JP6052927B2 - 試料の分析方法及びそれに用いる溶液 - Google Patents

Description

本開示は、試料の分析方法、キャピラリ電気泳動用溶液、及び試料分析用キットに関する。

臨床検査の現場においてヘモグロビン（Ｈｂ）の分析が日常的に行われている。分析対象となるヘモグロビン種は検査の目的に応じて異なる。糖尿病の診断や病状把握のための分析対象としてはＨｂＡ１ｃが良く知られている。異常ヘモグロビン症の診断のための分析対象としては、ＨｂＳ（鎌状赤血球ヘモグロビン）、ＨｂＣ、ＨｂＤ及びＨｂＥなどに代表される変異ヘモグロビン類が使用されている。また、βサラセミアの診断のための分析対象としては、ＨｂＡ２やＨｂＦ（胎児ヘモグロビン）が広く用いられている。

ヘモグロビンの分析は、イオン交換クロマトグラフィー法等の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法や、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）法により行われている（例えば、特許文献１〜４及び非特許文献１等）。
特許文献１には、陽イオン交換クロマトグラフィー法によるヘモグロビンの分析方法が記載されている。非特許文献１には、陰イオン交換クロマトグラフィー法によるヘモグロビンの分析方法が記載されている。しかしながら、ＨＰＬＣ法は、大型で高価な専用の装置を必要とし、装置の小型化及び低コスト化が困難である。
特許文献２には、アルカリｐＨでの自由溶液キャピラリ電気泳動法（キャピラリーゾーン電気泳動、ＣＺＥ）による、ヘモグロビンの分析方法が記載されている。特許文献３には、アルカリｐＨかつボロネート化合物の共存下でキャピラリ電気泳動を行う、ヘモグロビンの分析方法が記載されている。特許文献４には、擬似固定相としてアニオン性ポリマーを含有する溶液を用いた、陽イオン交換動電クロマトグラフィーによる、ヘモグロビンの分析方法が記載されている。

特開２０１４−９５６３８号公報 特開２００６−１４５５３７号公報 特表２０１２−５３１６０９号公報 特開２００９−１０９２３０号公報

Ｘｕｅｚｈｅｎ Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ７４， １０３８−１０４５

特許文献１及び非特許文献１の方法は、いずれもＨＰＬＣ法であるため、大型で高価な専用の装置を必要とし、装置の小型化および低コスト化が困難であるという問題がある。
特許文献２及び３の方法は、分析完了までに長時間を要し（例えば、８分以上）、また必要とされるキャピラリ長が長い（例えば、２０ｃｍ以上）ことから装置の小型化が困難であるという問題がある。
βサラセミア症患者は同時にＨｂＳなどの異常ヘモグロビン症を合併していることが多く、ＨｂＳとＨｂＡ２を分離することが求められるが、特許文献４の方法は、ＨｂＡ２と、比較的メジャーな変異ヘモグロビンであるＨｂＳとの分離が困難であるという問題がある。

そこで、本開示は、一態様において、ＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方の分離精度の向上及び分析時間の短縮及び装置の小型化が可能な試料の分析方法、キャピラリ電気泳動用溶液、及び試料分析用キットを提供する。

本開示は、一態様において、キャピラリ電気泳動により前記試料中のヘモグロビンを分離することを含み、前記ヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことを含む試料の分析方法に関する。

本開示は、一態様において、泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中のヘモグロビンの分離を行うことを含む試料の分析方法であって、前記泳動液がカチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である試料分析方法に関する。

本開示は、一態様において、カチオン性ポリマー及び水を含有し、アルカリ性である、ヘモグロビン分離分析用のためのキャピラリ電気泳動用溶液に関する。

本開示は、一態様において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器と、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有し、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップとを含む試料分析用キットに関する。

本開示によれば、装置の小型化が可能で、かつＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方の分離精度を向上可能な試料の分析方法、キャピラリ電気泳動用溶液、及び試料分析用キットを提供できる。

図１Ａは、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す上面図である。図１Ｂは、図１Ａに示す電気泳動チップの断面図である。 図２Ａ及びＢは、実施例１におけるキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示し、図２Ａはサンプルがβサラセミア患者由来の全血であり、図２Ｂはサンプルがコントロール検体である。 図３Ａ及びＢは、実施例２におけるキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示し、図３Ａはサンプルがβサラセミア患者由来の全血であり、図３Ｂはサンプルがコントロール検体である。 図４は、実施例３におけるキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラム（サンプル：コントロール検体）の一例を示す。 図５は、実施例４におけるキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラム（サンプル：コントロール検体）の一例を示す。 図６は、比較例１におけるキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラム（サンプル：コントロール検体）の一例を示す。 図７は、比較例２におけるキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラム（サンプル：コントロール検体）の一例を示す。

本開示は、一態様において、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で、キャピラリ電気泳動による試料中のヘモグロビンの分離を行うことによって、試料中のヘモグロビンの各分画（ＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方）を短時間で精度よく分離できるという知見に基づく。

カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中でキャピラリ電気泳動によるヘモグロビンの分離を行うことにより、試料中のＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方を短時間で精度よく分離できるメカニズムは明らかではないが、以下のように推察される。ヘモグロビンの等電点は中性付近であることから、アルカリ性溶液中ではヘモグロビンはマイナスにチャージする。マイナスにチャージしたヘモグロビンは、試料導入側に負電極を接触させて電圧を印加することにより正電極側へ移動する。一方、カチオン性ポリマーは正電極側から負電極側へ移動する。電気泳動中はマイナスチャージを有するヘモグロビンとプラスチャージを有するカチオン性ポリマーの間で相互作用が生じる。アルカリ溶液中では各ヘモグロビン画分のマイナスチャージの程度に差が存在するため、そのチャージの差が各ヘモグロビン画分とカチオン性ポリマーとの相互作用の差に反映される。この結果、ＨｂＡ２とＨｂＳの電気泳動速度に違いが生じることから、ＨｂＡ２又はＨｂＳの少なくとも一方の分離精度が向上するものと考えられる。ただし、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。

［カチオン性ポリマー］
本開示において「カチオン性ポリマー」とは、カチオン性基又はカチオン性基にイオン化されうる基を有するポリマーをいう。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、カチオン性基を有するモノマーの単独重合体やその他のモノマーとの共重合体又は縮重合体であってもよい。カチオン性基としては、一又は複数の実施形態において、窒素を含む基が挙げられる。カチオン性基としては、一又は複数の実施形態において、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、イミノ基、第４級アンモニウム塩基等のカチオン性基を有するポリマー等が挙げられ、分析精度の向上の観点から、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基を有するポリマーが好ましく、より好ましくは第１級アミノ基を有するポリマーである。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、水溶性であることが好ましい。カチオン性ポリマーは、分析精度の向上の観点から、一又は複数の実施形態において、直鎖であることが好ましい。カチオン性ポリマーは、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

第１級〜第３級アミノ基又は第１級〜第３級アミノ基にイオン化されうる基を有するカチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリジアリルアミン、ポリメチルジアリルアミン等が挙げられる。
イミノ基又はイミノ基にイオン化されうる基を有するカチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態においてポリエチレンイミン等が挙げられる。
第４級アンモニウム塩基又は第４級アンモニウム塩基にイオン化されうる基を有するカチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー等が挙げられる。本開示において「ポリクオタニウム」とは、第４級アンモニウム基を有するモノマーに由来する構成単位を含むカチオン性ポリマーをいう。ポリクオタニウムは、INCI(International Nomenclature for Cosmetic Ingredients) directoryで確認できる。ポリクオタニウムとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム−６（poly(diallyldimethylammonium chloride）、ポリクオタニウム−７（copolymer of acrylamide and diallyldimethylammonium chloride）、ポリクオタニウム−４（Diallyldimethylammonium chloride-hydroxyethyl cellulose copolymer）、ポリクオタニウム−２２（copolymer of acrylic acid and diallyldimethylammonium chloride）等のポリジアリルジメチルアンモニウム塩、及びポリクオタニウム−２（poly[bis(2-chloroethyl)ether-alt-1,3-bis[3-(dimethylamino)propyl]urea]）等が挙げられる。ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン以外の構成単位を含んでいてもよく、例えばエチレンジアミン等を含んでいてもよい。
また、カチオン性ポリマーとしては、上記アンモニウム塩以外にも、一又は複数の実施形態において、ホスホニウム塩、オキソニウム塩、スルホニウム塩、フルオロニウム塩、クロロニウム塩などのオニウム塩のカチオンポリマーも利用できる。
ヒドラジド基又はヒドラジド基にイオン化されうる基を有するカチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、アミノポリアクリルアミド等が挙げられる。
カチオン性ポリマーとしては、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン及びこれらの組み合わせが好ましく、より好ましくはポリアリルアミンである。

カチオン性ポリマーの重量平均分子量は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、１０００以上、５０００以上、又は１００００以上であり、溶液の粘性増加を抑える観点から、５０００００以下、又は３０００００以下である。

［カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液］
本開示において「カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液」とは、カチオン性ポリマーが媒体に分散又は溶解したアルカリ性の溶液をいう。媒体としては、一又は複数の実施形態において、水等が挙げられる。水としては、一又は複数の実施形態において、蒸留水、イオン交換水、純水及び超純水等が挙げられる。カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液としては、一又は複数の実施形態において、カチオン性ポリマー及び水を含むアルカリ性水溶液である。

アルカリ性溶液のｐＨは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンの等電点よりも高いことが好ましく、ＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方の等電点よりも高いことがより好ましい。ＨｂＳの等電点が７．２〜７．３であり、ＨｂＡ２の等電点が７．４〜７．５であることから、アルカリ性溶液のｐＨは、一又は複数の実施形態において、７．５以上であり、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、８．５以上、又は９．５以上が好ましく、ヘモグロビン変性の抑制の点から、１２．０以下又は１１．０以下が好ましい。なお、上記のｐＨは、２５℃におけるアルカリ性溶液のｐＨであり、ｐＨメータを用いて測定でき、電極の浸漬後３０分後の数値である。

アルカリ性溶液におけるカチオン性ポリマーの含有量は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の点から、０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上、０．０５％（Ｗ／Ｖ）以上又は０．１％（Ｗ／Ｖ）以上であり、溶液の粘性増加の抑制の点から、１０．０％（Ｗ／Ｖ）以下、８．０％（Ｗ／Ｖ）以下又は５．０％（Ｗ／Ｖ）以下である。

［試料］
本開示において「試料」としては、限定されない一又は複数の実施形態において、試料原料から調製したもの、又は試料原料そのものが挙げられる。試料原料としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンを含むもの又は生体試料が挙げられる。生体試料としては、限定されない一又は複数の実施形態において、血液、赤血球成分を含む血液由来物等が含まれる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、限定されない一又は複数の実施形態において、動物の血液、哺乳類の血液、ヒトの血液が挙げられる。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むものが挙げられ、限定されない一又は複数の実施形態において、血漿が除かれた血球画分、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球等が挙げられる。

［試料分析方法］
本開示は、一態様において、試料の分析方法に関する。本開示の試料分析方法は、一態様において、キャピラリ電気泳動による前記試料中のヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことを含む。また、本開示の試料分析方法は、一態様において、泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中のヘモグロビンの分離を行うことを含み、前記泳動液がカチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である。

本開示によれば、試料中のヘモグロビンの分離をカチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことから、一又は複数の実施形態において、ＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方の分離精度を向上できる。本開示によれば、特に限定されない一又は複数の実施形態において、ＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方の分離を小型の装置で短時間で行うことができ、好ましくはＨｂＳ及びＨｂＡ２の分離精度及び分離速度を向上できるという効果を奏しうる。

ヘモグロビンの分離は、一又は複数の実施形態において、ＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方を分離することを含み、好ましくはＨｂＳ及びＨｂＡ２を分離することを含む。また、ヘモグロビンの分離は、一又は複数の実施形態において、ＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方、及びＨｂＦ、ＨｂＣ、ＨｂＤ又はＨｂＥの少なくとも一つを分離することを含む。

本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である泳動液を用いて行うことを含む。

ヘモグロビンの分離は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ流路を用いて行う。キャピラリ流路は、一又は複数の実施形態において、内径が１００μｍ以下である管である。管の断面形状は、特に制限されず、円でも、矩形でも、その他の形状でもよい。また、キャピラリ流路の長さは、一又は複数の実施形態において、１０ｍｍ以上又は２０ｍｍ以上であり、１５０ｍｍ以下又は６０ｍｍ以下である。キャピラリ流路の内径は、一又は複数の実施形態において、１０μｍ以上又は２５μｍ以上であり、１００μｍ以下又は７５μｍ以下である。

キャピラリ流路は、一又は複数の実施形態において、カチオン性物質又はアニオン性物質で被覆された流路であることが好ましい。カチオン性物質で被覆することによってキャピラリ流路の内壁をプラスに帯電させることができ、その結果、キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。アニオン性物質で被覆した場合、キャピラリ流路はマイナスに帯電するが、アルカリ性溶液に含まれるカチオン性ポリマーがマイナスに帯電したキャピラリ流路に結合することによってキャピラリ流路の内壁はプラスに帯電され、上記と同様にキャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう液流を生じさせることを含む。液流は、一又は複数の実施形態において、電気浸透流であることが好ましい。

カチオン性物質としては、一又は複数の実施形態において、上述のカチオン性ポリマー、カチオン性官能基を有するシランカップリング剤等が挙げられる。分析精度の向上の観点から、第４級アンモニウム塩基を有するポリマーが好ましい。

アニオン性物質としては、一又は複数の実施形態において、アニオン性基を有する多糖類、アニオン性官能基を有するシランカップリング剤等が挙げられる。アニオン性基を有
する多糖類としては、一又は複数の実施形態において、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、及びリン酸化多糖類が挙げられる。硫酸化多糖類としては、限定されない一又は複数の実施形態において、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、又はその塩等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸、ヒアルロン酸又はその塩等が挙げられる。アニオン性基を有する多糖類が塩である場合、対イオンとしては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アミン化合物、有機塩基等のイオンが挙げられる。カルボン酸化多糖類の塩としては、一又は複数の実施形態において、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリス塩、アルギニン塩、リジン塩、ヒスチジン塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩、ジメチルアミノエタノール塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、クレアチニン塩等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、限定されない一又は複数の実施形態において、アルギン酸又はその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が挙げられる。

本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ流路がマイクロチップ化されたキャピラリ電気泳動チップを用いて行うことが好ましい。電気泳動チップの大きさは、一又は複数の実施形態において、長さ１０ｍｍ〜２００ｍｍ、幅１ｍｍ〜６０ｍｍ、厚み０．３ｍｍ〜５ｍｍであり、又は、長さ３０ｍｍ〜７０ｍｍ、幅１ｍｍ〜６０ｍｍ、厚み０．３ｍｍ〜５ｍｍである。キャピラリ電気泳動チップの限定されない実施形態は後述する。

本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行うこと含む。本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、試料導入側に負電極を接触させて電圧を印加することを含み、好ましくは試料導入側に負電極を接触させ、泳動液供給側に正電極を接触させて電圧を印加することを含む。

試料は、分離精度の向上の観点から、一又は複数の実施形態において、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液を用いて調製された試料であることが好ましい。本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液を用いて試料原料を希釈して試料を調製することを含む。希釈率は、一又は複数の実施形態において、１．２倍〜１００倍、２倍〜６０倍、又は３倍〜５０倍である。試料原料に分離能に影響を及ぼし得る程度にイオン成分が含まれている場合、希釈率は、一又は複数の実施形態において、２倍〜１０００倍、５倍〜３００倍、又は１０倍〜２００倍である。試料の調製に用いるカチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ流路に充填される液（ランニングバッファ）と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよい。

アルカリ性溶液は、一又は複数の実施形態において、非界面活性剤型の両イオン性物質又はｐＨ緩衝物質の少なくとも一方や、微生物の繁殖などを抑制するための保存剤等を含んでいてもよい。保存剤としては、一又は複数の実施形態において、アジ化ナトリウム、エチルパラベン、プロクリン等が挙げられる。

非界面活性剤型の両イオン性物質としては、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、ｐＨ緩衝作用を有さない物質であることが好ましく、泳動条件のｐＨにおいてｐＨ緩衝作用を発揮しない又は実質的に発揮しない物質であることがより好ましい。非界面活性剤型の両イオン性物質としては、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、非界面活性剤型のベタインが好ましく、より好ましくは非界面活性剤型のスルホベタイン及びカルボキシベタインが挙げられ、さらに好ましくは四級アンモニウムカチオンとスルホ基（−ＳＯ₃−）若しくはカルボキシル基（−ＣＯＯ−）とを同一分子内の隣り合わない位置に有する非界面活性剤型の物質、さらにより好ましくは非界面活性剤型スルホベタイン（ＮＤＳＢ）である。ＮＤＳＢの限定されない一又は複数の実施形態として、ＮＤＳＢ−２０１（３−（１−Ｐｙｒｉｄｉｎｉｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｃ₈Ｈ₁₁ＮＯ₃Ｓ）、ＮＤＳＢ−２１１（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｃ₇Ｈ₁₇ＮＯ₄Ｓ）、ＮＤＳＢ−２２１（３−（１−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｉｕｍ−１−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｃ₉Ｈ₁₉ＮＯ₃Ｓ）、ＮＤＳＢ−１９５（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｃ₇Ｈ₁₇ＮＯ₃Ｓ）、及びＮＤＳＢ−２５６（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｃ₁₂Ｈ₁₉ＮＯ₃Ｓ）等が挙げられる。

ｐＨ緩衝物質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、泳動条件のｐＨにおいてｐＨ緩衝作用を有するものであればよい。ｐＨ緩衝物質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）），ＰＯＰＳＯ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）， ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、炭酸、リン酸、ホウ酸、グリシン、アラニン、ロイシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、タウリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、プロリン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、バリン、システイン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、オルニチン、トリプトファン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジメチルアミノエタノール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、Ｎ−メチルアミノエタノール、クレアチニン、イミダゾール、バルビタール、アンモニア、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。その他のｐＨ緩衝物質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、１，４−ジアミノブタン等のジアミン化合物が挙げられる。

本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動によって分離されたヘモグロビン画分を検出することを含む。検出は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動により分離されたヘモグロビン画分を光学的手法により検出することにより行うことができる。光学的手法による検出としては、例えば、吸光度の測定が挙げられる。吸光度の波長としては、一又は複数の実施形態において、４１５ｎｍが挙げられる。

本開示の試料分析方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、光学的手法により得られたエレクトロフェログラムを解析する工程を含んでいてもよい。連続的にサンプリングしながら分離（キャピラリ電気泳動）を行う場合、得られるエレクトロフェログラムからは試料中のヘモグロビンを個別に分析することは因難であるが、解析処理を行うことにより、試料中のヘモグロビンを個別に分離・分析できる。解析工程は、エレクトロフェログラムを演算処理することにより、移動度（分離時間）に応じて分離したエレクトロフェログラムを得ることを含んでいてもよく、処理後のエレクトロフェログラムにおける各ピークの高さ及び／又はピークの面積に基づき、試料中のヘモグロビンの成分比を求めることを含んでいてもよい。演算処理としては、例えば、微分処理、差分処理が挙げられる。

本開示は、一態様において、本開示の試料分析方法を用いて試料中のヘモグロビンを測定することを含む試料中のヘモグロビンの測定方法に関する。試料は上記のとおりである。本開示の測定方法は、限定されない一又は複数の実施形態において、異常ヘモグロビン症の指標となるＨｂＳ又はβサラセミアの指標となるＨｂＡ２の少なくとも一方を測定することを含む。したがって、本開示は、その他の態様として、本開示の試料分析方法を用いてＨｂＳ又はＨｂＡ２の少なくとも一方を測定することを含むヘモグロビンの測定方法に関する。本開示の測定方法は、βサラセミア及び異常ヘモグロビン症の診断を同時に行う観点から、本開示の試料分析方法を用いてＨｂＳ及びＨｂＡ２を分離して測定することが好ましい。

［キャピラリ電気泳動用溶液］
本開示は、一態様において、カチオン性ポリマー及び水を含有し、アルカリ性であるキャピラリ電気泳動用溶液に関する。本開示において「キャピラリ電気泳動用溶液」とは、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動においてキャピラリ流路に充填される液をいう。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、試料を調製するための溶液として使用してもよい。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、本開示の試料分析方法に使用でき、それにより試料の分析精度の向上に寄与でき、好ましくは分析精度の向上と測定時間の短縮に寄与できる。

本開示のキャピラリ電気泳動用溶液としては、上述したカチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液が使用できる。

［試料分析用キット］
本開示は、一態様において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器、及びキャピラリ電気泳動チップを含む試料分析用キットに関する。本開示の試料分析用キットにおいて、キャピラリ電気泳動チップは、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有し、試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップである。本開示の試料分析用キットは、一又は複数の実施形態において、本開示の試料分析方法に使用でき、それにより試料の分析精度の向上に寄与でき、好ましくは分析精度の向上と測定時間の短縮に寄与できる。キャピラリ電気泳動用溶液、キャピラリ流路及びキャピラリ泳動チップについての説明及び実施形態については上述したとおりである。

［試料分析システム］
本開示は、一態様において、キャピラリ電気泳動チップを用いて試料を分析するシステムであって、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器及びキャピラリ電気泳動チップを保持する保持部と、前記キャピラリ電気泳動チップに電圧を印加する電源部と、分析の実施項目に応じて前記キャピラリ電気泳動チップに印加する電圧の極性の切り換えを制御する制御部とを備える試料の分析システムに関する。

以下、本開示の試料分析方法について、限定されない一実施形態を説明する。

（実施の形態１）
図１に示すキャピラリ電気泳動チップを用い、試料原料が全血である場合を例にとり説明する。

図１は、本開示の試料分析方法に使用するキャピラリ電気泳動チップの構成の限定されない一又は複数の実施形態を示す概念図である。図１Ａは、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す上面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示す電気泳動チップの断面図である。
図１Ａ及びＢに示すキャピラリ電気泳動チップは、キャピラリ流路１０、試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２を備え、試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２は、キャピラリ流路１０で連通している。キャピラリ流路１０には検出部１３が形成されている。キャピラリ流路１０の長さ及び内径、並びにキャピラリ電気泳動チップの大きさは上述したとおりである。

試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２の容積は、キャピラリ流路１０の内径及び長さ等に応じて適宜決定されるが、一又は複数の実施形態において、それぞれ、１ｍｍ³〜１０００ｍｍ³であり、好ましくは５ｍｍ³〜１００ｍｍ³である。試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２は、キャピラリ流路１０の両端に電圧を印加するための電極をそれぞれ備えていてもよい。

測定を行う位置、すなわち、分離に要する長さ（試料保持槽１１から検出部１３までの距離、図１Ａにおけるｘ）は、キャピラリ流路１０の長さ等に適宜決定できる。キャピラリ流路１０の長さ（図１Ａにおけるｘ＋ｙ）が１０ｍｍ〜１５０ｍｍである場合、検出部１３までの距離（ｘ）は、５ｍｍ〜１４０ｍｍ、１０ｍｍ〜１００ｍｍ又は１５ｍｍ〜５０ｍｍである。

キャピラリ流路１０の材質は、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等が挙げられる。プラスチックとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等が挙げられる。

キャピラリ流路１０は、市販のキャピラリであってもよい。キャピラリ電気泳動チップは、市販のＨｂＡ１ｃ用チップを用いてもよい。

つぎに、図１に示すキャピラリ電気泳動チップを用いた試料の分析方法の一例について説明する。

まず、キャピラリ電気泳動チップの泳動液保持槽１２に本開示のキャピラリ電気泳動用溶液（カチオン性ポリマーを含有するアルカリ性水溶液）を泳動液として充填し、毛細管現象により泳動液をキャピラリ流路１０に充填する。

つぎに、泳動液が充填されたキャピラリ電気泳動チップの試料保持槽１１に試料を配置する。

c
試料保持槽１１に配置する試料は、試料原料である全血を本開示のキャピラリ電気泳動用溶液により希釈することにより調製できる。

ついで、試料保持槽１１に負電極、泳動液保持槽１２に正電極を接触させ、キャピラリ流路１０の両端、すなわち、試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２との間に電圧を印加する。これにより、試料保持槽１１からキャピラリ流路１０に試料が導入され、ヘモグロビンを含む試料が試料保持槽１１から泳動液保持槽１２に向かって移動するとともに、ヘモグロビンの分離が行われる。キャピラリ流路１０の両端に印加する電圧は、限定されない一又は複数の実施形態において、５００Ｖ〜１００００Ｖ、又は５００Ｖ〜５０００Ｖである。

そして、検出部１３において測定を行う。測定は、例えば、波長４１５ｎｍの吸光度の測定等の光学的手法により行うことができる。

上述のように分析を行うことによって、ヘモグロビンの測定を行うことができ、好ましくは異常ヘモグロビン症の診断の指標となるＨｂＳや、βサラセミア診断の指標となるＨｂＡ２を分離して測定することができる。さらに、得られたエレクトロフェログラムを解析することにより、例えば、分離された各ヘモグロビンの比率（％）やその量を測定することができる。このため、本開示の試料分析方法は、異常ヘモグロビン症やβサラセミアの予防、診断及び治療等の用途に利用することができる。

本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕 試料の分析方法であって、
キャピラリ電気泳動により前記試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
前記ヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことを含む、試料分析方法。
〔２〕 泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、
前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中のヘモグロビンの分離を行うことを含む、試料の分析方法であって、
前記泳動液が、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である、試料分析方法。
〔３〕 カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液を用いて前記試料を調製することを含む、〔１〕又は〔２〕に記載の試料分析方法。
〔４〕 前記カチオン性ポリマーが、第１〜第３級アミノ基、イミノ基、第４級アンモニウム塩基又はヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔５〕 前記アルカリ性溶液のｐＨが、７．５〜１２.０である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔６〕 前記アルカリ性溶液が、非界面活性剤型の両イオン性物質、ｐＨ緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔７〕 前記キャピラリ流路は、カチオン性物質又はアニオン性物質が固定化されている、〔２〕から〔６〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔８〕 前記キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう液流を生じさせることを含む、〔２〕から〔７〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔９〕 前記試料導入側に負電極を接触させて電圧を印加することを含む、〔２〕から〔８〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔１０〕 カチオン性ポリマー及び水を含有し、アルカリ性である、ヘモグロビン分離分析用のためのキャピラリ電気泳動用溶液。
〔１１〕 前記カチオン性ポリマーが、第１〜第３級アミノ基、イミノ基、第４級アンモニウム塩基又はヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、〔１０〕記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
〔１２〕 非界面活性剤型の両イオン性物質、ｐＨ緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、〔１０〕又は〔１１〕に記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
〔１３〕 〔１０〕から〔１２〕のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器と、
試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有し、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップとを含む、試料分析用キット。

以下に、実施例及び比較例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。

（実施例１）
＜電気泳動用溶液の調製＞
電気泳動用溶液１は、純水に下記の各物質を添加して調製した。
［電気泳動用溶液１］
１．０％（Ｗ／Ｖ） ポリエチレンイミン（Ｗａｋｏ製、重量平均分子量７００００）
０．０２％（Ｗ／Ｖ） アジ化ナトリウム
５００ｍＭ ＮＤＳＢ−２０１（Ｎｏｎ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎ、３−（１−Ｐｙｒｉｄｉｎｉｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
３−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ｐＨ調整用）
ｐＨ９．０
＜ヘモグロビンサンプル＞
ヘモグロビンサンプルとして、以下の２種類を準備した。
・ＨｂＳを含まないβサラセミア患者由来の全血
・ＨｂＡ，ＨｂＡ２，ＨｂＳ及びＨｂＦを含むコントロール検体（バイオラッド社製）
＜分離デバイスと測定機器＞
分離デバイスとしては、図１に示す構造のキャピラリ流路１０を有する樹脂製のチップ（流路幅４０μｍ、流路高さ４０μｍ、流路長：３０ｍｍ、分離長２０ｍｍ）を用いた。試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２の容量は１０μＬとした。キャピラリ流路の内壁は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドで被覆した。
測定装置は、自社製の電気泳動装置を用いた。
＜キャピラリ電気泳動＞
キャピラリ電気泳動は、以下の手順で連続試料導入法にて行った。
１．チップの泳動液保持槽１２に電気泳動用溶液１を９μＬ添加して、キャピラリ流路１０内に電気泳動用溶液１を充填した。
２．電気泳動用溶液１で４１倍に希釈したサンプル９μＬを、チップの試料保持槽１１に添加した。
３．試料保持槽１１に負電極、泳動液保持槽１２に正電極を接触させ、１０００Ｖの電圧を印加して電気泳動を開始した。
４．検出部１３にて４１５ｎｍの吸光度を測定し、エレクトロフェログラムを得た。電気泳動は６０秒間行った。

この結果を図２Ａ及びＢに示す。図２Ａがβサラセミア患者由来の全血を用いた結果であり、図２Ｂがコントロール検体を用いた結果である。
図２Ａ及びＢに示すように、いずれのサンプルでも、ポリエチレンイミンを含むアルカリ性の電気泳動用溶液を用いることによって、２０ｍｍの有効キャピラリ長で、６０秒以内に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＡ及びＨｂＦの分離が可能であった。

（実施例２）
泳動液保持槽１２に添加する電気泳動用溶液１に替えて下記の電気泳動用溶液２を使用し、サンプルの希釈に用いた電気泳動用溶液１に替えて下記の電気泳動用溶液３を使用し、測定時間を７５秒とした以外は、実施例１と同様に測定を行った。
［電気泳動用溶液２］
１．０％（Ｗ／Ｖ） ポリアリルアミン（ニットーボーメディカル製、重量平均分子量２５０００）
０．０２％（Ｗ／Ｖ） アジ化ナトリウム
５００ｍＭ ＮＤＳＢ−２０１
３−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ｐＨ調整用）
ｐＨ９．８
［電気泳動用溶液３］
１．０％（Ｗ／Ｖ） ポリアリルアミン（ニットーボーメディカル製、重量平均分子量２５０００）
０．０２％（Ｗ／Ｖ） アジ化ナトリウム
３−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ｐＨ調整用）
ｐＨ９．８

この結果を図３Ａ及びＢに示す。図３Ａがβサラセミア患者由来の全血を用いた結果であり、図３Ｂがコントロール検体を用いた結果である。
図３Ａ及びＢに示すように、いずれのサンプルでも、ポリアリルアミンを含むアルカリ性の電気泳動用溶液を用いることによって、２０ｍｍの有効キャピラリ長で、７５秒以内に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＡ、ＨｂＦの分離が可能であった。

（実施例３）
電気泳動用溶液１に替えて下記の電気泳動用溶液４を使用し、印加する電圧を１５００Ｖとし、測定時間を４５秒とした以外は、実施例１と同様に測定を行った。ヘモグロビンサンプルとしては、実施例１のコントロール検体を使用した。
［電気泳動用溶液４］
１００ｍＭ アルギニン
１．０％（Ｗ／Ｖ） ポリＬ−リジン塩酸塩（ペプチド研究所製、重量平均分子量８０００以上）
０．０２％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウム
３−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ｐＨ調整用）
ｐＨ９．８

この結果を図４に示す。図４に示すように、ポリＬ−リジンを含むアルカリ性の電気泳動用溶液を用いることによって、２０ｍｍの有効キャピラリ長で、４５秒以内に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＡ及びＨｂＦの分離が可能であった。

（実施例４）
電気泳動用溶液４に替えて下記の電気泳動用溶液５を使用し、測定時間を８０秒とした以外は、実施例３と同様に測定を行った。
［電気泳動用溶液５］
１００ｍＭ アルギニン
０．２５％（Ｗ／Ｖ） ポリエチレンイミン（Ｗａｋｏ製、重量平均分子量１８００）
０．７５％（Ｗ／Ｖ） ポリアリルアミン（ニットーボーメディカル製、重量平均分子量１５００００）
３−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ｐＨ調整用）
ｐＨ９．８

この結果を図５に示す。図５に示すように、ポリエチレンイミン及びポリアリルアミンを含むアルカリ性の電気泳動用溶液を用いることによって、２０ｍｍの有効キャピラリ長で、７０秒以内に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＡ及びＨｂＦの分離が可能であった。

（比較例１）
電気泳動用溶液１に替えて下記の電気泳動用溶液６を使用し、印加する電圧を１５００Ｖとし、測定時間を７０秒とした以外は、実施例１と同様に測定を行った。ヘモグロビンサンプルとしては、実施例１のコントロール検体を使用した。
［電気泳動用溶液６］
２０ｍＭ ＭＥＳ
１．０％（Ｗ／Ｖ） ポリエチレンイミン（Ｗａｋｏ製、重量平均分子量７００００）
０．０２％（Ｗ／Ｖ） アジ化ナトリウム
３−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ｐＨ調整用）
ｐＨ６．０

この結果を図６に示す。図６に示すように、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンを含むものの、アルカリ性ではない電気泳動用溶液（ｐＨ６．０）では、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＡ及びＨｂＦのすべてについて分離が確認できなかった。

（比較例２）
電気泳動用溶液１に替えて下記の電気泳動用溶液７を使用し、試料保持槽１１に正電極、泳動液保持槽１２に負電極を接触させた以外は、比較例１と同様に測定を行った。
［電気泳動用溶液７］
１００ｍＭ アルギニン
１．０％（Ｗ／Ｖ） コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（Ｗａｋｏ製）
０．０２％（Ｗ／Ｖ） アジ化ナトリウム
３−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ｐＨ調整用）
ｐＨ９．８

この結果を図７に示す。図７に示すように、カチオン性ポリマーに替えてアニオン性ポリマーを含む電気泳動用溶液では、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＡ及びＨｂＦのすべてについて分離が確認できなかった。

Claims (13)

1. 試料の分析方法であって、
   キャピラリ電気泳動により前記試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
   前記ヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことを含む、試料分析方法。
2. 泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、
   前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中のヘモグロビンの分離を行うことを含む、試料の分析方法であって、
   前記泳動液が、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である、試料分析方法。
3. カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液を用いて前記試料を調製することを含む、請求項１又は２に記載の試料分析方法。
4. 前記カチオン性ポリマーが、第１〜第３級アミノ基、イミノ基、第４級アンモニウム塩基、ヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、請求項１から３のいずれかに記載の試料分析方法。
5. 前記アルカリ性溶液のｐＨが、７．５〜１２.０である、請求項１から４のいずれかに記載の試料分析方法。
6. 前記アルカリ性溶液が、非界面活性剤型の両イオン性物質、ｐＨ緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の試料分析方法。
7. 前記キャピラリ流路は、カチオン性物質又はアニオン性物質が固定化されている、請求項２から６のいずれかに記載の試料分析方法。
8. 前記キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう液流を生じさせることを含む、請求項２から７のいずれかに記載の試料分析方法。
9. 前記試料導入側に負電極を接触させて電圧を印加することを含む、請求項２から８のいずれかに記載の試料分析方法。
10. カチオン性ポリマー及び水を含有し、アルカリ性である、ヘモグロビン分離分析用のためのキャピラリ電気泳動用溶液。
11. 前記カチオン性ポリマーが、第１〜第３級アミノ基、イミノ基、第４級アンモニウム塩基、ヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、請求項１０記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
12. 非界面活性剤型の両イオン性物質、ｐＨ緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、請求項１０又は１１に記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
13. 請求項１０から１２のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器と、
    試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有し、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップとを含む、試料分析用キット。

Images