JP3311124B2 - 液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法 - Google Patents
液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法Info
- Publication number
- JP3311124B2 JP3311124B2 JP30646393A JP30646393A JP3311124B2 JP 3311124 B2 JP3311124 B2 JP 3311124B2 JP 30646393 A JP30646393 A JP 30646393A JP 30646393 A JP30646393 A JP 30646393A JP 3311124 B2 JP3311124 B2 JP 3311124B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mobile phase
- peak
- elution
- gradient method
- component
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、溶出力の異なる少なく
とも２種の移動相を用いる液体クロマトグラフィーに関
し、より詳細には、移動相の組成を変化させて、対象と
する溶出成分を、溶出ピークどうしの分離度および各成
分の定量性を低下することなく短時間で分離ないしは定
量するのに適用されるグラジエント方法に関する。
とも２種の移動相を用いる液体クロマトグラフィーに関
し、より詳細には、移動相の組成を変化させて、対象と
する溶出成分を、溶出ピークどうしの分離度および各成
分の定量性を低下することなく短時間で分離ないしは定
量するのに適用されるグラジエント方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、液体クロマトグラフィーにおい
て、２種以上の移動相を使用し測定を行う場合、ステッ
プグラジエント、リニアグラジエント等のグラジエント
方法が適用されている。特に、液体クロマトグラフィー
によって、混合物をその成分ごとに分離する場合、高分
離能のクロマトグラムを短時間で得るには、上記２法に
代表されるグラジエント方法が好適である。
て、２種以上の移動相を使用し測定を行う場合、ステッ
プグラジエント、リニアグラジエント等のグラジエント
方法が適用されている。特に、液体クロマトグラフィー
によって、混合物をその成分ごとに分離する場合、高分
離能のクロマトグラムを短時間で得るには、上記２法に
代表されるグラジエント方法が好適である。
【０００３】ステップグラジエント法についてより詳し
く説明する。
く説明する。
【０００４】この方法は、２種類以上の移動相を使用
し、各移動相の切り換え弁の開閉または送液ポンプのオ
ン・オフによって２種類以上の移動相を適宜切り替えて
供給することを特徴とする。この方法では、移動相の溶
出力は、その切り換えと同時に段階的に変化する。
し、各移動相の切り換え弁の開閉または送液ポンプのオ
ン・オフによって２種類以上の移動相を適宜切り替えて
供給することを特徴とする。この方法では、移動相の溶
出力は、その切り換えと同時に段階的に変化する。
【０００５】他方、リニアグラジエント法は、やはり２
種類以上の移動相を使用し、各移動相専用の送液ポンプ
の送液量（速度）を調整することによって各移動相の供
給流量を連続的に変化させることを特徴とする。この方
法では、移動相の溶出力は、各送液ポンプの送液速度の
変化に伴って連続的に変化する。
種類以上の移動相を使用し、各移動相専用の送液ポンプ
の送液量（速度）を調整することによって各移動相の供
給流量を連続的に変化させることを特徴とする。この方
法では、移動相の溶出力は、各送液ポンプの送液速度の
変化に伴って連続的に変化する。
【０００６】上記２法は、両者とも、溶出力の最も弱い
移動相が最初に送液され、ついでこれが溶出力のより強
い移動相に順次切り替えられ、または連続的に変化され
ていくグラジエント法である。
移動相が最初に送液され、ついでこれが溶出力のより強
い移動相に順次切り替えられ、または連続的に変化され
ていくグラジエント法である。
【０００７】これら２法の利点は、溶出時間の異なる多
くの対象成分を短時間で溶出する場合に特に発揮され
る。なぜなら、グラジエント法は、個々の対象成分に対
して、最も良好な分離能を与え、かつ最も短時間で分離
が可能となる溶出力を示すように、溶離条件を選択して
分析が行えるからである。
くの対象成分を短時間で溶出する場合に特に発揮され
る。なぜなら、グラジエント法は、個々の対象成分に対
して、最も良好な分離能を与え、かつ最も短時間で分離
が可能となる溶出力を示すように、溶離条件を選択して
分析が行えるからである。
【０００８】しかし、蛋白質等を含む生体試料のように
多種多様の夾雑物を分析する場合には、クロマトグラム
の多数の溶出ピークの分離能が悪く、個々のピークにそ
れぞれリーディング及びテーリングが発生し、ピークの
幅が広がってしまう現象が多く見受けられる。
多種多様の夾雑物を分析する場合には、クロマトグラム
の多数の溶出ピークの分離能が悪く、個々のピークにそ
れぞれリーディング及びテーリングが発生し、ピークの
幅が広がってしまう現象が多く見受けられる。
【０００９】例えば、特開平３−１１８４６６に記載の
糖化ヘモグロビンの定量法や、特開昭６３−７５５５８
に記載のグリコヘモグロビン分析法に従って血液試料を
分析する場合、個々のピークがかなり幅広になり、明瞭
に分離できない場合がよくある。
糖化ヘモグロビンの定量法や、特開昭６３−７５５５８
に記載のグリコヘモグロビン分析法に従って血液試料を
分析する場合、個々のピークがかなり幅広になり、明瞭
に分離できない場合がよくある。
【００１０】このような場合、カラムの変更なしで分離
状態を改善するには、移動相の溶出力を弱くして各溶出
成分をできるだけゆっくり溶出してやる必要がある。
状態を改善するには、移動相の溶出力を弱くして各溶出
成分をできるだけゆっくり溶出してやる必要がある。
【００１１】しかし、溶出をゆっくり行うことによって
分離能はある程度改善されるが、測定時間は大幅に長く
なってしまう。
分離能はある程度改善されるが、測定時間は大幅に長く
なってしまう。
【００１２】また、ステップグラジエント法、リニアグ
ラジエント法等を用いて、移動相の溶出力を徐々に強め
て、溶出を速めてやろうとすると、ピーク間の谷間部分
がベースライン付近まで落ち切らないうちに、つぎの成
分の溶出ピークの立上りが始まってしまい、該谷間部分
の分割が困難になるため、試料中の各成分の定量性が悪
くなる。
ラジエント法等を用いて、移動相の溶出力を徐々に強め
て、溶出を速めてやろうとすると、ピーク間の谷間部分
がベースライン付近まで落ち切らないうちに、つぎの成
分の溶出ピークの立上りが始まってしまい、該谷間部分
の分割が困難になるため、試料中の各成分の定量性が悪
くなる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】一般に液体クロマトグ
ラフィーで対象成分の分離、定量を行う場合、次の２点
の要請がある。
ラフィーで対象成分の分離、定量を行う場合、次の２点
の要請がある。
【００１４】・ピークの分離度を上げ、個々のピークの
定量性を向上する、 ・ピークの溶出時間を短くし、分析に必要な全時間を短
縮する。
定量性を向上する、 ・ピークの溶出時間を短くし、分析に必要な全時間を短
縮する。
【００１５】上記２点の要請は、通常、相反するもので
ある。
ある。
【００１６】なぜなら、一般に、各ピークの溶出時間を
短縮するためには、 ・移動相の流速を上げる、 ・移動相の分析試料に対する溶出力を上げる、 等の処置をとるが、これにより多くの場合、各ピークの
分離度が低下してしまい、ピーク間の谷間部分がベース
ラインまで落ち切らないうちに、つぎの成分の溶出ピー
クの立上りが始まってしまう等の問題が起きる。
短縮するためには、 ・移動相の流速を上げる、 ・移動相の分析試料に対する溶出力を上げる、 等の処置をとるが、これにより多くの場合、各ピークの
分離度が低下してしまい、ピーク間の谷間部分がベース
ラインまで落ち切らないうちに、つぎの成分の溶出ピー
クの立上りが始まってしまう等の問題が起きる。
【００１７】一般に、試料中の各成分の定量は、その成
分のピークの面積から求められるが、上記理由のため、
各ピークの分離度および各成分の定量性が悪くなってし
まう。
分のピークの面積から求められるが、上記理由のため、
各ピークの分離度および各成分の定量性が悪くなってし
まう。
【００１８】また逆に、各ピークの分離度を上げ、各成
分の定量性を向上するためには、 ・移動相の流速を下げ、カラム中の移動相の線速度を下
げる、 ・カラム長を長くして、各ピークの分離度を上げる、 等の処置が一般的であるが、これらは対象成分の溶出を
遅らせることなので、結局、分析時間が長くなる。
分の定量性を向上するためには、 ・移動相の流速を下げ、カラム中の移動相の線速度を下
げる、 ・カラム長を長くして、各ピークの分離度を上げる、 等の処置が一般的であるが、これらは対象成分の溶出を
遅らせることなので、結局、分析時間が長くなる。
【００１９】上記の相反する要請を同時に満足させる方
策として、カラムに詰める充填剤の改良が進められてお
り、種々の試料物質について短時間で良好な分離性能が
得られている。
策として、カラムに詰める充填剤の改良が進められてお
り、種々の試料物質について短時間で良好な分離性能が
得られている。
【００２０】しかし、対象とする試料物質によっては、
定量のために用いるには依然として不十分な分離しか得
られない場合も多い。
定量のために用いるには依然として不十分な分離しか得
られない場合も多い。
【００２１】特に、蛋白質等の生体物質の分析では、各
ピークが幅広くなる場合が多いので、上記問題が頻繁に
発生してしまい、個々の対象成分の定量が困難になる。
ピークが幅広くなる場合が多いので、上記問題が頻繁に
発生してしまい、個々の対象成分の定量が困難になる。
【００２２】本発明の目的は、各ピークの分離度および
各成分の定量性を悪くすることなしに、測定時間を短縮
することができるグラジエント方法を提供することにあ
る。
各成分の定量性を悪くすることなしに、測定時間を短縮
することができるグラジエント方法を提供することにあ
る。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成すべく工夫されたものであり、溶出力の異なる少なく
とも２種の移動相を用いる液体クロマトグラフィーにお
いて、対象成分の溶出ピークが立上がり始めた後、移動
相の溶出力を上げるように移動相の組成を段階的もしく
は連続的に変化させて対象成分を溶出させ、ついで対象
成分の溶出ピークが落ち切りる前に、移動相の溶出力を
下げるように移動相の組成を変化させることを特徴とす
る液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法で
ある。
成すべく工夫されたものであり、溶出力の異なる少なく
とも２種の移動相を用いる液体クロマトグラフィーにお
いて、対象成分の溶出ピークが立上がり始めた後、移動
相の溶出力を上げるように移動相の組成を段階的もしく
は連続的に変化させて対象成分を溶出させ、ついで対象
成分の溶出ピークが落ち切りる前に、移動相の溶出力を
下げるように移動相の組成を変化させることを特徴とす
る液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法で
ある。
【００２４】本発明によるグラジエント方法は、個々の
対象成分の溶出ごとに繰り返し行われる。
対象成分の溶出ごとに繰り返し行われる。
【００２５】移動相の溶出力を段階的または連続的に変
化させるには、ステップグラジエント法またはリニアグ
ラジエント法を行う場合と同様に、２種以上の移動相の
切り換え弁または送液ポンプのオン・オフによって各移
動相の供給を適宜切り替えるか、または、各移動相専用
の送液ポンプの送液量（速度）を調整することによって
各移動相の供給流量を連続的に変化させる。
化させるには、ステップグラジエント法またはリニアグ
ラジエント法を行う場合と同様に、２種以上の移動相の
切り換え弁または送液ポンプのオン・オフによって各移
動相の供給を適宜切り替えるか、または、各移動相専用
の送液ポンプの送液量（速度）を調整することによって
各移動相の供給流量を連続的に変化させる。
【００２６】以下にステップグラジエント法を応用した
本発明のグラジエント方法について説明する。
本発明のグラジエント方法について説明する。
【００２７】図１は、比較的弱い溶出力を持つ移動相Ｉ
を用いて、１液のみからなる移動相を用いて対象成分を
分離し、分光光度計を用いて測定したクロマトグラムで
ある。
を用いて、１液のみからなる移動相を用いて対象成分を
分離し、分光光度計を用いて測定したクロマトグラムで
ある。
【００２８】この分析に本発明のグラジエント方法を適
応する場合、仮に定量すべき対象成分がピーク１である
とき、ピーク１の溶出が始まるまで移動相Ｉを送液して
おく。
応する場合、仮に定量すべき対象成分がピーク１である
とき、ピーク１の溶出が始まるまで移動相Ｉを送液して
おく。
【００２９】そして、ピーク１の溶出に重なるように、
移動相を移動相Ｉからそれよりも強い溶出力をもつ移動
相IIに切り換える。
移動相を移動相Ｉからそれよりも強い溶出力をもつ移動
相IIに切り換える。
【００３０】このことにより、ピーク１は図１に示され
るよりも速く溶出し終るが、ピーク１の溶出が終る前
に、移動相を移動相IIから上記移動相Ｉ、もしくは移動
相IIよりも弱い溶出力をもつ移動相III に切り換える。
るよりも速く溶出し終るが、ピーク１の溶出が終る前
に、移動相を移動相IIから上記移動相Ｉ、もしくは移動
相IIよりも弱い溶出力をもつ移動相III に切り換える。
【００３１】移動相を移動相Ｉから移動相IIに切り替え
る（溶出力を上げる）タイミングとしては、移動相Ｉに
よりピーク１が立上がり始め、ピーク１の溶出物の濃度
（ここでは吸光度が目安になる）が、［（ピーク１の最
大吸光度）−（ピーク１とその前のピークとの間の谷間
部分の最小吸光度）］の１／５以上に達した時点が好ま
しい。
る（溶出力を上げる）タイミングとしては、移動相Ｉに
よりピーク１が立上がり始め、ピーク１の溶出物の濃度
（ここでは吸光度が目安になる）が、［（ピーク１の最
大吸光度）−（ピーク１とその前のピークとの間の谷間
部分の最小吸光度）］の１／５以上に達した時点が好ま
しい。
【００３２】また、移動相を移動相IIから、それより溶
出力の弱い移動相Ｉまたは移動相III に切り替える（溶
出力を下げる）タイミングとしては、ピーク１が落ち切
る前において、ピーク１の溶出物の濃度（やはり吸光度
が目安になる）が、［（ピーク１の最大吸光度）−（ピ
ーク１とその次のピークとの間の谷間部分の最小吸光
度）］の１／５以上の時点が好ましい。
出力の弱い移動相Ｉまたは移動相III に切り替える（溶
出力を下げる）タイミングとしては、ピーク１が落ち切
る前において、ピーク１の溶出物の濃度（やはり吸光度
が目安になる）が、［（ピーク１の最大吸光度）−（ピ
ーク１とその次のピークとの間の谷間部分の最小吸光
度）］の１／５以上の時点が好ましい。
【００３３】これらのタイミングがずれ、例えば、移動
相Ｉから移動相IIへの切り替えが、ピーク１の溶出物の
濃度が、［（ピーク１の最大吸光度）−（ピーク１とそ
の前のピークとの間の谷間部分の最小吸光度）］の１／
５未満の時点で行われたり、または、移動相IIから移動
相Ｉまたは移動相III への切り替えが、ピーク１の溶出
物の濃度が、［（ピーク１の最大吸光度）−（ピーク１
とその次のピークとの間の谷間部分の最小吸光度）］の
１／５未満の時点で行われると、ピーク１の前に溶出し
た成分、または次に溶出されるはずの成分までが、ピー
ク１に重なって溶出し、ピーク１の定量性が失われる恐
れがあり、好ましくない。
相Ｉから移動相IIへの切り替えが、ピーク１の溶出物の
濃度が、［（ピーク１の最大吸光度）−（ピーク１とそ
の前のピークとの間の谷間部分の最小吸光度）］の１／
５未満の時点で行われたり、または、移動相IIから移動
相Ｉまたは移動相III への切り替えが、ピーク１の溶出
物の濃度が、［（ピーク１の最大吸光度）−（ピーク１
とその次のピークとの間の谷間部分の最小吸光度）］の
１／５未満の時点で行われると、ピーク１の前に溶出し
た成分、または次に溶出されるはずの成分までが、ピー
ク１に重なって溶出し、ピーク１の定量性が失われる恐
れがあり、好ましくない。
【００３４】本発明で使用されるカラムおよび移動相
は、通常の液体クロマトグラフィーで使用されるもので
あり、分離対象成分に応じて最適なカラムおよび移動相
が選択される。
は、通常の液体クロマトグラフィーで使用されるもので
あり、分離対象成分に応じて最適なカラムおよび移動相
が選択される。
【００３５】次に、分離対象成分ごとに好ましいカラム
および移動相を例示する。
および移動相を例示する。
【００３６】(1) 蛋白質 ＧＰＣ用充填剤を詰めたカラムを使用し、移動相にはリ
ン酸緩衝液等を用いるか、または、充填剤表面を各種ア
ミノ基、カルボキシル基等で修飾したイオン交換タイプ
の充填剤を詰めたカラムを使用し、移動相にはリン酸緩
衝液等を用いる。
ン酸緩衝液等を用いるか、または、充填剤表面を各種ア
ミノ基、カルボキシル基等で修飾したイオン交換タイプ
の充填剤を詰めたカラムを使用し、移動相にはリン酸緩
衝液等を用いる。
【００３７】(2) 糖の場合 表面をアミノ基で修飾した充填剤を詰めたカラムを使用
し、移動相にはアセトニトリル／水系緩衝液等の混合溶
媒を用いる。
し、移動相にはアセトニトリル／水系緩衝液等の混合溶
媒を用いる。
【００３８】(3) ペプチドの場合 通常のＯＤＳカラムを使用し、移動相にはアセトニトリ
ル／水系緩衝液等を用いる。
ル／水系緩衝液等を用いる。
【００３９】(4) アミノ酸の場合 表面をスルフォニル基で修飾した充填剤を詰めたカラム
を使用し、移動相にはクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等
を用いる。
を使用し、移動相にはクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等
を用いる。
【００４０】(5) 核酸の場合 表面をアミノ基で修飾した充填剤を詰めたカラムを使用
し、移動相にはアセトニトリル／水系緩衝液等の混合溶
媒を用いる。
し、移動相にはアセトニトリル／水系緩衝液等の混合溶
媒を用いる。
【００４１】本発明で使用される移動相としては、上記
のような２液系または３液系の場合、移動相IIの１液の
みで溶出を行った場合のピーク１成分の溶出時間が、移
動相Ｉまたは移動相III のうち溶出力の弱い方の１液の
みで溶出を行った場合のピーク１成分の溶出時間の１／
２〜１／５であることが好ましい。
のような２液系または３液系の場合、移動相IIの１液の
みで溶出を行った場合のピーク１成分の溶出時間が、移
動相Ｉまたは移動相III のうち溶出力の弱い方の１液の
みで溶出を行った場合のピーク１成分の溶出時間の１／
２〜１／５であることが好ましい。
【００４２】また、このグラジエント方法を、個々の対
象成分の溶出ごとに繰り返す場合も、上記の操作の要領
で操作を行い、使用される移動相は、やはり対象とする
成分の溶出に最適になるように選択され、対象成分ごと
にすべて異なる溶出力をもつ移動相を使用することもあ
る。
象成分の溶出ごとに繰り返す場合も、上記の操作の要領
で操作を行い、使用される移動相は、やはり対象とする
成分の溶出に最適になるように選択され、対象成分ごと
にすべて異なる溶出力をもつ移動相を使用することもあ
る。
【００４３】また、定量に関係のないピークが複数本隣
接して溶出する場合には、これらのピークをまとめて１
本のピークとして溶出させてもよい。
接して溶出する場合には、これらのピークをまとめて１
本のピークとして溶出させてもよい。
【００４４】本発明によるグラジエント方法をリニアグ
ラジエントを用いて行うことも可能である。
ラジエントを用いて行うことも可能である。
【００４５】移動相の溶出力の変化は、段階的に行って
もまた連続的に行ってもよい。連続的な変化をさせるに
は、上記のように溶出される対象成分のピークに応じて
移動相の組成を変える。
もまた連続的に行ってもよい。連続的な変化をさせるに
は、上記のように溶出される対象成分のピークに応じて
移動相の組成を変える。
【００４６】
【作用】本発明方法では、ピークの溶出に応じて移動相
の溶出力を変化させることによって、対象成分の溶出を
速めるとともに、ピーク間の谷間部分をほぼベースライ
ンまで落とすことができる。そのため、ピークどうしの
分離度および各成分の定量性を低下することなく、対象
成分の溶出を速めることができ、分析に必要な時間を短
縮することができる。
の溶出力を変化させることによって、対象成分の溶出を
速めるとともに、ピーク間の谷間部分をほぼベースライ
ンまで落とすことができる。そのため、ピークどうしの
分離度および各成分の定量性を低下することなく、対象
成分の溶出を速めることができ、分析に必要な時間を短
縮することができる。
【００４７】また、個々のピークについて本発明の操作
を繰り返すことにより、分析に必要な全時間を大幅に短
縮することができる。
を繰り返すことにより、分析に必要な全時間を大幅に短
縮することができる。
【００４８】
【実施例】次に、実施例により本発明のグラジエント方
法を具体的に説明する。
法を具体的に説明する。
【００４９】＜実施例＞実施例として、糖尿病の臨床検
査項目であるグリコヘモグロビンの分析を行う。糖尿病
の臨床検査項目としては、グルコヘモグロビンのうち一
般的にＨｂＡｌｃが測定されているので、ＨｂＡｌｃの
定量を主目的として、本発明によるグラジエント方法を
用いてＨｂＡｌｃの溶出を行う。
査項目であるグリコヘモグロビンの分析を行う。糖尿病
の臨床検査項目としては、グルコヘモグロビンのうち一
般的にＨｂＡｌｃが測定されているので、ＨｂＡｌｃの
定量を主目的として、本発明によるグラジエント方法を
用いてＨｂＡｌｃの溶出を行う。
【００５０】グラジエント法としては３種類の成分から
なる移動相（移動相Ｉ、移動相IIおよび移動層III ）を
用いたステップグラジエント法を適用する。
なる移動相（移動相Ｉ、移動相IIおよび移動層III ）を
用いたステップグラジエント法を適用する。
【００５１】すなわち、ＨｂＡｌｃよりも先に溶出する
ＨｂＡｌａ、ＨｂＡｌｂ、ＨｂＦについては、より溶出
力の強い移動相IIですばやく溶出させ、ＨｂＦの溶出が
終る前に移動相IIを溶出力の弱い移動相Ｉに切り替え
る。そして、対象とするＨｂＡｌｃの溶出が始まった
後、移動相Ｉを再度移動相IIに切り替え、ＨｂＡｌｃの
溶出を早める。ＨｂＡｌｃの溶出が終る前に、移動相II
を移動相Ｉに切り替え、ＨｂＡｌｃ成分の溶出が完全に
終了した後、今度は、移動相Ｉを最も溶出力の強い移動
相III に切り替え、ＨｂＡｌｃ以降の、ＨｂＡｏを含む
すべての成分をまとめて溶出させる。
ＨｂＡｌａ、ＨｂＡｌｂ、ＨｂＦについては、より溶出
力の強い移動相IIですばやく溶出させ、ＨｂＦの溶出が
終る前に移動相IIを溶出力の弱い移動相Ｉに切り替え
る。そして、対象とするＨｂＡｌｃの溶出が始まった
後、移動相Ｉを再度移動相IIに切り替え、ＨｂＡｌｃの
溶出を早める。ＨｂＡｌｃの溶出が終る前に、移動相II
を移動相Ｉに切り替え、ＨｂＡｌｃ成分の溶出が完全に
終了した後、今度は、移動相Ｉを最も溶出力の強い移動
相III に切り替え、ＨｂＡｌｃ以降の、ＨｂＡｏを含む
すべての成分をまとめて溶出させる。
【００５２】以下に詳しく測定方法を説明する。
【００５３】移動相IIを送液ポンプにてカラムへ送液
する。
する。
【００５４】試料をカラム上流のインジェクターによ
り注入する。まず、移動相IIによりＨｂＡｌａ、ＨｂＡ
ｌｂ、ＨｂＦの各成分が分離、溶出される。
り注入する。まず、移動相IIによりＨｂＡｌａ、ＨｂＡ
ｌｂ、ＨｂＦの各成分が分離、溶出される。
【００５５】ＨｂＦ成分の溶出が終わる前に移動相II
が移動相I に切り換わるように、前もって移動相を切り
換えておく。このようにＨｂＦピークの溶出が終了する
前に移動相IIを移動相Ｉに切り替えることにより、Ｈｂ
ＦピークとＨｂＡｌｃピークの間の谷部部分が充分に落
ちる。
が移動相I に切り換わるように、前もって移動相を切り
換えておく。このようにＨｂＦピークの溶出が終了する
前に移動相IIを移動相Ｉに切り替えることにより、Ｈｂ
ＦピークとＨｂＡｌｃピークの間の谷部部分が充分に落
ちる。
【００５６】ＨｂＡｌｃの溶出ピークが立上がり始
め、その吸光度が、［（該ピークの最大吸光度）−（該
ピークとその前のピークとの間の谷間部分の最小吸光
度）］の１／５以上に達した時点で移動相Ｉが移動相II
に切り換わるように、前もって移動相を切り換えてお
く。この結果、ＨｂＡｌｃが移動相IIによりすばやく溶
出される。
め、その吸光度が、［（該ピークの最大吸光度）−（該
ピークとその前のピークとの間の谷間部分の最小吸光
度）］の１／５以上に達した時点で移動相Ｉが移動相II
に切り換わるように、前もって移動相を切り換えてお
く。この結果、ＨｂＡｌｃが移動相IIによりすばやく溶
出される。
【００５７】該ピークが落ち切る前に、ピークの吸光
度が、［（該ピークの最大吸光度）−（該ピークとその
次のピークとの間の谷間部分の最小吸光度）］の１／５
以上の時点で移動相が切り換わるように、前もって移動
相IIを移動相Ｉに切り換えておく。
度が、［（該ピークの最大吸光度）−（該ピークとその
次のピークとの間の谷間部分の最小吸光度）］の１／５
以上の時点で移動相が切り換わるように、前もって移動
相IIを移動相Ｉに切り換えておく。
【００５８】ＨｂＡｌｃピークと、その次に溶出され
てくるピークとの間の谷間部分が十分に落ち切った時点
で、移動相Ｉを移動相III に切り替える。この結果、Ｈ
ｂＡｏを含む他の成分が移動相III により溶出される。
てくるピークとの間の谷間部分が十分に落ち切った時点
で、移動相Ｉを移動相III に切り替える。この結果、Ｈ
ｂＡｏを含む他の成分が移動相III により溶出される。
【００５９】ＨｂＡｏのピークの溶出が終わった後、
移動相III をＩに切り換え、次の測定に備える。
移動相III をＩに切り換え、次の測定に備える。
【００６０】（測定）下記の装置および測定方法を用い
て、グリコヘモグロビンの測定を行う。
て、グリコヘモグロビンの測定を行う。
【００６１】 装置：送液ハポンプ ＬＣ−９Ａ （島津製作所社製） インジエクター ＳＩＬ−９Ａ （島津製作所社製） 検出器 ＳＰＤ−６ＡＤ（島津製作所社製） カラム恒温槽 ＣＴＯ−６Ａ （島津製作所社製） システムコントローラー ＳＣＬ−６Ａ （島津製作所社製） データ処理機 Ｃ−Ｒ６Ａ （島津製作所社製） カラム：ＭＩＣＲＯＮＥＸ−Ａｌｃ（積水化学工業社製） 移動相：Ｉ液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝６．０、塩濃度＝１４０ｍＭ） II液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝６．０、塩濃度＝１８０ｍＭ） III 液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝７．２、塩濃度＝３２０ｍＭ） ［グリコヘモグロビンに対する溶出能：III 液＞II液＞Ｉ液］ 試料：コントロール血液（国際試薬社製、特注品）の２００倍希釈液 測定条件 流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長：４１５ｎｍ カラム温度：４０℃ 試料注入量：３０μｌ 溶出条件：時間（分） 0.00→0.35→0.85→1.20→1.85→2.05→3.00 移動相の種類 II Ｉ II Ｉ III II
【００６２】上記測定条件で、グリコヘモグロビンの測
定を行った。得られたクロマトグラムを図２に示す。
定を行った。得られたクロマトグラムを図２に示す。
【００６３】図２から判るように、この方法では、上記
グラジエント法では、１検体の測定を３分間という短時
間で行うことができ、かつＨｂＡｌｃピークの前後の谷
間部分もベースラインにほぼ落ち切っており、ピークの
単離が実現できている。
グラジエント法では、１検体の測定を３分間という短時
間で行うことができ、かつＨｂＡｌｃピークの前後の谷
間部分もベースラインにほぼ落ち切っており、ピークの
単離が実現できている。
【００６４】比較例１（従来のステップグラジエント法
） 各ピークの分離を重視し、比較的弱い溶出力の移動相を
用いてグリコヘモグロビンの測定を行った。実施例で使
用した装置を用いて、測定を行う。カラムおよび測定試
料も実施例と同じものを使用する。
） 各ピークの分離を重視し、比較的弱い溶出力の移動相を
用いてグリコヘモグロビンの測定を行った。実施例で使
用した装置を用いて、測定を行う。カラムおよび測定試
料も実施例と同じものを使用する。
【００６５】 移動相：Ｉ液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝６．０、塩濃度＝１４０ｍＭ） II液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝７．２、塩濃度＝３２０ｍＭ） ［グリコヘモグロビンに対する溶出能：II液＞Ｉ液］ 測定条件 流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長：４１５ｎｍ カラム温度：４０℃ 試料注入量：３０μｌ
【００６６】上記測定条件で、グリコヘモグロビンの測
定を行った。得られたクロマトグラムを図３に示す。
定を行った。得られたクロマトグラムを図３に示す。
【００６７】図３から判るように、この方法では、ピー
クどうしの分離については良い結果が得られるが、１検
体当たりの測定時間が６分間もかかってしまう。
クどうしの分離については良い結果が得られるが、１検
体当たりの測定時間が６分間もかかってしまう。
【００６８】比較例２（従来のステップグラジエント法
） 測定時間の短縮を重視し、比較的強い溶出力の移動相を
用いてグリヘモグロビンの測定を行った。実施例で使用
した装置を用いて、測定を行う。カラムおよび測定試料
も実施例と同じものを使用する。
） 測定時間の短縮を重視し、比較的強い溶出力の移動相を
用いてグリヘモグロビンの測定を行った。実施例で使用
した装置を用いて、測定を行う。カラムおよび測定試料
も実施例と同じものを使用する。
【００６９】 移動相：Ｉ液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝６．０、塩濃度＝１６０ｍＭ） II液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝７．２、塩濃度＝３２０ｍＭ） ［グリヘモグロビンに対する溶出能：II液＞Ｉ液］ 測定条件 流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長：４１５ｎｍ カラム温度：４０℃ 試料注入量：３０μｌ
【００７０】上記測定条件で、グリコヘモグロビンの測
定を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。
定を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。
【００７１】図４から判るように、この方法では、１検
体当たりの測定時間は３分間と短時間で測定ができる
が、各ピーク間の谷間部分が充分に落ち切っていない時
点で次のピークの溶出が始まっており、ピークの分離状
態はあまり良くない。
体当たりの測定時間は３分間と短時間で測定ができる
が、各ピーク間の谷間部分が充分に落ち切っていない時
点で次のピークの溶出が始まっており、ピークの分離状
態はあまり良くない。
【００７２】比較例３（従来のリニアグラジェント法） 実施例で使用した装置を用いて、測定を行う。カラムお
よび測定試料も実施例と同じものを使用する。
よび測定試料も実施例と同じものを使用する。
【００７３】 移動相：Ｉ液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝６．０、塩濃度＝１５０ｍＭ） II液（リン酸系緩衝液、ｐＨ＝７．２、塩濃度＝３２０ｍＭ） ［グリヘモグロビンに対する溶出能：II液＞Ｉ液］ 測定条件 流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長：４１５ｎｍ カラム温度：４０℃ 試料注入量：３０μｌ 溶出条件：図６に示す
【００７４】上記測定条件で、グリコヘモグロビンの測
定を行った。得られたクロマトグラムを図５に示す。
定を行った。得られたクロマトグラムを図５に示す。
【００７５】図５から判るように、この方法では、１検
体当たりの測定時間は３分間と短時間で測定ができる
が、ＨｂＡｌｃピークの後の谷間部分が十分に落ち切っ
ていない時点で次のピークの溶出が始まっており、ピー
クの分離状態はあまり良くない。
体当たりの測定時間は３分間と短時間で測定ができる
が、ＨｂＡｌｃピークの後の谷間部分が十分に落ち切っ
ていない時点で次のピークの溶出が始まっており、ピー
クの分離状態はあまり良くない。
【００７６】
【発明の効果】本発明によるグラジエント方法では、ピ
ークの溶出に応じて移動相の溶出力を変化させることに
よって、対象成分の溶出を速めるとともに、ピーク間の
谷間部分をほぼベースラインまで落とすことができる。
そのため、ピークどうしの分離度および各成分の定量性
を低下することなく、対象成分の溶出を速めることがで
き、分析に必要な時間を短縮することができる。
ークの溶出に応じて移動相の溶出力を変化させることに
よって、対象成分の溶出を速めるとともに、ピーク間の
谷間部分をほぼベースラインまで落とすことができる。
そのため、ピークどうしの分離度および各成分の定量性
を低下することなく、対象成分の溶出を速めることがで
き、分析に必要な時間を短縮することができる。
【００７７】また、個々のピークについて本発明の操作
を繰り返すことにより、分析に必要な前時間を大幅に短
縮することができる。
を繰り返すことにより、分析に必要な前時間を大幅に短
縮することができる。
【００７８】こうして、本発明のグラジエント方法によ
れば、ピークどうしの分離度および各成分の定量性を低
下することなく、測定時間を大幅に短縮することができ
る。
れば、ピークどうしの分離度および各成分の定量性を低
下することなく、測定時間を大幅に短縮することができ
る。
【図１】１液のみからなる移動相を用いた場合のクロマ
トグラムである。
トグラムである。
【図２】実施例１で得られたクロマトグラムである。
【図３】比較例１で得られたクロマトグラムである。
【図４】比較例２で得られたクロマトグラムである。
【図５】比較例３で得られたクロマトグラムである。
【図６】比較例３の溶出条件を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】 溶出力の異なる少なくとも２種の移動相
を用いる液体クロマトグラフィーにおいて、対象成分の
溶出ピークが立上がり始めた後、移動相の溶出力を上げ
るように移動相の組成を段階的もしくは連続的に変化さ
せて対象成分を溶出させ、ついで対象成分の溶出ピーク
が落ち切りる前に、移動相の溶出力を下げるように移動
相の組成を変化させることを特徴とする液体クロマトグ
ラフィーにおけるグラジエント方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30646393A JP3311124B2 (ja) | 1993-12-07 | 1993-12-07 | 液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30646393A JP3311124B2 (ja) | 1993-12-07 | 1993-12-07 | 液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07159391A JPH07159391A (ja) | 1995-06-23 |
| JP3311124B2 true JP3311124B2 (ja) | 2002-08-05 |
Family
ID=17957320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30646393A Expired - Fee Related JP3311124B2 (ja) | 1993-12-07 | 1993-12-07 | 液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3311124B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101039964B (zh) * | 2004-08-12 | 2012-11-14 | 利普生技术有限公司 | 带电多糖的分级 |
| CN115166095A (zh) * | 2022-07-20 | 2022-10-11 | 江苏省食品药品监督检验研究院 | 一种蛋黄卵磷脂有关物质的检测方法 |
| CN115453030A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-12-09 | 博莱克科技（武汉）有限公司 | 一种提高气相色谱检测效率的方法 |
-
1993
- 1993-12-07 JP JP30646393A patent/JP3311124B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07159391A (ja) | 1995-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Granger et al. | Albumin depletion of human plasma also removes low abundance proteins including the cytokines | |
| Bietlot et al. | Analysis of recombinant human erythropoietin in drug formulations by high-performance capillary electrophoresis | |
| Benson Jr et al. | Accelerated chromatographic analysis of amino acids commonly found in physiological fluids on a spherical resin of specific design | |
| US20030168392A1 (en) | Multi-dimensional liquid chromatography separation system | |
| Guttman et al. | Multidimensional separations in the pharmaceutical arena | |
| US20080156080A1 (en) | Methods and systems for multidimensional concentration and separation of biomolecules using capillary isotachophoresis | |
| JPS594664B2 (ja) | イオン交換クロマトグラフイ− | |
| JP2619537B2 (ja) | 液体クロマトグラフの方法，その装置，そのシステム，及びその分離カラム | |
| Yuan et al. | Systematic investigation of orthogonal SPE sample preparation for the LC–MS/MS bioanalysis of a monoclonal antibody after pellet digestion | |
| Matsuda et al. | Analysis of drug–protein binding using on-line immunoextraction and high-performance affinity microcolumns: Studies with normal and glycated human serum albumin | |
| JP2004101477A (ja) | ２次元高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置 | |
| JP3508710B2 (ja) | アミノ酸分析方法および装置 | |
| Lee et al. | Optimization of reversed-phase microcapillary liquid chromatography for quantitative proteomics | |
| JP3311124B2 (ja) | 液体クロマトグラフィーにおけるグラジエント方法 | |
| JP3012685B2 (ja) | 生体液中のアミノ酸分析方法および装置 | |
| Linke et al. | Proteomic analysis of rat plasma by two-dimensional liquid chromatography and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry | |
| Fung et al. | A simple and inexpensive approach to interfacing high‐performance liquid chromatography and matrix‐assisted laser desorption/ionization‐time of flight‐mass spectrometry | |
| JP5084428B2 (ja) | アミノ酸分析方法 | |
| JPH04366762A (ja) | 液体クロマトグラフィーを利用したヘモグロビン類の分析装置及びヘモグロビン類の分析方法 | |
| Choudhary et al. | Integrated approach to the multidimensional analysis of complex biological samples by microseparation techniques: Analysis of glycoprotein factor associated with cancer cachexia | |
| Buckenmaier et al. | Dealing with Wandering First-Dimension Peaks in 2D-LC Separations | |
| Kaiser et al. | Modification of the IFCC reference measurement procedure for determination of HbA1c by HPLC-ESI-MS | |
| Nice et al. | Micropreparative high-performance liquid chromatography of proteins and peptides | |
| Jager et al. | Novel approach for the analysis of glycated hemoglobin using capillary isoelectric focusing with chemical mobilization | |
| Cacciola et al. | Hyphenations of 2D capillary-based LC with mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090524 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090524 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100524 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110524 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |