JP4660653B2

JP4660653B2 - キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法およびそれに用いる添加剤

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Publication number: JP4660653B2
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Inventors: 雄介中山; 聡米原
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Description

本発明は、キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法、およびそれに用いる添加剤に関する。

キャピラリー電気泳動法では、キャピラリー管内壁に集合したイオンが、印加によって移動することで電気浸透流が生じ、これにより試料が移動して電気泳動が行われる。一方、血液中のヘモグロビン（Ｈｂ）は、血液中のグルコースと反応して糖化Ｈｂとなる。血液中の糖化Ｈｂは、生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における指標とされている。糖化Ｈｂの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）は、特に重要な指標として、臨床検査等で、その測定が実施されている。ＨｂＡ１ｃは、β鎖Ｎ末端のバリンが糖化したものである。また、鎌状赤血球貧血症（ＳｉｃｋｌｅＣｅｌｌａｎｅｍｉａ）において、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）は、原因分子であり、かつ診断に重要である。ＨｂＳでは、β鎖の第６番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）が、バリン（Ｖａｌ）に置換されている。したがって、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＳ等の各種ヘモグロビンを、高精度で分析する技術が求められている。血液中のヘモグロビンの測定方法は、例えば、アガロース電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、ＨＰＬＣ法、免疫法、酵素法等がある。これらの中で、ヘモグロビンの遺伝的変異等の微小な変異が検出できるのは、キャピラリー電気泳動法とＨＰＬＣ法である。一方、ヘモグロビンの分析装置に対しては、小型化が求められている。この点に関し、ＨＰＬＣ法は、装置全体の小型化が困難である。これに対し、キャピラリー電気泳動法では、マイクロチップ化することで、装置全体を小型化することが可能である。

しかしながら、従来のキャピラリー電気泳動法は、各種のヘモグロビンの分析精度が、未だ不十分である。これに対し、ＨｂＡ１ｃを、高精度で分析する技術として、キャピラリー管内壁を、タンパク質で被覆し、さらにこの上を多糖類で被覆するという技術（特許文献１）がある（以下、「従来技術（１）」という）。しかしながら、従来技術（１）では、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ０）とＨｂＳとを分離できず、ピークが重なってしまうという問題がある。ＨｂＡ０およびＨｂＳを分離できないということは、血液中におけるＨｂＡ１ｃの割合が、正確に測定できていないということでもある。すなわち、従来技術（１）では、鎌状赤血球貧血症の患者においては、ＨｂＡ１ｃが、異常低値を示すという問題がある。この問題を解決する方法として、キャピラリー管内壁を被覆せずに、双性イオン性タイプのランニングバッファーに脂肪族ジアミン等の流れ阻害剤を含有させてキャピラリー電気泳動するという方法（特許文献２）がある（以下、「従来技術（２）」という）。しかしながら、従来技術（２）では、測定時間に長時間（例えば、１０分間）を必要とする。したがって、従来技術（２）では、多数の試料を短時間で処理する必要がある臨床検査には、実質的に適用できない。また、従来技術（２）では、キャピラリー管も長いものが必要となる。このため、従来技術（２）では、装置の小型化が図れない。さらに、従来技術（２）では、ＨｂＡ０とＨｂＳとを分離できるが、ＨｂＡ１ｃを測定できない。

特開平９−１０５７３９号公報特開２００６−１４５５３７号公報

そこで、本発明の目的は、装置の小型化が可能であり、分析精度が高く、短時間で分析可能なキャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法、および、それに用いる添加剤を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法であって、
ヘモグロビンを含む試料を準備する試料準備工程と、
緩衝液を含むキャピラリー管を準備するキャピラリー管準備工程と、
前記キャピラリー管の緩衝液中に前記試料を導入し、前記キャピラリー管の両端に電圧を印加して前記試料を電気泳動する電気泳動工程と
を含み、
下記（Ａ）および下記（Ｂ）の少なくとも一方の態様により電気泳動を実施することを特徴とする。
（Ａ）前記緩衝液中に、下記（ａ）界面活性剤を添加して前記電気泳動を実施する。
（ａ）界面活性剤：疎水部としてアルキル基を有し、親水部として糖を有する非イオン性界面活性剤
（Ｂ）前記試料中に、下記（ｂ）界面活性剤を添加して前記電気泳動を実施する。
（ｂ）界面活性剤：ベタイン型両性界面活性剤

本発明の添加剤は、前記本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動用の添加剤であって、下記（ａ）界面活性剤および下記（ｂ）界面活性剤の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
（ａ）界面活性剤：疎水部としてアルキル基を有し、親水部として糖を有する非イオン性界面活性剤
（ｂ）界面活性剤：ベタイン型両性界面活性剤

本発明の分析方法は、例えば、ＨｂＡ０およびＨｂＳを分離して分析することが可能であり、かつ、分析時間を従来よりも短くすることが可能である。また、本発明の分析方法は、例えば、ＨｂＡ１ｃを高精度で分析することができ、鎌状赤血球貧血症の患者の血液試料であっても、ＨｂＡ１ｃの異常低値の問題を防止できる。そして、本発明の分析方法は、キャピラリー管の長さを従来よりも短くすることができ、この点で、従来よりも分析装置の小型化が可能である。

図１は、本発明の一実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図２は、本発明のその他の実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図３は、本発明のさらにその他の実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図４は、本発明のさらにその他の実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図５は、本発明のさらにその他の実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図６は、比較例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図７は、その他の比較例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図８は、本発明のさらにその他の実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図９は、さらにその他の比較例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。図１０は、さらにその他の比較例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。

本発明にかかる前記（Ａ）の態様において、前記キャピラリー管準備工程で前記（ａ）界面活性剤を前記緩衝液に添加することが好ましい。

本発明にかかる前記（ａ）界面活性剤において、アルキル基の炭素数が、１１から１６の範囲であり、糖が、単糖または二糖であることが好ましい。さらに好ましくは、本発明にかかる前記（ａ）界面活性剤において、アルキル基が、炭素数１１または１２の直鎖状アルキル基であり、前記糖が、二糖であることである。

本発明にかかる前記（Ｂ）の態様において、前記試料準備工程で前記（ｂ）界面活性剤を前記試料に添加することが好ましい。

本発明にかかる前記（ｂ）界面活性剤は、スルホベタイン型両性界面活性剤であることが好ましい。

本発明の分析方法において、前記緩衝液中に、陰極性基含有化合物を添加し、前記ヘモグロビンと前記陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動することが好ましい。この場合、前記キャピラリー管準備工程において、前記陰極性基含有化合物を前記緩衝液に添加することが好ましい。前記陰極性基含有化合物は、陰極性基含有多糖類が好ましい。

本発明の分析方法において、ＨｂＡ０とＨｂＳとを分離することが好ましい。

本発明の分析方法において、分析対象のヘモグロビンが、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＭ、ＨｂＨおよびＨｂＦからなる群から選択される少なくとも一つのヘモグロビンであることが好ましい。

つぎに、本発明について、例をあげて、説明する。

前述のように、本発明の分析方法は、前記試料準備工程、前記キャピラリー管準備工程および前記電気泳動工程を有し、下記（Ａ）および下記（Ｂ）の少なくとも一方の態様で、キャピラリー電気泳動を行う。
（Ａ）前記緩衝液中に、下記（ａ）界面活性剤を添加して前記電気泳動を実施する。
（ａ）界面活性剤：疎水部としてアルキル基を有し、親水部として糖を有する非イオン性界面活性剤
（Ｂ）前記試料中に、下記（ｂ）界面活性剤を添加して前記電気泳動を実施する。
（ｂ）界面活性剤：ベタイン型両性界面活性剤

前記試料準備工程では、ヘモグロビンを含む試料を準備する。ヘモグロビンを含む試料としては、例えば、全血を溶血処理した溶血試料があげられる。前記溶血処理としては、例えば、超音波処理、凍結解凍処理、加圧処理、浸透圧処理、界面活性剤処理等がある。前記溶血試料は、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等により、適宜希釈されたものであってもよい。

前記（Ｂ）の態様では、前述のように、前記試料準備工程において、前記（ｂ）界面活性剤を試料に添加することが好ましい。しかし、本発明は、これに限定されない。例えば、前記電気泳動工程において、前記試料を前記キャピラリー管内の前記緩衝液に導入前までに、前記試料中に前記（ｂ）界面活性剤を添加すればよい。

前記（ｂ）界面活性剤は、前述のように、ベタイン型界面活性剤である。前記ベタイン型界面活性剤としては、例えば、カルボキシベタイン型界面活性剤、スルホベタイン型界面活性剤があげられる。このなかで、スルホベタイン型界面活性剤が、好ましい。

前記カルボキシベタイン型界面活性剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシアルキレンアンモニウムベタインがあげられる。

前記スルホベタイン型界面活性剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−スルホアルキレンアンモニウムベタインがあげられる。前記３つのアルキル基は、相互に同一または異なる。前記アルキル基の炭素数は、例えば、１４〜１８の範囲である。前記アルキル基は、直鎖状アルキル基または分岐状アルキル基である。前記スルホアルキレン基の炭素数は、例えば、１〜３の範囲である。前記スルホベタイン型界面活性剤の具体例としては、例えば、Ｐａｌｍｉｔｙｌｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅがあげられる。

前記試料中への前記（ｂ）界面活性剤の添加割合は、前記試料および前記（ｂ）界面活性剤の合計に対し、例えば、０．００１〜０．１重量％の範囲であり、好ましくは、０．００５〜０．０５重量％の範囲であり、より好ましくは、０．０１〜０．０３重量％の範囲である。

前記キャピラリー管準備工程は、前記緩衝液が注入されたキャピラリー管を準備する工程である。

前記緩衝液は、特に制限されないが、酸を用いた緩衝液が好ましい。前記酸は、例えば、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸がある。また、前記緩衝液は、弱塩基を含むことが好ましい。前記弱塩基としては、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等がある。前記緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ４．５〜６の範囲である。前記緩衝液の種類は、例えば、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等がある。

前記緩衝液には、前述のように、前記陰極性基含有化合物を添加することが好ましい。前記陰極性基含有化合物を添加することにより、前記電気泳動工程において、前記陰極性基含有化合物とヘモグロビンとの複合体が前記緩衝液中を泳動する。これによって、分析精度が、さらに向上し、また分析時間もさらに短縮可能であり、前記キャピラリー管の長さもさらに短くすることが可能となる。

前記陰極性基含有化合物としては、陰極性基含有多糖類が好ましい。前記陰極性基含有多糖類としては、例えば、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、リン酸化多糖類があり、この中で、硫酸化多糖類およびカルボン酸化多糖類が好ましい。前記硫酸化多糖類としては、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等が好ましく、より好ましくは、コンドロイチン硫酸である。前記カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が好ましい。コンドロイチン硫酸は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋの七種類があり、いずれを用いてもよい。前記緩衝液において、前記陰極性基含有化合物の濃度は、例えば、０．０１〜５重量％の範囲である。

前記（Ａ）の態様では、前述のように、前記キャピラリー管準備工程において、前記（ａ）界面活性剤を前記緩衝液に添加することが好ましい。しかし、本発明は、これに限定されない。例えば、前記電気泳動工程において、前記試料を前記キャピラリー管内の前記緩衝液に導入前までに、前記緩衝液中に前記（ａ）界面活性剤を添加すればよい。

前記（ａ）界面活性剤は、前述のように、疎水部としてアルキル基を有し、親水部として糖を有する非イオン性界面活性剤である。前記アルキル基は、例えば、直鎖状アルキル基であってもよいし、分岐状アルキル基であってもよいが、直鎖状アルキル基が好ましい。前記アルキル基の炭素数は、例えば、１〜１８個の範囲、好ましくは、１１〜１６個の範囲、より好ましくは、１１または１２個である。前記アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等があげられる。前記糖は、単糖でもよいし、二糖以上であってもよい。前記糖の数は、例えば、１〜２０個の範囲であり、好ましくは、１〜３個の範囲であり、より好ましくは、二糖である。前記（ａ）界面活性剤の具体例としては、例えば、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ，Ｓｕｃｒｏｕｓｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ，Ｏｘａｔｒｉｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｅ，Ｕｎｄｅｃｙｌｍａｌｔｏｓｉｄｅ，Ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ，Ｓｕｃｒｏｓｅｍｏｎｏｃａｐｒａｔｅ，Ｓｕｃｒｏｓｅｍｏｎｏｃｈｏｒａｔｅ等がある。この中で、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ，Ｓｕｃｒｏｕｓｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ，Ｏｘａｔｒｉｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｅが好ましい。前記（ａ）界面活性剤の前記緩衝液中での濃度は、例えば、０．００１〜１重量％の範囲、好ましくは、０．００５〜０．０５重量％の範囲、より好ましくは、０．０１〜０．０３重量％の範囲である。

前記キャピラリー管の材質は、特に制限されず、例えば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等があげられる。ガラス、溶融シリカ製のキャピラリー管の内壁は、通常、陰性の電荷を有する状態である。プラスチック製のキャピラリー管内壁は、プラスチック中の極性基の有無や種類により、陽性もしくは陰性の電荷を有する状態であり、または無電荷（無極性）の状態である。また、極性基を持たないプラスチックであっても、極性基を導入することにより、電荷を有する状態にすることができる。前記プラスチック製のキャピラリー管としては、市販品を使用してもよく、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等から形成されたキャピラリー管があげられる。前記キャピラリー管の内径は、例えば、１０〜２００μｍの範囲、好ましくは、２５〜１００μｍの範囲である。前記キャピラリー管の長さは、例えば、１０〜１０００ｍｍの範囲である。

本発明において、前記キャピラリー管内壁を、陽極性基含有化合物により被覆してもよい。前記陽極性基含有化合物としては、例えば、前記陽極性基および反応基を含む化合物を用いればよい。前記キャピラリー管が、ガラス若しくは溶融シリカ製である場合は、陽極性基およびケイ素を有する化合物（シリル化剤）を使用することができる。前記陽極性基としては、アミノ基、アンモニウム基が好ましい。前記陽極性基含有化合物として好ましいのは、アミノ基およびアンモニウム基の少なくとも一方の陽極性基を有するシリル化剤である。アミノ基は、一級、二級、三級のいずれであってもよい。

前記シリル化剤としては、例えば、Ｎ−（２−ジアミノエチル）−３−プロピルトリメトキシシラン、アミノフェノキシジメチルビニルシラン、３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン、３−アミノプロピルメチルビス（トリメチルシロキシ）シラン、３−アミノプロピルペンタメチルジシロキサン、３−アミノプロピルシラントリオール、ビス（Ｐ−アミノフェノキシ）ジメチルシラン、１，３−ビス（３−アミノプロピル）テトラメチルジシロキサン、ビス（ジメチルアミノ）ジメチルシラン、ビス（ジメチルアミノ）ビニルメチルシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−シアノプロピル（ジイソプロピル）ジメチルアミノシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルトリエトキシシラン、テトラキス（ジエチルアミノ）シラン、トリス（ジメチルアミノ）クロロシラン、トリス（ジメチルアミノ）シラン等があげられる。

前記シリル化剤において、ケイ素原子をチタン若しくはジルコニウムに置換したものを用いてもよい。前記シリル化剤は、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。

前記シリル化剤を用いたキャピラリー管内壁の被覆は、例えば、つぎのようにして実施する。まず、シリル化剤を有機溶媒に溶解若しくは分散させて処理液を調製する。前記処理液の調製に使用する前記有機溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、トルエン等が使用できる。前記処理液のシリル化剤の濃度は特に制限されない。この処理液を、ガラス製若しくは溶融シリカ製のキャピラリー管に通液し、加熱する。この加熱によって、前記シリル化剤が前記キャピラリー管内壁に共有結合で結合し、その結果、陽極性基が前記キャピラリー管内壁に配置されることになる。その後、有機溶媒（ジクロロメタン、メタノール、アセトン等）、酸性溶液（リン酸等）、アルカリ性溶液および界面活性剤溶液の少なくとも一つで洗浄（後処理）する。なお、この洗浄は任意であるが、実施することが好ましい。前記シリル化剤で内壁が被覆されたキャピラリー管は、市販品を用いてもよい。

つぎに、前記キャピラリー管の前記緩衝液中に前記試料を導入し、前記キャピラリー管の両端に電圧を印加し、前記試料を電気泳動する前記電気泳動工程を実施する。前記電気泳動工程は、例えば、つぎのようにして実施できる。

まず、コンドロイチン硫酸等の陰極性基含有化合物を含む緩衝液を前記キャピラリー管に、ポンプ等により圧力をかけて通液する。この通液の時間は、例えば、１〜６０分間であり、通液の圧力は、例えば、０．０５〜０．１ＭＰａである。前記キャピラリー管内に、前記緩衝液が存在する状態で、ヘモグロビン試料を前記緩衝液中に導入し、前記キャピラリー管の両端に電圧を印加して、電気泳動を行う。前記試料の導入は、前記キャピラリー管の陽極側から行う。導入された試料中のヘモグロビンは、前記緩衝液中の陰極性基含有化合物と結合して複合体となる。印加により、前記キャピラリー管内の緩衝液において電気浸透流が生じ、前記複合体がキャピラリー管の陰極側に向かって移動する。前記印加の程度は、例えば、１〜３０ｋＶである。この移動を、光学的手法により検出する。光学的手法による検出は、特に制限されないが、４１５ｎｍの波長で行うことが好ましい。

前記電気泳動において、前述のように、前記（Ａ）の態様および前記（Ｂ）の態様の少なくとも一方の態様で、電気泳動を実施することにより、前記（ａ）界面活性剤および前記（ｂ）界面活性剤の少なくとも一方の作用により、ＨｂＡ０およびＨｂＳを分離することが可能となる。

本発明において、分析対象となるヘモグロビンは、特に制限されず、例えば、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ０）、糖化ヘモグロビン（例えば、ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＧＨｂＬｙｓ等）、遺伝的変異型ヘモグロビン（例えば、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＭ、ＨｂＨ）、ＨｂＦ等がある。

つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。

（実施例１−１）
溶融シリカ製のキャピラリー管（全長３２ｃｍ、有効長８．５ｃｍ、内径５０μｍ）を準備した。一方、１００ｍＭフマル酸とアルギニン酸水溶液に、０．８重量％の割合でコンドロイチン硫酸Ｃを添加した緩衝液（ｐＨ４．８）を準備した。この緩衝液に、０．０２重量％の割合で、前記（ａ）界面活性剤（Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ、アルキル基の炭素数：１２）を添加した。前記（ａ）界面活性剤を添加した前記緩衝液を、前記キャピラリー管に、圧力０．１ＭＰａ（１０００ｍｂａｒ）で通液した。前記キャピラリー管内に前記緩衝液が充填された状態で、ヘモグロビンが精製水に溶解した試料を、前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を１０ｋＶで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、４１５ｎｍの吸光度で検出した。なお、前記試料は、ＨｂＳを含む試料と、ＨｂＳを含まない試料の２種類を準備し、それぞれについて、電気泳動を行った。この結果を、図１のチャートに示す。同図において、ＨｂＳを含まない試料の電気泳動のチャートは、点線で示し、ＨｂＳを含む試料の電気泳動のチャートは、太い実線で示す。図示のように、本実施例において、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができた。また、前記検出は、６分以内の短時間で実施できた。

（実施例１−２）
前記（ａ）界面活性剤として、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅに代えて、Ｓｕｃｒｏｓｅｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ（アルキル基の炭素数：１１）を使用した。また、前記試料は、ＨｂＳを含む試料のみを準備し、これを電気泳動した。これら以外は、前記実施例１−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図２のチャートに示す。図示のように、本実施例において、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができた。また、前記検出は、６分以内の短時間で実施できた。

（実施例１−３）
前記（ａ）界面活性剤として、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅに代えて、Ｏｘａｔｒｉｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｅ（アルキル基の炭素数：１２）を使用した。また、前記試料は、ＨｂＳを含む試料のみを準備し、これを電気泳動した。これら以外は、前記実施例１−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図３のチャートに示す。図示のように、本実施例において、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができた。また、前記検出は、６分以内の短時間で実施できた。

（実施例１−４）
前記（ａ）界面活性剤として、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅに代えて、Ｕｎｄｅｃｙｌ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（アルキル基の炭素数：１１）を使用した。また、前記試料は、ＨｂＳを含む試料のみを準備し、これを電気泳動した。これら以外は、前記実施例１−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図４のチャートに示す。図示のように、本実施例において、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができた。また、前記検出は、６分以内の短時間で実施できた。

（実施例１−５）
前記緩衝液に、０．０２重量％の割合で、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅを添加したのに代えて、０．００５重量％の割合で、Ｈｅｘａｄｅｃｙｌ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（アルキル基の炭素数：１６）を添加した。また、前記試料は、ＨｂＳを含む試料のみを準備し、これを電気泳動した。これら以外は、前記実施例１−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図５のチャートに示す。図示のように、本実施例において、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができた。また、前記検出は、７分以内の短時間で実施できた。

（比較例１−１）
前記（ａ）界面活性剤を使用しない以外は、前記実施例１−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図６のチャートに示す。同図において、ＨｂＳを含まない試料の電気泳動のチャートは、点線で示し、ＨｂＳを含む試料の電気泳動のチャートは、太い実線で示す。図示のように、本比較例において、メト化ＨｂとＨｂＳのピークが重なり、かつＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができなかった。

（比較例１−２）
前記（ａ）界面活性剤として、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅに代えて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名：ナカライテスク社製）を使用した。また、前記試料は、ＨｂＳを含む試料のみを準備し、これを電気泳動した。これら以外は、前記実施例１−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図７のチャートに示す。図示のように、本比較例において、Ｈｂの検出時間が遅れ、ピーク幅が広がり、かつ、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができなかった。

（実施例２−１、比較例２−１）
前記実施例１と同じ溶融シリカ製のキャピラリー管（全長３２ｃｍ、有効長８．５ｃｍ、内径５０μｍ）を準備した。一方、１００ｍＭフマル酸とアルギニン酸水溶液に、０．８重量％の割合でコンドロイチン硫酸Ｃを添加した緩衝液（ｐＨ４．８）を準備した。前記緩衝液を、前記キャピラリー管に、圧力０．１ＭＰａ（１０００ｍｂａｒ）で通液した。一方、ヘモグロビン（ＨｂＳを含む）を精製水に溶解した試料を準備した。前記試料に、前記（ｂ）界面活性剤（Ｐａｌｍｉｔｙｌｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ；商品名ＳＢ１６、Ｓｉｇｍａ社製）を１．０重量％の割合で添加した。前記キャピラリー管内に前記緩衝液が充填された状態で、前記試料を前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を１０ｋＶで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、４１５ｎｍの吸光度で検出した。なお、比較例２−１として、前記（ｂ）界面活性剤を添加しない試料についても、同様に電気泳動を行った。これらの結果を、図８のチャートに示す。同図において、前記（ｂ）界面活性剤を含む試料の電気泳動のチャート（実施例２−１）は、点線で示し、前記（ｂ）界面活性剤を含まない試料の電気泳動のチャート（比較例２−２）は、太い実線で示す。図示のように、本実施例において、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することができた。また、前記検出は、６分以内の短時間で実施できた。これに対し、本比較例では、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することはできなかった。

（比較例２−２）
前記（ｂ）界面活性剤として、Ｐａｌｍｉｔｙｌｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅに代えて、Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅを使用した。これ以外は、前記実施例２−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図９のチャートに示す。図示のように、本比較例において、メト化Ｈｂの検出時間を遅らせることはできたが、ＨｂＡ０とＨｂＳを分離して検出することはできなかった。

（比較例２−３）
前記（ｂ）界面活性剤として、Ｐａｌｍｉｔｙｌｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅに代えて、前記ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用した。これ以外は、前記実施例２−１と同様にして、キャピラリー電気泳動を実施した。この結果を、図１０のチャートに示す。図示のように、本比較例において、Ｈｂを検出することができなかった。

以上のように、本発明のキャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法は、装置の小型化が可能であり、分析精度が高く、短時間で分析可能な方法である。本発明は、臨床検査、生化学検査、医学研究等のヘモグロビンを分析する全ての分野に適用することができ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。

Claims

キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法であって、
ヘモグロビンを含む試料を準備する試料準備工程と、
緩衝液を含むキャピラリー管を準備するキャピラリー管準備工程と、
前記キャピラリー管の緩衝液中に前記試料を導入し、前記キャピラリー管の両端に電圧を印加して前記試料を電気泳動する電気泳動工程と
を含み、
下記（Ａ）および下記（Ｂ）の少なくとも一方の態様により電気泳動を実施することを特徴とする分析方法。
（Ａ）前記緩衝液中に、下記（ａ）界面活性剤を添加して前記電気泳動を実施する。
（ａ）界面活性剤：疎水部としてアルキル基を有し、親水部として糖を有する非イオン性界面活性剤
（Ｂ）前記試料中に、下記（ｂ）界面活性剤を添加して前記電気泳動を実施する。
（ｂ）界面活性剤：ベタイン型両性界面活性剤
前記（Ａ）の態様において、前記キャピラリー管準備工程で前記（ａ）界面活性剤を前記緩衝液に添加する請求の範囲１記載の分析方法。
前記（ａ）界面活性剤において、アルキル基の炭素数が、１１から１６の範囲であり、糖が、単糖または二糖である請求の範囲１記載の分析方法。
前記（ａ）界面活性剤において、アルキル基が、炭素数１１または１２の直鎖状アルキル基であり、前記糖が、二糖である請求の範囲１記載の分析方法。
前記（Ｂ）の態様において、前記試料準備工程で前記（ｂ）界面活性剤を前記試料に添加する請求の範囲１記載の分析方法。
前記（ｂ）界面活性剤が、スルホベタイン型両性界面活性剤である請求の範囲１記載の分析方法。
前記緩衝液中に、陰極性基含有化合物を添加し、前記ヘモグロビンと前記陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動する請求の範囲１記載の分析方法。
前記キャピラリー管準備工程において、前記陰極性基含有化合物を前記緩衝液に添加する請求の範囲７記載の分析方法。
前記陰極性基含有化合物が、陰極性基含有多糖類である請求の範囲７記載の分析方法。
ＨｂＡ０とＨｂＳとを分離する請求の範囲１記載の分析方法。
分析対象のヘモグロビンが、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＭ、ＨｂＨおよびＨｂＦからなる群から選択される少なくとも一つのヘモグロビンである請求の範囲１記載の分析方法。
請求の範囲１記載の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動用の添加剤であって、下記（ａ）界面活性剤および下記（ｂ）界面活性剤の少なくとも一方を含むことを特徴とする添加剤。
（ａ）界面活性剤：疎水部としてアルキル基を有し、親水部として糖を有する非イオン性界面活性剤
（ｂ）界面活性剤：ベタイン型両性界面活性剤