JP2017198666A

JP2017198666A - 液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラム

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Publication number: JP2017198666A
Application number: JP2017077851A
Authority: JP
Inventors: 明瀬崎; Akira Sezaki; 高木　毅; Takeshi Takagi; 毅高木
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: JP6856434B2

Abstract

【課題】複数の測定モードを切り替えてＨｂＡ１ｃを測定する場合に、ＨｂＡ１ｃの保持時間にずれが生じるのを抑制しつつ測定時間を短縮する。【解決手段】ＨＰＬＣ装置は、液体クロマトグラフィ法を用いて複数種類の溶離液を分析カラムに順次送液することにより測定試料のヘモグロビンＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する第１の測定モードと、複数種類の溶離液のうち第１の測定モードで使用する溶離液と共通の複数の共通溶離液を前記分析カラムに順次送液することによりヘモグロビンＡ１ｃを測定する第２の測定モードと、を切り替え、第１の測定モードでヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合、ヘモグロビンＡ１ｃの第１の保持時間が第２の測定モードで測定したヘモグロビンＡ１ｃの第２の保持時間と同一となるように、分析カラムを平衡化する。【選択図】図３

Description

本発明は、液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラムに係り、特に、血液などの生体試料の分析に使用される液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラムに関する。

従来、液体クロマトグラフィ法により、例えば血液等の測定試料のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）及び変異Ｈｂを測定する方法が提案されている（例えば特許文献１及び非特許文献１参照）。

従来では、測定試料のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を測定する場合、変異ヘモグロビンを検知し、これを分離若しくは除去してＨｂＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンの両方を測定する場合（バリアントモード）と、ヘモグロビンＡ１ｃを主として測定する場合（ファストモード）とでは、別々の測定装置を用いて測定したり、分析カラムを取り替えて測定したりすることが通常であった。これは、特に配管中の溶離液の濃度等の条件が測定の精度に影響を与えるため、各々の場合で異なる溶離液を使用して測定する必要があるためである。このため、従来では、液体クロマトグラフィ装置において、ファストモードとバリアントモードの測定が可能なものであっても、測定モードを変更する場合には、カラム及び配管内の洗浄工程と平衡化工程が必要であった。具体的には、測定モードを変更する場合には、測定モード終了時にエンドシーケンスにてカラム及び配管内を洗浄してから測定モードを変更する。そして、変更後の測定モードにおいて、カラム及び配管内を平衡状態にするためのスタートシーケンスを実施する。従来では、複数の測定試料に対して複数の測定モードを切り替えて、余分な工程を追加せずに連続的に測定を行うことは行われていなかった。

特開２００９−２３６７６８号公報

Ｂｉｏ−Ｒａｄ社「ＶａｒｉａｎｔＩＩＤｕａｌＰｒｏｇｒａｍ」のカタログ

上記のように、測定モードを変更する場合には、カラム及び配管内の洗浄工程と平衡化工程が必要であるため、溶離液の使用量が多くなると共に、測定時間も長時間となっていた。また、本発明者らは、１台の液体クロマトグラフィ装置において、複数の測定試料に対してバリアントモードとファストモードとを切り替えて連続的に測定する場合、バリアントモードでのみ使用する溶離液がその次の測定に影響を及ぼす場合があり、ＨｂＡ１ｃの保持時間(リテンションタイム）にずれが生じる場合があるという問題を見出した。この問題は、１台の液体クロマトグラフィ装置において、主にバリアントモード及びファストモードの何れか一方のみを実行する場合は、さほど問題とはならない。

しかしながら、１台の液体クロマトグラフィ装置で双方の測定モードを切り替えて連続して実行する場合には、測定したＨｂＡ１ｃの保持時間にずれがあると、ユーザがＨｂＡ１ｃの保持時間に基づいてＨｂＡ１ｃのピークを同定する場合に混乱を生じたり、液体クロマトグラフィ装置においてＨｂＡ１ｃのピークを特定するプロセスが煩雑化したりする、といった問題がある。このため、１台の液体クロマトグラフィ装置で双方の測定モードを切り替えて実行する場合には、十分な切替時間を設ける必要があり、測定時間を短縮するのが困難であった。

本発明は、複数の測定モードを切り替えてＨｂＡ１ｃを測定する場合に、ＨｂＡ１ｃの保持時間にずれが生じるのを抑制しつつ測定時間を短縮することができる液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラムの提供を目的とする。

本発明の液体クロマトグラフィ測定方法の一態様は、液体クロマトグラフィ法を用いて、第１の成分分離用溶離液、第２の成分分離用溶離液、及び洗浄用溶離液を分析カラムに順次送液することにより測定試料のヘモグロビンＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する第１の測定モードと、前記第１の成分分離用溶離液及び前記洗浄用溶離液を前記分析カラムに順次送液することにより前記ヘモグロビンＡ１ｃを測定する第２の測定モードと、を切り替える工程と、前記第１の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第１の保持時間と前記第２の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第２の保持時間とが同一となるように、前記第１の測定モードにおいて前記第２の成分分離用溶離液の影響がなくなる前に、前記洗浄用溶離液を送液する工程と、前記洗浄用溶離液の後に、前記第１の成分分離用溶離液を送液する工程と、を含む。

これによれば、一態様において、複数の測定モードを切り替えてＨｂＡ１ｃを測定する場合に、ＨｂＡ１ｃの保持時間にずれが生じるのを抑制しつつ測定時間を短縮することができる。なお、「保持時間が同一」とは、両者が完全に同一の場合だけでなく、保持時間に差があっても、±５％以内の差であれば「同一」に含まれる。

また、本発明の一態様は、前記第１の測定モードでの前記洗浄用溶離液を送液後の前記第１の成分分離用溶離液を送液する送液時間が、前記第２の測定モードでの前記洗浄用溶離液を送液後の前記第１の成分分離用溶離液を送液する送液時間よりも長い。

また、本発明の一態様は、少なくとも２測定分以上の前記測定試料を保持可能な保持手段に低濃度用キャリブレータ及び高濃度用キャリブレータのうち一方のキャリブレータを２測定分保持させて前記第１の測定モード及び前記第２の測定モードのキャリブレーションを実行し、前記保持手段に低濃度用キャリブレータ及び高濃度用キャリブレータのうち他方のキャリブレータを２測定分保持させて前記第１の測定モード及び前記第２の測定モードのキャリブレーションを実行する。

また、本発明の液体クロマトグラフィ測定装置の一態様は、液体クロマトグラフィ法を用いて、第１の成分分離用溶離液、第２の成分分離用溶離液、及び洗浄用溶離液を分析カラムに順次送液することにより測定試料のヘモグロビンＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する第１の測定モードと、前記第１の成分分離用溶離液及び前記洗浄用溶離液を前記分析カラムに順次送液することにより前記ヘモグロビンＡ１ｃを測定する第２の測定モードと、を切り替える切替手段と、前記第１の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第１の保持時間と前記第２の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第２の保持時間とが同一となるように、前記第１の測定モードにおいて前記第２の成分分離用溶離液の影響がなくなる前に、前記洗浄用溶離液を送液する第１の送液手段と、前記洗浄用溶離液の後に、前記第１の成分分離用溶離液を送液する第２の送液手段と、を含む。

これによれば、一態様において、複数の測定モードを切り替えてＨｂＡ１ｃを測定する場合に、ＨｂＡ１ｃの保持時間にずれが生じるのを抑制しつつ測定時間を短縮することができる。

本発明の一態様は、前記測定試料、前記第１の成分分離用溶離液、前記第２の成分分離用溶離液、及び前記洗浄用溶離液を濾過するためのプレフィルターが、前記分析カラムと一体化されている。

これによれば、一態様において、例えば、プレフィルターの接続部分でのデッドボリュームや配管の容量を減らすことができ、装置間差を小さくできる。測定モードの切り替えを行わない場合、このような装置間差は、放置しても特に問題は生じないが、測定モードの切り替えを行う装置においては、このような装置間差は、保持時間のずれに影響する。そのため、上記プレフィルターを分析カラムと一体化することは、保持時間のずれを低減する観点で有利である。

本発明の一態様の液体クロマトグラフィ測定プログラムは、コンピュータに、液体クロマトグラフィ法を用いて、第１の成分分離用溶離液、第２の成分分離用溶離液、及び洗浄用溶離液を分析カラムに順次送液することにより測定試料のヘモグロビンＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する第１の測定モードと、前記第１の成分分離用溶離液及び前記洗浄用溶離液を前記分析カラムに順次送液することにより前記ヘモグロビンＡ１ｃを測定する第２の測定モードと、を切り替え、前記第１の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第１の保持時間と前記第２の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第２の保持時間とが同一となるように、前記第１の測定モードにおいて前記第２の成分分離用溶離液の影響がなくなる前に、前記洗浄用溶離液を送液し、前記洗浄用溶離液の後に、前記第１の成分分離用溶離液を送液する処理を実行させる。

本発明によれば、一態様において、複数の測定モードを切り替えてＨｂＡ１ｃを測定する場合に、ＨｂＡ１ｃの保持時間にずれが生じるのを抑制しつつ測定時間を短縮することができる、という効果を有する。

ＨＰＬＣ装置の概略構成図である。ＨＰＬＣ装置の制御系の構成図である。液体クロマトグラフィ測定プログラムのフローチャートである。クロマトグラムの一例を示す線図である。（Ａ）はファストモードが連続する場合における各溶離液の送液タイミング等について説明するための図、（Ｂ）はバリアントモードからファストモードに切り替えた場合における各溶離液の送液タイミング等について説明するための図、（Ｃ）はバリアントモードにおいてＣ液の後に送液するＡ液の送液時間を長くした場合について説明するための図、（Ｄ）はバリアントモードにおいてＢ液の後に送液するＡ液の送液時間を長くした場合について説明するための図である。（Ａ）は保持時間のずれに基づいてフィードバック制御を行わない場合について説明するための図、（Ｂ）は保持時間のずれに基づいてフィードバック制御を行う場合について説明するための図である。ＨＰＬＣ装置の変形例を示す概略構成図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。

図１には、高速液体クロマトグラフィ（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）を利用したＨＰＬＣ装置Ｘの概略構成図を示した。

ＨＰＬＣ装置Ｘは、採血管１１をセットして、全血中のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を自動で測定するように構成されたものである。このＨＰＬＣ装置Ｘは、複数の溶離液ボトル１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅ（図１では５個）等を含む装置本体２を備えている。

各溶離液ボトル１２Ａ〜１２Ｅは、後述する分析カラム６０に供給すべき溶離液Ａ〜Ｅを各々保持したものである。各溶離液は、用途に応じて例えば組成、成分比、ｐＨ、浸透圧等が異なる。

装置本体２は、試料調製ユニット５、分析ユニット６、及び測光ユニット７を有している。

採血管１１は、例えば、ラック（図示せず）に収納され、後述する試料調製ユニット５におけるノズル５１により採取可能な位置に移動するように構成されている。

試料調製ユニット５は、採血管１１から採取した血液から、分析カラム６０に導入する試料を調製するためのものである。この試料調製ユニット５は、ノズル５１、及び希釈槽５３を有している。

ノズル５１は、採血管１１の血液試料１３をはじめとする各種の液体を採取するためのものであり、液体の吸引・吐出が可能であるとともに、上下方向及び水平方向に移動可能とされている。このノズル５１の動作は、後述する制御部１００によって制御される。

分析ユニット６は、分析カラム６０の充填剤に対する生体成分の吸着・脱着をコントロールし、各種の生体成分を測光ユニット７に供するためのものである。分析ユニット６における設定温度は、例えば４０℃程度とされる。分析カラム６０は、試料中のヘモグロビンを選択的に吸着させるための充填剤を保持させたものである。充填剤としては、例えばメタクリル酸−メタクリル酸エステル共重合体が使用される。

分析ユニット６は、分析カラム６０の他に、マニホールド６１、送液ポンプ６２、及びインジェクションバルブ６３を有している。

マニホールド６１は、複数の溶離液ボトル１２Ａ〜１２Ｅのうちの特定の溶離液ボトルから、分析カラム６０に選択的に溶離液を供給させるためのものである。このマニホールド６１は、配管８０Ａ〜８０Ｅを介して溶離液ボトル１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅに各々接続され、配管８４を介してインジェクションバルブ６３に接続されている。

送液ポンプ６２は、溶離液をインジェクションバルブ６３に移動させるための動力を付与するためのものであり、配管８４の途中に設けられている。

インジェクションバルブ６３は、一定量の導入用試料を採取するとともに、その導入用試料を分析カラム６０に導入可能とするものであり、複数の導入ポート及び排出ポート（図示省略）を備えている。このインジェクションバルブ６３には、インジェクションループ６４が接続されている。このインジェクションループ６４は、一定量（例えば数μＬ）の液体を保持可能なものであり、インジェクションバルブ６３を適宜切り替えることにより、インジェクションループ６４が希釈槽５３と連通して希釈槽５３からインジェクションループ６４に導入用試料が供給される状態、インジェクションループ６４がプレフィルターＰＦ及び配管８５を介して分析カラム６０と連通してインジェクションループ６４から導入用試料が分析カラム６０に導入される状態を選択することができる。このようなインジェクションバルブ６３としては、例えば六方バルブを使用することができる。なお、プレフィルターＰＦは、試料や溶離液を濾過するためのフィルターである。

測光ユニット７は、分析カラム６０からの脱着液に含まれるヘモグロビンを光学的に検出するためのものであり、配管８７を介して、分析カラム６０からの脱着液を排出するための廃液槽８８に接続されている。

図２には、ＨＰＬＣ装置Ｘの制御系のブロック図を示した。図２に示すように、ＨＰＬＣ装置Ｘは、制御部１００を備えている。制御部１００は、ＣＰＵ（ＣｅｎｔｒａｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＵｎｉｔ）１００Ａ、ＲＯＭ（ＲｅａｄＯｎｌｙＭｅｍｏｒｙ）１００Ｂ、ＲＡＭ（ＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓＭｅｍｏｒｙ）１００Ｃ、不揮発性メモリ１００Ｄ、及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｏ）１００Ｅがバス１００Ｆを介して各々接続された構成となっている。また、ＨＰＬＣ装置Ｘは、オペレータからの入力を受け付ける操作部（図示せず）を備えている。

Ｉ／Ｏ１００Ｅには、試料調製ユニット５、分析ユニット６、及び測光ユニット７が接続されている。

なお、後述する液体クロマトグラフィ測定プログラムは、本実施形態では一例として不揮発性メモリ１００Ｄに予め記憶される。ＣＰＵ１００Ａは、不揮発性メモリ１００Ｄに記憶された液体クロマトグラフィ測定プログラムを読み込んで実行する。また、ＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に液体クロマトグラフィ測定プログラムを記録し、これをＣＤ−ＲＯＭドライブ等で読み込むことにより実行するようにしてもよい。

次に、本実施形態の作用について説明する。

図３には、制御部１００のＣＰＵ１００Ａで実行される液体クロマトグラフィ測定処理のフローチャートを示した。

まずオペレータは、血液試料１３が入った採血管１１をセットする。複数の採血管１１を収容したラックを移動させることにより、採血管１１は採取位置まで搬送される。

オペレータが測定開始を指示すると、ＣＰＵ１００Ａは、不揮発性メモリ１００Ｄに記憶された液体クロマトグラフィ測定プログラムを読み込んで実行する。

ステップＳ１０では、測定対象の血液試料１３をバリアントモードで測定するかファストモード（通常モードともいう）で測定するかを判定し、ファストモードで測定する場合はステップＳ１２へ移行し、バリアントモードで測定する場合にはステップＳ２６へ移行する。ここで、バリアントモード（第１の測定モード）とは、液体クロマトグラフィ法を用いて、後述する複数種類の溶離液を分析カラム６０に予め定めた順序で順次送液することにより血液試料１３のＨｂＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する測定モードである。また、ファストモード（第２の測定モード）とは、複数種類の溶離液のうちバリアントモードで使用する溶離液と共通の複数の共通溶離液を分析カラム６０に予め定めた順序で順次送液することによりＨｂＡ１ｃを測定する測定モードである。

なお、バリアントモード及びファストモードの何れの測定モードで測定するのかは、血液試料１３毎に例えばユーザによって予め設定される。例えば、採血管１１に貼付されたバーコード情報を読み取ったり、ホストコンピュータからの指示信号を受け取ったり、操作部からの入力により、測定モードを識別し、設定することができる。ラックには、ファストモードとバリアントモードで測定される採血管１１が混在して収納されていても対応することができる。

ここで、複数種類の溶離液は、本実施形態ではＡ液〜Ｃ液である。Ａ液（第１の成分分離用溶離液）は、ＨｂＡ１ｃを溶出するため及び分析カラム６０を平衡化するための溶離液である。Ｂ液（洗浄用溶離液）は、分析カラム６０に残ったヘモグロビンを全て溶出するための溶離液、すなわち、分析カラム６０を洗浄するための溶離液である。Ｃ液（第２の成分分離用溶離液）は、ＨｂＡ１ｃが溶出された後にＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンを溶出するための溶離液である。なお、ヘモグロビンの溶出力が高い順にＢ液、Ｃ液、Ａ液となる。

そして、バリアントモードでは、Ａ液、Ｂ液、及びＣ液を予め定めた順序で分析カラム６０に送液して測定し、ファストモードでは、Ａ液及びＢ液を予め定めた順序で分析カラム６０に送液して測定する。すなわち、Ａ液及びＢ液はバリアントモード及びファストモードで共通に仕様する共通溶離液であり、Ｃ液は、バリアントモードでのみ使用する非共通溶離液である。

ステップＳ１２では、血液試料１３を導入する。具体的には、まず採血管１１から、血液試料１３を採取する。すなわち、ノズル５１を動作させることによって採血管１１から血液試料１３を採取する。ノズル５１によって採取された血液試料１３は、ノズル５１を動作させることによって希釈槽５３に供給される。

そして、インジェクションバルブ６３を切り替えることによりインジェクションループ６４に保持された試料は、プレフィルターＰＦによって濾過され、分析カラム６０に導入される。分析カラム６０に試料が導入されると、充填剤にＨｂＡ１ｃ及び変異Ｈｂ等が吸着される。

ステップＳ１４では、Ａ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０からＨｂＡ１ｃが溶出される。

ステップＳ１６では、Ｂ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０に残ったヘモグロビンが全て溶出され、分析カラム６０が洗浄される。

ステップＳ１８では、Ａ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０が平衡化される。

このように、ファストモードでは、Ａ液→Ｂ液→Ａ液の順序で分析カラム６０へ送液する。

分析カラム６０から排出される各種ヘモグロビンを含む脱着液は、配管８６を介して測光ユニット７に供給される。この脱着液は、配管８７を介して廃液槽８８に導かれる。

測光ユニット７においては、脱着液に対して連続的に光が照射され、その受光結果（吸光度）が制御部１００に出力される。そして、制御部１００においてクロマトグラムが演算される。

クロマトグラムは、図４に示したように、測定を開始してからの経過時間と受光結果としての吸光度との関係を表すグラフである。このクロマトグラムのピークがどの位置に現れるかによって、どのヘモグロビンが検出されたかを知ることができると共に、ピーク部分（山なりの部分）における吸光度の積算値、すなわちピーク部分の面積の大きさによってヘモグロビンの濃度を知ることができる。

本実施形態では、例えば、測定試料にＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０、何らかのヘモグロビン、特定の変異ヘモグロビン、例えば変異ヘモグロビンＣ、及び変異ヘモグロビンＳが含まれている場合において、溶離液を切り替えて分析カラム６０に順次送液した場合に、図４に示すように、ｔａ、ｔｂ、ｔｃ、ｔｆ、ｔｇの各時点にピークが現れることが予め想定されているとする。この場合、演算されたクロマトグラムから、ｔａ秒の時点でピークが現れているか否かを判断することにより、何らかのヘモグロビンが検出されたか否かを判断することができる。同様に、ｔｂの時点でピークが現れているか否かを判断することによりＨｂＡ１ｃが検出されたか否かを判断することができ、ｔｃの時点でピークが現れているか否かを判断することによりＨｂＡ０が検出されたか否かを判断することができ、ｔｆの時点でピークが現れているか否かを判断することによりＨｂＳが検出されたか否かを判断することができ、ｔｇの時点でピークが現れているか否かを判断することにより変異ヘモグロビンＣが検出されたか否かを判断することができる。また、ｔａ、ｔｂ、ｔｃ、ｔｆ、ｔｇ以外の時点でピークが現れた場合は、予め想定されていないヘモグロビンが検出されたと判断することができる。また、各時点における吸光度の大きさから各ヘモグロビンの濃度を測定することができる。

本実施形態では、ファストモードにおいては、例えば、測定試料にＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、何らかのヘモグロビン、変異ヘモグロビンＣ、及び変異ヘモグロビンＳが含まれている場合において、上記制御シーケンスによって溶離液を切り替えて分析カラム６０に順次送液した場合に、図４に示すように、測定開始からｔｂの時点にＨｂＡ１ｃのピークが現れることが予め想定されているとする。この場合、演算されたクロマトグラムから、ｔｂ付近でピークが現れているか否かを判断することにより、ＨｂＡ１ｃが検出されたか否かを判断することができる。

従って、ステップＳ２０では、演算されたクロマトグラムに基づいて、ＨｂＡ１ｃを測定する。すなわち、前述したように、ｔｂ付近でピークが現れているか否かを判断し、ｔｂ付近でピークが現れていればＨｂＡ１ｃが検出されたと判断する。そして、ｔｂ付近のピーク部分の吸光度の積算値からＨｂＡ１ｃの濃度を測定する。

ステップＳ２４では、測定結果を不揮発性メモリ１００Ｄに記憶させる。すなわち、ＨｂＡ１ｃの濃度及び変異ヘモグロビンの検知の有無を不揮発性メモリ１００Ｄに記憶する。

ステップＳ４４では、全ての採血管１１について上記の測定が終了したか否かを判断し、全ての採血管１１について測定が終了した場合は本ルーチンを終了し、測定が終了していない採血管１１が存在する場合には、ステップＳ１０へ戻って測定対象の血液試料１３をバリアントモードで測定するかファストモードで測定するかを判定する。

ステップＳ１０においてバリアントモードで測定すると判定された場合は、ステップＳ２６へ移行する。

ステップＳ２６では、ステップＳ１２と同様に血液試料１３を導入する。

ステップＳ２８では、Ａ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０からＨｂＡ１ｃが溶出される。

ステップＳ３０では、Ｃ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０からＨｂＡ１ｃが溶出された後にＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンが溶出される。

ステップＳ３２では、Ａ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０が平衡化される。

ステップＳ３４では、Ｂ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０に残ったヘモグロビンが全て溶出され、分析カラム６０が洗浄される。

ステップＳ３６では、Ａ液を分析カラム６０に予め定めた時間供給する。これにより、分析カラム６０が平衡化される。

このように、バリアントモードでは、Ａ液→Ｃ液→Ａ液→Ｂ液→Ａ液の順序で分析カラム６０へ送液する。

ステップＳ３８では、ステップＳ２０と同様にＨｂＡ１ｃを測定する。

ステップＳ４０では、変異ヘモグロビンを測定する。すなわち、前述したように、ｔｂ及びｔｃ以外の時点でピークが現れているか否かを判断することにより変異ヘモグロビンが検出されたか否かを判断する。そして、ｔｂ及びｔｃ以外の時点でピークが現れている場合は、そのピーク部分の積算値から変異ヘモグロビンの濃度を測定する。

ステップＳ４２では、測定結果を不揮発性メモリ１００Ｄに記憶させる。すなわち、ＨｂＡ１ｃの濃度及び変異ヘモグロビンの濃度を不揮発性メモリ１００Ｄに記憶する。

このようにして、本実施形態では、１つの装置でファストモードとバリアントモードとを切り替えて測定することができる。

次に、図５（Ａ）を参照して、ファストモードでの測定が連続した場合における、Ａ液及びＢ液の送液タイミング、ＨｂＡ１ｃのピークが出現するタイミング、及びＢ液を分析カラム６０に送液した後の分析カラム６０内におけるＢ液の残存量について説明する。

図５（Ａ）において、ハッチングで表されている波形Ｗ１は、ＨｂＡ１ｃの吸光度のピークの波形を表している。また、波形Ｗ２は、Ｂ液の送液タイミングを表している。また、波形Ｗ３は、分析カラム６０内におけるＢ液の残存量を示している。すなわち、図５（Ａ）における縦軸は、ＨｂＡ１ｃの吸光度及びＢ液の残存量の２つの意味がある。

例えば図５（Ａ）に示すように、ファストモードのｎ測定目では、ｔ１時点からｔ２時点までＡ液を送液し、ｔ２時点からｔ３時点までＢ液を送液し、ｔ３時点からｔ４時点までＡ液を送液する。ここで、Ｂ液をｔ２時点からｔ３時点まで送液する場合、Ｂ液は分析カラム６０に入るまでの配管内でＡ液と混ざり合うため、分析カラム６０内のＢ液の残存量（濃度）は、実際は波形Ｗ２のようにはならず、波形Ｗ３のように徐々に増加し、その後徐々に減る波形となる。また、ＨｂＡ１ｃのピークは、ｔ_ｐｎ時点で出現する。測定開始時点であるｔ１時点からＨｂＡ１ｃのピークが出現するｔ_ｐｎ時点までの時間Ｔ秒を保持時間（リテンションタイム）という。

そして、ｔ４時点から（ｎ＋１）測定目におけるＡ液の送液が開始されるが、ｎ測定目で送液したＢ液が分析カラム６０に少し残った状態であるにもかかわらず、（ｎ＋１）測定目におけるＡ液の送液が開始される。これは、１回の測定時間を極力短縮するためであるが、次の（ｎ＋２）測定目もファストモードの測定であれば、（ｎ＋２）測定目の開始時に分析カラム６０に残るＢ液の残存量は、（ｎ＋１）測定目の開始時に分析カラム６０に残るＢ液の残存量と略同じになる。このように、ファストモードが連続する場合は、測定開始時のＢ液の残存量は略同じとなる。このため、例えば（ｎ＋１）測定目における保持時間、すなわちｔ１時点からｔ_ｐｎ時点までの時間と、（ｎ＋１）測定目における保持時間、すなわちｔ４時点からｔ_{ｐ（ｎ−１）}時点までの時間と、は略同一となり、特に問題は無い。

次に、バリアントモードからファストモードに切り替えた場合における、Ａ液〜Ｃ液の送液タイミング、ＨｂＡ１ｃのピークが出現するタイミング、Ｃ液を分析カラム６０に送液した後の分析カラム６０内におけるＣ液の残存量、及びＢ液を分析カラム６０に送液した後の分析カラム６０内におけるＢ液の残存量について説明する。

例えば図５（Ｂ）に示すように、バリアントモードのｎ測定目では、ｔ１時点からｔ２時点までＡ液を送液し、ｔ２時点からｔ３時点までＣ液を送液し、ｔ３時点からｔ４時点までＡ液を送液し、ｔ４時点からｔ５時点までＢ液を送液し、ｔ５時点からｔ６時点までＡ液を送液する。なお、図５（Ｂ）のｔ４からｔ６の時点は、図５（Ａ）のｔ２からｔ４の時点に各々対応している。すなわち、図５（Ｂ）のＢ液の送液時間（ｔ４からｔ５までの時間）は図５（Ａ）のＢ液の送液時間（ｔ２からｔ３までの時間）と同一であり、図５（Ｂ）のＡ液の送液時間（ｔ５からｔ６までの時間）は図５（Ａ）のＡ液の送液時間（ｔ３からｔ４までの時間）と同一である。

ここで、波形Ｗ４は、Ｃ液の送液タイミングを表している。また、波形Ｗ５は、分析カラム６０内におけるＣ液の残存量を示している。Ｃ液をｔ２時点からｔ３時点まで送液する場合、分析カラム６０内のＣ液の残存量は、前述したＢ液の場合と同様に、実際は波形Ｗ４のようにはならず、波形Ｗ５のように徐々に増加し、その後徐々に減る波形となる。このため、（ｎ＋１）測定目が開始されるｔ６の時点において、ｎ測定目で送液したＣ液が分析カラム６０に少し残った状態となる。また、図５（Ａ）と同様に、Ｂ液も少し残った状態となる。

これにより、図５（Ｂ）に示すように、（ｎ＋１）測定目においてＨｂＡ１ｃのピークが出現するタイミングが、図５（Ａ）の場合と比較してａ秒早まり、保持時間が（Ｔ−ａ）秒となる。これは、ｔ６時点において、Ｂ液の残存量は図５（Ａ）の場合と同一であるものの、Ｃ液が残存しているためである。

そこで、本実施形態では、図５（Ｃ）に示すように、Ｃ液の後に送液するＡ液の送液時間を図５（Ｂ）の場合と比較して長くする。すなわち、Ｃ液の後に送液するＡ液の送液量を図５（Ｂ）の場合と比較して多くする。図５（Ｃ）の例では、図５（Ｂ）の場合と比較して、Ｃ液の後に送液するＡ液の送液時間（ｔ３からｔ４までの時間）を長くしている。すなわち、ステップＳ３２において送液するＡ液の送液時間を長くする。なお、Ｃ液、Ａ液の後に送液するＢ液及びＡ液の送液時間は図５（Ｂ）の場合と同一である。

これにより、図５（Ｃ）に示すように、（ｎ＋１）測定目が開始されるｔ６の時点において、ｎ測定目で送液したＣ液が無くなり、Ｃ液の影響が無くなる。Ｂ液の残存量は、図５（Ａ）の場合と同じであるため、（ｎ＋１）測定目のＨｂＡ１ｃの保持時間がＴ秒となり、図５（Ａ）のようにファストモードが連続する場合におけるＨｂＡ１ｃの保持時間と同一となる。なお、Ｃ液の後に送液するＡ液の送液時間は、必ずしも分析カラム６０からＣ液が無くなる時間に設定されなくても良く、分析カラム６０にＣ液が少し残っていても、保持時間にずれが生じない時間に設定されれば良い。

また、図５（Ｄ）に示すように、Ｃ液の後に送液するＡ液の送液時間を長くするのではなく、Ｂ液の後に送液するＡ液の送液時間を図５（Ｂ）の場合と比較してｂ秒長くしても良い。すなわち、ステップＳ３６において送液するＡ液の送液時間を長くする。これにより、ｎ測定目の測定時間（ｔ１からｔ６までの時間）を図５（Ｃ）の場合と比較して短縮することができる。これは、Ｃ液の残りが増えた分、Ｂ液の残りが減ったためである。

このように、本実施形態では、バリアントモードでＨｂＡ１ｃを測定する場合、ＨｂＡ１ｃの保持時間がファストモードで測定したＨｂＡ１ｃの保持時間と同一となるように、Ｃ液の送液後に分析カラム６０に送液するＡ液、すなわち、Ｃ液の直後に送液するＡ液及びＢ液の直後に送液するＡ液の少なくとも一方の送液時間を制御する。これにより、ファストモード及びバリアントモードの測定開始時において、ＨｂＡ１ｃの溶出に及ぼすＢ液及びＣ液の残存成分並びに残存量の影響を実質的に同一になるように設定できる。このため、バリアントモードとファストモードとを切り替えてＨｂＡ１ｃを測定する場合に、ＨｂＡ１ｃの保持時間にずれが生じるのを抑制することができる。

なお、本実施形態では、分析カラム６０内の溶離条件を制御する一態様として、バリアントモード及びファストモードで測定したＨｂＡ１ｃの保持時間が同一となるように、溶離液の送液時間を制御する場合について説明したが、分析カラム６０内の溶離条件を制御する態様としては、これに限られるものではない。例えば、分析カラム６０内の溶離条件を制御する他の態様としては、溶離液の送液タイミングを制御すること、溶離液の送液量を制御すること、溶離液の流速を制御すること、消去液を添加すること、及び溶離液の濃度を変更すること、が含まれる。このような溶離条件を、バリアントモードとファストモードとを切り替えない場合における溶離条件と異ならせることにより、バリアントモード及びファストモードで測定したＨｂＡ１ｃの保持時間が同一となるように制御してもよい。

また、バリアントモードで測定した第１の保持時間とファストモードで測定した第２の保持時間とが異なる場合、第１の保持時間と第２の保持時間との差に応じて、バリアントモードにおけるＢ液の送液タイミングを異ならせるようにしてもよい。

一般的に、バリアントモードにおいては、ファストモードよりも使用する溶離液の種類が多いため、Ｃ液の影響が次の測定に残り、次の測定においてＨｂＡ１ｃの保持時間が早くなるのが通常である。なお、Ｂ液はバリアントモードでもファストモードでも使用するため、保持時間の差に影響は無く、Ｃ液の残存量の差が保持時間の差に影響すると考えられる。

従って、例えば、図６（Ｂ）に示すように、第１の保持時間と第２の保持時間との差（ｃ秒）に応じて、Ｂ液の送液タイミングをｄ秒早くするフィードバック制御を行う。これにより、ｎ測定目におけるＣ液とＢ液の合成の残り量が調整され、図６（Ｂ）に示すように、次のバリアントモードで測定した第１の保持時間Ｔ１秒がファストモードで測定した第２の保持時間Ｔ２秒と同一となる。なお、図６（Ｂ）の例では、バリアントモードで測定した第１の保持時間の方がファストモードで測定した第２の保持時間よりもｃ秒短いため、Ｂ液の送液タイミングをｄ秒早くしているが、例えばバリアントモードで測定した第１の保持時間の方がファストモードで測定した第２の保持時間よりもｃ秒遅い場合には、Ｂ液の送液タイミングをｄ秒遅くすればよい。第１の保持時間と第２の保持時間との差に応じてＢ液の送液タイミングをどの程度調整するか、すなわちｃ秒とｄ秒との対応関係については、予め実験により求めておいてもよいし、実際に測定を繰り返し、その測定結果から求めても良い。

なお、上記のフィードバック制御は、例えば、Ｃ液の残存量が保持時間に影響するバリアントモードの測定時に行うが、これに限定されるものではない。

また、本実施形態では、プレフィルターＰＦがインジェクションバルブ６３と分析カラム６０との間に設けられた場合について説明したが、これに限らず、例えば図７に示すように、プレフィルターＰＦを分析カラム６０と一体化した構成としてもよい。これにより、配管８５の容量を少なくすることができ、Ｃ液の残存量を極力抑えることができる。このため、ＨｂＡ１ｃの保持時間にずれが生じるのを極力抑えることができる。

また、液体クロマトグラフィ装置では、分析カラムの交換時や液体クロマトグラフィ装置のメンテナンス時のように、測定条件が変更される虞がある場合に、校正用の試料（以下、キャリブレータと称する）を用いて、液体クロマトグラフィ装置の校正（以下、キャリブレーションと称する）を実施するのが通常である。また、測定条件が変更される虞がない場合であっても、定期的に校正を実施して、測定精度の維持を図るのが通常である。

この場合、低濃度のＬｏｗキャリブレータと高濃度のＨｉｇｈキャリブレータの２種類のキャリブレータを準備し、キャリブレータ毎にキャリブレーションを実行する必要がある。

本実施形態のように１台の液体クロマトグラフィ装置でバリアントモードとファストモードとを切り替える場合、測定モード毎にキャリブレーションを行う必要があるが、例えばバリアントモードでＬｏｗキャリブレータ及びＨｉｇｈキャリブレータを用いてキャリブレーションを実行してから、ファストモードに切り替えて低濃度及び高濃度のキャリブレータを用いてキャリブレーションを実行すると、装置の洗浄やキャリブレータの準備が煩雑となり、ユーザがキャリブレータを置く順番や、置く数などを間違える可能性が高くなる。すなわち、上記の例の場合、Ｌｏｗ（バリアントモード）→Ｈｉｇｈ（バリアントモード）→Ｌｏｗ（ファストモード）→Ｈｉｇｈ（ファストモード）の順で測定が実行され、キャリブレータの切り替えが３回実行されることとなり、流路の洗浄を３回実行しなければならない。また、Ｌｏｗキャリブレータ及びＨｉｇｈキャリブレータをバリアントモード及びファストモードの測定モード毎に準備しなければならない。

そこで、希釈槽５３とインジェクションバルブ６３とを接続する配管８３を、少なくとも２測定分以上の測定試料を保持することが可能な容量を有する配管とし、例えば２測定分のＬｏｗキャリブレータを配管８３に保持させてバリアントモード及びファストモードの各測定モードでＬｏｗキャリブレータによるキャリブレーションを実行して各測定モードの測定結果を記録し、その後２測定分のＨｉｇｈキャリブレータを配管８３に保持させてバリアントモード及びファストモードの各測定モードでＨｉｇｈキャリブレータによるキャリブレーションを実行して各測定モードの測定結果を記録するようにしてもよい。

これにより、Ｌｏｗ（バリアントモード）→Ｌｏｗ（ファストモード）→Ｈｉｇｈ（バリアントモード）→Ｈｉｇｈ（ファストモード）の順で測定が実行され、キャリブレータの切り替えは１回となり、流路の洗浄は１回で済む。このように、校正作業を簡略化することができ、コストを低減することができると共に、ユーザがキャリブレータを置く順番や、置く数などを間違える可能性を低減することができる。なお、この方法はキャリブレーションに限らず、精度管理物質（検体）の測定（コントロール測定）などにも使用することができ、試薬の使用量削減、精度管理物質の使用量削減などのコストダウンに貢献することができると共に、ユーザによる精度管理物質の置き間違いなどを減らすことができる。

また、配管８３を、２測定分の測定試料を保持することが可能な容量を有する配管とした場合、最初に半分の測定試料を用いてファストモードで測定を実行し、何らかの異常が発生した場合、例えば測定したＨｂＡ１ｃの値が異常に低い値であった場合は、残りの半分の測定試料を用いてバリアントモードで測定を実行するようにしてもよい。

なお、本発明は、上述した実施の形態には限定されず、種々に変更可である。例えば、血液中のヘモグロビン濃度を測定するためのＨＰＬＣ装置に限らず、血液以外の検体を用いる場合、ヘモグロビン濃度以外の成分を測定する場合、あるいはＨＰＬＣ装置以外の液体クロマトグラフィ装置についても本発明を適用することができる。

ＸＨＰＬＣ装置
５試料調製ユニット
６分析ユニット
７測光ユニット
１１採血管
１３血液試料
６０分析カラム
１００制御部

Claims

液体クロマトグラフィ法を用いて、第１の成分分離用溶離液、第２の成分分離用溶離液、及び洗浄用溶離液を分析カラムに順次送液することにより測定試料のヘモグロビンＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する第１の測定モードと、前記第１の成分分離用溶離液及び前記洗浄用溶離液を前記分析カラムに順次送液することにより前記ヘモグロビンＡ１ｃを測定する第２の測定モードと、を切り替える工程と、
前記第１の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第１の保持時間と前記第２の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第２の保持時間とが同一となるように、前記第１の測定モードにおいて前記第２の成分分離用溶離液の影響がなくなる前に、前記洗浄用溶離液を送液する工程と、
前記洗浄用溶離液の後に、前記第１の成分分離用溶離液を送液する工程と、
を含む液体クロマトグラフィ測定方法。
前記第１の測定モードでの前記洗浄用溶離液を送液後の前記第１の成分分離用溶離液を送液する送液時間が、前記第２の測定モードでの前記洗浄用溶離液を送液後の前記第１の成分分離用溶離液を送液する送液時間よりも長い
請求項１記載の液体クロマトグラフィ測定方法。
少なくとも２測定分以上の前記測定試料を保持可能な保持手段に低濃度用キャリブレータ及び高濃度用キャリブレータのうち一方のキャリブレータを２測定分保持させて前記第１の測定モード及び前記第２の測定モードのキャリブレーションを実行し、前記保持手段に低濃度用キャリブレータ及び高濃度用キャリブレータのうち他方のキャリブレータを２測定分保持させて前記第１の測定モード及び前記第２の測定モードのキャリブレーションを実行する
請求項１又は請求項２記載の液体クロマトグラフィ測定方法。
液体クロマトグラフィ法を用いて、第１の成分分離用溶離液、第２の成分分離用溶離液、及び洗浄用溶離液を分析カラムに順次送液することにより測定試料のヘモグロビンＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する第１の測定モードと、前記第１の成分分離用溶離液及び前記洗浄用溶離液を前記分析カラムに順次送液することにより前記ヘモグロビンＡ１ｃを測定する第２の測定モードと、を切り替える切替手段と、
前記第１の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第１の保持時間と前記第２の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第２の保持時間とが同一となるように、前記第１の測定モードにおいて前記第２の成分分離用溶離液の影響がなくなる前に、前記洗浄用溶離液を送液する第１の送液手段と、
前記洗浄用溶離液の後に、前記第１の成分分離用溶離液を送液する第２の送液手段と、
を含む液体クロマトグラフィ測定装置。
前記第１の測定モードでの前記洗浄用溶離液を送液後の前記第１の成分分離用溶離液を送液する送液時間が、前記第２の測定モードでの前記洗浄用溶離液を送液後の前記第１の成分分離用溶離液を送液する送液時間よりも長い
請求項４記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
前記測定試料、前記第１の成分分離用溶離液、前記第２の成分分離用溶離液、及び前記洗浄用溶離液を濾過するためのプレフィルターが、前記分析カラムと一体化されている
請求項４又は請求項５記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
コンピュータに、
液体クロマトグラフィ法を用いて、第１の成分分離用溶離液、第２の成分分離用溶離液、及び洗浄用溶離液を分析カラムに順次送液することにより測定試料のヘモグロビンＡ１ｃ及び変異ヘモグロビンを測定する第１の測定モードと、前記第１の成分分離用溶離液及び前記洗浄用溶離液を前記分析カラムに順次送液することにより前記ヘモグロビンＡ１ｃを測定する第２の測定モードと、を切り替え、
前記第１の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第１の保持時間と前記第２の測定モードでの前記ヘモグロビンＡ１ｃの第２の保持時間とが同一となるように、前記第１の測定モードにおいて前記第２の成分分離用溶離液の影響がなくなる前に、前記洗浄用溶離液を送液し、
前記洗浄用溶離液の後に、前記第１の成分分離用溶離液を送液する
処理を実行させるための液体クロマトグラフィ測定プログラム。