 존재할 수 있는 탄수화물에 대한 대조구로서 제공한다. 반응 B는, 시알릴화되지 않은 탄수화물 그룹을 가수분해하지만, 시알릴 그룹으로 "캡핑된" 것이 아닌, β-갈락토시다제를 함유한다. 반응 C는 α-시알리다제 및 β-갈락토시다제 모두를 함유한다. 이러한 반응에 있어서, α-시알리다제는 캡핑 시알릴 모이어티를 가수분해하고, 그 다음 β-갈락토시다제로 상기 탄수화물 그룹 모두를 가수분해하는 것을 허용한다. 이러한 조합된 α-시알리다제 및 β-갈락토시다제 반응에 있어서, 모든 당화 (즉, 시알릴화 및 시알릴화되지 않은)는 상기 단백질로부터 제거되는 반면, β-갈락토시다제 반응에 있어서, 오직 캡핑되지 않은 (시알릴화되지 않은) 탄수화물 그룹만 제거된다. 상기 3개의 반응 조건에 대한 성분은 하기 표 1에서 나타낸다.
글리코실라제 반응 조건
반응 탈이온수
(㎕)		 갈락토시다제
반응 버퍼
(㎕)		 시알리다제 반응 버퍼
(㎕)		 β(1-4)-
갈락토시다제
(㎕)		 α(2-3,6,8,9)-시알리다제
(㎕)
A-대조구 12 4 4 0 0
B-β-갈락토시다제 10 4 4 2 0
C-β-갈락토시다제+ α-시알리다제 8 4 4 2 2
상기 개별 반응은 소화될 샘플의 수에 기초하여 다중으로 제조된다. 각 소화를 위하여, 45 ㎕의 샘플은 3개의 개별 튜브에 첨가된다. 그 이후에, 20 ㎕의 적절한 효소 반응 A, B, 또는 C는 그 반응 타입을 위한 지시된 튜브에 첨가되고, 2.5 시간 내지 4 사이 시간 동안, 적당히 흔들면서, 37 ℃의 열 혼합기 (thermo-mixer)에서 가열된다. 상기 반응은 5분 동안 90 ℃에서 배양에 의해 퀀칭된다 (quenched).
상기 소화가 완성된 때, 상기 샘플은 바이알에서 30 ㎕의 샘플 및 20 ㎕의 0.02 mg/mL 디옥시리보스 표준를 조합하고, 완전히 혼합하여 크로마토그래피 분석을 위해 제조된다. 상기 샘플은 그 다음 10 ℃에서 HPLC 자동시료주입기 (autosampler)에 위치되고, 실시 예 2에 기재된 크로마토그래피 방법을 사용하여 실행시킨다.
실시 예 2: 크로마토그래피 방법론
펄스식 전기화학 검출기를 갖는 고성능 음이온-교환 크로마토그래피 (HPAEC PAD) 분석은 단일 펌프를 갖는 Dionex ICS-3000 이온 크로마토그래피 시스템, 10 ℃로 설정된 항온 자동시료주입기 (thermostatted autosamplers), 및 전기화학적 검출 유닛 (Dionex, Sunnyvale, CA)상에서 수행된다. 일회용 금 (Au) 전극은 펄스식 전기화학 검출기(PAD) (Dionex Prod. No. 060139)에 대해 사용된다. 샘플 분석을 위해 사용된 파형 (waveform)은, 표 2에 나타낸 바와 같이 탄수화물의 PAD에 대해 최적으로 설정을 설명하는, Dionex Technical Note 21에 기초를 둔다. Dionex Technical Note 21, Dionex ED40 전기화학 검출기, Dionex (1998)를 사용하여 탄수화물의 펄스식 전기화학 검출기를 위한 최적 설정, 참조.
탄수화물 샘플의 PAD에 대한 Dionex 권장 최적 파형 설정
시간 전위 (V) 인테그레이션 (Integration)
0.00 +0.1
0.20 +0.1 시작
0.40 +0.1 종료
0.41 -0.2
0.42 -0.2
0.43 +0.6
0.44 -0.1
0.50 -0.1
크로마토그래피는 탈시알릴화된 (desialylated) 단백질을 결합 및 상기 컬럼에 이의 흡착을 방지하도록 4 ×50 mm 아미노 트랩 컬럼 (Amino Trap column) (Dionex Prod. No. 046112), 및 인-라인 CarboPac PA10 4×50 mm 가드 컬럼 (guard column)을 구비한 Dionex CarboPac PA10 4 ×250 mm 음이온 교환 컬럼 (Dionex Prod. No. 046110)을 사용하여 수행된다.
제1 이동 상 (A)은 20 mM NaOH를 함유하고, 30분 동안 1 mL/min 유속으로 등용매 분리 (isocratic separation)를 위해 사용된다 (초기 작동 시간은 28분이지만 100% 이동상 A에서 재-평형을 위해 더 많은 시간을 허용하도록 전개 동안 30분으로 연장된다. 제2 이동상 (B)은 500 mM NaOH를 함유하고, 컬럼 용출 (column elution), 컬럼 세정, 및 전극 세정을 위해 사용된다. 상기 A 및 B 이동상을 사용하여 램프 세척 (ramp wash)을 포함하는, 크로마토그래피 용출 방법은 표 3에 나타낸다. 상기 샘플 주입 부피는 20 ㎕이다. 데이터 분석은 Chromeleon® 6.8 Chromatography Data Analysis System software (Dionex)을 사용하여 수행된다.
HPAE-PAD 크로마토그래피 용출 방법
시간 (분) % A (20 mM NaOH) % B (500 mM NaOH) 램프 시간 (분)
0.0 100 0.0
19.0 100 0.0 0.5
19.5 0.0 100
24.5 0.0 100 0.5
25.0 100 0.0
30.0 100 0.0
실시 예 3 : 표준, 대조구 , 보정 및 시스템 안정성
갈락토오스 농도는 8 pmol 내지 1.5 nmol의 선형 범위에서 연속하여 희석된 10 mM 갈락토오스 표준 (BioAssay Systems, EGAL-100)의 공지의 양을 참조하여 정량화된다. 방법 전개 동안, 각 점의 단일 주입 (single injection)은 컬럼 및 시스템 성능을 보장하기 위해 샘플 주입 전에 실행된다. 도 6 참조.
상기 단당류 2-데옥시-D-리보스 (데옥시리보스)는 내부 표준 (internal standard)으로서 사용된다. 데옥시리보스의 당량은 전극 성능을 모니터하기 위해 모든 단백질 샘플, 표준, 및 대조구에 첨가된다. PAD의 본질에 기인하여, 상기 내부 표준은, 주입으로부터 주입까지 발생할 수 있는, 검출기 반응에서의 차이에 대해 보정하는데 사용된다. 모든 샘플의 갈락토오스 피크의 면적은 상기 데옥시리보스 영역으로 갈락토스 영역을 나누어 보정된다.
양의 대조구는 이것이 수행된 각각의 분석 시간의 정확성을 보장하기 위해 사용된다. 이것은 효소 기능을 모니터하는데 요구되고, 적절한 샘플 취급을 보장한다. 상기 대조구 반응은 상업적으로 이용가능한 소 시알릴화된 페투인 (bovine sialylated fetuin) 및 아시알로 페투인 표준 (asialo fetuin standard) (각각, Sigma F3004 및 A4781)의 1 대 1 혼합물이다. 개별적으로, 상기 시알릴화된 페투인은 99% 이상의 캡핑 퍼센트를 가지며 상기 아시알로 페투인은 0% 캡팽 퍼센트를 갖는다. 동일한 비율로 혼합된 경우, 페투인에 대한 상기 캡핑 (시알릴화) 비는 50% ±3%일 수 있다. 상기 페투인 대조구는 분취된 큰 배치로서 제조되고, -70 ℃에서 동결되며, 개별 샘플은, 샘플의 세트가 본 발명에 기술된 방법을 사용하여 소화되고 수행될 때마다, 대조구로서 해동되고, 사용된다.
상기 분석 방법의 성능을 보장하기 위한 시스템 적합성 실험은 실행 내내 전극 및 컬럼 성능을 모니터하기 위해 상기 실행 초기에서 주입되고, 매 12개의 샘플 주입 (즉, 중복의 2 샘플)으로 분류되며, 실행의 종료시에 주입된 갈락토오스 및 데옥시리보스의 혼합물을 사용하여 모니터된다. 통상적 크로마토그래피 실행을 위한 일련의 실험은 하기 표 4에 나타낸다.
통상적 크로마토그래피 실행 배열
샘플 내용 반복 주입 부피 (㎕)
1 버퍼 블랭크 a 3 20
2 고농도 표준-시스템 적합성 3 20
3 저농도 표준 b 1 20
4 고농도 표준 b 1 20
5 효소 블랭크 c 1 20
6 페투인-반응 B d 1 20
7 페투인-반응 C d 1 20
8 페투인-반응 B d 1 20
9 페투인-반응 C d 1 20
10 고농도 표준-시스템 적합성 b 1 20
11 버퍼 블랭크 a 1 20
12 샘플 1-반응 A 1 20
13 샘플 1-반응 B 1 20
14 샘플 1-반응 C 1 20
15 샘플 1-반응 A 1 20
16 샘플 1-반응 B 1 20
17 샘플 1-반응 C 1 20
18 버퍼 블랭크 a 1 20
19 샘플 2-반응 A 1 20
20 샘플 2-반응 B 1 20
21 샘플 2-반응 C 1 20
22 샘플 2-반응 A 1 20
23 샘플 2-반응 B 1 20
24 샘플 2-반응 C 1 20
25 고농도 표준-시스템 적합성 b 1 20
26 버퍼 블랭크 a 1 20
N . . . N . . . 1 20
N + 1 고농도 표준-시스템 적합성 b 3 20
N + 2 플러쉬 (Flush)
a 상기 버퍼 블랭크는 어떤 물질도 주입하지 않음 (즉, A 이동상만 함유).
부가적인 블랭크 주입은 상기 컬럼이 세정되고 평형되는 것을 보장하기 위해 요구될 수 있음.
상기 제2 블랭크 주입은 컬럼 세정도 (cleanliness)를 평가하기 위해 사용되는 것이 권장됨.
블랭크 주입은 또한 매 6 샘플 주입에 대해 적어도 한번 또는 필요하다면 곧 수행될 수 있음 (버퍼 블랭크).
b 저농도 표준은 8 pmol 갈락토오스이고, 고농도 표준은 1500 pmol 갈락토오스이다.
이들 분석 표준은 상기 샘플 결과가 상기 분석을 위해 가장 낮고 가장 높은 농도의 선형 범위 내에 있는 것을 보장하도록 의도됨.
상기 1500 pmol 분석 대조구는 전극 및 컬럼 성능을 모니터하기 위한 실행 내내 시스템 적합성 대조구 (예를 들어, 고농도 표준 시스템 적합성)로서 사용되고, 각 12개 샘플 주입 실행으로 분류될 수 있음 (즉, 4개의 A, B, 및 C 샘플 세트).
c 상기 효소 블랭크는 상기 효소 (즉, β-갈락토시다제 및 α-시알리다제) 및 단백질 샘플 없는 버퍼 (즉, 단백질 분석물 없는 반응 C)를 함유하는 주입임.
d 소 페투인 (시알릴화된 및 아시알로 페투인의 1:1 혼합물)은 시알릴화를 위한 양성 대조구로서 사용됨.
실시 예 4: 결과의 보정 및 계산
대표적인 크로마토그램은 도 2에 나타낸다. 모든 샘플 주입의 면적은 데옥시리보스의 면적에 의해 보정된다. 보정은 상기 데옥시리보스 피크의 면적으로 상기 갈락토오스 피크의 면적을 나누어 수행된다. 이러한 보정된 수는 그 다음 퍼센트 시알릴화를 계산하는데 사용된다. 이러한 퍼센트를 계산하기 위하여, 총 갈락토오스에 대한 캡핑되지 않은 갈락토오스의 비는 하기 수학 식 1을 사용하여 결정된다:
Figure pct00001
상기 퍼센트 캡핑을 계산하기 위하여, 상기 갈락토오스 면적은 보정 갈락토오스 면적을 제공하기 위해 상기 데옥시리보스 면적으로 나누어진다. 상기 퍼센트 캡핑은 상기 보정된 면적을 사용하여 각각의 샘플의 중복 주입에 대해 계산된다. 반응 B에 대해 측정된 보정 갈락토오스 면적은 반응 C로부터 결정된 보정 갈락토오스 면적으로부터 빼고; 이러한 값은 시알릴-캡된 갈락토오스의 양에 상응한다. 반응 A에 대해 결정된 보정 갈락토오스 면적은 그 다음 반응 C에 대해 측정된 보정 갈락토오스 면적으로부터 빼고; 이러한 값은 (즉, 캡핑된 및 캡핑되지 않은) 총 갈락토오스에 상응한다. 상기 캡핑된 갈락토오스 (C - B)는 총 갈락토오스 (C-A)으로 나누고, 시알릴-캡핑의 퍼센트를 제공하기 위해 100을 곱한다. 대표적인 데이터는 표 5에 나타낸다.
대표적인 갈락토오스 캡핑 데이터
샘플 데옥시리보스 면적
(nC ×min)		 갈락토오스 면적
(nC ×min)		 보정 면적
(nC ×min)		 퍼센트
캡핑		 평균
퍼센트 캡핑
샘플 1-반응 A 4.597 0.162 0.035
97.9

97.8
샘플 1-반응 B 4.523 0.537 0.119
샘플 1-반응 C 4.461 17.545 3.933
샘플 1-반응 A 4.723 0.150 0.032
97.7
샘플 1-반응 B 4.633 0.548 0.118
샘플 1-반응 C 4.557 17.48 3.763
상기 시스템 적합성은 실행 내지 전극 및 컬럼 성능을 모니터하기 위해 상기 실행의 초기 및 상기 실행의 종료시 주입된 갈락토오스 및 데옥시리보스의 혼합물을 사용하여 모니터된다. 보고된 평균 퍼센트 캡핑은 중복 주입으로부터의 상기 보정 면적으로부터 결정된다. 만약 반응 B에서 상기 갈락토오스 피크 면적이 상기 8 pmol 표준에서 상기 갈락토오스 피크 면적보다 작다면, 상기 퍼센트 캡핑은 상기 계산의 계산기 (numerator)에서 8 pmol 표준의 상기 갈락토오스 피크 면적에 기초하여 계산된 "＞[캡핑]%" (즉,"초과")로서 보고된다. 꼬리끌림 인자 (tailing factor) (Chromeleon® software에서 "비대칭"으로 불림), 이론단 (theoretical plates), 및 해상도의 계산은 Dionex data acquisition software에 의해 수행되고 결정된다. 나머지 시스템 적합성 기준에 대한 계산은 수동으로 결정된다. 대표적인 시스템 적합성 파라미터는 표 6에 나타낸다.
대표적인 시스템 적합성 파라미터 계산
샘플 데옥시리보스
비대칭		 데옥시리보스
해상도		 데옥시리보스
이론단		 데옥시리보스
체류시간
(분)		 데옥시리보스 면적
(nC×in)		 갈락토오스면적
(nC×min)		 % 차이
데옥시리보스
체류시간		 % 차이
갈락토오스 면적
적합성 0.92 10.20 3281 7.62 7.210 38.735 0 -3
적합성 0.92 10.25 3323 7.62 6.846 36.872 0 -8
적합성 0.94 10.28 3330 7.62 7.242 39.057 0 -2
1500 pmol 0.93 10.29 3334 7.62 7.410 39.749 0
8 pmol 0.92 11.36 3337 7.62 7.595 0.215 0
RAD6425 A 0.92 3377 7.60 7.377 0
RAD6425 B 0.93 11.26 3308 7.57 7.031 0.236 -1
RAD6425 C 0.91 10.27 3276 7.57 6.863 12.407 -1
RAD6425 A 0.93 3304 7.57 6.631 -1
RAD6425 B 0.91 11.45 3301 7.57 7.228 0.229 -1
RAD6425 C 0.90 10.24 3283 7.57 7.107 12.833 -1
적합성 0.93 10.18 3298 7.58 7.330 39.516 0 -1
적합성 0.93 10.27 3326 7.60 7.345 39.758 0 0
적합성 0.92 10.25 3345 7.62 7.220 39.041 0 -2
시스템 적합성 분석 판정 기준은 표 7에 나타낸다.
시스템 적합성 분석 판정 기준
시스템 적합성을 위한 파라미터 기준
고 및 저농도 표준의 평균에서 데옥시리보스의 체류시간과 비교한 상기 샘플에서 데옥시리보스의 체류시간의 퍼센트 차이 ±5%
초기 분석 대조구 (고농도 표준) 및 분류 분석 대조구 주입 (즉, 고농도 표준 시스템 적합성 주입)의 갈락토오스 면적의 퍼센트 차이
±15%
상기 중복 recalpha-1 샘플의 % 캡핑의 퍼센트 차이 ±2%
이전 확립되고 예상된 % 캡핑 결과와 대조구 % 캡핑 결과의 퍼센트 차이 확립된 값의 ±3%
꼬리끌림 인자 (Tailing Factor) (즉, 비대칭)* 1 ±0.2
이론단* ≥2000
해상도* ≥8.5
* 상기 꼬리끌림 인자는 각 샘플 주입에 대한 데옥시리보스 피크를 사용하여 결정됨.
실시 예 5: 샘플/효소 반응 및 소화 시간의 화학양론
효소 반응 속도를 최적화하기 위하여, 효소 대 단백질의 비는 분석된다. 상기 β-갈락토시다제 효소는 >3 Units/mL의 활성 (특이적 활성 >6 Units/mg)에서 제조자에 의해 제공되고, 반면 α-시알리다제 효소는 5 Units/mL의 활성을 갖는다 (135 Units/mg에서 특이적 활성). 각 효소의 양은 상기 반응에서 β-갈락코시다제의 0.012 Units 및 α-시알리다제의 0.02 Units에 상응하는, 각 4 ㎕에서 일정하게 유지되고, 반면 상기 단백질 양은 540 내지 2160 pmol로 변화된다. 상기 분석된 샘플은 1.4 mg/mL의 농도의 세포 배양 상층액에서 recalpha-1 을 버퍼-교환되고 여과된다. 상기 샘플은 표 8에 나타낸 바와 같이 제조된다.
반응 화학양론
샘플 RAD0906 부피 (㎕) 반응 부피 (㎕) 반응 첨가 후 샘플 농도 (mg/mL)
20 20 0.7
40 20 0.9
80 20 1.1
각 recalpha-1 반응 화학양론 및 소화 시점 (digestion time point)에 대하여, 상기 갈락토오스 크로마토그래피 피크 면적은 분석되고 상기 퍼센트 캡핑은 결정된다. 결과의 요약은 하기 표 9에 나타내고, 이것은 캡핑 값이 어떤 화학양론적 조건에 대해 변화하지 않는다는 것을 입증한다. 원래의 반응 화학양론 (예를 들어, 2.2 ×10-5 Units/pmol 단백질)은 제조자의 권고에 기초하여 평가된다. 그러나, 이들 결과는 상기 효소가 상기 단백질 농도가 4 배로 증가된 경우에서도, 공급업체가 권장된 조건에서 과잉일 수 있다는 것을 나타낸다. 제공된 이러한 화학양론의 광범위한 동적 범위인, "중간-점" 화학양론적 조건 (즉, 대략 1.1 ×10-5 Units/pmol 단백질)은 절차를 단순화시키고, 효소 비용을 최소화하며, 샘플 제조에서 충분한 견고성 (robustness)을 허용하기 위해 선택된다.
recalpha-1 반응 화학양론 결과
단백질 (pmol) 단백질
부피
(㎕)		 샘플 타입 β-갈락토시다제
(units)		 시알리다제 (units) β-갈락토시다제
(units/pmol)		 시알리다제 (units/pmol) 갈락토오스
면적
(nC×min)		 %
캡핑
540 20 B 0.012 2.22 ×10-5 0.710 96.6
540 20 C 0.012 0.02 2.22 ×10-5 3.7 ×10-5 21.78 96.6
1080 40 B 0.012 1.11 ×10-5 0.740 96.4
1080 40 C 0.012 0.02 1.11 ×10-5 1.8 ×10-5 18.817 96.4
1080 40 B 0.012 1.11 ×10-5 0.638 96.6
1080 40 C 0.012 0.02 1.11 ×10-5 1.8 ×10-5 18.817 96.6
1080 40 B 0.012 1.11 ×10-5 0.647 96.8
1080 40 C 0.012 0.02 1.11 ×10-5 1.8 ×10-5 20.323 96.8
2160 80 B 0.012 5.56 ×10-6 0.565 96.7
2160 80 C 0.012 0.02 5.56 ×10-6 9.1 ×10-6 17.204 96.7
평균 96.6
표준편차 0.15
% RSD 0.16
반응 화학양론은 또한 상기 반응에서 4 ㎕의 효소를 사용하여 Day 1 및 2 ㎕의 효소를 사용하여 Day 2 (14일 후)에 제조된 업스트림 recalpha-1 샘플 (RAD-0637)에 대한 캡핑 결과를 비교하여 실험된다. 상기 실험의 결과는, 2 ㎕의 효소가 상기 관찰과 일치하는, 완성으로 진행을 위한 반응에 대해 충분하다는 것을 나타내는, 2 ㎕ 및 4 ㎕ 효소 양에 대해 동일한 캡핑 값을 보여준다 (표 10).
효소 정량 결과
분석일 효소 부피 (㎕) 퍼센트 캡핑
Day 1 4 97.4
Day 2 2 97.2
실시 예 6: 내부 표준
이러한 HPAEC-PAD 방법에 있어서, 내부 표준은 각 주입에서 전기화학 검출기의 고유의 가변성에 기인하여 상기 갈락토오스의 피크 면적을 표준화하는데 사용된다. 초기에, 2개의 내부 표준은 시험된다: 갈락토사민 및 데옥시리보스. 내부 표준 모두는 적절하게 관능화되고, 갈락토오스와 충분히 다른 시간에서 모두 용출되며, 정량화에 방해받지 않는다. 비록 갈락토사민이 적절하게 수행될지라도, 피크 면적에서 약간의 불일치는 시스템 성능을 모니터하는데 폭넓은 판정 기준을 요구하는 것으로 관찰된다. 결과적으로, 데옥시리보스는 상기 내부 표준으로 선택된다. 더욱이, 데옥시리보스는 일반적으로 전기화학 검출기 방법에 대한 산업 표준으로 사용된다. 상기 데옥시리보스 피크에 대한 면적은 상기 긴 주입 배열 내내 적은 가변성을 보여주고, 더욱 엄격한 판정 기준하에서 사용될 수 있다.
전개 동안, 데옥시리보스 면적에서 설명되지 않은 증가 또는 감소의 여러 가지 예들은 관찰된다. 그러나, 이들 동일한 샘플에서, 상기 데옥시리보스 면적에서 증가 또는 감소는 상기 갈락토오스 피크에서 대립 변화를 수반한다 (하기 표 11).
관찰된 데옥시리보스 피크 면적에서 변화
샘플명 데옥시리보스 면적 (nC×min) 갈락토오스 면적 (nC ×min)
페투인, 반응 B 3.724 11.858
페투인, 반응 C 3.940 25.019
페투인, 반응 B 5.482 8.363
페투인, 반응 C 5.179 17.452
RAD6236, 반응 A 3.855 0.082
RAD6236, 반응 B 3.885 0.548
RAD6236, 반응 C 3.991 11.560
RAD6236, 반응 A 4.589 0.089
RAD6236, 반응 B 4.483 0.406
RAD6236, 반응 C 4.540 10.227
통상적으로, 피크 면적에서 파동 (fluctuation)은 상기 전극에 의한 반응에서 차이로서 설명될 수 있다. 만약 이것이 상기 경우라면, 두 피크는 증가 또는 감소하는 것으로 예상될 것이다. 실험은 데옥시리보스가 3개의 샘플에 첨가되지만 혼합되지 않게 수행된다. 상기 샘플들은 HPAEC-PAD에 의해 분석되고, 그 다음 제거되고, 내부 표준 및 샘플의 혼합을 보장하기 위하여 와동된다 (vortexed). 상기 샘플은 그 다음 재-주입된다. 이들 실험의 결과는 상기 내부 표준 및 상기 샘플의 불충분한 혼합으로부터 결과하는 면적에서 파동을 나타낸다. 이것은 상기 내부 표준 용액 및 샘플 사이의 층상 (stratification)이 발생할 수 있고, 사용자가 자동샘플 주입기 트레이를 위치시키기 전에 충분하게 상기 반응을 혼합해야하는 것을 의미한다. 이들 실험으로부터 결과는 표 12에 요약된다.
데옥시리보스 피크 면적 파동을 유발하는 불충분한 혼합의 확인
샘플 제조 데옥시리보스 면적 (nC×min) 갈락토오스 면적 (nC ×min)
RAD6249 반응 C 혼합없음 3.172 22.260
페투인 반응 C 혼합없음 2.460 17.247
2C9 반응 C 혼합없음 2.762 18.110
RAD6249 반응 C 혼합 후 4.704 17.607
페투인 반응 C 혼합 후 4.933 12.440
2C9 반응 C 혼합 후 4.877 14.671
실시 예 7: 효소 공급 업체 비교
반응 속도 및 갈락토오스 정량에 β-갈락토시다제 및 시알리다제 효소 품질의 임계 (criticality)를 제공하여, 4개의 다른 공급업체의 β-갈락토시다제 및 α-시알리다제 효소는 비교된다. 목적은 정확한 반응을 제공할 반응 속도의 타당성을 측정하고, 더 이상 상업적으로 이용가능하지 않는 1차 공급업체의 효소의 경우에 있어서, 백업 공급업체를 확립하는 데 있다. 선택된 공급업체는 Sigma, Glyko-Prozyme, New England BioLabs, 및 QA Bio이다. QA Bio 효소는 본 발명에 기재된 대부분의 실험에 대해 사용된다. Sigma는 효소 반응이 반응을 산출하지 않는 경우 제거되었다. Glyko-Prozyme는 또한 상기 갈락토오스 피크 면적이 2개의 개별 실험에서 β-갈락토시다제 및 α-시알리다제 모두로 처리된 샘플로서 β-갈락토시다제로 처리된 샘플과 동일한 경우 선택으로 제거된다 (즉 상기 α-시알리다제 활성이 검출되지 않는 경우). New England BioLabs 및 QA Bio 효소와 비교하는 정면 (Head-to-head) 실험은 같은 날에 제조되고 실행된다. 상기 결과는 또한 QA Bio 효소로 소화된 동일한 샘플과 이전의 데이터와 비교된다. 2개의 효소 사이에 퍼센트 차이는 무시할만하고, 여러 시도에 대한 상대적 표준 편차 (% RSD)는 New England BioLabs β-갈락토시다제 및 α-시알리다제 효소가 QA Bio 효소와 비교가능하며, QA Bio 효소가 더 이상 상업적으로 유용하지 않는 경우에 있어서, 백업 공급업체로서 사용될 수 있다. 상기 실험 결과는 표 13에 요약된다.
QA Bio 또는 New England BioLabs 효소를 사용하여 소화된 샘플의 결과
샘플 분석일 효소 제조자 퍼센트 캡핑
페투인 Day 1 QA Bio 49.5
페투인 Day 5 QA Bio 52.1
페투인 Day 5 New England BioLabs 52.8
평균 51.5
표준편차 1.74
% RSD 3.38
RAD0637 Day 1 QA Bio 97.4
RAD0637 Day 15 QA Bio 97.2
RAD0637 Day 15 New England BioLabs 97.6
평균 97.4
표준편차 0.20
% RSD 0.21
실시 예 8 : 샘플 타입 및 제조
업스트림 단백질 샘플이 세포 배양 배지로부터 5 mg/mL 갈락토오스를 함유할 수 있게 제공하여, 샘플 제조 방법은 다른 잠재적 방해 부형제뿐만 아니라, 배지로부터 대부분의 과잉의 갈락토오스를 제거하기 위해 개발된다. 이러한 단독 세정은 모든 공정 불순물을 제거하기 위해 충분하기 않고, 그래서 부가적인 세정은 상기 캡핑 방법 제조의 부분으로서 수행되어야 한다. 신속한 세정의 두 방법은 평가된다: 탈이온수에 대해 투석 및 10 kDa 원심 스핀 필터.
상기 실험은 버퍼-교환된 recalpha-1 샘플을 활용한다. 이러한 실험에 있어서, 샘플은 4시간 동안 탈이온수에 대해 투석되고, 반면 다른 샘플은 10 kDa 스핀 필터를 사용하여 동시에 세정된다. 샘플 모두는 그 다음 상기 캡핑 방법에 의해 분석된다. 상기 실험으로부터 결론은 10 kDa 스핀 필터가 투석보다 불순물을 제거하는 것에서 더욱 효과적이고, 상당히 증가된 소요 시간 (turnaround time)에서, 한번에 30개의 샘플까지 제조를 허용한다. 반응 C로 소화 (β-갈락토시다제 및 α-시알리다제)를 포함한 세정 절차 모두의 크로마토그램은 도 3에 나타낸다. 상기 스핀 필터된 샘플은 탈이온수로 재구성되고, 결과적으로 상기 투석된 샘플보다 더 낮은 농도를 갖는다. 비록 갈락토오스의 미량이 상기 세정 후 존재할 수 있을지라도, 모든 배경 피크 (background peaks) (즉, 반응 A)는 그 이후에 오염 피크 면적을 밖으로 빼내서 퍼센트 캡핑 계산에서 기록된다.
상기 세포 배양 상층액으로부터 몇몇 부형제는 상기 갈락토오스 피크 후에 짧게 용출되고, 몇몇 경우에 있어서, 상기 갈락토오스 피크에 피크 숄더 (peak shoulder)로서 나타나는 것이 관찰된다 (도 4 참조). 특정 잔류 부형제가 10 kDa 스핀 필터에 의해 제거될 수 없는 경우에 있어서, 이러한 불순물의 존재는 "드럽 다운" 인테그레이션을 수행 및 불순물 피크를 인테그레이션하지 않아 상기 갈락토오스 피크 면적으로부터 배제된다.
실시 예 9: 특이성 ( Specificity )
특이성은 불순물, 분해 산물, 매트릭스 (matrices) 등과 같이, 존재하는 것으로 예상될 수 있는, 성분의 존재하에서 분석물 (analyte)을 평가하기 위한 방법의 능력이다. 상기 방법의 특이성은 상업적으로 이용가능한 중성 및 아미노 단당류의 혼합물을 제조 및 HPAEC-PAD에 의해 상기 혼합물을 분석하여 결정된다. 평가된 당은 푸코오스 (fucose), 갈락토사민, 글루코사민, 및 갈락토오스이다. 상기 당은 체류 시간을 확인하기 위해 개별적으로 분석되고, 그 다음 특이성을 결정하기 위해 혼합물로서 분석된다 (도 5). 상기 단당류의 분리는 Dionex Technical Note 20에서 알 수 있는 것과 비교가능하고, 여기서 갈락토오스는 모든 3개의 다른 단당류 이후에 용출된다. Dionex Technical Note 20, 펄스식 전기화학 검출기(HPAE-PAD)를 갖는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 탄수화물의 분석, Dionex Corp. (2000) 참조. 부가적으로, 높은 불순물 샘플, 즉, 세포 배양 상층액에 대하여, 상기 배경 수준은 어떤 방해하는 부형제가 존재하는지 및 이들이 샘플 제조를 통해 제거되는지의 여부를 평가하기 위해 분석된다.
실시 예 10 : 선형성 ( Linearity )
상기 HPAEC PAD 시알릴화 분석의 선형성은 제공된 범위 내에 상기 분석물 농도 또는 함량에 대한 직접적인 비율인 시험 결과를 얻기 위한 이의 능력이다. 부가적으로, 상기 선형성 연구로부터 유도된 범위는 상기 절차에 의해 달성가능한 선형성, 정확성, 및 정밀도의 허용가능한 정도를 확인하는데 사용된다. 상기 방법에 대한 선형성은 8 pmol 내지 1.5 nmol의 최적 범위로 갈락토오스 표준 검정 곡선 (calibration curve)을 제조하여 평가된다 (도 6). 상기 결정의 계수 (회귀 계수 (regression coefficient))는 8 pmol 내지 1.5 nmol 범위에 대해 0.99 이상이다. 상기 회귀 잔류는 또한 분석되고 그 범위에서 편중되지 않은 것으로 나타낸다. 상기 검정 곡선은 2 nmol까지 연장될 수 있고, 허용가능한 선형성을 유지하지만, 상기 검정 곡선의 낮은 말단에 정확성을 갖는다. 상기 최적 검정 곡선 범위는 다른 시스템, 컬럼 및 Dionex ICS-3000 일회용 금 전극을 사용하여, 다른 날짜에 걸쳐 모니터된다.
이들 결과의 요약
6개의 검정 곡선에 대한 R-제곱, 기울기, 및 y-절편의 요약
분석일 기기 R 2 기울기 y-절편
Day 1 RTQ-0087 0.9999 0.0276 0.0435
Day 4 RTQ-0094 1.0000 0.0279 -0.0139
Day 11 RTQ-0094 0.9999 0.0263 0.0342
Day 39 RTQ-0094 1.0000 0.028 0.0029
Day 42 RTQ-0094 1.0000 0.0308 -0.0553
Day 46 RTQ-0087 0.9998 0.0297 0.1138
실시 예 11: 정량의 한도
상기 HPAEC PAD 시알릴화 분석의 정량의 한도 (LOQ)은 적절한 정밀도 및 정확도로 정량적으로 결정될 수 있는 샘플에서 분석물의 가장 작은 양을 나타낸다. 정량적 방법의 상기 LOQ을 계산하는데 여러 가지 방법이 있다. 하나의 방법은 평균 기울기로 나눈 y-절편의 표준 편차에 기초를 둔다. 또 다른 방법은 크로마토그램의 가시적 분석에 기초를 둔다. 첫째, 상기 분석의 LOQ는 통상적 크로마토그램의 신호-대-노이즈 (noise) 비에 기초하여 계산된다. 구체적으로, 상기 크로마토그램의 1-분 수평 영역에서 노이즈 수준은 측정되고 피크 높이의 관점에서 상기 LOQ를 산출하기 위해 10을 곱한다. 상기 피크 높이는 그 다음 상기 검정 표준의 피크 높이에 기초하여 pmol 양으로 전환된다. 상기 노이즈 수준 결과는 유사한 반응을 산출하는 검정 표준과 비교된다 (표 15 참조). 상기 노이즈 수준은 두 개의 다른 ICS-3000 시스템상에 6개의 다른 날짜에 걸쳐 얻어진다. 이들 결과는 다른 날짜에 노이즈 수준이 유사한 결과 (±0.02)를 제공하고, 대략 8 pmol 표준 수준에 있다는 것을 나타낸다 (0.12 nC ×min의 차이, 이것은 대략 70 nC ×min에서 1500 pmol 표준의 높이와 비교하여 미미하다).
8 pmol갈락토오스에 대한 6개의 분석물에 따른 노이즈 수준의 비교
분석일 기기 노이즈 수준 차이×10 (nC×min) 표준 피크 높이 8 pmol 갈락토오스
Day 1 RTQ-0094 0.22 0.27
Day 7 RTQ-0087 0.25 0.40
Day 14 RTQ-0087 0.27 0.37
Day 28 RTQ-0087 0.22 0.36
Day 36 RTQ-0087 0.25 0.30
Day 37 RTQ-0087 0.23 0.45
평균 0.24 0.36
상기 크로마토그램 노이즈 수준은 기기로부터 기기로 변화될 수 있기 때문에, 상기 LOQ는 또한 다른 방식으로 계산된다. 표 14의 값, 구체적으로 평균 기울기 (0.0283)로 나누고, 10을 곱한 상기 y-절편 (0.0577)의 표준 편차에 기초하여, 상기 LOQ는 20 pmol로 계산된다. 정량의 한도를 계산하는 상기 두 방법은 LOQ가 대략 8 내지 20pmol이라고 제안한다.
실시 예 12: 방법의 정확도
상기 방법의 정확도는 공지의 표준 및 실험적으로-측정된 결과 사이에 동의에 의해 결정된다. 기준으로서 제공된 "금 표준"은 없기 때문에, 상기 방법의 정확도는 상업적으로 이용가능한 시알릴화된 및 아시알로 페투인 표준의 동일한 혼합물을 사용하여 결정된다. 상기 시알릴화된 소 페투인 표준 및 상기 아시알로 페투인 표준은 280 nm (즉, A280)에서 UV 흡광도에 의해 결정된 바와 같은 동일한 농도로 제조된다. 상기 표준은 개별적으로 분석되고, 그 다음 1:1 비로 제조되고 분석된다. 상기 시알릴화된 페투인 표준은 99.4%의 퍼센트 캡핑를 가지며, 반면 상기 아시알로 페투인 표준은 반응 C보다 다소 더 높은 반응 B에서 갈락토오스의 양에 기인하여, 1.2%의 퍼센트 캡핑 결과를 갖는다. 이들 발견을 기초로, 상기 페투인 혼합 대조구에 대한 예상된 캡핑 퍼센트는 대략 50%일 것이다. 상기 페투인 혼합물에 대한 실제 결과는 다중 실행의 평균에 기초하여 49.3%으로 확립된다. 상기 실험에 대한 결과는 표 16에 요약된다. 비록 상기 가변성의 정확한 편차 또는 상기 A280 측정으로부터 근거하는 정확도가 만들어질 수 없을지라도, 이들 결과는 이러한 방법이 약간의 퍼센트 포인트 내에서 정확하다는 것을 가리킨다. 더구나, 이러한 페투인 대조구는 다른 날짜에 중간 정밀도 연구의 일부로 분석되고 (표 18 및 표 19 참조), 3%의 상대 표준 편차 (% RSD)를 갖게 나타낸다. 이러한 대조구의 사용은 상기 분석이 수행된 언제나 권장된다.
HPAEC-PAD 방법의 정확도를 결정하기 위한 페투인 표준에 대한 결과
페투인 반응 갈락토오스 면적 (nC ×min) 퍼센트 캡핑 퍼센트 회수
아시알로 A 0
아시알로 B 27.636 -1.2 100
아시알로 C 27.301
시알릴화된 A 0
시알릴화된 B 0.182 99.4 100
시알릴화된 C 28.808
반응 A 0
반응 B 14.019 49.3 99
반응 C 27.657
실시 예 13: 재현성 ( Reproducibility )
상기 분석의 재현성은 전술된 조건 하에서 짧은 시산 간격 동안 상기 방법으로부터 얻어진 결과의 일관성을 위해 평가된다. 상기 방법의 재현성은 6번 반복된 주입에 걸쳐 recalpha-1 세포 배양 상층액 샘플을 사용하여 결정된다. 상기 배경 샘플 (즉, 반응 A)은 이러한 샘플이 이전에 분석되고 어떤 방해하는 갈락토오스를 함유하지 않는 것으로 나타나기 때문에 분석되지 않는다. 상대적 표준 편차는 6번 반복 주입에 걸친 캡핑 퍼센트, 갈락토오스 면적, 및 갈락토사민 면적에 의해 결정된다. 상기 결과는 표 17에 요약되고, 갈락토사민 면적에 의해 보정 및 보정 없는 모두를 나타낸다. 상기 데이터는 약 0,20%로 재현성을 나타낸다.
방법의 재현성
샘플 주입 No. 반응 면적
갈락토사민
(nC×min)		 갈락토오스
면적
(nC×min)		 보정된
면적
(nC×min)		 퍼센트
캡핑		 보정 없는
퍼센트 캡핑
1 B 14.681 1.364 0.093 96.8 96.5
1 C 13.408 39.026 2.911
2 B 14.917 1.359 0.091 96.8 96.6
2 C 13.851 39.396 2.844
3 B 14.865 1.389 0093 96.6 96.5
3 C 14.506 39.863 2.748
4 B 15.241 1.412 0.093 96.5 96.2
4 C 14.140 37.593 2.659
5 B 14.936 1.375 0.092 96.4 96.5
5 C 15.070 38.760 2.572
6 B 14.710 1.360 0.092 96.3 96.5
6 C 15.532 39.260 2.528
평균 Gal 단독 14.897 1.376 0.092 96.6 96.5
Gal + Sal 14.418 38.983 2.70
표준편차. Gal 단독 0.201 0.021 0.001 0.19 0.11
Gal + Sal 0.786 0.775 0.151
% RSD Gal 단독 1.35 1.50 0.82 0.2 0.12
Gal + Sal 5.45 1.90 5.59
실시 예 14: 중간 정밀도 ( Intermediate Precision )
상기 재현성 연구에 부가하여, 상기 중간 정밀도 분석은 여러 가지 부가 요인: 다른 날짜, 다른 기기 설정, 및 다른 샘플 제조를 혼입된다. 상기 방법의 중간 정밀도는 3개의 다른 날짜 및 3개의 다른 농도에 대한 캡핑 분석을 위해 다운스트림 공정 개발 recalpha-1 샘플 (RAD-5904)을 제조하여 조사된다. 상기 분석을 위하여, 다른 Dionex ICS-3000 크로마토그래피 시스템, 일회용 전극, 아미노 트랩 컬럼 (amino trap columns), 가드 컬럼, 및 분석 컬럼은 사용된다. 상기 결과는 0.25%로 상기 샘플의 상대 표준 편차 (RSD)를 보인다. 부가적으로, 3개의 분석일에 걸쳐 제조된 상기 페투인 대조구의 캡핑 퍼센트는 또한 비교된다. 상기 페투인 대조구의 RSD는 2.99%이다. recalpha-1 샘플 및 페투인 대조구의 중간 정밀도에 대한 결과는 각각 표 18 및 표 19에 요약된다. 상기 면적은 중복 실행으로부터 평균되고 보정되지 않는다.
recalpha-1에 대한 중간 정밀도 결과
샘플 부피 (㎕) 반응 면적 (nC ×min) 퍼센트 캡핑
Day 1
20 B 0.525 95.7
20 C 12.073
40 B 0.7035 95.5
40 C 15.756
80 B 0.4335 95.4
80 C 9.48
Day 2
20 B 0.491 95.9
20 C 12.0425
40 B 0.6645 95.7
40 C 15.396
80 B 0.3745 96.2
80 C 9.7415
Day 3
20 B 0.554 95.8
20 C 13.161
40 B 0.708 95.9
40 C 17.434
80 B 0.417 95.9
80 C 9.298
평균 95.7
표준 편차 0.24
% RSD 0.25
페투인 대조구에 대한 중간 정밀도 결과
페투인 반응 면적 (nC ×min) 퍼센트 캡핑
Day 1
B 14.119 51.8
C 29.281
Day 2
B 13.679 49.3
C 27.002
Day 3
B 18.683 49.1
C 36.676
평균 50.1
표준편차 1.50
% RSD 2.99
실시 예 15: 견고성 ( Robustness )
상기 분석의 견고성은, 방법 파라미터 또는 샘플 취급에서 의도적인 변형이 아닌, 작은 것에 의해 영향을 받지 않고 유지되는 이의 역량의 측정이다. 여러 가지 다른 요인은 자동샘플주입기 안정성, 효소 반응 시간, 효소 부피, 및 매트릭스 간섭과 같은, 실험의 몇몇 세트에서 의도적인 변화이다.
자동샘플주입기에서 샘플 안정성
견고성은 10 ℃에서 자동샘플주입기에 샘플 대기 주입이 상기 결과의 품질을 손상시킬지의 여부를 결정하기 위해 상기 HPLC 자동샘플 주입기 조건 (즉, 10 ℃)에서 48시간 동안 샘플 안정성을 실험하여 결정된다. 자동샘플 주입기에 유지된 단일 제조된 샘플은 다양한 간격에서 주입되고, 상기 갈락토오스 양의 피크 반응이 매 포인트에 대해 결정된다. 상기 결과는 표 20에 요약되고, 상기 중간 정밀도로부터 결정된 상대 표준 편차와 일치하는, 0.23%의 상대 표준 편차값을 보인다. 결과는 상기 갈락토사민 피크 면적에 의한 보정 및 보정 없이 모두 나타낸다. 이들 데이터는 샘플이 캡핑 결과에 영향받지 않고 주입 전에 48시간까지 자동샘플주입기에 유지될 수 있다는 것을 가리킨다.
자동샘플주입기에서 샘플 안정성에 대한 결과
반응 갈락토사민 면적
(nC ×min)		 갈락토오스 면적
(nC ×min)		 보정된 면적
(nC ×min)		 퍼센트
캡핑		 보정된
퍼센트 캡핑
평균 B 14.465 1.353 0.094 96.4 96.4
C 14.601 37.900 2.600
표준편차 B 0.48 0.04 0.00 0.10 0.22
C 0.59 1.27 0.14
% RSD B 3.35 2.69 2.19 0.10 0.23
C 4.01 3.34 5.28
효소 반응 시간
견고성은 다른 효소 배치에 대하여 반응의 다른 속도에서 가변성에 대한 해석을 확인하기 위해 1 내지 4시간 동안 효소 반응 시간을 변화시켜 실험된다. 샘플은 1, 2.5, 및 4 시간 포인트에서 배양되고, 각각은 분석된다. 상기 결과는 표 21에 요약되고, 비록 퍼센트 캡핑이 3개의 반응 시간에 대해 유사할지라도, 상기 한-시간 소화 샘플은 더 긴 반응보다 다소 더 낮다는 것을 보인다. 이들 데이터에 기초하여, 2.5 시간 소화는 완성하기 위해 실행하는 반응에 대해 충분한 것으로 결정된다. 상기 방법이 2개의 효소의 반응 속도에 의존하는 것을 제공하여, 1-시간 반응 시간에서 더 낮은 퍼센트 캡핑 결과는 상기 시알리다제 효소가 속도-제한 단계인 것을 가리킨다.
효소 반응시간의 결과
샘플 부피 (㎕) 반응 반응 시간 (h) 갈락토오스 면적 (nC ×min) 퍼센트캡핑
40 B 1 0.740 96.4
40 C 1 20.617
40 B 2.5 0.638 96.6
40 C 2.5 18.817
40 B 4 0.647 96.8
40 C 4 20.323
매트릭스 간섭 ( matrix interference )
비록 부형제 및 매트릭스 간섭이 특이성 섹션에서 설명되었을지라도, 매트릭스 스파이킹 연구 (matrix spiking study)는 업스트림 매트릭스가 상기 결과를 편파적으로 하지 않게 하는 것을 보장하기 위해 수행된다. 다른 매트릭스를 함유하는 플라즈마 유도된-알파-1 (PD 알파-1)은 세포 배양 배지에 첨가되고, 상기 퍼센트 캡핑은 본 발명에 기재된 방법을 사용하여 측정된다. 가장 높은 수준의 첨가제를 함유한 실험에 대한 선택된 배지는 CDM4PERMAB™ 배지 (Hyclone), Pluronic® F-68 (BASF), Antifoam-C (Dow Corning®), 및 다양한 세포 배양 배지와 같은 업스트림 개발 실험에 사용된다. 플라스마 유도된 알파-1은 0.5 mg/mL 농도로 배지에 첨가된다. 상기 샘플은 그 다음 10 kDa 스핀 필터를 수반하는 pH 7, 20 mM로 교환하는 버퍼의 통상적 세정 절차를 사용하여 제조된다. 배양 배지에 첨가된 상기 PD 알파-1의 캡핑 퍼센트는 세포 배양 배지에 첨가되지 않는 PD 알파-1에 대한 캡핑 결과와 비교된다 (표 22 참조). 상기 결과는 상기 배지에 첨가된 상기 PD 알파-1에 대해 99.4% 및 배지에 첨가되지 않은 상기 PD 알파-1에 대한 99.2% (평균)의 퍼센트 캡핑을 보여주고, 이것은 이러한 방법과 연관된 중간 정밀도 이내에 있다. 이들 결과는, 샘플이 적절한 세정 단계를 수행한 후, 상기 세포 배양 배지가 분석을 간섭하지 않는다는 것을 나타낸다.
매트릭스 간섭에 대한 결과
샘플 반응 보정된 면적 퍼센트 캡핑
PD 알파-1 (배양 배지) A 0.006
99.4
PD 알파-1 (배양 배지) B 0.012
PD 알파-1 (배양 배지) C 1.064
PD 알파-1, Day 1 A 0.000
99.0
PD 알파-1, Day 1 B 0.020
PD 알파-1, Day 1 C 2.132
PD 알파-1, Day 2 A 0.000
99.3
PD 알파-1, Day 2 B 0.017
PD 알파-1, Day 2 C 2.330
요약
상기 개발 (development) 및 전-정량화 실험으로부터 얻어진 결과는 하기 표 23에 요약된다. 상기 연구에 기초하여, 이러한 방법은 단백질 샘플에서 캡핑 속도의 결정을 위해 최적화된다. 이러한 분석에 대해 결정된 상기 선형성, LOQ, 정밀도, 정확도, 및 견고성 파라미터는 이러한 방법이 지속적이고, 정확하며, 신뢰성 있다는 것을 보여준다.
방법 파라미터의 요약
파라미터 실험 결과
선형성 6개 표준 곡선 대 갈락토오스의 피크 면적
(8 내지 1500 pmol)		 R 2 ≥ 0.99
범위 단백질 농도의 작동 범위 ≤1.5 mg/mL
LOQ 8 pmol
갈락토오스/주입
재현성 같은 날/같은 기기상에 6개 샘플 복제 0.20% RSD
중간 정밀도 3일, 2개 컬럼, 3개 전극, 및 2개 ICS 3000시스템에 기초한 계산된 캡핑 recalpha-1 샘플에 대한 0.25% RSD; 페투인 대조구에 대한 2.99%
정확도 평균 페투인 값 대 미리-설정된 값의 근접성 97-103% 회수
견고성 48 시간동안 10 ℃에서 샘플 안정성 효과 없음
2 내지 4 시간의 효소 반응 시간 효과 없음

Claims (6)

  1. (a) 분석을 위한 단백질을 제조하는 단계;
    (b) 하기 단계를 포함하는 상기 제조된 단백질을 효소적으로 처리하는 단계:
    (i) 배지 샘플로서 적어도 하나의 단백질 샘플을 제공하는 단계 (반응 A);
    (ii) 적어도 하나의 단백질 샘플에 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계 (반응 B);
    (iii) 적어도 하나의 다른 단백질 샘플에 α-시알리다제, 및 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계를 포함하는 복수의 단백질 샘플로 상기 제조된 단백질을 분할하는 단계, 및
    상기 복수의 단백질 샘플을 배양시키는 단계; 및
    (c) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 상기 복수의 단백질 샘플을 분석하는 단계; 및
    (d) 복수의 단백질 샘플에 대한 탄수화물 함량을 결정하는 단계를 포함하는 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은:
    (f) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 양 및 음의 대조구를 분석하는 단계;
    (g) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 표준을 분석하는 단계; 및
    (h) 상기 복수의 단백질 샘플과 복수의 표준 및 대조구를 비교하는 단계를 더욱 포함하는 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 방법.
  3. (a) 분석을 위한 단백질을 제조하는 단계;
    (b) 하기 단계를 포함하는 상기 제조된 단백질을 효소적으로 처리하는 단계:
    (i) 배지 샘플로서 적어도 하나의 단백질 샘플을 제공하는 단계 (반응 A);
    (ii) 적어도 하나의 단백질 샘플에 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계 (반응 B);
    (iii) 적어도 하나의 다른 단백질 샘플에 α-시알리다제, 및 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계를 포함하는 복수의 단백질 샘플로 상기 제조된 단백질을 분할하는 단계, 및
    상기 복수의 단백질 샘플을 배양시키는 단계; 및
    (c) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 상기 복수의 단백질 샘플을 분석하는 단계;
    (d) 복수의 단백질 샘플에 대한 탄수화물 함량을 결정하는 단계; 및
    (e) 상기 단백질의 퍼센트 시알릴화를 계산하는 단계를 포함하는 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 HPAEC-PAD 크로마토그래피의 용도.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 용도는:
    (f) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 양 및 음의 대조구를 분석하는 단계;
    (g) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 표준을 분석하는 단계; 및
    (h) 상기 복수의 단백질 샘플과 복수의 표준 및 대조구를 비교하는 단계를 더욱 포함하는 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 HPAEC-PAD 크로마토그래피의 용도.
  5. 미리측정된 양의 갈락토시다제 및 시알리다제를 포함하는 복수의 용기를 포함하는 적어도 하나의 용기;
    선택적으로, 적어도 하나의 버퍼 조성물, 양의 대조구 샘플, 음의 대조구 샘플 및 탄수화물 표준을 함유하는 용기; 및
    하기 단계들의 설명을 포함하는, 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 방법을 설명하는 지시서를 포함하는 어떤 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 키트:
    (a) 분석을 위한 단백질을 제조하는 단계;
    (b) 하기 단계를 포함하는 상기 제조된 단백질을 효소적으로 처리하는 단계:
    (i) 배지 샘플로서 적어도 하나의 단백질 샘플을 제공하는 단계 (반응 A);
    (ii) 적어도 하나의 단백질 샘플에 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계 (반응 B);
    (iii) 적어도 하나의 다른 단백질 샘플에 α-시알리다제, 및 적어도 β-갈락토시다제를 첨가하는 단계를 포함하는 복수의 단백질 샘플로 상기 제조된 단백질을 분할하는 단계, 및
    상기 복수의 단백질 샘플을 배양시키는 단계; 및
    (c) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 상기 복수의 단백질 샘플을 분석하는 단계;
    (d) 복수의 단백질 샘플에 대한 탄수화물 함량을 결정하는 단계; 및
    (e) 상기 단백질의 퍼센트 시알릴화를 계산하는 단계.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 키트는:
    (f) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 양 및 음의 대조구를 분석하는 단계;
    (g) HPAEC-PAD 크로마토그래피를 사용하여 복수의 표준을 분석하는 단계; 및
    (h) 상기 복수의 단백질 샘플과 복수의 표준 및 대조구를 비교하는 단계를 더욱 포함하는 어떤 단백질의 시알릴화 함량을 결정하기 위한 키트.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2675511T3 (es) * 2011-07-14 2018-07-11 Grifols, S.A. Análisis rápido y preciso de la sialilación de proteínas
CN106324234B (zh) * 2016-08-08 2018-05-22 上海睿康生物科技有限公司 修饰的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用
CN107045019B (zh) * 2016-09-30 2019-08-16 中国医学科学院输血研究所 一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法
CN110346500B (zh) * 2018-04-04 2021-11-30 青岛大学附属医院 一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法
CN109329713B (zh) * 2018-12-01 2022-04-22 西华大学 一种降解牦牛肉中n-羟乙酰神经唾液酸的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060270048A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-30 Dwek Raymond A Automated strategy for identifying physiological glycosylation marker(s)
WO2009126564A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Bayer Healthcare Llc Methods of recombinant production of glycoproteins

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5570677B2 (ja) * 2002-04-25 2014-08-13 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療
ES2214166T1 (es) * 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
JP2008539413A (ja) * 2005-04-26 2008-11-13 レイモンド， エー． ドウェック， 自動化糖鎖フィンガープリント戦略
US20110086362A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Massachusetts Institute Of Technology High-Throughput Method for Quantifying Sialylation of Glycoproteins
ES2675511T3 (es) * 2011-07-14 2018-07-11 Grifols, S.A. Análisis rápido y preciso de la sialilación de proteínas

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060270048A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-30 Dwek Raymond A Automated strategy for identifying physiological glycosylation marker(s)
WO2009126564A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Bayer Healthcare Llc Methods of recombinant production of glycoproteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anal. Chem. 1998, Vol. 70, pp 455-463. *
Chembiochem. 2007, Vol. 8, pp 194-201. *

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