JPH1010108A

JPH1010108A - 液体クロマトグラフィーによる試料の分析方法

Info

Publication number: JPH1010108A
Application number: JP16185696A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Oishi; 和之大石; Kazuhiko Shimada; 一彦嶋田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1998-01-16

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中の測定目的成分の分画より後に溶出す
る成分を、短時間で溶出することができ、且つ分離カラ
ムを測定目的成分の溶離液で平衡化するための時間を短
かくできる、液体クロマトグラフィーによる試料の分析
方法を提供する。【解決手段】分離カラムに溶出力の相対的に弱い溶離
液を送液して測定目的成分を分画した後、溶出力が相対
的に強く、且つ界面活性剤〔例、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテ
ル）〕を含有する溶離液を送液し、次いで該分離カラム
を前記の溶出力の相対的に弱い溶離液で平衡化すること
を特徴とする。測定例：溶血液試料中の糖化ヘモグロビ
ンの測定。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】請求項１記載の発明は、液体
クロマトグラフィーによる試料の分析方法に関する。請
求項２記載の発明は、溶血液中の糖化ヘモグロビンを測
定する液体クロマトグラフィーによる試料の分析方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】有機化学、生化学、医学などの分野にお
ける試料中の成分の分析に液体クロマトグラフが汎用さ
れている。この液体クロマトグラフのシステムは、通
常、図２のように構成されている。溶離液１が切り替え
機構２（例えば、電磁弁からなり、溶離液１ａ、１ｂ、
１ｃなどの切り替えを行う機構）を通り、送液ポンプ３
により試料導入装置４を経由して、充填剤が充填された
分離カラム５に入り、この分離カラム５により試料中の
各成分が分離される。分離された各成分は検出器６によ
って、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、
その結果が記録計７に記録され、検出後の溶離液１は廃
液溜め８に溜められる。

【０００３】このような液体クロマトグラフを用いた液
体クロマトグラフィーによる試料の分析において、通
常、測定目的成分を分画後、溶出条件を変えて、測定目
的成分以外の成分を一挙に溶出させて、測定時間を短縮
する方法がとられる。例えば、血液中の赤血球を溶血し
て得られた溶血液を試料として、糖尿病の指標として臨
床的に広く測定されている糖化ヘモグロビン（以下、Ｈ
ｂＡ１ｃという）を測定する場合、分画が必要なＨｂＡ
１ｃなどは溶出力の相対的に弱い溶離液（以下、溶出力
の相対的に弱い溶離液のことをＡ液という）で徐々に溶
出させ、該試料中に大量に含まれ、かつ測定目的成分以
外の成分である非糖化ヘモグロビンＨｂＡ０は分画する
必要がないので溶出力の相対的に強い溶離液（以下、溶
出力の相対的に強い溶離液のことをＢ液という）で一挙
に溶出させている（特開平２−３０９２５３号公報）。
なお、上記の溶出条件を変えるとは、それまでの溶離液
と、ｐＨ、イオン強度又は組成などの条件を変えて、試
料成分が充填剤から遊離する条件（溶出力の強い条件）
を選ぶことである。なお、上記Ａ液、Ｂ液には、それぞ
れ複数の溶離液を含む場合もある。

【０００４】また、このようなＢ液は、その作用とし
て、分離カラムを含む分析系流路の洗浄効果も併せ持っ
ている。なお、洗浄効果とは、分析系流路に測定試料成
分を残さずに溶出させ、次測定に影響を及ぼさないよう
にする効果のことである。一般に分析系流路に測定試料
の残存物が存在すると、次測定に悪影響を及ぼすと共
に、蓄積されて、やがては分離カラムの劣化や流路の汚
染を引き起こす。

【０００５】従来、測定試料の残存物を残さないための
対策としては、溶出力の十分強いＢ液を送液する。しかしながら、こ
の方法は、Ｂ液を送液後、次工程開始のため初期状態に
戻す（平衡化）ためには、開始時に使用する溶離液（例
えば、Ａ液）を十分流す必要があり、測定以外の時間が
大幅にかかるという問題点があった。しかも、Ａ液とＢ
液の溶出力差が大きいほど平衡化には時間がかかる。

【０００６】Ｂ液の溶出力を下げ、Ａ液との溶出力の
差を小さくする。この方法は、平衡化時間の短縮が図れ
るという利点があるが、しかしながら、試料の一部が残
存する可能性があるという問題点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】請求項１記載の発明
（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、上
記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、試
料中の測定目的成分の分画より後に溶出する成分を、短
時間で溶出することができ、且つ分離カラムを測定目的
成分の溶離液で平衡化するための時間を短かくできる、
液体クロマトグラフィーによる試料の分析方法を提供す
ることにある。請求項２記載の発明（以下、請求項２記
載の発明を本発明２という）の目的は、試料が溶血液で
あり、測定目的成分が糖化ヘモグロビンである場合に、
上記請求項１記載の発明と同様の目的を達成することで
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明１の液体クロマト
グラフィーによる試料の分析方法は、分離カラムに溶出
力の相対的に弱い溶離液を送液して測定目的成分を分画
した後、溶出力が相対的に強く、且つ界面活性剤を含有
する溶離液を送液し、次いで該分離カラムを前記の溶出
力の相対的に弱い溶離液で平衡化することを特徴とす
る。

【０００９】本発明２の液体クロマトグラフィーによる
試料の分析方法は、試料が溶血液であり、測定目的成分
が糖化ヘモグロビンである本発明１の液体クロマトグラ
フィーによる試料の分析方法である。

【００１０】以下、本発明の液体クロマトグラフィーに
よる試料の分析方法について説明するが、以下におい
て、本発明という場合は、本発明１及び２をいうものと
する。

【００１１】本発明の液体クロマトグラフィーによる試
料の分析方法は、まず、分離カラムに溶出力の相対的に
弱い溶離液を送液して測定目的成分を分画する。上記、
溶出力の相対的に弱い溶離液とは、この溶離液の後に送
液される溶離液に比較して溶出力が弱いものを指し、且
つ測定目的成分を分画し得るものである。

【００１２】次いで、測定目的成分の分画終了後、分離
カラムに溶出力が上記の溶離液よりも相対的に強く、且
つ界面活性剤を含有する溶離液を送液して測定試料中の
測定目的成分以外の残存物を短時間で溶出する。上記界
面活性剤としては、測定系に悪影響を及ぼさないことが
必要であり、公知の界面活性剤から選択される。その種
類としては、測定系にもよるが非イオン性、イオン性の
どちらでもよく、単独又は２種以上併用してもよい。非
イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピ
レングリコール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルが
挙げられる。イオン性界面活性剤としては、例えば、ア
ルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸
エステル塩が挙げられる。

【００１３】界面活性剤の溶離液中の濃度は、低くなる
と測定試料の残存物の洗浄効果が低くなり、高くなると
分離に悪影響を及ぼすので、０．００１〜１重量％が好
ましい。

【００１４】次いで、該分離カラムを前記の溶出力の相
対的に弱い溶離液で平衡化する。

【００１５】本発明は、同一の条件下で試料を変えて繰
り返して測定する場合に特に有効である。

【００１６】本発明１が適用される液体クロマトグラフ
ィーの方法は、従来から使用されてきた液体クロマトグ
ラフィーの方法のいずれでもよく、充填剤としては、無
機又は有機系の各種モード（例えば、イオン交換、逆
相、順相モードなど）に用いられる充填剤が挙げられ、
溶離液としては、充填剤又は測定試料によって異なる
が、例えば、アルコール系や炭化水素系などの有機溶
媒、無機酸塩・有機酸塩を含む緩衝液、又はこれらの混
合液などが用いられる。

【００１７】本発明で用いられる液体クロマトグラフィ
ーのシステムも、従来から使用されてきたシステムのい
ずれでもよく、例えば、従来技術の項で述べた図２のシ
ステムが挙げられる。

【００１８】本発明２では、上記液体クロマトグラフィ
ーの方法として、試料が溶血液であり、測定目的成分が
糖化ヘモグロビンである液体クロマトグラフィーによる
試料の分析方法に限定される他は、本発明１の液体クロ
マトグラフィーによる試料の分析方法と同様である。そ
して、この液体クロマトグラフィーの測定モードは、通
常、陽イオン交換モードである。

【００１９】本発明２で用いられる、溶出力の相対的に
弱い溶離液としては、例えば、リン塩緩衝液、ビス−ト
リス緩衝液、クエン塩緩衝液などの緩衝液；アセトニト
リル、メタノール、エタノールなどの有機溶媒及びこれ
らと水との混合物などの、通常、糖化ヘモグロビンの液
体クロマトグラフィー分析において、糖化ヘモグロビン
の分離に用られる溶離液が挙げられる。

【００２０】本発明２で用いられる、溶出力が相対的に
強く、且つ界面活性剤を含有する溶離液としては、例え
ば、上記の溶出力の相対的に弱い溶離液の例として挙げ
たものが挙げられ、上記と異なる点は、その溶出力が相
対的に強くされていることである。本発明２で用いられ
る界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好まし
く、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエー
テルが挙げられる。本発明２で用いられる界面活性剤の
溶離液中の濃度は、低くなると洗浄効果がなくなり、高
くなると分離に悪影響を及ぼすので、０．０１〜０．５
重量％が好ましい。

【００２１】本発明２で用いられる、分離カラムを平衡
化するための溶離液としては、前記の溶出力の相対的に
弱い溶離液である。

【００２２】本発明２で用いられる試料としての溶血液
は、血液を溶血して赤血球中の糖化ヘモグロビンを赤血
球から取り出した溶血液試料を用いる。

【００２３】（作用）本発明では、分離カラムに溶出力
の相対的に弱い溶離液を送液して測定目的成分を分画し
た後、溶出力が相対的に強く、且つ界面活性剤を含有す
る溶離液を送液するが、界面活性剤を含有するので洗浄
力が向上するため、この溶離液として従来よりも濃度の
低い溶離液でも従来同様の洗浄力を有するようになる。
従って、従来よりも濃度の低い溶離液が用いられ得るの
で、その後、該分離カラムを前記の溶出力の相対的に弱
い溶離液で平衡化する際の時間を短縮できる。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。

【００２５】以下の実施例及び比較例においては、試料
を健常人血液の溶血液とし、測定目的成分として試料中
の糖化ヘモグロビンＡ１ｃを液体クロマトグラフィーに
よって測定した。溶血液試料及び測定装置は以下の通り
である。

【００２６】溶血液試料血液試料として、健常人の血液を使用し、採血後、直ち
に全血１ｍｌに対して血液抗凝固剤としてフッ化ナトリ
ウムを１０ｍｇの割合で添加したものを用い、血液試料
３μｌを溶血剤〔溶血試薬としてＴｒｉｔｏｎＸ−１
００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテ
ル、和光純薬社製）が０．１重量％で、不安定型糖化ヘ
モグロビン除去試薬としてテトラポリリン酸（ナカライ
テスク社製）が０．１重量％で溶解された０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）〕で１５０倍に希釈したもの
を溶血液試料とした。

【００２７】測定装置糖化ヘモグロビンの測定は、分離カラムとして陽イオン
交換体が充填されたカラムである、積水化学工業社製、
商品名「ＭｉｃｒｏｎｅｘＡ１ｃＨＳ−II」を用
い、以下の汎用の液体クロマトグラフのシステムで行っ
た。送液ポンプ：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ試料導入装置：積水化学工業社製、ＡＳＵ−４２０検出器：紫外可視吸光度計、島津製作所社製、ＳＰＤ６
−ＡＶ（測定波長４１５ｎｍで測定）。

【００２８】（実施例１）溶出力の相対的に弱い溶離液
（以下、溶離液１という）として、濃度０．１Ｍ、ｐＨ
６のリン酸緩衝液、溶出力が相対的に強く、且つ界面活
性剤を含有する溶離液（以下、溶離液２という）とし
て、濃度０．３Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液に界面活性剤
としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ポリエチレングリコ
ールオクチルフェニルエーテル、和光純薬社製）が０．
０５重量％の割合で溶解されたものを使用し、溶離液１
を１３０秒、溶離液２を１０秒、次いで、溶離液１を４
０秒送液することを１サイクルとして、溶血液試料を連
続して次々と測定した。なお、流速は２ｍｌ／分とし
た。

【００２９】得られたクロマトグラムを図１に示した。
図１における各ピークは、１１糖化ヘモグロビンＨｂＡ
１ａ及びＨｂＡ１ｂ、１２胎児性ヘモグロビンＨｂＦ、
１３糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、１４正常ヘモグロビ
ンＨｂＡ０である。このように、３分間で分離できた。
上記サイクルを繰り返して、１０試料（試料番号を、Ｎ
ｏ．１，Ｎｏ．２，Ｎｏ．３，Ｎｏ．４，Ｎｏ．５，Ｎ
ｏ．６，Ｎｏ．７，ＮＮｏ．８，Ｎｏ．９，Ｎｏ．１０
とする）を連続測定し、各測定における糖化ヘモグロビ
ンＨｂＡ１ｃの保持時間（分）を表１に示した。

【００３０】

【表１】

【００３１】表１にみられるように、保持時間は安定し
ており、各測定開始時における分離カラムの平衡化が十
分になされていることが分かる。

【００３２】また、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５試料について
は、各試料の測定終了毎に、該試料が完全に溶出されて
いるかをみるために、前記の溶血剤のみを試料として実
施例と同様の方法で測定した（すなわち、実施例１の測
定の順序としては、溶血液試料Ｎｏ．１−溶血剤−溶血
液試料Ｎｏ．２−溶血剤−溶血液試料Ｎｏ．３−溶血剤
−溶血液試料Ｎｏ．４−溶血剤−溶血液試料Ｎｏ．５−
溶血剤−溶血液試料Ｎｏ．６−溶血液試料Ｎｏ．７−溶
血液試料Ｎｏ．８−溶血液試料Ｎｏ．９−溶血液試料Ｎ
ｏ．１０の順番で測定した）。溶血液試料の測定サイク
ルにおいて試料成分が完全に溶出されていれば、溶血剤
を測定試料として測定して得られたクロマトグラムは、
いずれのピークも示さないはずであり、溶血液試料の測
定サイクルにおいて試料成分が完全に溶出されていなけ
れば（完全に溶出されずに試料成分の一部が残ること
を、キャリーオーバーという）、溶血剤を測定試料とし
て測定して得られたクロマトグラムは、何らかのピーク
を示す。このキャリーオーバー量の評価方法として、溶
血剤を測定試料として測定して得られたクロマトグラム
における、正常ヘモグロビンＨｂＡ０の溶出位置に検出
されるピークの高さ（実測値、単位はｍｍ）を測定する
方法をとった。このようにして測定されたキャリーオー
バー量を表２に示した。

【００３３】

【表２】

【００３４】表２にみられるように、本実施例において
は、キャリーオーバーが少ないことが分かる。

【００３５】（比較例１）実施例１における溶離液２の
代わりに、溶離液２から界面活性剤を除いたものを溶離
液２として用いたことの他は、実施例１と同様に操作し
て糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃの保持時間（分）及びキ
ャリーオーバー量を測定し、表１及び表２に示した。こ
の結果は、連続測定の初期のクロマトグラムは図１と同
じであったが、表２から分かるように、徐々にキャリー
オーバー量が大きく、更に累積してゆく傾向がみられ
た。これは、界面活性剤を含まないことにより、洗浄効
果が減少したためと考えられる。

【００３６】（比較例２）比較例１におけるキャリーオ
ーバーを解消するために、溶離液２の溶出力を高めてみ
た。すなわち、溶離液２として、界面活性剤を含まず
に、濃度０．５Ｍ、ｐＨ７のリン酸緩衝液を用いたこと
の他は、実施例１と同様に操作して糖化ヘモグロビンＨ
ｂＡ１ｃの保持時間（分）及びキャリーオーバー量を測
定し、表１及び表２に示した。この結果は、連続測定の
初期のクロマトグラムは図１と同じであったが、表２か
ら分かるようにキャリーオーバー量は減少したが、表１
から分かるように糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃの保持時
間（分）は、測定毎に早くなった。これは、各測定開始
時の分離カラムの平衡化が不十分である（前測定の溶離
液２の影響が、次測定に影響したため）ことによる。こ
の条件で平衡化を十分にしようとすると、正常ヘモグロ
ビンＨｂＡ０の溶出後の時間の延長しかなく、その場合
は測定時間の延長となる。

【００３７】

【発明の効果】本発明１の液体クロマトグラフィーによ
る試料の分析方法の構成は、上述の通りであり、本発明
１の分析方法は、試料中の測定目的成分の分画より後に
溶出する成分を、短時間で溶出することができ、且つ分
離カラムを測定目的成分の溶離液で平衡化するための時
間を短かくできる、従って、液体クロマトグラフィーに
よる試料の分析時間を短縮できる。また、試料の残存物
質を最小限にすることができる。

【００３８】本発明２の液体クロマトグラフィーによる
試料の分析方法の構成は、上述の通りであり、本発明２
の分析方法を用いると、溶血液中の糖化ヘモグロビンの
測定において、試料中の糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃよ
り後に溶出する正常ヘモグロビンＨｂＡ０を、短時間で
溶出することができ、且つ分離カラムを糖化ヘモグロビ
ンの分離のための溶離液で平衡化するための時間を短か
くできる、従って、液体クロマトグラフィーによる糖化
ヘモグロビンの分析時間を短縮できる。また、試料の残
存物質を最小限にすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたクロマトグラムである。

【図２】液体クロマトグラフのシステムを示す説明図で
ある。

【符号の説明】

１溶離液２切り替え機構３送液ポンプ４試料導入装置５分離カラム６検出器７記録計８廃液溜め

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分離カラムに溶出力の相対的に弱い溶離
液を送液して測定目的成分を分画した後、溶出力が相対
的に強く、且つ界面活性剤を含有する溶離液を送液し、
次いで該分離カラムを前記の溶出力の相対的に弱い溶離
液で平衡化することを特徴とする液体クロマトグラフィ
ーによる試料の分析方法。
【請求項２】試料が溶血液であり、測定目的成分が糖
化ヘモグロビンである請求項１記載の液体クロマトグラ
フィーによる試料の分析方法。