JP2023117671A - キャリブレーターの測定方法および液体クロマトグラフ装置 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の測定モードを使用する液体クロマトグラフィーにおいて、連続して行うキャリブレーションおよび検体の測定を効率的に、オペレーションミスなく実行すること。【解決手段】検体の測定に先立ち、キャリブレーターを複数の測定モードで測定する際、最後のキャリブレーターの測定に適用する測定モードが、直後の検体の測定に適用する測定モードと同じになる測定順序で、キャリブレーターおよび検体を測定する。キャリブレーターの測定を検体の測定に優先させるという第１の制御規則と、連続して実行するキャリブレーターの測定および検体の測定には同じ測定モードを適用するという第２の制御規則とに基づいて測定順序を制御する。また、被検体・キャリブレーターの測定依頼をする入力手段と、入力内容に基づいてキャリブレーターの設置位置をユーザーに案内表示する手段とを備えた液体クロマトグラフ装置を提供する。【選択図】図６

Description

本発明は、液体クロマトグラフィーによる測定方法および液体クロマトグラフ装置に関するものである。

グラジエント溶出法を使用する液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定時間は、目的成分のピークを溶出するためのグラジエント時間、カラムを洗浄するための洗浄時間そしてカラムの状態を平衡化する平衡化時間から構成される。ＨＰＬＣは、臨床検査の分野でも広く用いられており、ヘモグロビン分画のＨｂＡ１ｃ、カテコールアミン、リポ蛋白、アミノ酸などの測定に利用されている。臨床検査の分野では、診療前検査への対応、ランニングコストの削減、装置の集約化などの要因により一検体当たりの測定時間を短くするハイスループット化が求められる。例えば特許文献１では、平衡化時間を短くして平衡に達する前に検体をインジェクションして測定時間を短くする技術が開示されている。

その一方で、特許文献２が開示するような測定項目を専用化した装置であっても、迅速測定や詳細測定など、同一カラム、同一溶離液を使用する条件下で測定条件の異なる複数の測定モードを用意する場合がある。一般にＨＰＬＣの検出器の出力信号（出力信号比を含む）を、標準化した報告値に変換するために、標準規格に基づいて値付けされた較正試料（キャリブレーター）を測定して、事前に値付け値と出力信号との関係（検量線）を取得する必要がある。より正確な報告値を求めるためには、測定モードごとに検量線を作成することが望ましい。そしていずれの測定モードに対する検量線も、それぞれの被検体の測定より先に取得しておくことが望ましい。

ところで、平衡化時間を極限まで短くした場合、洗浄時間の変化により平衡化の状況に差異が出る可能性がある。また、測定モードが異なる場合、グラジエント時間の変化に合わせて洗浄時間もしくは平衡化時間が変わってくる。測定モードを切り替えた場合は、同じ測定モードを続けて測定した場合と比較して、測定モードを切り替えた最初の測定結果が変化する可能性が出てくる。まして、前述の特許文献１のように平衡化時間に達する前に次の試料を注入する場合はその影響がさらに大きくなる。それを避けるために、測定モードが切り替わった際に次に測定しようとする測定モードで試料を導入せずにグラジエント溶離法を行う空運転（空サイクルともいう）を実施することがある。

特許文献３が示すような液体クロマトグラフ装置、つまりサンプルローダー上に検体を設置し、搬送される検体の存在を光学認識することにより測定が開始される装置に関しては、あらかじめ検体の測定依頼をたてる必要がない。検体認識や検体ＩＤの読み取り時を起点としてサンプルローダー上の順序に従った測定が実施される。特許文献３ではそのような背景において、順序通りでない検体設置位置として緊急検体用ポート（ＳＴＡＴポートともいう）の利用と、２以上の較正材料が一体化されたパッケージについて開示している。一体化されたパッケージは設置が容易で利便性が高いが、測定モードを切り替えてあるいは組み合わせて測定する状況には対応することが難しい。また、このパッケージをＳＴＡＴポートで使用するために、通常一検体の測定が想定されるＳＴＡＴポートでは対応できず、ポートの拡張や機構の複雑化を要する。

前述の通り、異なる検量線をあらかじめそれぞれ測定しようとするとキャリブレーションの実施方法が複雑化し、オペレーションミスが発生しやすくなる。さらに複数の測定モードを切り替えると、測定間に空サイクル動作が必要となるためスループットが落ちるという課題があった。

特開２０００－１８７０２９号公報 特開２０２１－０６７５７９号公報 特開２０１９－０７４５４３号公報

本発明の課題は、複数の測定モードを使用する液体クロマトグラフィーにおいて、連続して行うキャリブレーションおよび検体の測定を効率的に、そしてオペレーションミスなく実行するキャリブレーターの測定方法および液体クロマトグラフ装置を提供することにある。

本発明において「測定モード」とは測定項目を専用化した液体クロマトグラフィーにおいて、合目的的に規格化された代表的な測定条件とくに溶離条件を表す。「検体」は測定対象の未知試料および精度管理試料を含む。「キャリブレーター」とは、値付けされて供給されたまたは調製された較正試料を表し、また検量線を作成するために必要な較正試料一式を表すこともある。

本発明の要点は、異なる測定モードで連続測定をする際に必要となる空サイクル動作を最小限にとどめることである。その要点に基づく第１の態様は、液体クロマトグラフィーによる測定方法であって、被検体の測定に先立ち、キャリブレーターを複数の測定モードで測定する際、最後のキャリブレーターの測定に適用する測定モードが、直後の被検体の測定に適用する測定モードと同じになる測定順序で、キャリブレーターおよび被検体を測定することを特徴とする。

第２の態様は、被検体・キャリブレーターの測定依頼をするための入力手段と、測定順序の制御手段とを備えた液体クロマトグラフ装置である。入力手段は、被検体の測定に適用しようとする測定モードの入力を受け付け可能な第１の入力手段と、測定しようとするキャリブレーターの識別情報と、そのキャリブレーターの測定に適用しようとする複数の測定モードとの入力を受け付け可能な第２の入力手段とを含む。ここで、キャリブレーターの識別情報は、値付けされた基準値を含むことが望ましい。制御手段は、第２の入力手段に入力されたキャリブレーターの測定を、第１の入力手段に入力された測定モードを適用する被検体の測定に優先させるという第１の制御規則と、連続して実行するキャリブレーターの測定および被検体の測定には同じ測定モードを適用するという第２の制御規則とに基づいて測定順序を制御する。

第３の態様は、被検体・キャリブレーターの測定依頼をするための入力手段と、キャリブレーターの設置位置をユーザーに案内表示する表示手段とを備えた液体クロマトグラフ装置である。入力手段は、第２の態様と同様に、被検体に対する測定モードと、キャリブレーターの識別情報および測定モードとの入力を受け付ける。表示手段は、第２の入力手段に入力されたキャリブレーターを測定のために設置する態様を案内表示する表示手段であって、第１の入力手段で入力された測定モードと同じ測定モードを適用して測定するキャリブレーターを最後に処理する位置に設置するように案内表示する。好ましくは、その表示手段は、キャリブレーターを容器に分注した状態で、容器ラックの所定位置に処理予定の順に載置したイラストとともに、容器の内容物とその必要量を示すテキストを表示する。そのイラストやテキストにより、ユーザーにとってキャリブレーターの設置位置や量が確認しやすくなり、オペレーションミスの防止に役立つ。

上記のように構成された本発明は、キャリブレーターの測定と被検体の測定の間に空サイクル動作を介在させる必要がないため、測定時間の短時間化に寄与する。

本発明の一実施形態における測定装置の図である。 図１に示す測定装置の構成図である。 図１に示す測定装置の測定設定画面で、測定時の測定モードを選択可能な入力画面の一例である。 図１に示す測定装置のキャリブレーション設定画面で、キャリブレーションモードとしてＳｈｏｒｔモードを設定した際の入力画面の一例である。 図１に示す測定装置のキャリブレーション設定画面で、キャリブレーションモードとしてＬｏｎｇモードを設定した際の入力画面の一例である。 図１に示す測定装置のキャリブレーション設定画面で、キャリブレーションモードとしてＳｈｏｒｔモードおよびＬｏｎｇモードを設定した際の入力画面の一例である。 実施形態の手順の一例を示したフローチャートである。

本発明の実施の形態を、添付の図面を参照して詳細に説明する。図１に液体クロマトグラフィーを測定原理とするヘモグロビン分析装置１０００を例示する。本発明に係る液体クロマトグラフ装置の測定対象は、ヘモグロビンに限定されず、リポ蛋白、アミノ酸、カテコールアミン、ビタミン類、アルブミン、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール、クレアチニン、尿酸などが例示でき、検体種も血液のみならず尿、細胞、唾液、涙、便またはそれらの由来物などが例示できる。

測定装置１０００の構成をブロック図（図２）に示す。測定装置１０００には、３種の溶離液（１０、１１、１２）を脱気する脱気ユニット１３、溶離液を送液する送液ユニット（送液プランジャーポンプ）１４、溶離液の混合比を切り替えるための電磁弁ユニット（１５、１６、１７）が設けられ、試料を注入するためのオートサンプラーユニット１８、分析カラム１９、吸光光度検出器２０が設けられる。分析カラム１９はカラムオーブン２１により２５℃で一定に温調される。これら各ユニットの動作、温調は、制御／処理部２２で制御される。吸光光度検出器２０から得られる検出信号は、制御／処理部２２に取り込まれ、検出器信号のプロットデータからクロマトグラムデータを作成し、そのクロマトグラムを表示部２４で測定結果の一部として出力する。制御／処理部２２では、ノイズ処理、クロマトグラムの波形処理、ピーク同定処理、定量なども実施される。カラムオーブン温調、ポンプ流速、あるいは電磁弁の切り替えプログラム等の各種パラメータは格納部２３に記憶される。

液体クロマトグラフが複数の測定モードを有する場合、それらの測定モードは、グラジエント条件、測定時間、ポンプ送液流速、カラムオーブン温度、検体注入量などの測定条件のうち一つ以上の条件が異なっている。それらの測定条件を構成する制御パラメータのセットが格納部２３に格納される。また、測定データ、クロマトグラムそしてそれらに伴う測定モード情報を含む各種条件情報はデータベース等の形でデータ保存部２５に保存される。

制御／処理部２２はマイコンあるいはパーソナルコンピューターで構成することができ、格納部２３やデータ保存部２５は制御／処理部２２と一体化したユニットであってもよく、または外部ストレージのように分離されたユニットであってもよい。また表示部２４は、定量結果が表示可能なディスプレイであればよいが、クロマトグラムを表示可能な液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などが望ましく、さらに入力部や操作部を兼ねたタッチパネルＬＣＤが望ましく、図１に示すように装置と一体化されていることがより望ましい。測定装置１０００は、装置全体の小型化、送液流路容積の削減、システム全体の最適化、そしてコストダウン等を目的として、これらユニット、処理／制御部、格納部そして表示部が一体化されたシステムである。

試料の供給手段としては、試料容器３０および採血管３１を設置した容器ラック２９を用いて試料吸引部３２の作動領域に搬送するラックローダー方式が例示できる。さらにラックローダー２８の搬送路とは独立して緊急検体を設置可能なＳＴＡＴポート２６を設置することができる。試料吸引部３２の手前に置かれた検体識別情報読み取り部２７は、容器ラック２９で搬送される容器の有無と種類、検体ＩＤの識別を行う。採血管、容器アダプターまたは容器ラック２９等に貼付されたバーコード等の識別子から情報を読み取り、測定結果にその情報を付与することができる。

測定装置１０００は、一例としてその格納部２３の中に、迅速測定に適したＳｈｏｒｔモードと、精密測定に適したＬｏｎｇモードの二つの測定モードを有している。いずれの測定モードも主たる測定項目は、糖化ヘモグロビンであるＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンＡ１ｃ、ｓ－Ａ１ｃ、安定型Ａ１ｃ）である。Ｓｈｏｒｔモードは、Ａ１ａ、Ａ１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ－Ａ１ｃ（不安定型Ａ１ｃ）、ＨｂＡ１ｃおよびＡ０を含む６つのピークにヘモグロビンを分画する。また検体によっては６つ以上のピークに分画される。これらの分画は１検体当たり３０秒で測定可能である。

一方で、Ｌｏｎｇモードでは、Ｓｈｏｒｔモードによって分画される６つの分画に加えて、主要な異常ヘモグロビン（異常Ｈｂ）であるＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、そしてＨｂＣの非糖化ピークまたは糖化ピークを分離することが可能である。Ｌｏｎｇモードの測定時間は、たとえば１測定あたり５０秒である。測定装置１０００を用いた運用例としては、通常はＳｈｏｒｔモードで測定し、その結果から異常Ｈｂの存在が推量される場合に、Ｌｏｎｇモードで再検査して異常Ｈｂの存在を確かめるとともに、正確なＨｂＡ１ｃ濃度を定量する方法が挙げられる。本実施形態は、二つの測定モードを用いて説明するが、測定装置１０００に搭載する測定モードは３以上であってもよく、例えばＬｏｎｇモードよりさらに分画数を増やした測定モードや測定時間をさらに延ばした測定モードを設けることも可能である。

検体測定の測定モードの切り替えは、測定装置の待機中に図３のような入力画面を操作することにより、格納部に保管された別の測定モード情報を呼び出して切り替えることが可能である。制御部は切り替えられた条件に従って各ユニットの制御を変更する。たとえば装置起動時、測定待機中の任意のタイミング、または測定中であっても測定予定の任意の検体に対して切り替え設定が可能である。したがって、分析カラムや溶離液をはじめとする消耗品や測定試薬は、測定中の交換を避けるために測定モード間で共通であることが望ましい。測定モードの切り替えにおいては、溶離液混合比率を変更するグラジエント条件や測定結果の収集取り込み時間などの分析条件の少なくとも一部を、異なるパラメータ―に変更する。

ＨＰＬＣ法で測定するＨｂＡ１ｃのピーク面積比（生値、生データまたは出力信号比）と臨床の現場で報告されるＨｂＡ１ｃ（％）濃度は厳密には異なることが知られている。また、米国を中心に普及しているＮＧＳＰ値や、国際臨床化学連合が開発したＩＦＣＣ値をはじめとする各種標準化への準拠を担うために、測定により得られた生値に対してキャリブレーターを用いてキャリブレーションをする必要がある。キャリブレーターは、あらかじめ試薬メーカー等により上位標準品などから値付けがなされている。１種から３種程度のキャリブレーターを測定試料に先立って測定し、得られた結果と値付けされた値により検量線を作成する。その後、検体に対する出力信号を本検量線に当てはめて変換し報告値を得る。キャリブレーションは検体の測定ごとに実施するのが理想的であるが、実際はコスト削減と効率化のため、カラムを交換した際に、またはコントロール試料の測定結果が所定の基準から逸脱した際に実施されることが一般的である。

キャリブレーションの測定条件は、図４から図６で例示される入力画面（入力手段）により設定する。これらの入力画面でキャリブレーションが予約設定された状態で測定が開始された場合に限り、あらかじめ規定された位置に配置された試料をキャリブレーターとして認識し、キャリブレーションを実施する。キャリブレーションの入力画面には、測定モードを選択するキャリブレーションモード選択部１０１、キャリブレーター基準値入力部１０２、キャリブレーターロット入力部１０３、キャリブレーター使用期限入力部１０４などの入力部を備える。これらの入力は手動で直接入力することも可能だが、たとえばキャリブレーターの梱包箱、ラベル、付属書などに付されたバーコード等の情報を読み取って自動入力させることもできる。

またこれらの入力情報を消去するクリアボタン１０５を設けてもよい。これらの入力画面において、キャリブレーターの種類と測定モードを入力すると、表示手段としてのキャリブレーター設置図１０６に示すように、キャリブレーター名とその必要量が処理予定の順序に応じた設置位置にイラストおよびテキストにより表示される。入力画面で測定モード条件を変更するとそれに応じてキャリブレーター設置図１０６の情報も更新される。

通常、キャリブレーションから測定を開始する装置において、装置の慣らし運転のため、キャリーオーバーが生じないダミー試料を、キャリブレーション測定の前に装置に注入して測定動作をさせ、キャリブレーションの安定化を図ることがある。たとえば、一番先頭に設置されたキャリブレーターの一部をダミー試料として使用する。キャリブレーターは、一試料あたり少なくとも２回測定することが一般的である。その際、測定再現性を評価し、測定結果間で乖離がみられた場合はキャリブレーションを停止もしくは検量線を棄却する。

したがってキャリブレーターとして濃度の異なるレベル１、レベル２の試料の一測定当たりの必要量が１５０μＬの場合は、レベル１（ＣＡＬ１）はダミー測定１測定分、キャリブレーション測定２測定分の計３測定分の４５０μＬを要する。レベル２（ＣＡＬ２）はキャリブレーション測定２測定分の３００μＬを要する。測定モードとして、Ｓｈｏｒｔモードが選択された場合の態様を図４に、Ｌｏｎｇモードが選択された場合の態様を図５にそれぞれ示した。図６に示すように、ＳｈｏｒｔモードとＬｏｎｇモードの両方を一度にキャリブレーションする場合、レベル１（ＣＡＬ１）はＳｈｏｒｔモードでダミー測定１測定分、キャリブレーション測定２測定分の計３測定分の４５０μＬと、レベル２（ＣＡＬ２）は同じくＳｈｏｒｔモードでキャリブレーション測定２測定分の３００μＬを要する。

さらに、測定モードは変わるものの、連続して測定を実施するためにダミー測定が不要となるため、Ｌｏｎｇモードで測定するレベル１（ＣＡＬ１）はキャリブレーション測定２測定分の３００μＬと、同じくＬｏｎｇモードで測定するレベル２（ＣＡＬ２）はキャリブレーション測定２測定分の３００μＬを要する。

上記のように、測定モードの組み合わせ方や各キャリブレーターの測定順序（設置位置）によって用意すべきキャリブレーター試料の必要量が変化するため、作業者が一元的に管理することは難しく、最も多く使用する試料の量に揃えると検体の無駄が生じてランニングコストが上がることとなる。しかしながら、本発明に係る液体クロマトグラフ装置の入力手段および表示手段によって、ユーザーにとってキャリブレーターの設置位置や量が確認しやすくなり、オペレーションの負担軽減やランニングコストの低減ができる。また、ＳｈｏｒｔモードとＬｏｎｇモードで異なるキャリブレーターを使用する場合であっても、例えばレベル１、レベル２のみならず、レベル３、レベル４のキャリブレーター情報の入力欄を加えることで容易に対応することができる。

ところで、連続測定中に測定モードを切り替えた場合、切り替え前後のモードにおける洗浄時間または平衡化時間の違い、送液流量の差などにより、モードを切り替えた直後の測定条件ではピークの溶出時間が異なるまたはピークの高さが変化するなど、意図した結果が得られなくなる現象がある。この現象を避けるために、モード切り替え直後には空サイクルの測定動作が必要となる。２つの測定モードを連続してキャリブレーションする場合は、キャリブレーション中に１回のモード切り替えの動作を挟むことになる。キャリブレーションに続けて通常検体の測定を実施する場合は、さらにもう一度モード切り替えの動作を必要とする場合がある。これは現在設定されている測定モードとキャリブレーション時の測定モードの順序に依存することになる。

本発明の液体クロマトグラフ装置を構成する制御部は、現在設定されている検体の測定モードまたは検体測定時に設定される測定モードを監視しつつ、キャリブレーション予約時に設定された測定モード条件を読み取って、キャリブレーション時の測定順序を変更することができる。すなわち、複数の測定モードが設定されたキャリブレーション条件で、かつその一つが検体測定時の測定モードを含む場合は、キャリブレーションの最後に実施される測定モードが検体測定時の測定モードと同じものになるように制御する。

その手順を図７のフローチャートにより説明する。まず、検体測定の測定モードを図３に示す入力画面で選択または確認する（ステップＳ１）。つづいて、キャリブレーション設定（図４～６）で複数の測定モードを使用する設定の選択または確認をする（ステップＳ２）。キャリブレーションの測定モードが単一設定（ステップ３でＮｏ）の場合は、指定された測定モードでキャリブレーションを実施する（ステップＳ８）。つづいて、キャリブレーションモードと測定モードが異なる（ステップＳ９でＮｏ）場合は、検体測定の測定モードへの切り替え動作（ステップＳ１０）を実施したあとに検体測定を実施する（ステップＳ１１）。キャリブレーションの測定モードと検体測定の測定モードが同じ（ステップＳ９でＹｅｓ）場合は、測定モード切り替え動作を省略して検体測定に移行する（ステップＳ１３）。

一方で、キャリブレーションの測定モードに複数のモードが指定されている（ステップ３でＹｅｓ）場合は、選択されたモードの中に検体測定のモードが含まれるかどうかを確認する（ステップＳ４）。選択されたモードの中に検体測定モードが含まれない場合（ステップＳ４でＮｏ）は、異なるモードについて逐一キャリブレーションを実行する（ステップＳ１１）。その際、異なる測定モードのキャリブレーションの動作前には、モード切り替えとそれに伴う空サイクル動作を実行し、キャリブレーションの最後に検体測定のモードへのモード切り替え動作（ステップＳ１２）を実施する。

選択されたＣＡＬのモードに検体測定と同じモードが有る（Ｓ４でＹｅｓ）場合は、異なるモードについて逐一キャリブレーションを実行する（ステップＳ５）。その際、異なる測定モードのキャリブレーションの動作前には、モード切り替えとそれに伴う空サイクル動作を実行し、検体測定のモード以外のキャリブレーションをすべて実施する。検体測定のモードに切り替え（Ｓ６）、検体測定のモードでキャリブレーションを実行（Ｓ７）し、モード切り替えや空サイクル動作を実施せずに検体の測定に移行する（Ｓ１３）。

１０、１１、１２ 溶離液
１３ 脱気ユニット
１４ 送液ユニット（送液ポンプ）
１５、１６、１７ 電磁弁
１８ オートサンプラーユニット
１９ 分析カラム
２０ 吸光光度検出器
２１ カラムオーブン
２２ 制御／処理部
２３ 格納部
２４ 入力部兼表示部
２５ データ保存部
２６ ＳＴＡＴポート
２７ 検体識別情報読み取り部
２８ ラックローダー
２９ 容器ラック
３０ キャリブレーターの入った試料カップ
３１ 被検体の入った採血管
３２ 試料吸引部
１００ 測定モード選択部
１０１ キャリブレーションモード選択部
１０２ キャリブレーター基準値入力部
１０３ キャリブレーターロット入力部
１０４ キャリブレーター有効期限入力部
１０５ 入力クリアボタン
１０６ キャリブレーター設置図
１０００ 分析装置

Claims (5)

1. 液体クロマトグラフィーによる測定方法であって、検体の測定に先立ち、キャリブレーターを複数の測定モードで測定する際、最後のキャリブレーターの測定に適用する測定モードが、その直後の検体の測定に適用する測定モードと同じになる測定順序で、キャリブレーターおよび検体を測定する前記測定方法。
2. 検体の測定に適用する測定モードの入力を受け付け可能な第１の入力手段と、
   測定するキャリブレーターの識別情報と、前記キャリブレーターの測定に適用する複数の測定モードとの入力を受け付け可能な第２の入力手段と、
   前記第２の入力手段に入力されたキャリブレーターの測定を、第１の入力手段に入力された測定モードを適用する検体の測定に優先させるという第１の制御規則と、連続して実行するキャリブレーターの測定および検体の測定には同じ測定モードを適用するという第２の制御規則とに基づいて測定順序を制御する制御手段と、
   を備えた液体クロマトグラフ装置。
3. 検体の測定に適用する測定モードの入力を受け付け可能な第１の入力手段と、
   測定するキャリブレーターの識別情報と、前記キャリブレーターの測定に適用する複数の測定モードとの入力を受け付け可能な第２の入力手段と、
   前記第２の入力手段に入力されたキャリブレーターを測定のために設置する態様を案内表示する表示手段であって、前記第１の入力手段で入力された測定モードと同じ測定モードを適用して測定するキャリブレーターを最後に処理する位置に設置するように案内表示する前記表示手段と、
   を備えた液体クロマトグラフ装置。
4. 前記表示手段は、キャリブレーターを容器に分注した状態のイラストと、容器ラックの所定位置に処理予定の順に載置したイラストとともに、前記容器の内容物とその必要量を示すテキストを表示する、請求項３に記載の液体クロマトグラフ装置。
5. 前記キャリブレーターの識別情報は、値付けされた基準値を含む、請求項２から４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ装置。