JP4854637B2

JP4854637B2 - ヘモグロビン類の測定方法

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Publication number: JP4854637B2
Application number: JP2007279186A
Authority: JP
Inventors: 和之大石; 泉大本; 絵里子日下; 俊樹川辺
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2027-10-26
Also published as: JP2009109230A

Description

本発明は、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法に関する。

ヘモグロビン（Ｈｂともいう）類、なかでも糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。

従来、ＨｂＡ１ｃの測定は、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等により行なわれてきた。このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。

これに対して、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動装置のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。

これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能であるとされており、例えば、特許文献１や特許文献２には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する手法が開示されている。
しかしながら、特許文献１の方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高いことから、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。

また、特許文献２には、該文献特許以前より公知であった２つの技術、すなわち、硫酸化多糖類のＨｂ類への親和性の利用と、キャピラリー内面の動的コーティング法という２つの技術を組み合わせることにより、ゲル電気泳動法と比較して短時間の測定を実現したものであり、１０分間程度での測定が可能であるとされている。

しかしながら、このような動的コーティング法は、測定終了後、次試料の測定時に再びコーティングを行う必要がある。そのため、毎測定開始時に同じコーティング状態とするためには、測定終了後の洗浄操作によりコーティング層を剥し、測定開始前の初期の状態に戻す必要がある。即ち、連続測定する際には、測定の間に洗浄及びコーティング操作を挿入する必要があり、測定時間の延長を招いていた。また、これらの洗浄及びコーティング操作は、測定誤差発生の要因となりうる。加えて、コーティング用の試薬を測定時に具備する必要があるため、コスト的にも不利であった。また、連続測定を行わない場合であっても、１０分程度の測定時間はＨＰＬＣ法と比較して非常に長く、臨床検査に適用するには不充分であった。

更に、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃ成分のなかでも、特に糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを、不安定型ＨｂＡ１ｃやカルバミル化Ｈｂ等の、測定の障害となる成分（以下、これらを修飾Ｈｂ類ともいう）から分離しなければならない。また、糖尿病患者の安定型ＨｂＡ１ｃ値を管理するためには、同時再現性、日差再現性等が良好な値を示さなければ適用することはできない。しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示された方法によって得られたエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法の技術範囲では、安定型ＨｂＡ１ｃを修飾Ｈｂ類から分離することは困難であった。従って、これらの方法の技術範囲では、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃ値を求めることはできなかった。

また、一部の試料に含まれる異常Ｈｂ類は、溶血性貧血やサラセミア等のヘモグロビン由来の疾病の診断指標となることが知られており、ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ測定方法においては、安定型ＨｂＡ１ｃと異常Ｈｂ類とを同時に測定する技術が開発されている。しかしながら、これまでのところ電気泳動法によるこのような技術は明らかにされていない。
特表平０９−５１０７９２号特開平０９−１０５７３９号

本発明は、上記現状に鑑み、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法において、亜硝酸塩を含有する緩衝液を用いることにより、特に安定型ＨｂＡ１ｃの測定を短時間、高精度で測定することが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、キャピラリー電気泳動法又はマイクロチップ電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、イオン性泳動路と、電気泳動時に前記泳動路の内部に満たされる、亜硝酸塩を含有する緩衝液とを用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
以下に本発明を詳述する。

本発明のヘモグロビン類の測定方法を適用することができる電気泳動装置としては、特に限定されず、例えば、一般にキャピラリー電気泳動装置、マイクロチップ電気泳動装置等と呼称される電気泳動装置類が挙げられる。

図７に、本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いるキャピラリー電気泳動装置の一例を示す。図７に示すように、キャピラリー電気泳動装置１１は、陽極槽１２、陰極槽１３、キャピラリー１４、高圧電源１５、検出器１６、及び、一対の電極１７、１８からなり、キャピラリー１４の両端は陽極槽１２及び陰極槽１３内の緩衝液に浸され、管状のキャピラリー１４の内部は緩衝液で満たされている。また、電極１７及び１８は高圧電源１５と電気的に接続されている。
ヘモグロビン類を測定する際には、キャピラリー１４の一方より試料を注入し、高圧電源１５から所定の電圧を印加することにより、キャピラリー１４内を移動する目的成分を検出器１６によって測定する。

本発明のヘモグロビン類の測定方法は、亜硝酸塩を含有する緩衝液を用いる。
上記「緩衝液」とは、電気泳動時に泳動路内に満たされる緩衝液、及び、電気泳動時に泳動路の両端に設置される陽極槽及び陰極槽に満たされる緩衝液のほか、測定試料を溶解希釈するために用いられる溶血希釈用緩衝液、泳動路内を洗浄するために用いられる泳動路洗浄用緩衝液等、本発明のヘモグロビン類の測定方法を実施するために用いられる全ての種類の緩衝液を含む（以下、単に「緩衝液」又は「緩衝液類」と記す場合は、これらの各種緩衝液全てを指す場合がある）。

上記亜硝酸塩としては特に限定されず、例えば、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸カルシウム等が挙げられる。なかでも、亜硝酸ナトリウム又は亜硝酸カリウムが好ましい。

上記緩衝液において、上記亜硝酸塩の濃度としては、使用時において亜硝酸塩が溶解していれば特に限定されないが、好ましい下限は０．０００１モル／Ｌ、好ましい上限は５モル／Ｌである。０．０００１モル／Ｌ未満であると、優れた分離性能等を発揮することができないことがある。５モル／Ｌを超えると、測定時間時間の延長や分離不良を引き起こすことがある。より好ましい下限は０．００１モル／Ｌ、より好ましい上限は１モル／Ｌである。

上記緩衝液は、本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いられる全ての緩衝液に用いられてもよいし、一部の緩衝液のみに用いられてもよい。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、複数種の緩衝液が用いられてもよく、複数種の緩衝液が用いられる場合、上記亜硝酸塩を含有する緩衝液の他に、更に上記亜硝酸塩を含有する他の緩衝液を併用してもよいし、上記亜硝酸塩を含有しない他の緩衝液を併用してもよい。

上記緩衝液は、上記亜硝酸塩の他に、緩衝能を有する公知の溶液を用いることができ、具体的には例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類等が挙げられる。

上記緩衝液は、この他にも、一般に添加される物質、例えば、各種ポリマー類、界面活性剤、親水性の低分子化合物等を適宜含有してもよい。
上記各種ポリマー類としては特に限定されないが、アニオン性ポリマーであることが好ましい。
上記アニオン性ポリマーとしては特に限定されないが、アニオン性基を含有する非架橋性の水溶性ポリマーが好ましく、なかでも、アニオン性基含有多糖類、アニオン性基含有有機合成ポリマー等がより好ましい。

上記アニオン性基含有多糖類としては特に限定されず、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類及びその塩類；アルギン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類及びその塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体へのアニオン性基導入化物、及びその塩類等の、公知のアニオン性基含有多糖類等が挙げられる。なかでも、硫酸基含有多糖類であることが好ましい。

上記アニオン性基含有有機合成ポリマーとしては、アニオン性の官能基を含有する水溶性の有機合成ポリマーであれば特に限定されないが、アクリル系ポリマー；すなわちアクリル酸又はメタクリル酸（以下、（メタ）アクリル酸と表記する）及びその誘導体類及びエステル類等を主成分とするポリマーが好ましい。

上記緩衝液が上記アニオン性ポリマーを含有する場合、上記緩衝液において上記アニオン性ポリマーの濃度の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は１０．０重量％である。０．０１重量％未満であると、アニオン性ポリマーを含有することによる効果が発現しにくく、分離性能が不充分となることがある。１０．０重量％を超えると、測定時間時間の延長や分離不良を引き起こすことがある。

本発明のヘモグロビン類の測定方法では、イオン性泳動路を用いる。
上記「泳動路」とは、電気泳動が行われる流路において、測定試料が電気泳動により移動及び／又は分離する部位（測定試料が注入された部位から検出される部位まで）のことをいう。具体的には例えば、キャピラリー電気泳動法の場合には、キャピラリー内に試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合には、マイクロチップ溝内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいう。
上記泳動路の内面とは、具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合には、キャピラリーの泳動路の内面のことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合には、マイクロチップ溝の泳動路の内面のことをいう。
上記イオン性泳動路とは、泳動路の内面が使用時の環境下においてイオン性を示すこと、すなわち、泳動路の内面に、使用時の環境下で解離するイオン性官能基を有する泳動路のことをいう。

上記イオン性官能基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等のアニオン性基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基等のカチオン性基等が挙げられる。

上記イオン性泳動路を調製する方法としては特に限定されず、公知の方法により調整することができ、イオン性官能基を有する素材から泳動路を作製する方法、表面改質手段により泳動路内面にイオン性を付与する方法等が挙げられるが、特に、イオン性官能基を有するポリマー（以下、イオン性ポリマーともいう）により、泳動路内面をコーティングする方法が好ましい。

上記イオン性ポリマーとしては、基材となるポリマー分子内にイオン性基を有するものであれば特に限定されず、例えば、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー等が挙げられる。

上記アニオン性ポリマーは、分子内にアニオン性基を有するポリマーである。
上記アニオン性ポリマーは、親水性であることが好ましい。
上記親水性を有するアニオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、アニオン性基含有多糖類、アニオン性基含有有機合成ポリマー等が挙げられる。
上記アニオン性基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。

上記アニオン性基含有多糖類としては特に限定されず、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類及びその塩類；アルギン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類及びその塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体へのアニオン性基導入化物及びその塩類等が挙げられる。

上記アニオン性基含有有機合成ポリマーとしては、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有（メタ）アクリル酸重合体、２−アクリルアミド−ブチルスルホン酸重合体及びこれらの共重合物等が挙げられる。

上記カチオン性ポリマーは、分子内にカチオン性基を有するポリマーである。
上記カチオン性ポリマーは、親水性であることが好ましい。
上記親水性を有するカチオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、アミノ基含有多糖類、アミノ基含有有機合成ポリマー等が挙げられる。
上記カチオン性基としては特に限定されず、例えば、１〜４級のアミノ基等が挙げられる。

上記アミノ基含有多糖類としては特に限定されず、例えば、キチン、キトサン等のキトサン誘導体及びその塩類；アミノセルロース、Ｎ−メチルアミノセルロース等のＮ−置換セルロースの誘導体及びその塩類；デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体へのアミノ基導入化物及びその塩類等が挙げられる。

上記アミノ基含有有機合成高分子としては特に限定されず、例えば、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ポリ２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート等のアミノ基含有（メタ）アクリレート及び共重合物等が挙げられる。

上記イオン性ポリマーの重量平均分子量の好ましい下限は５００である。５００未満であると、泳動路の内面を充分に被覆することが困難となり、分離性能が不良になることがある。

上記イオン性ポリマーを泳動路の内面をコーティングする方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、上記イオン性ポリマーを含有する溶液を上記泳動路の内部に通液することにより、泳動路内面にイオン性ポリマーの吸着平衡状態を作製することによりコーティングする動的コーティング法；イオン性ポリマーを泳動路の内面に接触させて疎水性的又は静電気的な相互作用等を利用して物理的に吸着させて固定化する固定化コーティング法；泳動路の内面及びイオン性ポリマーをそれぞれの物質が有する官能基や他の物質等を介して共有結合により固定化する固定化コーティング法等が挙げられる。これらの固定化コーティング法を用いた場合、例えば、加熱工程や乾燥工程等を経ることにより、剥離しにくく、繰り返し測定が可能なイオン性ポリマーの固定化が可能となる。上記コーティング法のうち、特に固定化コーティング法がより好ましい。
また、イオン性ポリマー層と泳動路の内面との間に、別種の層を形成してもよい。即ち、最終的に泳動路の最内面にイオン性ポリマー層が形成されていればよい。

上記コーティング法に用いるイオン性ポリマーは、イオン性ポリマーの種類や固定化法にもよるが、好ましくは０．０１〜２０％程度の溶液として上記操作に供されるのが好ましい。０．０１％未満であると、固定化が不充分となる恐れがあり、２０％を超えると固定層が均一にならず、測定途中に剥離し、再現性低下の原因となる可能性がある。

本発明のヘモグロビン類の測定方法において、測定対象となるヘモグロビン類としては特に安定型ＨｂＡ１ｃである。本発明のヘモグロビン類の測定方法において、安定型ＨｂＡ１ｃが測定できるとは、少なくとも安定型ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ_０が単独ピークとして分離できることを意味する。すなわち、安定型ＨｂＡ１ｃのピークと、ＨｂＡ_０のピークとを、ＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）のピーク、不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類のピーク等と分離することができることを意味する。
このような本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の一つである。

本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、糖尿病以外の疾病の指標となり得るＨｂＡ２を測定することができる。
更に、本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、糖尿病以外の疾病の指標となり得るＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常Ｈｂ類を測定することができる。安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、ＨｂＡ２や、異常Ｈｂ類を測定することによって、糖尿病及び糖尿病以外の疾病に関する情報を同時に得ることができる。
このような本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法もまた、本発明の一つである。

本発明によれば、亜硝酸塩類を含む緩衝液を用いて電気泳動を行なうことにより、糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃの測定を１試料当り数分という短時間に、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％以下、日差再現性を示すＣＶ値も２．０％以下という高精度で測定することが可能となる。そのため、従来技術では困難であった糖尿病患者の電気泳動法によるＨｂＡ１ｃ値の管理を好適に行うことができる。また、電気泳動法は装置構成がＨＰＬＣ法よりも簡便であることから、本発明の方法を用いることで、安価なヘモグロビン類の測定装置を提供できる可能性を示すことができる。更に、本発明によれば、糖尿病の指標となり得る安定型ＨｂＡ１ｃを極めて高精度に測定できることに加えて、安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、糖尿病以外の疾病の指標となり得る異常Ｈｂ類を極めて高精度に測定することが可能となる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
アニオン性ポリマーであるデキストラン硫酸（和光純薬社製）を０．２重量％含有する水溶液を調製した。次いで、フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス社製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）に、０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌをこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、得られたデキストラン硫酸水溶液を２０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入してデキストラン硫酸水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再びデキストラン硫酸水溶液を注入し、空気の注入及び乾燥を５回繰り返した。
得られたデキストラン硫酸固定化キャピラリーを、キャピラリー電気泳動装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製ＰＡＣ／ＥＭＤＱ）にセットした。その後、亜硝酸ナトリウム（亜硝酸塩：和光純薬社製）５０ｍＭ及びコンドロイチン硫酸（和光純薬社製）２．０重量％を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）を泳動用緩衝液としてキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。

（健常人血の測定）
測定試料としては、健常人血よりフッ化ナトリウム採血した血液を用い、該健常人全血７０μＬに、０．０５重量％のトリトンＸ−１００及び２０ｍＭの亜硝酸ナトリウムを含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μＬを添加して溶血希釈したものを用いた。
キャピラリーの一方より試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に２０ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、ヒト血液中の安定型ＨｂＡ１ｃのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。得られたエレクトロフェログラムを図１に示す。図１中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ_０を示す。

（修飾Ｈｂを含む試料の測定）
健常人血の測定で用いた健常人全血に、グルコース（和光純薬社製）を２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温して、修飾Ｈｂの一種である不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含む試料を人為的に調製した。得られた修飾Ｈｂ含有試料を、上記と同様の条件で測定して得られたエレクトロフェログラムを図２に示す。図２中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ_０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図２に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃが良好に分離された。

（実施例２）
アニオン性ポリマーであるポリメタクリル酸の０．５重量％水溶液を用い、実施例１と同様の方法でキャピラリー内面をコーティングした後、緩衝液として、亜硝酸カリウム２００ｍＭ及びデキストラン硫酸２．０重量％を含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．２）を泳動用緩衝液として用いた以外は、実施例１と同様にしてキャピラリー電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。
得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。

（実施例３）
ガラス製マイクロチップ（幅５０ｍｍ×長さ３０ｍｍ×厚さ２ｍｍ）にクロス十字型の泳動路（流路幅１００μｍ）を作製し、泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。
泳動路をアニオン性ポリマーであるコンドロイチン硫酸（１．０重量％水溶液）を用いて、実施例１と同様の手順でコーティングした後、実施例１と同様の泳動用緩衝液を用いて、１０００Ｖにて、マイクロチップ電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。
得られたエレクトロフェログラムは図１及び図２と同様であった。

（実施例４）
カチオン性ポリマーであるキトサン（和光純薬社製、キトサン１００）を０．２重量％含有する０．２Ｎ塩酸溶液を用い、実施例１と同様の方法でキャピラリー内面をコーティングした以外は、実施例１と同様の泳動用緩衝液、手順を用いて、キャピラリー電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。
なお、健常人血及び修飾Ｈｂ含有試料としては、全血７０μＬに、０．０５重量％のトリトンＸ−１００を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０：亜硝酸塩を含まない緩衝液）２００μＬを添加して溶血希釈したものを用いた。
得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。

（実施例５）
カチオン性ポリマーであるポリブレン（ナカライテスク社製）の０．５重量％水溶液を用い、実施例１と同様の方法でキャピラリー内面をコーティングした後、泳動用緩衝液として、亜硝酸ナトリウム３０ｍＭ及びコンドロイチン硫酸２．０重量％を含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．８）を用いた以外は、実施例１と同様にしてキャピラリー電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。
得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。

（実施例６）
ガラス製マイクロチップ（幅５０ｍｍ×長さ３０ｍｍ×厚さ２ｍｍ）にクロス十字型の泳動路（流路幅１００μｍ）を作製し、泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。
泳動路をカチオン性ポリマーであるキトサン（１．０重量％水溶液）を用いて、実施例３と同様の方法でコーティングした後、実施例２と同様の泳動用緩衝液を用いた以外は、実施例３と同様にしてマイクロチップ電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。
得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。

（実施例７）
ポリジメチルシロキサン製マイクロチップ（幅５０ｍｍ×長さ３０ｍｍ×厚さ２ｍｍ）にダブルＴ型の泳動路（流路幅８０μｍ）を作製し、泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。泳動路をカチオン性ポリマーであるポリブレン（１．０重量％水溶液）を用いて、実施例３と同様の方法でコーティングした後、実施例５と同様の泳動用緩衝液を用いて、９００Ｖにて、マイクロチップ電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。
得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。

（実施例８）
フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス社製：内径２５μｍ×全長２３ｃｍ）を０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、０．５重量％のアルブミン（ウマ由来：和光純薬社製）を含むリンゴ酸緩衝液を１分間通液して、動的コーティングを施した。
次に、０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製：硫酸化多糖類）及び亜硝酸ナトリウム３０ｍＭを含むリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）をキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に通液した。キャピラリーの一方より試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に８．５ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。
得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。

（比較例１〜８）
比較例１〜８において、泳動用緩衝液及び溶血希釈液が亜硝酸塩類を含有しないこと以外は、実施例１〜８と同様にして、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料を測定した（実施例１の条件で亜硝酸塩を含まない場合を比較例１とした。実施例２〜７についても同様である。）。
比較例１〜７において得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。比較例８において得られたエレクトロフェログラムを図３に示す。図３に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃを修飾Ｈｂから分離できなかった。

（評価）
（１）同時再現性試験による評価
実施例１〜８及び比較例１〜８の測定条件を用いて、同一の健常人血試料を同日に１０回連続して測定し、得られた各エレクトロフェログラムから安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。
なお、安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出し、ＣＶ値は（標準偏差／平均値）を求めることにより算出した。
結果を表１に示した。

表１に示すように、実施例１〜７では、健常人血試料の安定型Ａ１ｃ値の同時再現性（ＣＶ値）は、１．０％以下であり、安定型ＨｂＡ１ｃ値が精度良く測定できることが確認された。実施例８もわずかにＣＶ値が大きいが（１．３％）、良好な数値を示した。
比較例１〜８も、ＣＶ値が１．０〜２．０％であり、良好な同時再現性を示したが、実施例より劣り、亜硝酸塩の緩衝液類への添加により、同時再現性が向上することが確認された。

（２）日差再現性試験による評価
実施例１〜８及び比較例１〜８の測定条件を用いて、同一の健常人血試料を同日内に連続して５回測定する一連の測定を、連続する５日間に渡って実施し、得られた各エレクトロフェログラムから安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。
なお、安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出しし、ＣＶ値は（標準偏差／平均値）を求めることにより算出した。
結果を表２に示した。

表２に示すように、実施例１〜７では、健常人血試料の安定型Ａ１ｃ値の日差再現性を示すＣＶ値は、１．６％以下であり、安定型ＨｂＡ１ｃ値が精度良く測定できることが確認された。
一方、比較例１〜７においては、日差再現性を示すＣＶ値が４．０％以上であり、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値の管理に使用できるレベルではなかった。
実施例８ではＣＶ３．０％であったが、比較例８より改善することができた。
従って、亜硝酸塩の緩衝液類への添加により、日差再現性が顕著に向上することが確認された。

（３）異常Ｈｂ類の測定
実施例１及び比較例８の測定条件を用いて、異常ＨｂとしてＨｂＳ及びＨｂＣを含む試料（ＡＦＳＣヘモコントロール：ヘレナ研究所社製）の測定を行った。
実施例１の測定条件を用いて測定した結果、得られたエレクトロフェログラムを図４に示す。また、比較例８の測定条件を用いて測定した結果、得られたエレクトロフェログラムを図５に示す。図４及び図５中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ_０、ピーク４はＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク５はＨｂＳ、ピーク６はＨｂＣを示す。なお、実施例２〜８の測定条件により得られたエレクトロフェログラムは図４とほぼ同様な形状を示した。図４に示すように、実施例１の測定条件を用いて測定した場合、安定型ＨｂＡ１ｃと共に、異常ＨｂであるＨｂＳ及びＨｂＣが短時間で精度よく分離された。
一方、図５に示すように、比較例８の測定条件を用いて測定した場合、異常Ｈｂ類であるＨｂＳ及びＨｂＣを分離することはできなかった。

（４）ＨｂＡ２を含む試料の測定
ＨｂＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を用いた以外は、実施例１〜７、比較例８の測定条件と同様の方法によって、ＨｂＡ２を含む試料の測定を行った。
実施例１の測定条件を用いて測定した場合において、得られたエレクトロフェログラムを図６に示す。図６中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ_０、ピーク４はＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク７はＨｂＡ２を示す。なお、実施例２〜７の測定条件により得られたエレクトロフェログラムは図６とほぼ同様な形状を示した。
図６に示すように、実施例１の測定条件を用いて測定した場合、ＨｂＡ２を分離することができ、安定型ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ２との同時測定が可能であった。
一方、比較例８の測定条件では、ＨｂＡ２は分離できなかった。
この結果から、実施例１〜７の測定条件を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃの測定による糖尿病診断に加えて、他のＨｂ由来の疾病について同時にスクリーニング検査することが可能となることが確認された。

本発明によれば、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法を提供することができる。

実施例１の測定条件により、健常人血を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。実施例１の測定条件により、修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。比較例８の測定条件により、修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムを示す。実施例１の測定条件により、異常Ｈｂ（ＨｂＳ及びＨｂＣ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。比較例８の測定条件により、異常Ｈｂ（ＨｂＳ及びＨｂＣ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。実施例１の測定条件により、ＨｂＡ２を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いた電気泳動装置の一例を示す模式図である。

符号の説明

１１キャピラリー電気泳動装置
１２陽極槽
１３陰極槽
１４キャピラリー
１５高圧電源
１６検出器
１７電極
１８電極
１安定型ＨｂＡ１ｃ
２ＨｂＡ_０
３修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）
４ＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）
５ＨｂＳ
６ＨｂＣ
７ＨｂＡ２

Claims

キャピラリー電気泳動法又はマイクロチップ電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、イオン性泳動路と、電気泳動時に前記泳動路の内部に満たされる、亜硝酸塩を含有する緩衝液とを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
イオン性泳動路は、イオン性ポリマーを泳動路の内面に固定化したものであり、亜硝酸塩を含有する緩衝液は、更にアニオン性ポリマーを含有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
請求項１又は２記載のヘモグロビン類の測定方法を用いることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
請求項１又は２記載のヘモグロビン類の測定方法を用いることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法。