JPH05113440A - 糖化ヘモグロビンの分析方法 - Google Patents
糖化ヘモグロビンの分析方法Info
- Publication number
- JPH05113440A JPH05113440A JP11242891A JP11242891A JPH05113440A JP H05113440 A JPH05113440 A JP H05113440A JP 11242891 A JP11242891 A JP 11242891A JP 11242891 A JP11242891 A JP 11242891A JP H05113440 A JPH05113440 A JP H05113440A
- Authority
- JP
- Japan
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- exchange group
- glycated hemoglobin
- hemoglobin
- cation exchange
- column
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- Pending
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 血液中の糖化ヘモグロビンを非糖化ヘモグロ
ビンと分離して糖尿病の診断や糖尿病患者の経過観察の
最適な指標とされている糖化ヘモグロビンを効率良く分
析できる方法を提供する。 【構成】 陽イオン交換基とホウ酸交換基とを有する充
填剤又は陽イオン交換基を有する充填剤とホウ酸交換基
を有する充填剤の混合物をカラムに充填し、第１液、第
２液、第３液を準じ流し、まず糖化ヘモグロビンと非糖
化ヘモグロビンとを陽イオン交換基に吸着させ、次いで
糖化ヘモグロビンをホウ酸イオン交換基に吸着させた
後、ホウ酸イオン交換基から糖化ヘモグロビンを溶離し
て分離する。
ビンと分離して糖尿病の診断や糖尿病患者の経過観察の
最適な指標とされている糖化ヘモグロビンを効率良く分
析できる方法を提供する。 【構成】 陽イオン交換基とホウ酸交換基とを有する充
填剤又は陽イオン交換基を有する充填剤とホウ酸交換基
を有する充填剤の混合物をカラムに充填し、第１液、第
２液、第３液を準じ流し、まず糖化ヘモグロビンと非糖
化ヘモグロビンとを陽イオン交換基に吸着させ、次いで
糖化ヘモグロビンをホウ酸イオン交換基に吸着させた
後、ホウ酸イオン交換基から糖化ヘモグロビンを溶離し
て分離する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は糖尿病の診断や糖尿病患
者の経過観察の指標となる糖化ヘモグロビンの分析方法
に関する。
者の経過観察の指標となる糖化ヘモグロビンの分析方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】糖化ヘ
モグロビンとは血液中の糖がその濃度に比例して非酵素
的にヘモグロビンと結合して生成したものであり、その
濃度は過去１〜２ケ月の血液中の平均的な糖濃度を反映
すると言われている。そして血糖値や尿糖値に比べ生理
的要因に左右されにくいということもあり、糖尿病の診
断或いは糖尿病患者の経過観察の最適な指標として広く
使用されている。
モグロビンとは血液中の糖がその濃度に比例して非酵素
的にヘモグロビンと結合して生成したものであり、その
濃度は過去１〜２ケ月の血液中の平均的な糖濃度を反映
すると言われている。そして血糖値や尿糖値に比べ生理
的要因に左右されにくいということもあり、糖尿病の診
断或いは糖尿病患者の経過観察の最適な指標として広く
使用されている。
【０００３】従来、血液中の糖化ヘモグロビンを分析す
る方法としてイオン交換ゲルやホウ酸ゲルを用いたミニ
カラム法が知られている。しかしながらイオン交換ゲル
を用いたミニカラム法の場合、糖化ヘモグロビンのＡ1
分画に、非糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＦが含
まれてしまい、このためＡ1 分画を更に細分画してヘモ
グロビンＦを分離する必要があるが、ヘモグロビンＦは
糖化ヘモグロビンとイオン強度が近似しているためＡ1
分画を迅速かつ正確に細分画することは困難であった。
またホウ酸ゲルを用いたミニカラム法では、糖化ヘモグ
ロビンの吸光光度分析の測定波長である４１５nm付近に
吸収を有するポルフィリンの分離が困難であるため測定
誤差が大きくなり、また他の糖蛋白質、糖類や、溶血の
目的でサンプル中に添加される各種の界面活性剤の影響
で糖化ヘモグロビンとホウ酸ゲルとの相互作用が弱めら
れ、この結果測定に時間を要する問題があった。を固定
相として用いたミニカラム法や高速液体クロマトグラフ
ィー法等が知られている。
る方法としてイオン交換ゲルやホウ酸ゲルを用いたミニ
カラム法が知られている。しかしながらイオン交換ゲル
を用いたミニカラム法の場合、糖化ヘモグロビンのＡ1
分画に、非糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＦが含
まれてしまい、このためＡ1 分画を更に細分画してヘモ
グロビンＦを分離する必要があるが、ヘモグロビンＦは
糖化ヘモグロビンとイオン強度が近似しているためＡ1
分画を迅速かつ正確に細分画することは困難であった。
またホウ酸ゲルを用いたミニカラム法では、糖化ヘモグ
ロビンの吸光光度分析の測定波長である４１５nm付近に
吸収を有するポルフィリンの分離が困難であるため測定
誤差が大きくなり、また他の糖蛋白質、糖類や、溶血の
目的でサンプル中に添加される各種の界面活性剤の影響
で糖化ヘモグロビンとホウ酸ゲルとの相互作用が弱めら
れ、この結果測定に時間を要する問題があった。を固定
相として用いたミニカラム法や高速液体クロマトグラフ
ィー法等が知られている。
【０００４】ミニカラム法は非常に簡単な設備によって
分離分析を行うことの便利な方法であるが、ミニカラム
法による血液中の糖化ヘモグロビンの分離分析には上記
の如き問題があるため、現在では分離能力の高い高速液
体クロマトグラフィー法が広く使用されている。この方
法では血液中の糖化ヘモグロビンを迅速に分離分析する
ことができるが、高価な分析装置を必要とするため、ミ
ニカラム法のような簡単な設備によっても容易に糖化ヘ
モグロビンを分離分析できる方法の開発が望まれてい
た。本発明は上記従来技術の問題点に鑑みなされたもの
で、高速液体クロマトグラフィー法はもとより、ミニカ
ラム法によっても容易に血液中の糖化ヘモグロビンを分
離分析することのできる糖化ヘモグロビンの分析方法を
提供することを目的とする。
分離分析を行うことの便利な方法であるが、ミニカラム
法による血液中の糖化ヘモグロビンの分離分析には上記
の如き問題があるため、現在では分離能力の高い高速液
体クロマトグラフィー法が広く使用されている。この方
法では血液中の糖化ヘモグロビンを迅速に分離分析する
ことができるが、高価な分析装置を必要とするため、ミ
ニカラム法のような簡単な設備によっても容易に糖化ヘ
モグロビンを分離分析できる方法の開発が望まれてい
た。本発明は上記従来技術の問題点に鑑みなされたもの
で、高速液体クロマトグラフィー法はもとより、ミニカ
ラム法によっても容易に血液中の糖化ヘモグロビンを分
離分析することのできる糖化ヘモグロビンの分析方法を
提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】即ち本発明の糖化ヘモグ
ロビンの分析方法は、陽イオン交換基とホウ酸交換基の
両方を有する充填剤または陽イオン交換基を有する充填
剤とホウ酸交換基を有する充填剤の混合物を充填したカ
ラムに、第１液を流して試料中の糖化ヘモグロビン及び
非糖化ヘモグロビンを充填剤の陽イオン交換基に吸着さ
せ、次いで第２液をカラムに流して陽イオン交換基に吸
着されている糖化ヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビン
を溶離して、非糖化ヘモグロビンを溶出するとともに、
糖化ヘモグロビンを充填剤のホウ酸交換基に吸着させ、
しかる後、第３液をカラムに流して糖化ヘモグロビンを
溶出させて分析することを特徴とする。
ロビンの分析方法は、陽イオン交換基とホウ酸交換基の
両方を有する充填剤または陽イオン交換基を有する充填
剤とホウ酸交換基を有する充填剤の混合物を充填したカ
ラムに、第１液を流して試料中の糖化ヘモグロビン及び
非糖化ヘモグロビンを充填剤の陽イオン交換基に吸着さ
せ、次いで第２液をカラムに流して陽イオン交換基に吸
着されている糖化ヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビン
を溶離して、非糖化ヘモグロビンを溶出するとともに、
糖化ヘモグロビンを充填剤のホウ酸交換基に吸着させ、
しかる後、第３液をカラムに流して糖化ヘモグロビンを
溶出させて分析することを特徴とする。
【０００６】このようにホウ酸交換基を有する充填剤を
使用することにより、ヘモグロビンＦを含むことなく糖
化ヘモグロビンを迅速に分画でき、また糖化ヘモグロビ
ンを一旦陽イオン交換基を有する充填剤に吸着させ、次
いでホウ酸交換基を有する充填剤に吸着させることによ
り、ポルフィリン等の如く、４１５nm付近に吸収を有す
るヘモグロビン以外の物質の影響や、溶血剤としてサン
プルに添加される界面活性剤の影響も受けることなく迅
速且つ正確に糖化ヘモグロビンを分離分析できる。
使用することにより、ヘモグロビンＦを含むことなく糖
化ヘモグロビンを迅速に分画でき、また糖化ヘモグロビ
ンを一旦陽イオン交換基を有する充填剤に吸着させ、次
いでホウ酸交換基を有する充填剤に吸着させることによ
り、ポルフィリン等の如く、４１５nm付近に吸収を有す
るヘモグロビン以外の物質の影響や、溶血剤としてサン
プルに添加される界面活性剤の影響も受けることなく迅
速且つ正確に糖化ヘモグロビンを分離分析できる。
【０００７】本発明においてカラムに充填して用いる充
填剤としては、陽イオン交換基とホウ酸交換基の両方を
有する充填剤を用いることができ、この充填剤は例えば
ポリビニル系樹脂、シリカ系ゲル、デキストラン樹脂等
に、陽イオン交換基とホウ酸交換基の両方を同時に結合
させたもの等を用いることができる。また上記ポリビニ
ル系樹脂、シリカ系ゲル、デキストラン樹脂等に陽イオ
ン交換基のみを結合させた充填剤と、ホウ酸交換基のみ
を結合させた充填剤とを混合して用いることもできる。
これらのうち、陽イオン交換基とホウ酸交換基の両方を
有する充填剤を用いた場合には、陽イオン交換基を有す
る充填剤と、ホウ酸基を有する充填剤を混合して充填す
る場合に比べて充填の手間が少なくて済むため好まし
い。陽イオン交換基の種類は特に限定されないが、例え
ばスルホキシプロピル基やカルボキシメチル基、グルタ
ミン酸基等が挙げられる。カラムに充填する充填剤中の
陽イオン交換基とホウ酸基との割合は、陽イオン交換基
の種類によっても異なるが、例えば陽イオン交換基がカ
ルボキシル基の場合、１：１程度が好ましい。これらの
充填剤を充填するカラムとしては、液体クロマトグラフ
ィー用カラム、ミニカラム法用のオープンタイプのカラ
ム等を用いることができる。また充填剤の粒径は、使用
する分析手段によっても異なるが、例えば液体クロマト
グラフィー法を使用する場合には、３〜１０μｍ程度、
ミニカラム法を使用する場合には、２０〜１００μｍ程
度のものが好ましい。
填剤としては、陽イオン交換基とホウ酸交換基の両方を
有する充填剤を用いることができ、この充填剤は例えば
ポリビニル系樹脂、シリカ系ゲル、デキストラン樹脂等
に、陽イオン交換基とホウ酸交換基の両方を同時に結合
させたもの等を用いることができる。また上記ポリビニ
ル系樹脂、シリカ系ゲル、デキストラン樹脂等に陽イオ
ン交換基のみを結合させた充填剤と、ホウ酸交換基のみ
を結合させた充填剤とを混合して用いることもできる。
これらのうち、陽イオン交換基とホウ酸交換基の両方を
有する充填剤を用いた場合には、陽イオン交換基を有す
る充填剤と、ホウ酸基を有する充填剤を混合して充填す
る場合に比べて充填の手間が少なくて済むため好まし
い。陽イオン交換基の種類は特に限定されないが、例え
ばスルホキシプロピル基やカルボキシメチル基、グルタ
ミン酸基等が挙げられる。カラムに充填する充填剤中の
陽イオン交換基とホウ酸基との割合は、陽イオン交換基
の種類によっても異なるが、例えば陽イオン交換基がカ
ルボキシル基の場合、１：１程度が好ましい。これらの
充填剤を充填するカラムとしては、液体クロマトグラフ
ィー用カラム、ミニカラム法用のオープンタイプのカラ
ム等を用いることができる。また充填剤の粒径は、使用
する分析手段によっても異なるが、例えば液体クロマト
グラフィー法を使用する場合には、３〜１０μｍ程度、
ミニカラム法を使用する場合には、２０〜１００μｍ程
度のものが好ましい。
【０００８】本発明において、第１液としては陽イオン
交換基に糖化ヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビンを吸
着させ得るものであれば特に限定されないが、例えばpH
5.５〜6.５のイオン強度５〜２０ｍＭのリン酸緩衝液や
酢酸緩衝液等が挙げられる。また第２液としては陽イオ
ン交換基に吸着されている糖化ヘモグロビン及び非糖化
ヘモグロビンを溶離して非糖化ヘモグロビンはホウ酸交
換基に吸着させることなく溶出し、糖化ヘモグロビンは
ホウ酸交換基に吸着させ得るものであれば特に限定され
ない。このような第２液としては、例えばpH７〜８のイ
オン強度５〜２０ｍＭのリン酸緩衝液や酢酸緩衝液等が
挙げられる。更にこれら第２液中にアルカリ土類金属塩
であるMgCl2 、CaCl2 等を１０〜５０ｍＭ程度添加する
と、ホウ酸交換基に対する糖化ヘモグロビンの吸着力が
高まり好ましい。第３液としては、糖化ヘモグロビンを
ホウ酸交換基から溶離できるものであれば特に限定され
ないが、例えば１００ｍＭ酢酸溶液や、３００ｍＭソル
ビトール溶液等を用いることができる。
交換基に糖化ヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビンを吸
着させ得るものであれば特に限定されないが、例えばpH
5.５〜6.５のイオン強度５〜２０ｍＭのリン酸緩衝液や
酢酸緩衝液等が挙げられる。また第２液としては陽イオ
ン交換基に吸着されている糖化ヘモグロビン及び非糖化
ヘモグロビンを溶離して非糖化ヘモグロビンはホウ酸交
換基に吸着させることなく溶出し、糖化ヘモグロビンは
ホウ酸交換基に吸着させ得るものであれば特に限定され
ない。このような第２液としては、例えばpH７〜８のイ
オン強度５〜２０ｍＭのリン酸緩衝液や酢酸緩衝液等が
挙げられる。更にこれら第２液中にアルカリ土類金属塩
であるMgCl2 、CaCl2 等を１０〜５０ｍＭ程度添加する
と、ホウ酸交換基に対する糖化ヘモグロビンの吸着力が
高まり好ましい。第３液としては、糖化ヘモグロビンを
ホウ酸交換基から溶離できるものであれば特に限定され
ないが、例えば１００ｍＭ酢酸溶液や、３００ｍＭソル
ビトール溶液等を用いることができる。
【０００９】本発明方法において上記充填剤を充填した
カラム及び上記第１、第２、第３液を用いて糖化ヘモグ
ロビンを分離するには、高速液体クロマトグラフィー
法、ミニカラム法、ミニカラム法等が採用されるが、高
速液体クロマトグラフィー法の場合もミニカラム法の場
合も、第１、第２、第３液を１〜２ミリリットル／分の
速度で流すことが好ましい。
カラム及び上記第１、第２、第３液を用いて糖化ヘモグ
ロビンを分離するには、高速液体クロマトグラフィー
法、ミニカラム法、ミニカラム法等が採用されるが、高
速液体クロマトグラフィー法の場合もミニカラム法の場
合も、第１、第２、第３液を１〜２ミリリットル／分の
速度で流すことが好ましい。
【００１０】糖化ヘモグロビンの検出には吸光光度計を
用い、測定波長４００〜４３０nmで測定すれば良い。特
に好ましい測定波長は４１５nmである。高速液体クロマ
トグラフィー法の場合にはフロータイプの吸光光度計が
用いられ、ミニカラム法の場合にはセルタイプの吸光光
度計が用いられる。
用い、測定波長４００〜４３０nmで測定すれば良い。特
に好ましい測定波長は４１５nmである。高速液体クロマ
トグラフィー法の場合にはフロータイプの吸光光度計が
用いられ、ミニカラム法の場合にはセルタイプの吸光光
度計が用いられる。
【００１１】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。
明する。
【００１２】実施例１ 抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を
添加して採血した新鮮血（試料No１〜８）に、溶血剤Ａ
（東ソー（株）製）にて１０倍に希釈したものを試料と
し、１回の測定に３０マイクロリットルを使用した。分
離用のカラムは、内径１cmのオープンタイプのカートリ
ッジカラムに、ホウ酸交換基を有する充填剤としてＴＳ
Ｋｇｅｌホウ酸トヨパール６５０（東ソー（株）製）と
ＴＳＫｇｅｌＳＰ−トヨパール６５０（東ソー（株）
製）を予め１対１に混合したもの、0.５ミリリットルを
充填して用いた。第１液として５ｍＭリン酸緩衝液pH6.
０を、第２液として２５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５０
ｍＭ塩化マグネシウム混合液pH8.０を、第３液として５
０ｍＭ酢酸溶液を用い、これらを順次それぞれ2.５ミリ
リットルずつカラムに滴下したところ、糖化ヘモグロビ
ンは第３液中に分離された。カラムから滴下した第２液
と第３液を、それぞれ試験管に受け、これらの４１５nm
における吸光度を吸光光度計により測定し、第２液の吸
光度：Ａ2 、第３液の吸光度：Ａ3 から、下記数式１に
より糖化ヘモグロビン量を算出した。第３液の滴下終了
までに要した時間は、略３分であり、非常に短時間で糖
化ヘモグロビンを確実に分離分析することができた。
添加して採血した新鮮血（試料No１〜８）に、溶血剤Ａ
（東ソー（株）製）にて１０倍に希釈したものを試料と
し、１回の測定に３０マイクロリットルを使用した。分
離用のカラムは、内径１cmのオープンタイプのカートリ
ッジカラムに、ホウ酸交換基を有する充填剤としてＴＳ
Ｋｇｅｌホウ酸トヨパール６５０（東ソー（株）製）と
ＴＳＫｇｅｌＳＰ−トヨパール６５０（東ソー（株）
製）を予め１対１に混合したもの、0.５ミリリットルを
充填して用いた。第１液として５ｍＭリン酸緩衝液pH6.
０を、第２液として２５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５０
ｍＭ塩化マグネシウム混合液pH8.０を、第３液として５
０ｍＭ酢酸溶液を用い、これらを順次それぞれ2.５ミリ
リットルずつカラムに滴下したところ、糖化ヘモグロビ
ンは第３液中に分離された。カラムから滴下した第２液
と第３液を、それぞれ試験管に受け、これらの４１５nm
における吸光度を吸光光度計により測定し、第２液の吸
光度：Ａ2 、第３液の吸光度：Ａ3 から、下記数式１に
より糖化ヘモグロビン量を算出した。第３液の滴下終了
までに要した時間は、略３分であり、非常に短時間で糖
化ヘモグロビンを確実に分離分析することができた。
【００１３】
【数１】糖化ヘモグロビン量（％）＝Ａ3 ÷（Ａ2 ＋Ａ
3 ）×１００
3 ）×１００
【００１４】
【表１】
【００１５】
【発明の効果】以上説明したように本発明方法は、まず
陽イオン交換基を有する充填剤に糖化ヘモグロビンと非
糖化ヘモグロビンとを吸着させた後、糖化ヘモグロビン
をホウ酸交換基を有する充填剤に吸着させ、次いで溶離
して分離することにより、ミニカラム法等の簡単な手段
を用いても、糖尿病の診断や糖尿病患者の経過観察の最
適な指標とされている血液中の糖化ヘモグロビンを、ヘ
モグロビンＦや溶血剤の影響を受けることなく確実かつ
短時間で分離分析することができる効果がある。
陽イオン交換基を有する充填剤に糖化ヘモグロビンと非
糖化ヘモグロビンとを吸着させた後、糖化ヘモグロビン
をホウ酸交換基を有する充填剤に吸着させ、次いで溶離
して分離することにより、ミニカラム法等の簡単な手段
を用いても、糖尿病の診断や糖尿病患者の経過観察の最
適な指標とされている血液中の糖化ヘモグロビンを、ヘ
モグロビンＦや溶血剤の影響を受けることなく確実かつ
短時間で分離分析することができる効果がある。
Claims (1)
- 【請求項１】 陽イオン交換基とホウ酸交換基の両方を
有する充填剤または陽イオン交換基を有する充填剤とホ
ウ酸交換基を有する充填剤の混合物を充填したカラム
に、第１液を流して試料中の糖化ヘモグロビン及び非糖
化ヘモグロビンを充填剤の陽イオン交換基に吸着させ、
次いで第２液をカラムに流して陽イオン交換基に吸着さ
れている糖化ヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビンを溶
離して、非糖化ヘモグロビンを溶出するとともに、糖化
ヘモグロビンを充填剤のホウ酸交換基に吸着させ、しか
る後、第３液をカラムに流して糖化ヘモグロビンを溶出
させて分析することを特徴とする糖化ヘモグロビンの分
析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11242891A JPH05113440A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 糖化ヘモグロビンの分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11242891A JPH05113440A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 糖化ヘモグロビンの分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05113440A true JPH05113440A (ja) | 1993-05-07 |
Family
ID=14586398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11242891A Pending JPH05113440A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 糖化ヘモグロビンの分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05113440A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000008460A1 (fr) * | 1998-08-07 | 2000-02-17 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Procede de determination d'hemoglobines |
| US20200393472A1 (en) * | 2018-04-18 | 2020-12-17 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Haemoglobin analysis method |
-
1991
- 1991-04-17 JP JP11242891A patent/JPH05113440A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000008460A1 (fr) * | 1998-08-07 | 2000-02-17 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Procede de determination d'hemoglobines |
| US6428704B1 (en) * | 1998-08-07 | 2002-08-06 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Method for determination of hemoglobins |
| US20200393472A1 (en) * | 2018-04-18 | 2020-12-17 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Haemoglobin analysis method |
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