CN101529238A - 血红蛋白类的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种使用电泳法的血红蛋白类的测定方法,特别是能以高精度测定稳定型血红蛋白A1c的血红蛋白类的测定方法,以及同时测定稳定型血红蛋白A1c及异常血红蛋白类的方法。本发明是一种使用电泳法测定血红蛋白类的方法,其是将离子性聚合物固定于泳道的内面且使用含有硫酸化多糖类的缓冲液的血红蛋白类的测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及使用电泳法的血红蛋白类的测定方法,特别涉及能以高精度测定稳定型血红蛋白A1c的血红蛋白类的测定方法、以及同时测定稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白类的方法。
背景技术
血红蛋白(以下也称为Hb)类、其中作为糖化血红蛋白类之一种的血红蛋白A1c(以下也称为HbA1c)由于反映过去1~2个月期间血液中的平均糖浓度,所以广泛用作用于糖尿病的筛选检测和掌握糖尿病患者的血糖管理状态的检测项目。
目前,HbA1c的测定通过HPLC法、免疫法、电泳法等进行。其中,在临床检测领域中普遍采用的HPLC法中,每1种试样的测定可能为1~2分钟,另外能够实现批内重现性试验(within-run reproducibility)的CV值为1.0%左右的测定精度。作为用于掌握糖尿病患者的血糖管理状态的测定方法,需要这样水平的性能。
相对于此,电泳法由于装置结构简便,所以是能制作微芯片电泳装置之类的廉价且小型的系统的技术,可以期待电泳法的HbA1c的高精度测定技术适用于临床检测在成本方面具有非常有益的效果。
自古以来,基于电泳法的Hb类的测定用作具有与通常不同的氨基酸序列的异常Hb类的分离方法,但HbA1c的分离非常困难,用凝胶电泳的方法需要30分钟以上的时间。如上所述,电泳法应用于临床检测领域时,由于在测定时间和测定精度方面存在问题,所以目前几乎没有应用于诊断糖尿病。
相对于此,在1990年左右提出的毛细管电泳法使高分离和高精度测定成为可能,例如专利文献1和专利文献2中公开了通过毛细管电泳法分离HbA1c的方法。
但是,采用专利文献1的方法时,无法消除测定时间长的问题,除此之外,使用的缓冲液的pH高达9~12,所以Hb有可能发生变性,从而难以将该方法应用于临床检测。
另外,专利文献2中,通过组合在该专利文献公开前就公知的2种技术,即利用硫酸化多糖类对Hb类的亲和性以及毛细管内面的动态涂渍法这2种技术,实现了比凝胶电泳法更短时间的测定,并且能用10分钟左右进行测定。
但是,上述动态涂渍法在测定结束后必须在测定随后的试样时再次进行涂渍。因此,在每次测定开始时为了处于相同的涂渍状态,必须通过测定结束后的清洗操作剥离涂渍层,恢复至测定开始前的初始状态。即,进行连续测定时,必须在测定期间插入清洗和涂渍操作,从而导致测定时间延长。另外,上述清洗和涂渍操作会导致测定误差发生。除此之外,由于在测定时必须具备涂渍用的试剂,所以于成本上也不利。另外,即使在不进行连续测定的情况下,与HPLC法相比,10分钟左右的测定时间非常长,对于应用于临床检测是不充分的。
进而,进行糖尿病诊断时,必须将HbA1c成分中、特别是成为糖尿病指标的稳定型HbA1c从不稳定型HbA1c或氨基甲酰化Hb等妨碍测定的成分(以下也将它们称为修饰Hb类)中分离。但是,由专利文献1及专利文献2中公开的方法得到的电泳图谱中,分离性能和测定精度不充分,在上述方法的技术范围内难以从修饰Hb类中分离出稳定型HbA1c。
另外,已知一部分试样中所含的异常Hb类为溶血性贫血和地中海贫血等来源于血红蛋白的疾病的诊断指标,在基于HPLC法的HbA1c测定方法中,公开了同时测定稳定型HbA1c和异常Hb类的技术。但是,至今为止,并未明确基于电泳法进行的此类技术。
【专利文献1】日本特表平09-510792号
【专利文献2】日本特开平09-105739号
发明内容
鉴于上述现状,本发明的目的在于提供使用电泳法的血红蛋白类的测定方法,特别是能以高精度测定稳定型血红蛋白A1c的血红蛋白类的测定方法,以及同时测定稳定型血红蛋白A1c及异常血红蛋白类的方法。
本发明人等进行了潜心研究,结果发现通过将离子性聚合物固定于泳道,并且使用含有硫酸化多糖类的缓冲液,能以短时间、高精度地测定特别是稳定型HbA1c,从而完成了本发明。
本发明涉及使用电泳法测定血红蛋白类的方法,涉及将离子性聚合物固定于泳道且使用含有硫酸化多糖类的缓冲液的血红蛋白类的测定方法。
以下详细说明本发明。
作为能应用本发明的血红蛋白类的测定方法的电泳装置,没有特别限定,可以举出例如通常被称为毛细管电泳装置、微芯片电泳装置等的电泳装置类。
图7表示用于本发明的血红蛋白类的测定方法的毛细管电泳装置之一例。如图7所示,毛细管电泳装置11由阳极槽12、阴极槽13、毛细管14、高压电源15、检测器16以及一对电极17、18构成,毛细管14的两端浸在阳极槽12及阴极槽13内的缓冲液中,管状毛细管14的内部充满缓冲液。另外,电极17及18与高压电源15电连接。
本发明的血红蛋白类的测定方法中,将离子性聚合物固定于作为泳道的毛细管14的内面。并且,测定血红蛋白类时,从毛细管14的一端注入试样,由高压电源15施加规定的电压,由此,利用检测器16测定在毛细管14内移动的目标成分。
在本发明的血红蛋白类的测定方法中,固定于泳道的离子性聚合物是在成为基材的聚合物分子内具有离子性基团的聚合物,可以使用例如阴离子性聚合物、阳离子性聚合物。
上述阴离子性聚合物是分子内具有阴离子性基团的聚合物。
上述阴离子性聚合物优选为亲水性的,具体而言,可以举出例如含有阴离子性基团的多糖类、含有阴离子性基团的有机合成高分子等。
作为上述阴离子性基团,没有特别限定,可以举出例如羧基、磷酸基、磺酸基等。
作为上述含有阴离子性基团的多糖类,举出例如硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、肝素、乙酰肝素、墨角藻聚糖等含有硫酸基的多糖类及其盐类;藻酸、果胶酸等含有羧基的多糖类及其盐类;在纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甘露聚糖、淀粉等中性多糖类以及其衍生物中导入阴离子性基团的导入物及其盐类等公知的含有阴离子性基团的多糖类等。
作为上述含有阴离子性基团的有机合成高分子,可以举出例如聚(甲基)丙烯酸、含有磷酸基的(甲基)丙烯酸酯聚合物、含有磺酸基的(甲基)丙烯酸聚合物、2-丙烯酰胺-磺酸丁酯聚合物以及它们的共聚物等公知的含有氨基的有机合成高分子等。
上述阴离子性聚合物的分子量的优选下限为500Da。小于500Da时,难以充分被覆泳道的内面,有时导致分离性能不良。
上述阳离子性聚合物是在分子内具有阳离子性基团的聚合物。
上述阳离子性聚合物优选是亲水性的,具体而言,可以举出例如氨基化多糖类、含有氨基的有机合成高分子等。
作为上述阳离子性基团,没有特别限定,可以举出例如1~4级的氨基等。
作为上述氨基化多糖类,可以举出例如壳多糖、壳聚糖等壳聚糖衍生物及其盐类;氨基纤维素、N-甲基氨基纤维素等N-取代纤维素的衍生物及其盐类;在葡聚糖、琼脂糖、甘露聚糖、淀粉等中性多糖类及其衍生物中导入氨基的导入物及其盐类等公知的氨基化多糖类等。
作为上述含有氨基的有机合成高分子,可以举出例如聚亚乙基亚胺、聚凝胺、聚(甲基)丙烯酸2-二乙基氨基乙酯等含有氨基的(甲基)丙烯酸酯及共聚物等公知的含有氨基的有机合成高分子等。
上述阳离子性聚合物的分子量的优选下限为500Da。小于500Da时,难以充分被覆泳道的内面,有时导致分离性能不良。
本发明的血红蛋白类的测定方法中的“泳道”是指,在进行电泳的流路中测定试样通过电泳移动及/或分离的部位(从测定试样被注入的部位至被检测的部位为止)。具体而言,例如,在毛细管电泳法的情况下,是指从毛细管内的试样被注入的部位至被检测器检测的部位为止,在微芯片型电泳法的情况下,是指从微芯片型电泳装置的微芯片槽内的试样被注入的部位至被检测器检测的部位为止。
所谓上述泳道的内面,具体而言,例如在毛细管电泳法的情况下,是指毛细管的泳道的内面,在微芯片型电泳法的情况下,是指微芯片型电泳装置的微芯片槽的泳道的内面。
构成上述泳道的原料无特别的限定,可以举出例如玻璃制、金属制、树脂制等。其中,优选为玻璃制或树脂制。
另外,虽然在泳道内可以存在填充剂粒子之类的固态物质,但优选泳道内不存在填充剂粒子之类的固态物质。
上述泳道的长度的优选下限为10mm,优选上限为300mm。小于10mm时,由于不能充分分离试样,所以有时无法正确地测定。超过300mm时,测定时间延长或所得的电泳图谱中峰形状发生变形,从而有时无法准确测定。较优选的下限为20mm,较优选的上限为200mm。
另外,上述泳道的宽度或直径的优选下限为1μm,优选的上限为200μm。小于1μm时,用于检测试样成分的光路长度小,有时测定精度降低。超过200μm时,试样在泳道内部扩散,从而所得的电泳图谱中,峰变宽,有时测定精度降低。
作为将上述离子性聚合物固定于泳道的方法,可以使用公知的方法。具体而言,可以举出下述方法,例如使离子性聚合物与泳道的内面接触,利用疏水性或静电的相互作用等使其物理地吸附的方法;借助各个物质所具有的官能团或其他物质等通过共价键将泳道的内面及离子性聚合物进行固定化的方法等。使用上述方法时,例如经加热工序或干燥工序等,能进行剥离难、能反复测定的离子性聚合物的固定化。
另外,可以在离子性聚合物层和泳道的内面之间形成其他种类的层。即,最终在泳道的最内面形成离子性聚合物层即可。
用于上述固定化的离子性聚合物也取决于离子性聚合物的种类或固定化方法,但优选制成0.01~20%左右的溶液供给于上述操作。小于0.01%时,有可能导致固定化不充分,超过20%时,固定层不均匀,在测定过程中发生剥离,有可能成为重现性降低的原因。
本发明的血红蛋白类的测定方法中,使用含有硫酸化多糖类的缓冲液。
在本发明的血红蛋白类的测定方法中,所谓上述缓冲液,除包括电泳时充满在泳道内的缓冲液、充满电泳时设置在泳道两端的阳极槽及阴极槽的缓冲液之外,还包括溶解稀释测定试样的溶血稀释液、其他清洗流路内的缓冲液等。
本发明的血红蛋白类的测定方法中,上述所有缓冲液可以含有硫酸化多糖类,也可以仅一部分缓冲液含有硫酸化多糖类。
作为上述缓冲液,可以使用具有缓冲能力的含有公知的缓冲液组合物的溶液,具体而言,可以举出例如柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等有机酸及其盐类;甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等氨基酸类;盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、乙酸等无机酸及其盐类等。
另外,可以在上述缓冲液中适当添加其他通常添加的物质,例如表面活性剂、各种聚合物、亲水性的低分子化合物等。
作为上述硫酸化多糖类,没有特别限定,可以使用公知的硫酸化多糖类。具体而言,可以举出向纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甘露聚糖、淀粉等中性多糖类及其衍生物中导入硫酸基的导入物及其盐类、或硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、肝素、乙酰肝素、墨角藻聚糖等。
上述缓冲液中的硫酸化多糖类的含量的优选下限为0.01重量%,优选上限为10.0重量%。小于0.01重量%时,难以呈现添加硫酸化多糖类的效果,有时分离不充分,超过10.0重量%时,有时引起测定时间延长或导致分离不良。
本发明的血红蛋白类的测定方法中,作为成为测定对象的血红蛋白类,没有特别限定,可以举出例如现有公知的血红蛋白类。具体而言,可以举出例如HbA0、HbA1a、HbA1b、稳定型HbA1c、不稳定型HbA1c、HbF(胎儿Hb);乙酰基化Hb、氨基甲酰基化Hb等修饰Hb类;HbS、HbC等异常Hb类等。其中,可以将成为糖尿病诊断指标的稳定型HbA1c与不稳定型HbA1c和氨基甲酰基化Hb等修饰Hb类等分离进行测定。
使用上述本发明的血红蛋白类的测定方法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法也是本发明之一。
通过使用本发明的血红蛋白类的测定方法,可以与稳定型HbA1c一起测定HbA0、HbA1a、HbA1b、不稳定型HbA1c、HbF(胎儿Hb)。
另外,通过使用本发明的血红蛋白类的测定方法,可以与稳定型HbA1c一起测定能成为除糖尿病以外的疾病的指标的HbA2。
进而,通过使用本发明的血红蛋白类的测定方法,可以与稳定型HbA1c一起测定能成为除糖尿病以外的疾病的指标的HbS、HbC等异常Hb类。通过与稳定型HbA1c一起测定HbA2或异常Hb类,可以同时得到糖尿病及除糖尿病以外的疾病的指标。
使用上述本发明的血红蛋白类的测定方法同时测定稳定型血红蛋白A1c及异常血红蛋白类的方法也是本发明之一。
根据本发明,通过将离子性聚合物固定于泳道的内面,特别地是能以每种试样数分钟如此短的时间、以表示批内重现性的CV值为1.0%左右的高精度测定稳定型HbA1c,所以可以适当进行用现有技术难以进行的用电泳法管理糖尿病患者的HbA1c值。这并不是由通常所知的动态涂渍法变更为固定化涂渍法而能够得到的效果,即无需每次测定时的涂渍而缩短测定时间的效果,而是能得到可以分离目前难以分离的成分的无法预测的效果的结果。
另外,通过在泳道的内面进行固定化,无需每次测定的涂渍操作等,从而能在更短时间内测定,也由于无需使用涂渍剂等,所以于成本方面也非常有利。
并且电泳法由于装置结构比HPLC简便,所以通过使用本发明的血红蛋白类的测定方法,能提供廉价的血红蛋白类的测定方法。
除此之外,可以同时测定稳定型HbA1c和能成为除糖尿病以外的疾病指标的异常Hb类等。
附图说明
【图1】是通过实施例1的测定条件测定健康人血时所得的电泳图谱。
【图2】是通过实施例1的测定条件测定含有修饰Hb(不稳定型HbA1c)的试样时得到的电泳图谱。
【图3】表示通过比较例2的测定条件测定含有修饰Hb(不稳定型HbA1c)的试样时所得的电泳图谱。
【图4】是通过实施例1的测定条件测定含有异常Hb(HbS及HbC)的试样时所得的电泳图谱。
【图5】是通过比较例2的测定条件测定含有异常Hb(HbS及HbC)的试样时所得的电泳图谱。
【图6】是通过实施例1的测定条件测定含有HbA2的试样时所得的电泳图谱。
【图7】是表示使用本发明的血红蛋白类的测定方法的电泳装置之一例的模式图。
符号说明
11毛细管电泳装置
12阳极槽
13阴极槽
14毛细管
15高压电源
16检测器
17电极
18电极
1稳定型HbA1c
2HbA0
3修饰Hb(不稳定型HbA1c)
4HbF(胎儿Hb)
5HbS
6HbC
7HbA2
具体实施方式
以下给出实施例更详细地说明本发明,但本发明并不仅限于这些实施例。
(实施例1)
调制含有0.2重量%的作为阴离子性聚合物的硫酸葡聚糖(和光纯药公司制)的水溶液。然后,在熔融石英制毛细管(GL Science制:内径25μm×全长30cm)中依次通入0.2N-NaOH、离子交换水、0.5N-HCl,清洗毛细管内后,将所得的硫酸葡聚糖水溶液通入20分钟。然后,将空气注入毛细管内,排出硫酸葡聚糖水溶液后,在40℃的干燥机内使其干燥12小时。接着,再次注入硫酸葡聚糖水溶液,反复5次注入空气和干燥。
将所得的硫酸葡聚糖固定化毛细管安装在毛细管电泳装置(BeckmanCoulter公司制PAC/E MDQ)中。然后,将含有2重量%的作为硫酸化多糖类的硫酸软骨素(和光纯药公司制:硫酸化多糖类)的柠檬酸缓冲液(pH4.7)放置在毛细管的两端,充满毛细管内。
(健康人血的测定)
作为测定试样,使用下述试样,即,使用从健康人血中肝素采集的血液,在该健康人全血70μL中添加含有2.0重量%的硫酸软骨素作为硫酸化多糖类的柠檬酸缓冲液(pH6.0)200μL进行溶血稀释而得到的试样。
从毛细管的一端注入试样,对毛细管的两端缓冲液施加20kV电压进行电泳,测定415nm的可见光的吸光度变化,由此通过毛细管电泳法测定人血液中的稳定型HbA1c。所得的电泳图谱如图1所示。图1中,峰1表示稳定型HbA1c,峰2表示HbA0。需要说明的是,能够以约1.5分钟的电泳时间分离稳定型HbA1c。
(含有修饰Hb的试样的测定)
在用于健康人血的测定的健康人全血中添加葡萄糖至2000mg/dL,人为地调制大量含有作为修饰Hb之一种的不稳定型HbA1c的试样。所得的电泳图谱示于图2。图2中,峰1表示稳定型HbA1c,峰2表示HbA0,峰3表示修饰Hb(不稳定型HbA1c)。如图2所示,很好地分离了稳定型HbA1c和作为修饰Hb的不稳定型HbA1c。
(实施例2)
使用作为阴离子性聚合物的聚甲基丙烯酸的0.5重量%水溶液,用与实施例1相同的方法涂渍毛细管内面后,使用含有2.0重量%的作为硫酸化多糖类的硫酸葡聚糖的苹果酸缓冲液作为缓冲液,除此以外,与实施例1相同地操作,通过毛细管电泳法测定健康人血试样及含有修饰Hb的试样。所得的电泳图谱与图1及图2相同。
(实施例3)
在玻璃制微芯片(30mm×20mm×2mm)上制作交叉十字型的泳道,在泳道的两端设置缓冲液槽。
使用作为阴离子性聚合物的硫酸软骨素(1.0重量%水溶液),用与实施例1相同的顺序涂渍泳道后,使用与实施例1相同的缓冲液,以1000V利用微芯片电泳法测定健康人血试样及含有修饰Hb的试样。所得的电泳图谱与图1及图2相同。
(实施例4)
使用含有0.2重量%的作为阳离子性聚合物的壳聚糖(和光纯药公司制、壳聚糖100)的0.2N盐酸溶液,用与实施例1相同的方法涂渍毛细管内面后,使用含有2.0重量%的作为硫酸化多糖类的硫酸软骨素的柠檬酸缓冲液作为缓冲液,除此以外,与实施例1相同地操作,通过毛细管电泳法测定健康人血试样及含有修饰Hb的试样。所得的电泳图谱与图1及图2相同。
(实施例5)
使用作为阳离子性聚合物的聚凝胺(Nacalai Tesque制)的0.5重量%水溶液,用与实施例1相同的方法涂渍毛细管内面后,使用含有2.0重量%的作为硫酸化多糖类的硫酸葡聚糖的苹果酸缓冲液作为缓冲液,除此以外,与实施例1相同地操作,通过毛细管电泳法测定健康人血试样及含有修饰Hb的试样。所得的电泳图谱与图1及图2相同。
(实施例6)
在聚二甲基硅氧烷制微芯片(30mm×20mm×2mm)中制作交叉十字型的泳道,在泳道的两端设置缓冲液槽。
使用作为阳离子性聚合物的壳聚糖(1.0重量%水溶液),用与实施例3相同的方法涂渍泳道后,使用含有2.0重量%的作为硫酸化多糖类的硫酸葡聚糖的苹果酸缓冲液作为缓冲液,除此以外,与实施例3相同地操作,通过微芯片电泳法测定健康人血试样及含有修饰Hb的试样。所得的电泳图谱与图1和图2相同。
(比较例1)
不将阴离子性聚合物固定在毛细管内面,并使用在测定前通入毛细管内的动态涂渍法进行测定。
即,在熔融石英制毛细管(GL Science制:内径25μm×全长30cm)中依次通入0.2N-NaOH、离子交换水、0.5N-HCl清洗毛细管内后,将用于实施例1的硫酸葡聚糖水溶液通入1分钟。
然后,将含有2.0重量%的硫酸软骨素(和光纯药公司制:硫酸化多糖类)的苹果酸缓冲液(pH4.7)放置在上述毛细管的两端,充满毛细管内后,用与实施例1相同的方法测定含有修饰Hb的试样。所得的电泳图谱中未检测到峰。
(比较例2)
不将阳离子性聚合物固定在毛细管内面,并使用在测定前通入毛细管内的动态涂渍法进行测定。
即,在熔融石英制毛细管(GL Science制:内径25μm×全长30cm)中依次通入0.2N NaOH、离子交换水、0.5N HCl清洗毛细管内后,将用于实施例1的壳聚糖溶液通入1分钟,动态地涂渍毛细管内面。
然后,将含有2.0%的硫酸软骨素(和光纯药公司制:硫酸化多糖类)的苹果酸缓冲液(pH4.7)放置在上述毛细管的两端,通入毛细管内。
然后,用与实施例1相同的方法测定含有修饰Hb的试样,结果得到图3所示的电泳图谱。图3中的峰1表示稳定型HbA1c,峰2表示HbA0,峰3表示修饰Hb(不稳定型HbA1c)。如图3所示,表示稳定型HbA1c的峰1与表示修饰Hb的峰3重合,无法分离。
(比较例3)
不将阳离子性聚合物固定在毛细管内面,并使用在测定前通入毛细管内的动态涂渍法进行测定。即,在熔融石英制毛细管(GL Science制:内径25μm×全长23cm)中依次通入0.2N NaOH、离子交换水、0.5N HCl清洗毛细管内后,将含有0.5重量%的白蛋白(来源于马:和光纯药公司制)的苹果酸缓冲液通入1分钟。然后,将含有0.2重量%的硫酸软骨素(和光纯药公司制:硫酸化多糖类)的苹果酸缓冲液(pH4.7)放置在上述毛细管的两端,通入毛细管内。从毛细管的一端注入试样,对毛细管的两端的缓冲液施加8.5kV的电压进行电泳,测定在415nm的可见光下的吸光度变化,由此测定含有修饰Hb的试样。所得的电泳图谱与图3相同,无法从修饰Hb中分离稳定型HbA1c。
(比较例4)
除使用不含有硫酸软骨素的柠檬酸缓冲液(pH4.7)作为缓冲液以外,与实施例4相同地操作,进行健康人血的电泳。所得的电泳图谱中未检测到峰。
(比较例5)
除使用不含有硫酸葡聚糖的苹果酸缓冲液(pH4.7)作为缓冲液以外,与实施例6相同地操作,进行健康人血的电泳。所得的电泳图谱中未检测到峰。
(评价)
(1)修饰Hb类的分离性能确认
关于实施例1~6及比较例2、3的测定条件,调制下述试样:健康人血试样;以该健康人血为基础调制得到的含有修饰Hb的试样,即用与实施例1相同的方法在健康人血中添加葡萄糖至2000mg/dL所得的含有不稳定型HbA1c的试样;以及其他含有修饰Hb的试样,即添加氰酸钠至50mg/dL所得的含有氨基甲酰基化Hb的试样,求出各试样的稳定型HbA1c值。
通过求出稳定型HbA1c峰的面积相对于总血红蛋白峰的面积的比率(%)算出各试样的稳定型HbA1c值。
求出由所得的各含有修饰Hb的试样的稳定型HbA1c值减去所得的健康人血试样的稳定型HbA1c值得到的值(ΔHbA1c值)。
结果示于表1。
需要说明的是,关于比较例1、4,由于未检测到稳定型HbA1c的峰,所以处于测定对象外。
如表1所示,关于实施例1~6的测定条件,含有修饰Hb的试样和不含有修饰Hb的健康人血试样的稳定型HbA1c的测定值之差几乎没有差别,测定值差为0.2%以下,确认即使在存在修饰Hb类的情况下,也能正确地测定稳定型HbA1c。
另一方面,在比较例2、3中,由于修饰Hb类和稳定型HbA1c的分离不充分,所以确认0.7~1.3%的测定值差,并确认在含有修饰Hb的情况下,无法正确地测定稳定型HbA1c值。
(2)批内重现性试验
使用实施例1~6及比较例2、3的测定条件,连续10次测定同一健康人血试样,计算所得的稳定型HbA1c值的CV值。
通过计算(标准偏差/平均值)而求出CV值。
需要说明的是,比较例2、3中,1次测定结束时,将0.2N的NaOH溶液通入1分钟,将泳动用缓冲液通入2分钟,清洗毛细管内后,再次将各涂渍溶液通入1分钟,在毛细管内面实施动态涂渍后,注入下一测定试样,反复进行测定,由此进行批间重现性试验。
结果示于表2。
(3)耐久性试验
使用实施例1~6及比较例2、3的测定条件,计算连续测定100次同一健康人血试样所得的稳定型HbA1c值的最大值和最小值之差(R值)。结果示于表2。
【表2】
重现性试验CV(%) | 耐久性试验R值 | |
实施例1 | 1.1 | 0.3 |
实施例2 | 0.9 | 0.2 |
实施例3 | 1.1 | 0.3 |
实施例4 | 1.0 | 0.3 |
实施例5 | 1.0 | 0.3 |
实施例6 | 0.9 | 0.2 |
比较例2 | 5.2 | 1.4* |
比较例3 | 4.1 | 1.6** |
*测定50次为止的数值
*测定60次为止的数值
如表2所示,在实施例1~6中,在批间重现性试验中,表示不均程度的CV值显示约为1%的良好的值,确认为可以管理糖尿病患者的稳定型HbA1c值的水准。另外,耐久性试验的连续测定100个试样时的不均幅度为0.2~0.3%左右,非常小。由该结果确认,使用实施例1~6的测定条件时,能高精度地分离稳定型HbA1c,进行反复测试时,也能稳定地得到稳定型HbA1c值。
另一方面,使用比较例2及比较例3的测定条件的批间重现性试验中,CV值极大,在管理糖尿病患者的HbA1c值方面是完全不充分的值。另外,在耐久性试验中,通过进行反复测定,测定值缓慢变化,最终显示较大的不均幅度(R值),在比较例2的条件下,约50次的测定为不能测定,在比较例3的条件下,在约60次的测定为不能测定。
(4)异常Hb类的测定
除使用AFSC Hemo control(Helena研究所社制)作为含有异常Hb的试样以外,用与实施例1、比较例2的测定条件相同的方法,测定含有异常Hb类的试样。
使用实施例1的测定条件测定的结果中,所得的电泳图谱示于图4。另外,使用比较例2的测定条件测定的结果中,所得的电泳图谱示于图5。图4及图5中,峰1表示稳定型HbA1c,峰2表示HbA0,峰4表示HbF(胎儿Hb),峰5表示HbS,峰6表示HbC。需要说明的是,通过实施例2~6的测定条件得到的电泳图谱显示与图4几乎相同的形状。
如图4所示,使用实施例1的测定条件进行测定时,与稳定型HbA1c一起能在短时间精度良好地分离作为异常Hb的HbS及HbC。
另一方面,如图5所示,使用比较例2的测定条件进行测定时,无法分离作为异常Hb类的HbS及HbC。
由该结果确认通过使用实施例1~6的测定条件,除能测定稳定型HbA1c来诊断糖尿病之外,还能同时筛选检测其他来源于Hb的疾病。
(5)含有HbA2的试样的测定
除使用A2对照(等级2)(Bio-Rad公司制)作为含有HbA2的试样以外,通过与实施例1的测定条件相同的方法测定含有HbA2的试样。
所得的电泳图谱示于图6。图6中,峰1表示稳定型HbA1c,峰2表示HbA0,峰4表示HbF(胎儿Hb),峰7表示HbA2。需要说明的是,使用实施例2~6的测定条件进行测定时,所得的电泳图谱显示与图6几乎相同的形状。
如图6所示,使用实施例1的测定条件进行测定时,可以分离HbA2,并能同时测定稳定型HbA1c和HbA2。
另一方面,使用比较例2的测定条件进行测定时,无法分离HbA2。
由该结果确认,通过使用实施例1~6的测定条件,除能测定稳定型HbA1c来诊断糖尿病之外,还能同时筛选检测其他来源于Hb的疾病。
产业上的可利用性
根据本发明,可以提供使用电泳法的血红蛋白类的测定方法,特别是能以高精度测定稳定型血红蛋白A1c的血红蛋白类的测定方法、以及同时测定稳定型血红蛋白A1c及异常血红蛋白类的方法。
Claims (5)
1、一种血红蛋白类的测定方法,其特征在于,
其使用电泳法测定血红蛋白类,其中,
将离子性聚合物固定于泳道的内面,并且使用含有硫酸化多糖类的缓冲液。
2、如权利要求1所述的血红蛋白类的测定方法,其特征在于,
离子性聚合物为阴离子性聚合物。
3、如权利要求1所述的血红蛋白类的测定方法,其特征在于,
离子性聚合物为阳离子性聚合物。
4、一种稳定型血红蛋白A1c的测定方法,其特征在于,
使用权利要求1、2或3所述的血红蛋白类的测定方法。
5、一种同时测定稳定型血红蛋白Alc和异常血红蛋白类的方法,其特征在于,
使用权利要求1、2或3所述的血红蛋白类的测定方法。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102128873A (zh) * | 2010-01-19 | 2011-07-20 | 爱科来株式会社 | 使用电泳的试样的分析方法及其利用 |
CN105806919A (zh) * | 2015-01-15 | 2016-07-27 | 爱科来株式会社 | 试样的分析方法及其中所用的溶液 |
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CN108445071A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-08-24 | 中国计量科学研究院 | 一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术 |
CN111638261A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-09-08 | 融智生物科技(青岛)有限公司 | 一种计算设备、存储介质和地中海贫血筛查装置及系统 |
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Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5599433A (en) | 1995-01-17 | 1997-02-04 | Beckman Instruments, Inc. | Capillary electrophoresis of glycosylated proteins |
US5611903A (en) * | 1995-03-22 | 1997-03-18 | Analis S. A. | Capillary electrophoresis method using initialized capillary and polyanion-containing buffer and chemical kit therefor |
US5792331A (en) * | 1996-12-19 | 1998-08-11 | Dionex Corporation | Preformed polymer coating process and product |
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FR2878033B1 (fr) * | 2004-11-18 | 2007-05-04 | Sebia Sa | Procede d'analyse de l'hemoglobine par electrophorese capillaire, trousse pour electrophorese capillaire et utilisation de ralentisseur de flux dans un tel procede |
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Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102128873A (zh) * | 2010-01-19 | 2011-07-20 | 爱科来株式会社 | 使用电泳的试样的分析方法及其利用 |
CN105806919A (zh) * | 2015-01-15 | 2016-07-27 | 爱科来株式会社 | 试样的分析方法及其中所用的溶液 |
CN105806919B (zh) * | 2015-01-15 | 2019-07-05 | 爱科来株式会社 | 试样的分析方法及其中所用的溶液 |
CN107971050A (zh) * | 2016-10-25 | 2018-05-01 | 爱科来株式会社 | 微芯片、分析系统以及生产微芯片的方法 |
CN107971050B (zh) * | 2016-10-25 | 2022-04-12 | 爱科来株式会社 | 微芯片、分析系统以及生产微芯片的方法 |
CN108445071A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-08-24 | 中国计量科学研究院 | 一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值技术 |
CN111638261A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-09-08 | 融智生物科技(青岛)有限公司 | 一种计算设备、存储介质和地中海贫血筛查装置及系统 |
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CN115389598A (zh) * | 2022-09-27 | 2022-11-25 | 达碧清诊断技术(上海)有限公司 | 糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法 |
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