JP4854651B2 - ヘモグロビン類の測定装置及びヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Description
従来、HbA1cの測定方法としては、HPLC法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているHPLC法では、1試料当たり1〜2分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のCV値が1.0%程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている
しかしながら、従来から汎用されているゲル電気泳動の手法では30分以上の時間が必要であり、測定精度の点でも問題があるため、現在では糖尿病診断への応用は、ほとんど行われていない。
しかしながら、特許文献1に開示された方法では、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のpHが9〜12と高く、Hbが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。
また、特許文献2には、キャピラリーにカチオン性ポリマーを通液することによって、キャピラリー内面にカチオン性ポリマーを動的にコーティングし、硫酸化多糖類を含む緩衝液を用いる方法が開示されている。この方法によれば、10分間程度で測定することができ、ゲル電気泳動法と比較して短時間で測定することが可能となる。しかしながら測定毎に動的コーティングが必要であるため操作時間が延長し、また測定毎のコーティングのバラツキが測定結果に悪影響を及ぼす可能性がある。
以下、本発明を詳細に説明する。
上記マイクロデバイスは、該マイクロデバイス内に電気泳動が実施できる流路が形成されていれば特に制限はなく、公知の素材、形状、大きさのものを使用することができる。
上記マイクロデバイスとしては、例えば、数cm〜数十cm角以下程度の大きさを有し、電気泳動を行うための泳動路が形成された基板からなる公知のマイクロデバイス等が挙げられ、具体的には例えば、μ−TAS、Lab−on−a−chipと呼ばれる技術に用いられる従来公知のマイクロチップ等を用いることができる。
上記流路は、内表面及び内空部を有し、電気泳動を実施する際には、内空部に緩衝液が満たされる。また、上記内空部に測定対象試料(以下、単に試料ともいう)が導入され、緩衝液に電圧が負荷されて同試料が移動することにより、試料の分離が行なわれる。分離された試料中の各分画は、流路部に設けられた検出部において、順次検出される。
本発明のヘモグロビン類の測定装置において、「泳動路」とは、電圧が負荷され始める時、すなわち、実質上、電気泳動が開始される時に、試料が位置する流路の部位から、各成分が移動して検出される流路の部位までの流路部分をいう。
上記泳動路の長さは、好ましい下限が5mm、好ましい上限が200mmである。5mm未満であると、充分に試料が分離されないため、正確な測定をすることができないことがある。200mmを超えると、測定時間の延長や得られるエレクトロフェログラムにおいてピーク形状の変形が生じることによって、正確な測定をすることができないことがある。より好ましい下限は10mm、より好ましい上限は150mmである。
上記泳動路の断面の形状としては特に限定されず、例えば、矩形、円形等が挙げられる。
また、上記泳動路は、複数の泳動路を一度に用いる構成、すなわち、キャピラリーを複数本同時に使用できるものや、1つのデバイス上に複数の泳動路を有している構成でもよい。
本発明のヘモグロビン類の測定装置において、「カチオン性素材により形成される」とは、従来技術により開示される各種コーティングによる泳動路内面の性質の改変によりカチオン性を付与されて得られるカチオン性泳動路は含まない。すなわち、本発明のヘモグロビン類の測定装置において、「カチオン性素材により形成された」泳動路とは、該泳動路において電気泳動が実施される際において、動的コーティング法及び静的(コーティング剤が固定化される)コーティング法のいずれの動作も行なわれることなくカチオン性を有しており、電気泳動を実施する泳動路であることを意味する。
上記カチオン性官能基としては特にされず、例えば、1〜3級のアミノ基、4級アンモニウム基、ピリジウム基、グアジニノ基、及びこれらを含む官能基等が挙げられる。
なかでも、1〜3級アミノ基及び4級アンモニウム基が好ましい。
上記カチオン性基を有する高分子材料を調整する方法としては特に限定されず、例えば、上記カチオン性基を有する単量体を重合する方法、又は、基材となる高分子材料に上記カチオン性基を導入する方法等が挙げられる。なかでも、上記カチオン性基を有する単量体を重合する方法が好ましい。
また、上記カチオン性基を有する素材は親水性であることが好ましい。
上記カチオン性基を有する単量体は、単独で用いてもよく、複数種を用いてもよく、他の単量体との共重合体としてもよい。
上記緩衝液類としては特に限定されず、従来公知の緩衝液を用いることができる。
本明細書において、「緩衝液類」とは、電気泳動時、電気泳動に用いる上記流路及び泳動路の内部に満たされる緩衝液の他、電気泳動に用いる陽極槽及び陰極槽に満たされる緩衝液、流路を洗浄する緩衝液、試料を溶解希釈する溶血希釈液等を含むものとする。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
上記アニオン性ポリマーとしては、アニオン性官能基を有し、電気泳動の実施条件下でアニオン性であるポリマーであれば特に限定されず、従来公知のものを用いることができる。
上記アニオン性ポリマーは、上記緩衝液類の全てに含まれてもよいし、上記緩衝液類の一部にのみ含まれてもよい。
上記アニオン性ポリマーの重量平均分子量としては特に限定されないが、好ましい下限は500である。分子量が500未満であると、アニオン性ポリマーの添加効果が充分に発揮されないことがある。より好ましい下限は1000である。
上記水溶性としては、電気泳動実施時に上記アニオン性ポリマーが上記緩衝液類に溶解している程度であれば特に限定されないが、水に対する溶解度の好ましい下限は1g/Lである。1g/L未満であると、アニオン性基を有する水溶性ポリマー低濃度でしか用いることができないため効果が現れにくく、測定精度が不充分となることがある。より好ましい下限が5g/Lである。
上記アクリル系ポリマーは、アニオン性基を有する(メタ)アクリルモノマーと、アニオン性基を有しない(メタ)アクリルモノマーとの共重合体であってもよい。
本明細書において、「安定型ヘモグロビンA1cを他のヘモグロビン類から分離して測定する」とは、安定型HbA1cを、不安定型HbA1c、カルバミル化Hb等の修飾Hb類、その他のHb類、すなわち、HbA1a、HbA1b、HbF、HbA0から分離して測定することができることを意味し、更に、安定型HbA1cを他のヘモグロビン類から分離して測定することと同時に、HbS、HbC、HbA2等を分離して測定することができることを意味する。
このように電気泳動法によりヘモグロビン類を測定する方法であって、本発明のヘモグロビン類の測定装置を用いるヘモグロビン類の測定方法もまた、本発明の一つである。
更に、このような本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いることによって、安定型ヘモグロビンA1cと、異常ヘモグロビン類とを同時に測定するする安定型ヘモグロビンA1c及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法もまた、本発明の一つである。
なお、本明細書おいて、異常ヘモグロビン類とは、HbS、HbC等の他に、HbA2も含めたヘモグロビン類を意味する。
(ジエチルアミノエチルメタクリレート(カチオン性官能基を有する単量体))−(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)−(メチルメタクリレート)の3元共重合体によりマイクロデバイスを作製した(50mm×80mm)。得られたマイクロデバイス内に流路(内径100μ×50mm)を作製した。
緩衝液として、2.0重量%のコンドロイチン硫酸(アニオン性ポリマー)を含むクエン酸緩衝液(pH5.0)を上述の流路に注入した。
試料として、健常人血よりフッ化ナトリウム採血した健常人全血70μLに、0.5重量%のサポニンを含むクエン酸緩衝液(pH6.0)200μLを添加して溶血希釈したもの(健常人試料)を用いた。
得られた健常人試料を上述の流路内に注入し、流路の両端に800Vの電圧をかけて電気泳動を行った。流路の途中に415nmの可視光を照射し、透過した光の吸光度変化を測定したところ、図1に示すエレクトロフェログラムが得られた。図1中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0を示す。
上述の健常人全血に、グルコースを2000mg/dLとなるよう添加して、不安定型HbA1cを多量に含む試料(L−A1c試料)、及び、上述の健常人全血に、シアン酸ナトリウムを50mg/dLとなるように添加してカルバミル化Hbを多量に含む試料(CHb試料)をそれぞれ人為的に調製した。
L−A1c試料を測定した結果、得られたエレクトロフェログラムを図2に示す。図2中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク3は不安定型HbA1cを示す。安定型HbA1cと修飾Hbである不安定型HbA1cが良好に分離された。
同様に、CHb試料を測定した結果、上述の図2と同様のエレクトロフェログラムが得られ、図2のピーク3の位置にカルバミル化Hbが確認された。
カチオン性官能基を有する単量体としてアクリルアミドを用いてマイクロデバイスを作製し、緩衝液として、1.5重量%の硫酸デキストランを含むリン酸緩衝液(pH5.4)を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、健常人試料、L−A1c試料、CHb試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは、図1及び図2と同様であった。
(エチレンイミン(カチオン性官能基を有する単量体))−(エチレンビニルアルコール)−(メチルメタクリレート)の3元共重合体を用いてマイクロデバイスを作製し、緩衝液として、1.0重量%の(2−(メタ)アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸)−(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)共重合体を含むリンゴ酸緩衝液(pH4.9)を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、健常人試料、L−A1c試料、CHb試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは、図1及び図2と同様であった。
実施例1のマイクロデバイスの作製に用いた素材(単量体)のうち、カチオン性官能基を有する単量体を除いた単量体のみからなる共重合体を用いたこと、すなわち、(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)−(メチルメタクリレート)共重合体を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、マイクロデバイスを作製し、健常人試料、L−A1c試料、CHb試料の測定を行った。
いずれの測定においても、Hbのいずれの成分のピークも検出されなかった。
実施例3のマイクロデバイスの作製に用いた素材(単量体)のうち、カチオン性官能基を有する単量体を除いた単量体のみからなる共重合体を用いたこと、すなわち、(エチレンビニルアルコール)−(メチルメタクリレート)共重合体を用いたこと以外は、実施例3と同様にして、マイクロデバイスを作製し、健常人試料、L−A1c試料、CHb試料の測定を行った。
いずれの測定においても、Hbのいずれの成分のピークも検出されなかった。
フューズドシリカを用いて、実施例1と同様のマイクロデバイスを作製した。得られたマイクロデバイスの泳動路に、0.01%のポリブレン水溶液を20分間通液した後、空気を注入して乾燥することにより、泳動路内面にポリカチオンをコーティングした。実施例1と同様にして、健常人試料、L−A1c試料、CHb試料の測定を行った。健常人試料を測定して得られたエレクトロフェログラムは、図1と同様であったが、L−A1c試料及びCHb試料を測定して得られたエレクトロフェログラムは、図5に示すように、分離が不充分であった。図5中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク3は不安定型HbA1cを示す。
(ΔHbA1c値)
実施例1〜3及び比較例3で得られたヘモグロビン類の測定システムを用いて、グルコースを添加する前の健常人試料と、同一人を元に調製したL−A1c試料の安定型HbA1c値の差(ΔHbA1c)を求めた。同様に、シアン酸ナトリウムを添加する前の健常人試料と、同一人を元に調製したCHb試料の安定型HbA1c値の差(ΔHbA1c)を求めた。
結果を表1に示す。
実施例1〜3及び比較例3で得られたヘモグロビン類の測定システムを用いて、同一健常人試料を10回連続して測定した際の、安定型HbA1c値のCV値を算出した。
なお、CV値は(標準偏差/平均値)を算出することにより求めた。
結果を表2に示す。
実施例1について、異常Hb類として、HbS及びHbCを含む試料(AFSCヘモコントロール、ヘレナ研究所社製)を用いて、上述の健常人試料の電気泳動による測定と同様の測定をした結果、得られたエレクトロフェログラムを図3に示す。図3中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク4はHbF(胎児性Hb)、ピーク5はHbS、ピーク6はHbCを示す。図3に示すように、安定型HbA1cとともに、HbS及びHbCが良好に分離された。実施例2、3及び比較例1について得られたエレクトロフェログラムも図3と同様であった。
2 HbA0
3 修飾Hb(不安定型HbA1c)
4 HbF(胎児性Hb)
5 HbS
6 HbC
7 HbA2
Claims (3)
- 電気泳動法によりヘモグロビン類を測定するためのヘモグロビン類の測定装置であって、
内表面がカチオン性を有する素材によって形成された泳動路を有するマイクロデバイスを有し、
前記マイクロデバイスは、アニオン性ポリマーを含有する緩衝液類が充填された泳動路を有することを特徴とするヘモグロビン類の測定装置。 - 電気泳動法によりヘモグロビン類を測定する方法であって、
請求項1記載のヘモグロビン類の測定装置を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。 - 請求項2記載のヘモグロビン類の測定方法を用いることによって、安定型ヘモグロビンA1cと異常ヘモグロビン類とを同時に検出することを特徴とする安定型ヘモグロビンA1c及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法。
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