JP6052927B2 - 試料の分析方法及びそれに用いる溶液 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
特許文献1には、陽イオン交換クロマトグラフィー法によるヘモグロビンの分析方法が記載されている。非特許文献1には、陰イオン交換クロマトグラフィー法によるヘモグロビンの分析方法が記載されている。しかしながら、HPLC法は、大型で高価な専用の装置を必要とし、装置の小型化及び低コスト化が困難である。
特許文献2には、アルカリpHでの自由溶液キャピラリ電気泳動法(キャピラリーゾーン電気泳動、CZE)による、ヘモグロビンの分析方法が記載されている。特許文献3には、アルカリpHかつボロネート化合物の共存下でキャピラリ電気泳動を行う、ヘモグロビンの分析方法が記載されている。特許文献4には、擬似固定相としてアニオン性ポリマーを含有する溶液を用いた、陽イオン交換動電クロマトグラフィーによる、ヘモグロビンの分析方法が記載されている。
特許文献2及び3の方法は、分析完了までに長時間を要し(例えば、8分以上)、また必要とされるキャピラリ長が長い(例えば、20cm以上)ことから装置の小型化が困難であるという問題がある。
βサラセミア症患者は同時にHbSなどの異常ヘモグロビン症を合併していることが多く、HbSとHbA2を分離することが求められるが、特許文献4の方法は、HbA2と、比較的メジャーな変異ヘモグロビンであるHbSとの分離が困難であるという問題がある。
本開示において「カチオン性ポリマー」とは、カチオン性基又はカチオン性基にイオン化されうる基を有するポリマーをいう。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、カチオン性基を有するモノマーの単独重合体やその他のモノマーとの共重合体又は縮重合体であってもよい。カチオン性基としては、一又は複数の実施形態において、窒素を含む基が挙げられる。カチオン性基としては、一又は複数の実施形態において、第1級アミノ基、第2級アミノ基、第3級アミノ基、イミノ基、第4級アンモニウム塩基等のカチオン性基を有するポリマー等が挙げられ、分析精度の向上の観点から、第1級アミノ基、第2級アミノ基、第3級アミノ基を有するポリマーが好ましく、より好ましくは第1級アミノ基を有するポリマーである。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、水溶性であることが好ましい。カチオン性ポリマーは、分析精度の向上の観点から、一又は複数の実施形態において、直鎖であることが好ましい。カチオン性ポリマーは、単独で又は2種以上を組み合わせて用いることができる。
イミノ基又はイミノ基にイオン化されうる基を有するカチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態においてポリエチレンイミン等が挙げられる。
第4級アンモニウム塩基又は第4級アンモニウム塩基にイオン化されうる基を有するカチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー等が挙げられる。本開示において「ポリクオタニウム」とは、第4級アンモニウム基を有するモノマーに由来する構成単位を含むカチオン性ポリマーをいう。ポリクオタニウムは、INCI(International Nomenclature for Cosmetic Ingredients) directoryで確認できる。ポリクオタニウムとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム−6(poly(diallyldimethylammonium chloride)、ポリクオタニウム−7(copolymer of acrylamide and diallyldimethylammonium chloride)、ポリクオタニウム−4(Diallyldimethylammonium chloride-hydroxyethyl cellulose copolymer)、ポリクオタニウム−22(copolymer of acrylic acid and diallyldimethylammonium chloride)等のポリジアリルジメチルアンモニウム塩、及びポリクオタニウム−2(poly[bis(2-chloroethyl)ether-alt-1,3-bis[3-(dimethylamino)propyl]urea])等が挙げられる。ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン以外の構成単位を含んでいてもよく、例えばエチレンジアミン等を含んでいてもよい。
また、カチオン性ポリマーとしては、上記アンモニウム塩以外にも、一又は複数の実施形態において、ホスホニウム塩、オキソニウム塩、スルホニウム塩、フルオロニウム塩、クロロニウム塩などのオニウム塩のカチオンポリマーも利用できる。
ヒドラジド基又はヒドラジド基にイオン化されうる基を有するカチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、アミノポリアクリルアミド等が挙げられる。
カチオン性ポリマーとしては、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン及びこれらの組み合わせが好ましく、より好ましくはポリアリルアミンである。
本開示において「カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液」とは、カチオン性ポリマーが媒体に分散又は溶解したアルカリ性の溶液をいう。媒体としては、一又は複数の実施形態において、水等が挙げられる。水としては、一又は複数の実施形態において、蒸留水、イオン交換水、純水及び超純水等が挙げられる。カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液としては、一又は複数の実施形態において、カチオン性ポリマー及び水を含むアルカリ性水溶液である。
本開示において「試料」としては、限定されない一又は複数の実施形態において、試料原料から調製したもの、又は試料原料そのものが挙げられる。試料原料としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンを含むもの又は生体試料が挙げられる。生体試料としては、限定されない一又は複数の実施形態において、血液、赤血球成分を含む血液由来物等が含まれる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、限定されない一又は複数の実施形態において、動物の血液、哺乳類の血液、ヒトの血液が挙げられる。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むものが挙げられ、限定されない一又は複数の実施形態において、血漿が除かれた血球画分、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球等が挙げられる。
本開示は、一態様において、試料の分析方法に関する。本開示の試料分析方法は、一態様において、キャピラリ電気泳動による前記試料中のヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことを含む。また、本開示の試料分析方法は、一態様において、泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中のヘモグロビンの分離を行うことを含み、前記泳動液がカチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である。
する多糖類としては、一又は複数の実施形態において、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、及びリン酸化多糖類が挙げられる。硫酸化多糖類としては、限定されない一又は複数の実施形態において、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、又はその塩等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸、ヒアルロン酸又はその塩等が挙げられる。アニオン性基を有する多糖類が塩である場合、対イオンとしては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アミン化合物、有機塩基等のイオンが挙げられる。カルボン酸化多糖類の塩としては、一又は複数の実施形態において、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリス塩、アルギニン塩、リジン塩、ヒスチジン塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩、ジメチルアミノエタノール塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、クレアチニン塩等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、限定されない一又は複数の実施形態において、アルギン酸又はその塩(例えば、アルギン酸ナトリウム)が挙げられる。
本開示は、一態様において、カチオン性ポリマー及び水を含有し、アルカリ性であるキャピラリ電気泳動用溶液に関する。本開示において「キャピラリ電気泳動用溶液」とは、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動においてキャピラリ流路に充填される液をいう。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、試料を調製するための溶液として使用してもよい。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、本開示の試料分析方法に使用でき、それにより試料の分析精度の向上に寄与でき、好ましくは分析精度の向上と測定時間の短縮に寄与できる。
本開示は、一態様において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器、及びキャピラリ電気泳動チップを含む試料分析用キットに関する。本開示の試料分析用キットにおいて、キャピラリ電気泳動チップは、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有し、試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップである。本開示の試料分析用キットは、一又は複数の実施形態において、本開示の試料分析方法に使用でき、それにより試料の分析精度の向上に寄与でき、好ましくは分析精度の向上と測定時間の短縮に寄与できる。キャピラリ電気泳動用溶液、キャピラリ流路及びキャピラリ泳動チップについての説明及び実施形態については上述したとおりである。
本開示は、一態様において、キャピラリ電気泳動チップを用いて試料を分析するシステムであって、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器及びキャピラリ電気泳動チップを保持する保持部と、前記キャピラリ電気泳動チップに電圧を印加する電源部と、分析の実施項目に応じて前記キャピラリ電気泳動チップに印加する電圧の極性の切り換えを制御する制御部とを備える試料の分析システムに関する。
図1に示すキャピラリ電気泳動チップを用い、試料原料が全血である場合を例にとり説明する。
図1A及びBに示すキャピラリ電気泳動チップは、キャピラリ流路10、試料保持槽11及び泳動液保持槽12を備え、試料保持槽11及び泳動液保持槽12は、キャピラリ流路10で連通している。キャピラリ流路10には検出部13が形成されている。キャピラリ流路10の長さ及び内径、並びにキャピラリ電気泳動チップの大きさは上述したとおりである。
試料保持槽11に配置する試料は、試料原料である全血を本開示のキャピラリ電気泳動用溶液により希釈することにより調製できる。
〔1〕 試料の分析方法であって、
キャピラリ電気泳動により前記試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
前記ヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことを含む、試料分析方法。
〔2〕 泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、
前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中のヘモグロビンの分離を行うことを含む、試料の分析方法であって、
前記泳動液が、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である、試料分析方法。
〔3〕 カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液を用いて前記試料を調製することを含む、〔1〕又は〔2〕に記載の試料分析方法。
〔4〕 前記カチオン性ポリマーが、第1〜第3級アミノ基、イミノ基、第4級アンモニウム塩基又はヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔5〕 前記アルカリ性溶液のpHが、7.5〜12.0である、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔6〕 前記アルカリ性溶液が、非界面活性剤型の両イオン性物質、pH緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔7〕 前記キャピラリ流路は、カチオン性物質又はアニオン性物質が固定化されている、〔2〕から〔6〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔8〕 前記キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう液流を生じさせることを含む、〔2〕から〔7〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔9〕 前記試料導入側に負電極を接触させて電圧を印加することを含む、〔2〕から〔8〕のいずれかに記載の試料分析方法。
〔10〕 カチオン性ポリマー及び水を含有し、アルカリ性である、ヘモグロビン分離分析用のためのキャピラリ電気泳動用溶液。
〔11〕 前記カチオン性ポリマーが、第1〜第3級アミノ基、イミノ基、第4級アンモニウム塩基又はヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、〔10〕記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
〔12〕 非界面活性剤型の両イオン性物質、pH緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、〔10〕又は〔11〕に記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
〔13〕 〔10〕から〔12〕のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器と、
試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有し、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップとを含む、試料分析用キット。
<電気泳動用溶液の調製>
電気泳動用溶液1は、純水に下記の各物質を添加して調製した。
[電気泳動用溶液1]
1.0%(W/V) ポリエチレンイミン(Wako製、重量平均分子量70000)
0.02%(W/V) アジ化ナトリウム
500mM NDSB−201(Non−detergent Sulfobetain、3−(1−Pyridinio)−1−propanesulfonate)
3−ヒドロキシプロパンスルホン酸(pH調整用)
pH9.0
<ヘモグロビンサンプル>
ヘモグロビンサンプルとして、以下の2種類を準備した。
・HbSを含まないβサラセミア患者由来の全血
・HbA,HbA2,HbS及びHbFを含むコントロール検体(バイオラッド社製)
<分離デバイスと測定機器>
分離デバイスとしては、図1に示す構造のキャピラリ流路10を有する樹脂製のチップ(流路幅40μm、流路高さ40μm、流路長:30mm、分離長20mm)を用いた。試料保持槽11及び泳動液保持槽12の容量は10μLとした。キャピラリ流路の内壁は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドで被覆した。
測定装置は、自社製の電気泳動装置を用いた。
<キャピラリ電気泳動>
キャピラリ電気泳動は、以下の手順で連続試料導入法にて行った。
1.チップの泳動液保持槽12に電気泳動用溶液1を9μL添加して、キャピラリ流路10内に電気泳動用溶液1を充填した。
2.電気泳動用溶液1で41倍に希釈したサンプル9μLを、チップの試料保持槽11に添加した。
3.試料保持槽11に負電極、泳動液保持槽12に正電極を接触させ、1000Vの電圧を印加して電気泳動を開始した。
4.検出部13にて415nmの吸光度を測定し、エレクトロフェログラムを得た。電気泳動は60秒間行った。
図2A及びBに示すように、いずれのサンプルでも、ポリエチレンイミンを含むアルカリ性の電気泳動用溶液を用いることによって、20mmの有効キャピラリ長で、60秒以内に、HbA2、HbS、HbA及びHbFの分離が可能であった。
泳動液保持槽12に添加する電気泳動用溶液1に替えて下記の電気泳動用溶液2を使用し、サンプルの希釈に用いた電気泳動用溶液1に替えて下記の電気泳動用溶液3を使用し、測定時間を75秒とした以外は、実施例1と同様に測定を行った。
[電気泳動用溶液2]
1.0%(W/V) ポリアリルアミン(ニットーボーメディカル製、重量平均分子量25000)
0.02%(W/V) アジ化ナトリウム
500mM NDSB−201
3−ヒドロキシプロパンスルホン酸(pH調整用)
pH9.8
[電気泳動用溶液3]
1.0%(W/V) ポリアリルアミン(ニットーボーメディカル製、重量平均分子量25000)
0.02%(W/V) アジ化ナトリウム
3−ヒドロキシプロパンスルホン酸(pH調整用)
pH9.8
図3A及びBに示すように、いずれのサンプルでも、ポリアリルアミンを含むアルカリ性の電気泳動用溶液を用いることによって、20mmの有効キャピラリ長で、75秒以内に、HbA2、HbS、HbA、HbFの分離が可能であった。
電気泳動用溶液1に替えて下記の電気泳動用溶液4を使用し、印加する電圧を1500Vとし、測定時間を45秒とした以外は、実施例1と同様に測定を行った。ヘモグロビンサンプルとしては、実施例1のコントロール検体を使用した。
[電気泳動用溶液4]
100mM アルギニン
1.0%(W/V) ポリL−リジン塩酸塩(ペプチド研究所製、重量平均分子量8000以上)
0.02%(W/V)アジ化ナトリウム
3−ヒドロキシプロパンスルホン酸(pH調整用)
pH9.8
電気泳動用溶液4に替えて下記の電気泳動用溶液5を使用し、測定時間を80秒とした以外は、実施例3と同様に測定を行った。
[電気泳動用溶液5]
100mM アルギニン
0.25%(W/V) ポリエチレンイミン(Wako製、重量平均分子量1800)
0.75%(W/V) ポリアリルアミン(ニットーボーメディカル製、重量平均分子量150000)
3−ヒドロキシプロパンスルホン酸(pH調整用)
pH9.8
電気泳動用溶液1に替えて下記の電気泳動用溶液6を使用し、印加する電圧を1500Vとし、測定時間を70秒とした以外は、実施例1と同様に測定を行った。ヘモグロビンサンプルとしては、実施例1のコントロール検体を使用した。
[電気泳動用溶液6]
20mM MES
1.0%(W/V) ポリエチレンイミン(Wako製、重量平均分子量70000)
0.02%(W/V) アジ化ナトリウム
3−ヒドロキシプロパンスルホン酸(pH調整用)
pH6.0
電気泳動用溶液1に替えて下記の電気泳動用溶液7を使用し、試料保持槽11に正電極、泳動液保持槽12に負電極を接触させた以外は、比較例1と同様に測定を行った。
[電気泳動用溶液7]
100mM アルギニン
1.0%(W/V) コンドロイチン硫酸Cナトリウム(Wako製)
0.02%(W/V) アジ化ナトリウム
3−ヒドロキシプロパンスルホン酸(pH調整用)
pH9.8
Claims (13)
- 試料の分析方法であって、
キャピラリ電気泳動により前記試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
前記ヘモグロビンの分離を、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液中で行うことを含む、試料分析方法。 - 泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、
前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中のヘモグロビンの分離を行うことを含む、試料の分析方法であって、
前記泳動液が、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液である、試料分析方法。 - カチオン性ポリマーを含むアルカリ性溶液を用いて前記試料を調製することを含む、請求項1又は2に記載の試料分析方法。
- 前記カチオン性ポリマーが、第1〜第3級アミノ基、イミノ基、第4級アンモニウム塩基、ヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、請求項1から3のいずれかに記載の試料分析方法。
- 前記アルカリ性溶液のpHが、7.5〜12.0である、請求項1から4のいずれかに記載の試料分析方法。
- 前記アルカリ性溶液が、非界面活性剤型の両イオン性物質、pH緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、請求項1から5のいずれかに記載の試料分析方法。
- 前記キャピラリ流路は、カチオン性物質又はアニオン性物質が固定化されている、請求項2から6のいずれかに記載の試料分析方法。
- 前記キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう液流を生じさせることを含む、請求項2から7のいずれかに記載の試料分析方法。
- 前記試料導入側に負電極を接触させて電圧を印加することを含む、請求項2から8のいずれかに記載の試料分析方法。
- カチオン性ポリマー及び水を含有し、アルカリ性である、ヘモグロビン分離分析用のためのキャピラリ電気泳動用溶液。
- 前記カチオン性ポリマーが、第1〜第3級アミノ基、イミノ基、第4級アンモニウム塩基、ヒドラジド基及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つを有する、請求項10記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
- 非界面活性剤型の両イオン性物質、pH緩衝物質及びこれらの組合せからなる群から選択される一つをさらに含む、請求項10又は11に記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
- 請求項10から12のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液を含む容器と、
試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有し、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップとを含む、試料分析用キット。
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