JP6579515B2 - アポｅ含有ｈｄｌの測定方法及び測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）の一種であるアポＥ含有ＨＤＬの測定方法及び測定装置に関する。

従来、健康診断で行われている血液検査では、高ＬＤＬ（Low Density Lipoprotein）コレステロール血症、低ＨＤＬ（High Density Lipoprotein）コレステロール血症、高トリグリセライド血症をそれぞれの基準値に基づいて診断し、動脈硬化の指標として利用している。

このうち、ＨＤＬは、粒子径が７〜18nm程度のリポ蛋白質の総称であって、粒子径の大きい方からＨＤＬ２、ＨＤＬ３、プレβＨＤＬ等に分類されている。

近年、ＨＤＬの中でも、アポＥ含有ＨＤＬが動脈の弾性維持に関与しているとする研究が報告されており（例えば、非特許文献１参照。）、また、その他の研究からもアポＥ含有ＨＤＬが注目されている。

アポＥ含有ＨＤＬの測定方法としては、超遠心法とヘパリンカラムクロマトグラフィを組み合わせた方法（例えば、非特許文献２参照。）や、２種類の沈殿法を組み合わせた方法（例えば、非特許文献３参照。）が知られている。

Devashish Kothapalli, et al. Cell Reports 2, 1259_1271, November 29, 2012 Wilson HM, et al. Clin Chim Acta. 1993;220(2):175-87 Chiba H, et al. Biochem Med Metab Biol. 1992;47(1):31-7

超遠心法とヘパリンカラムクロマトグラフィを組み合わせた方法では、超遠心法での処理時間として数時間〜数十時間の比較的長時間の処理が必要であり、しかも、超遠心法で処理を行ったとしても、アポＥ含有ＨＤＬの比重が、ＬＤＬや他のＨＤＬの比重と一部重なるために、完全な分離が困難であることから測定精度の低下が生じやすいことが知られていた。また、超遠心法での処理中に、アポＥ含有ＨＤＬにおいてＨＤＬ粒子からのアポＥの乖離が生じることも知られており、アポＥ含有ＨＤＬを正確に測定することが困難であった。

また、２種類の沈殿法を組み合わせた方法では、一般的に第一段階としてポリエチレングリコール法による沈殿を行い、第二段階としてリンタングステン酸−デキストラン硫酸−Mg法による沈殿を行うが、自動化が極めて困難であり、しかも、測定に必要となるサンプル量が最低でも400μＬ以上であり、臨床検査として実施することが実質的には不可能であった。

本発明者らはこのような現状に鑑み、血清中のアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を簡便かつ正確に測定可能とする方法を研究開発する中で、本発明を成すに至ったものである。

本発明のアポＥ含有ＨＤＬの測定方法は、被検体である血清を、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに順次送流させ、ヘパリンアフィニティカラムから流出した流出液に試薬を混合して混合液を作成し、この混合液に所定波長の光を照射して得たクロマトグラムから血清中のアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定する方法であって、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに送流させる緩衝液のイオン濃度を調整して、血清中からアポＥを含有しないＨＤＬを分離してアポＥ含有ＨＤＬよりも先にヘパリンアフィニティカラムから流出させるとともに、血清中のＨＤＬ以外のリポ蛋白質をアポＥ含有ＨＤＬよりも後にヘパリンアフィニティカラムから流出させるものである。

特に、本発明のアポＥ含有ＨＤＬの測定方法では、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに酢酸マグネシウムを含有する緩衝液を送給して、陽イオン交換カラムにＨＤＬ以外のリポ蛋白質を吸着させるとともにヘパリンアフィニティカラムにアポＥ含有ＨＤＬを吸着させる第1ステップと、この第１ステップの後に、ヘパリンアフィニティカラムに酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を送給して、ヘパリンアフィニティカラムで吸着したアポＥ含有ＨＤＬを溶出させる第２ステップと、この第２ステップの後に、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに酢酸マグネシウムを含有する緩衝液を送給する第３ステップと、この第３ステップの後に、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を送給して、陽イオン交換カラムで吸着したＨＤＬ以外のリポ蛋白質を溶出させる第４ステップと有するものである。

また、本発明のアポＥ含有ＨＤＬの測定装置では、被検体である血清を緩衝液とともに送給するサンプル供給器と、このサンプル供給器から送給された血清を送流させる陽イオン交換カラムと、この陽イオン交換カラムから流出した第１流出液を送流させるヘパリンアフィニティカラムと、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムとの間に設けて、ヘパリンアフィニティカラムに向けて補助緩衝液を送給する緩衝液供給器と、ヘパリンアフィニティカラムから流出した第２流出液に試薬を混合して混合液を作成する混合器と、混合器から送給された混合液に所定波長の光を照射してクロマトグラムを得るディテクタとを備えた装置であって、サンプル供給器には、酢酸マグネシウムを含有する第１の緩衝液を送給する第１のポンプと、酢酸ナトリウムを含有する第２の緩衝液を送給する第２のポンプを設け、緩衝液供給器には、酢酸マグネシウムを含有する第３の緩衝液を送給する第３のポンプと、前記第２の緩衝液を送給する第４のポンプを設け、第３の緩衝液は、第１の緩衝液よりも酢酸マグネシウムの濃度を高くするとともに、第１〜４のポンプの駆動制御を行って、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに送給する緩衝液のイオン濃度を調整しているものである。

さらに、本発明のアポＥ含有ＨＤＬの測定装置では、第２の緩衝液には界面活性剤を添加して、アポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定するとともに、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムをそれぞれ浄化していることにも特徴を有するものである。

本発明のアポＥ含有ＨＤＬの測定方法及び測定装置によれば、血清からそのままアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定できるので、測定のための準備の手間が極めて簡便であり、しかも極めて短時間で、かつ自動的に測定できる。そのうえ、測定に必要となる血清の量が５μＬ程度と極めて微量でよく、動物実験の血液サンプルの測定にも利用できる。

本実施形態のアポＥ含有ＨＤＬの測定装置の概略模式図である。 本実施形態のアポＥ含有ＨＤＬの測定装置で得られるクロマトグラムの一例である。 第１〜４ポンプによる各緩衝液の送給状態を示すタイミングチャートである。

本発明のアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量の測定方法及び測定装置は、血清に対する液体クロマトグラフィによって血清中のアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定するものである。特に、本発明の測定方法及び測定装置では、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムの２種類のカラムを用い、陽イオン交換カラムの下流側にヘパリンアフィニティカラムを接続しているものである。

さらに、本発明の測定方法及び測定装置では、それぞれのカラムに送給する緩衝液を調整することで、アポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定可能としている。

以下において、図面を示しながら、本発明の具体的な実施形態を説明する。

図１は、本実施形態のアポＥ含有ＨＤＬの測定装置の概略模式図である。測定装置は、緩衝液とともに血清を送給するサンプル供給器10と、サンプル供給器10から送給された血清を送流させる陽イオン交換カラム20と、陽イオン交換カラム20から流出した第１流出液を送流させるヘパリンアフィニティカラム30と、ヘパリンアフィニティカラム30から流出した第２流出液に試薬を混合して混合液を作成する混合器40と、混合器40から送給された混合液に所定波長の光を照射してクロマトグラムを得るディテクタ50とを備えている。

サンプル供給器10と陽イオン交換カラム20とは第１配管61で連通連結し、陽イオン交換カラム20とヘパリンアフィニティカラム30とは第２配管62で連通連結し、ヘパリンアフィニティカラム30と混合器40とは第３配管63で連通連結し、混合器40とディテクタ50とは第４配管64で連通連結することで、サンプル供給器10から緩衝液とともに血清を順次送給可能としている。図１中、符号65は廃液配管であって、ディテクタ50から送出された廃液を廃液タンク70に導いている。

さらに、測定装置には、第２配管62の中途部から補助緩衝液を供給する緩衝液供給器80を設けている。

サンプル供給器10は、第１緩衝液の供給にともなって検査対象の血清を所定量ずつ流出させるオートサンプラー11と、第１タンクB1に貯留された第１緩衝液をオートサンプラー11に送給する第１ポンプP1と、オートサンプラー11に第１緩衝液の代わりに第２タンクB2に貯留された第２緩衝液を送給する第２ポンプP2とで構成している。特に、第１ポンプP1を介して第１タンクB1からオートサンプラー11に第１緩衝液を送給する配管の中途部に、第２ポンプP2の下流側の配管を接続することで、オートサンプラー11に第２緩衝液を送給可能としている。

オートサンプラー11は、検査対象の血清を複数保持可能として、検査対象の血清を順次送給することで、連続的に測定可能としている。

緩衝液供給器80は、第３タンクB3に貯留された第３緩衝液を第２配管62に送給する第３ポンプP3と、第２タンクB2に貯留された第２緩衝液を第２配管62に送給する第４ポンプP4とを備えており、第２配管62を介して第３緩衝液または第２緩衝液を補助緩衝液としてヘパリンアフィニティカラム30に送給することとしている。

本実施形態では、サンプル供給器10における第２タンクB2と、緩衝液供給器80における第２タンクB2とを共用することとしているが、それぞれ別々のタンクとして、第２緩衝液を各々送給可能としてもよい。

混合器40は、試薬タンクＲに貯留された試薬を第３配管63に注入する第５ポンプP5と、第３配管63に注入された試薬と第３配管63内の第２流出液とを混合するリアクタ41とを備えている。リアクタ41は、本実施形態では、比較的長尺な流路として形成しており、リアクタ41内を通過する間に、試薬と第２流出液とを十分に混合させて、第２流出液中のコレステロールと試薬とを確実に反応させることとしている。そのため、本実施形態では、試薬と第２流出液とを混合した混合液は、約４分程度をかけてリアクタ41を通過させることとしている。

ディテクタ50は、混合液に波長555nmの光を照射して図２に示すようなクロマトパターンを得ることとしている。

図示していないが、オートサンプラー11、第１ポンプP1、第２ポンプP2、第３ポンプP3、第４ポンプP4、第５ポンプP5及びディテクタ50は、それぞれ制御部と接続しており、制御部からの制御信号に基づいて所定の動作を実行することとしている。

第１タンクB1に貯留された第１緩衝液は、10mMのＭＯＰＳと、5mMの酢酸マグネシウムを含む水溶液であって、pH7.2としている。

第２タンクB2に貯留された第２緩衝液は、10mMのＭＯＰＳと、1.0Mの酢酸ナトリウムと、0.01%の非イオン性界面活性剤を含む水溶液であって、pH7.2としている。第２の緩衝液には界面活性剤を添加しておくことで、この界面活性剤の作用により陽イオン交換カラム20及びヘパリンアフィニティカラム30をそれぞれ浄化可能としている。

第３タンクB3に貯留された第３緩衝液は、10mMのＭＯＰＳと、0.1Mの酢酸マグネシウムを含む水溶液であって、pH7.2としている。

試薬タンクＲに貯留された試薬は、コレステロール発色試薬である酵素試薬であって、リアクタ41において37℃でオンライン反応させている。

第１〜４ポンプP1〜P4は、図３に示すタイミングチャートに基づいて各々駆動させている。なお、オートサンプラー11からは５μＬの血清が送出されることとしている。また、ヘパリンアフィニティカラム30における流量が、1.0mL/minとなるように調整している。

図３に示すように、０分から４分までの第１区間では、第１ポンプP1で送給される第１緩衝液の送給量を80%とし、第３ポンプP3で送給される第３緩衝液の送給量を20%としている。ここで、80%あるいは20%という送給量は、その時点でヘパリンアフィニティカラム30を通過している緩衝液の配合割合を示しており、各ポンプP1,P3の稼働率を示すものではない。以下の説明においても同じである。

０分から４分までの第１区間では、陽イオン交換カラム20にＨＤＬ以外のリポ蛋白質の吸着を促すとともに、ヘパリンアフィニティカラム30へのアポＥ含有ＨＤＬの吸着を促している。これが第１ステップである。アポＥを含有しないＨＤＬは陽イオン交換カラム20及びヘパリンアフィニティカラム30には吸着しないので、図２のクロマトパターンに示すように、アポＥを含有しないＨＤＬによるピークが生じる。このピークを「第１ピーク」と呼ぶこととする。第１ピークが図２のクロマトパターンに示すように４分から７分あたりで現れるのは、リアクタ41の通過に約４分程度を要しているからである。

４分から６分までの第２区間では、第４ポンプP4で送給される第２緩衝液の送給量を100%としている。

４分から６分までの第２区間では、第２緩衝液を送流させることで、ヘパリンアフィニティカラム30に吸着されたアポＥ含有ＨＤＬを溶出させている。これが第２ステップである。したがって、図２のクロマトパターンに示すように、アポＥ含有ＨＤＬによるピークが生じる。このピークを「第２ピーク」と呼ぶこととする。第２ピークも、リアクタ41の影響により図２のクロマトパターンに示すように８分から１０分あたりで現れる。

６分から７分までの第３区間では、第１ポンプP1で送給される第１緩衝液の送給量を100%としている。これが第３ステップである。

さらに、７分から１１分までの第４区間では、第２ポンプP2で送給される第２緩衝液の送給量を100%としている。

７分から１１分までの第４区間では、陽イオン交換カラム20に吸着されたＨＤＬ以外のリポ蛋白質を溶出させている。これが第４ステップである。したがって、図２のクロマトパターンに示すように、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質によるピークが生じる。このピークを「第３ピーク」と呼ぶこととする。第３ピークも、リアクタ41の影響により図２のクロマトパターンに示すように１１分過ぎから現れる。

なお、図２のクロマトパターンに示すように、第４区間中の１０分から１１分のあたりで、第１〜３ピークよりも小さい極小のピークが現れる。この極小のピークは、第３ピークによるＨＤＬ以外のリポ蛋白質のコレステロール量の測定に対するアーチファクトである。そこで、第３区間において第１緩衝液を送流させることで、この極小のピークが第３ピークと重なることを回避し、リポ蛋白質のコレステロール量を正確に測定可能としている。

１１分から１６分までの第５区間では、第１ポンプP1で送給される第１緩衝液の送給量を80%とし、第３ポンプP3で送給される第３緩衝液の送給量を20%としている。

１１分から１６分までの第５区間は、陽イオン交換カラム20及びヘパリンアフィニティカラム30を初期状態に戻す復帰処理区間としており、これによりオートサンプラー11によって次ぎのサンプル注入が可能となる。

このように、タイミングに応じて送流させる緩衝液のマグネシウムイオン、ナトリウムイオン、及び酢酸イオン等のイオン濃度を調整することで、アポＥを含有しないＨＤＬ、アポＥ含有ＨＤＬ、及び血清中のＨＤＬ以外のリポ蛋白をヘパリンアフィニティカラムから流出させるタイミングを調整でき、第１ピーク、第２ピーク、第３ピークの３つのピークを有するクロマトパターンを得ることができる。なお、マグネシウムイオンの代わりにカルシウムイオン等の２価の陽イオンを用いてもよく、また、酢酸イオンの代わりに塩化物イオン等を用いてもよく、濃度や送流時間を適宜調整することで、同様の３つのピークを有するクロマトパターンを得ることができる。

そして、第２ピークの面積から、アポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定できる。このように、血清からそのままアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定できるので、測定のための準備の手間が極めて簡便であり、しかも極めて短時間で、かつ自動的に測定できる。そのうえ、測定に必要となる血清の量が５μＬ程度と極めて微量でよく、動物実験の血液サンプルの測定にも利用できる。

さらに、第１ピークの面積からアポＥを含有しないＨＤＬのコレステロール量を測定でき、第１ピークと第２ピークの面積の総和からＨＤＬのコレステロール量を測定でき、第３ピークの面積から血清中のＨＤＬ以外のリポ蛋白のコレステロール量を測定でき、第１ピークと第２ピークと第３ピークの面積の総和から総コレステロール量を測定できる。

なお、今回の測定方法で、クロマトパターンの第２ピークがアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量に対応していることは、血清から分離したＨＤＬ分画を用いて、本発明の測定装置におけるヘパリンアフィニティカラム30からの溶出液を0.4分間隔でフレクションコレクターにて分取し、分取フラクションに含まれるアポＥ濃度はサンドイッチELISA法で測定することで確認している。

10 サンプル供給器
11 オートサンプラー
20 陽イオン交換カラム
30 ヘパリンアフィニティカラム
40 混合器
41 リアクタ
50 ディテクタ
61 第１配管
62 第２配管
63 第３配管
64 第４配管
65 廃液配管
70 廃液タンク
80 緩衝液供給器
P1 第１ポンプ
P2 第２ポンプ
P3 第３ポンプ
P4 第４ポンプ
P5 第５ポンプ
B1 第１タンク
B2 第２タンク
B3 第３タンク
Ｒ 試薬タンク

Claims (4)

1. 被検体である血清を、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに順次送流させ、ヘパリンアフィニティカラムから流出した流出液に試薬を混合して混合液を作成し、この混合液に所定波長の光を照射して得たクロマトグラムから血清中のアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定する方法において、
   陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに酢酸マグネシウムを含有する緩衝液を送給して、陽イオン交換カラムにＨＤＬ以外のリポ蛋白質を吸着させるとともにヘパリンアフィニティカラムにアポＥ含有ＨＤＬを吸着させる第1ステップと、
   この第１ステップの後に、ヘパリンアフィニティカラムに酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を送給して、ヘパリンアフィニティカラムで吸着したアポＥ含有ＨＤＬを溶出させる第２ステップと、
   この第２ステップの後に、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに酢酸マグネシウムを含有する緩衝液を送給する第３ステップと、
   この第３ステップの後に陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を送給して、陽イオン交換カラムで吸着したＨＤＬ以外のリポ蛋白質を溶出させる第４ステップとにより、
   陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに送流させる緩衝液のイオン濃度を調整して、血清中からアポＥを含有しないＨＤＬを分離してアポＥ含有ＨＤＬよりも先にヘパリンアフィニティカラムから流出させるとともに、血清中のＨＤＬ以外のリポ蛋白質をアポＥ含有ＨＤＬよりも後にヘパリンアフィニティカラムから流出させるアポＥ含有ＨＤＬの測定方法。
2. 酢酸ナトリウムを含有する緩衝液に界面活性剤を添加している請求項１に記載のアポＥ含有ＨＤＬの測定方法。
3. 被検体である血清を緩衝液とともに送給するサンプル供給器と、
   このサンプル供給器から送給された血清を送流させる陽イオン交換カラムと、
   この陽イオン交換カラムから流出した第１流出液を送流させるヘパリンアフィニティカラムと、
   陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムとの間に設けて、ヘパリンアフィニティカラムに向けて補助緩衝液を送給する緩衝液供給器と、
   ヘパリンアフィニティカラムから流出した第２流出液に試薬を混合して混合液を作成する混合器と、
   混合器から送給された混合液に所定波長の光を照射してクロマトグラムを得るディテクタと
   を備えた血清中のアポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定する装置において、
   サンプル供給器には、酢酸マグネシウムを含有する第１の緩衝液を送給する第１のポンプと、酢酸ナトリウムを含有する第２の緩衝液を送給する第２のポンプを設け、
   緩衝液供給器には、酢酸マグネシウムを含有する第３の緩衝液を送給する第３のポンプと、前記第２の緩衝液を送給する第４のポンプを設け、
   第３の緩衝液は、第１の緩衝液よりも酢酸マグネシウムの濃度を高くするとともに、第１〜４のポンプの駆動制御を行って、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムに送給する緩衝液のイオン濃度を調整しているアポＥ含有ＨＤＬの測定装置。
4. 第２の緩衝液には界面活性剤を添加して、アポＥ含有ＨＤＬのコレステロール量を測定するとともに、陽イオン交換カラムとヘパリンアフィニティカラムをそれぞれ浄化している請求項３に記載のアポＥ含有ＨＤＬの測定装置。