JP2009186445A - キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法およびそれに用いる試薬 - Google Patents

キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法およびそれに用いる試薬 Download PDF

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Abstract

【課題】装置を小型化でき、分析精度が高く、短時間で分析可能なキャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法およびそれに用いる試薬を提供する。
【解決手段】本発明の分析方法は、キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法であって、試料準備工程と、電気泳動工程とを含み、前記電気泳動工程において、陰イオン性のカオトロピックイオンの存在下、緩衝液中で試料を電気泳動することを特徴とする。本発明の分析方法によれば、図１に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃを高精度に分離測定できる。また、本発明の試薬は、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動用の試薬であって、陰イオン性のカオトロピックイオンを含むことを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法およびそれに用いる試薬に関する。
血液中のヘモグロビン（Ｈｂ）は、血液中のグルコースと反応して糖化Ｈｂとなる。糖化Ｈｂの中でも、特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）は、糖尿病の診断や治療等において、重要な指標とされている。ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ０）のβ鎖Ｎ末端のバリンが糖化したものであり、この糖化反応の段階によって、安定型ＨｂＡ１ｃと不安定型ＨｂＡ１ｃが存在する。不安定型ＨｂＡ１ｃは、ＨｂＡ０のβ鎖N末端のバリンに、グルコースがシッフ塩基結合して、アルジミンとなったものである。この不安定型ＨｂＡ１ｃが、さらにアマドリ転移を受けてケトアミン化合物となったものが、安定型ＨｂＡ１ｃである。安定型ＨｂＡ１ｃは、過去数ヶ月間の血糖値を反映し、日本糖尿病学会の標準測定法の測定項目となっている。したがって、安定型ＨｂＡ１ｃを、高精度で分析する技術が求められている。
血液中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、例えば、免疫法、酵素法、アフィニティ法、ＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法等がある。免疫法および酵素法は、自動分析装置に適用可能であるため、検体を大量に処理できるという長所を有するが、糖尿病患者の血糖コントロール指標（合併症の発症予防マーカー）として用いるには、測定精度に欠ける。そして、アフィニティ法は、分離原理上、β鎖N末端の糖化バリンに対する特異性が低く、Ｈｂ分子中の糖化リジンが測定値に含まれてしまうため、ＨｂＡ１ｃの測定精度が低い。また、ＨＰＬＣ法は、糖尿病患者の治療における糖化ヘモグロビンの測定方法として汎用されているが（例えば、特許文献１等）、大型で高価な専用の装置を必要とし、装置の小型化および低コスト化が困難である。集団検診利用等の理由から、ヘモグロビンの分析装置に対しては、小型化が求められているが、前述のように、ＨＰＬＣ法は、この要請に応えることは困難である。一方、キャピラリー電気泳動法では、キャピラリー管内壁に集合したイオンが、印加によって移動することで電気浸透流が生じ、これにより試料が移動して電気泳動が行われる。キャピラリー電気泳動法では、キャピラリー管の短縮化や、キャピラリー電気泳動装置の一部をマイクロチップ化することで、装置全体を小型化することが可能である。そこで、安定型ＨｂＡ１ｃを、高い精度で分析可能なキャピラリー電気泳動法の開発が望まれている。
特許第３４２９７０９号公報
そこで、本発明の目的は、装置の小型化が可能であり、分析精度が高く、短時間で分析可能なキャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法、および、それに用いる試薬を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法であって、
ヘモグロビンを含む試料を準備する試料準備工程と、
緩衝液を含むキャピラリー流路を準備するキャピラリー流路準備工程と、
前記キャピラリー流路の緩衝液中に前記試料を導入し、前記キャピラリー流路の両端に電圧を印加して前記試料を電気泳動する電気泳動工程とを含み、
前記電気泳動工程において、陰イオン性のカオトロピックイオンの存在下、前記緩衝液中で前記試料を電気泳動することを特徴とする。
本発明の試薬は、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動用の試薬であって、陰イオン性のカオトロピックイオンを含むことを特徴とする。
本発明の分析方法は、例えば、安定型ＨｂＡ１ｃと、不安定型ＨｂＡ１ｃまたは修飾Ｈｂを分離して測定できるため、安定型ＨｂＡ１ｃを高精度で分析でき、かつ、従来より短時間の分析が可能である。本発明の分析方法は、前記安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃおよび修飾Ｈｂ以外のヘモグロビンが分析可能であってもよい。そして、本発明の分析方法は、キャピラリー流路の長さを従来より短くすることが可能であり、マイクロチップ電気泳動法に適用できるため、分析装置の小型化が可能である。
本発明の分析方法において、前記陰イオン性のカオトロピックイオンは、特に限定されず、例えば、過塩素酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、トリクロロ酢酸イオンおよびトリフルオロ酢酸イオンからなる群から選択される少なくとも一つのイオンであってもよい。
本発明の分析方法において、前記緩衝液中に、陰極性基含有化合物を添加し、前記ヘモグロビンと前記陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動することが好ましい。また、前記陰極性基含有化合物は、陰極性基含有多糖類であることが好ましい。そして、前記陰極性基含有多糖類は、例えば、コンドロイチン硫酸であってもよい。
本発明の分析方法において、分析対象のヘモグロビンが、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＭ、ＨｂＨ、ＨｂＦおよび修飾Ｈｂからなる群から選択される少なくとも一つのヘモグロビンであることが好ましい。また、前記ＨｂＡ１ｃが、安定型ＨｂＡ１ｃおよび不安定型ＨｂＡ１ｃの少なくとも一方のヘモグロビンであることが好ましい。そして、前記修飾Ｈｂが、カルバミル化Ｈｂおよびアセチル化Ｈｂの少なくとも一方のヘモグロビンであることが好ましい。
つぎに、本発明について、例を挙げて説明する。
前述のように、本発明のキャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法は、試料準備工程と、キャピラリー流路準備工程および電気泳動工程とを有し、電気泳動工程において、陰イオン性のカオトロピックイオンの存在下、緩衝液中で試料を電気泳動することを特徴とする。
カオトロピックイオンとは、水分子間の相互作用を破壊して、疎水性物質との接触による水のエントロピーの減少を抑制することにより、疎水性分子の水溶性を高めるイオンである。本発明の分析方法において、前記カオトロピックイオンとしては、陰イオン性のカオトロピックイオンが用いられる。前記陰イオン性のカオトロピックイオンは、特に限定されず、例えば、過塩素酸イオン（ＣｌＯ４ −）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、トリクロロ酢酸イオン（ＣＣｌ３ＣＯＯ−）、トリフルオロ酢酸イオン（ＣＦ３ＣＯＯ−）、硝酸イオン（ＮＯ３−）、ジクロロ酢酸イオン（ＣＣｌ２ＣＯＯ−）等が挙げられる。
また、本発明の分析方法において、前記陰イオン性のカオトロピックイオンとは、陰イオン性のカオトロピックイオンを含む塩、電離して陰イオン性のカオトロピックイオンを生じる物質等も含まれる。前記塩としては、例えば、酸性塩、中性塩、塩基性塩が挙げられる。前記陰イオン性のカオトロピックイオンを含む塩および前記電離して陰イオン性のカオトロピックイオンを生じる物質は、特に限定されないが、例えば、過塩素酸、チオシアン酸、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。したがって、本発明において、前記陰イオン性のカオトロピックイオンの存在下とは、前記陰イオン性のカオトロピックイオンを含む塩の存在下、または前記電離して陰イオン性のカオトロピックイオンを生じる物質の存在下のこともいう。また、本発明において、前記陰イオン性のカオトロピックイオンを添加するとは、前記陰イオン性のカオトロピックイオンを含む塩を添加すること、または前記電離して陰イオン性のカオトロピックイオンを生じる物質を添加することもいう。
前記緩衝液中に存在する前記陰イオン性のカオトロピックイオンの濃度は、例えば、１〜３０００ｍＭの範囲であり、５〜１００ｍＭの範囲が好ましく、１０〜５０ｍＭの範囲がより好ましい。前記陰イオン性のカオトロピックイオンは、電気泳動時に、前記緩衝液中に存在すればよく、例えば、前記試料準備工程において、ヘモグロビンを含む試料を希釈する緩衝液中に添加してもよく、前記キャピラリー流路準備工程において、キャピラリー流路に充填する緩衝液中に添加してもよい。
本発明において、前記試料準備工程では、ヘモグロビンを含む試料を準備する。前記ヘモグロビンを含む試料としては、例えば、ヒト等の全血を溶血処理した溶血試料等が挙げられる。前記溶血処理は、特に制限されず、例えば、超音波処理、凍結解凍処理、加圧処理、浸透圧処理、界面活性剤処理等が挙げられる。また、前記溶血試料は、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等により、適宜希釈されたものであってもよく、前述のように、前記試料は、前記陰イオン性のカオトロピックイオンが添加されていてもよい。前記陰イオン性のカオトロピックイオンの添加方法は、特に限定されず、例えば、前記溶血処理時に添加してもよく、前記希釈時に添加してもよい。
本発明において、前記キャピラリー流路準備工程では、前記緩衝液が充填されたキャピラリー流路を準備する。
前述のように、前記キャピラリー流路準備工程において、前記緩衝液に前記陰イオン性のカオトロピックイオンを添加してもよい。前記陰イオン性のカオトロピックイオンの添加方法は、特に制限されず、例えば、前記緩衝液に前記陰イオン性のカオトロピックイオンを添加したものを、キャピラリー流路に充填してもよい。
前記緩衝液には、前述のように、陰極性基含有化合物を添加することが好ましい。前記陰極性基含有化合物を前記緩衝液に添加した場合、前記電気泳動工程において、前記ヘモグロビンは、前記陰極性基含有化合物と複合体を形成した状態で、前記緩衝液中を泳動する。これによって、分析精度がさらに向上し、また、分析時間がさらに短縮可能であり、前記キャピラリー流路の長さもさらに短くすることができる。前記陰極性基含有化合物は、前記試料導入時までに前記緩衝液中に添加すればよく、例えば、前記キャピラリー流路準備工程において添加してもよく、前記試料準備工程において、前記ヘモグロビンを含む試料中に添加してもよい。
前記陰極性基含有化合物は、例えば、陰極性基含有多糖類が好ましい。前記陰極性基含有多糖類は、特に限定されないが、例えば、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、リン酸化多糖類等が挙げられ、この中で、硫酸化多糖類およびカルボン酸化多糖類が好ましい。前記硫酸化多糖類としては、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等が好ましく、より好ましくは、コンドロイチン硫酸である。前記カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が好ましい。前記コンドロイチン硫酸は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋの七種類があり、いずれを用いてもよい。前記緩衝液において、前記陰極性基含有化合物の濃度は、特に限定されず、例えば、０．０１〜５重量％の範囲である。
本発明の分析方法において、例えば、前記陰極性基含有化合物を前記緩衝液に添加した場合、安定型ＨｂＡ１ｃと、不安定型ＨｂＡ１ｃまたは修飾Ｈｂを分離する機構は、以下のように推定できる。前記安定型ＨｂＡ１ｃと前記不安定型ＨｂＡ１ｃは、各々、前記陰極性基含有化合物と電荷的および疎水的に結合し、安定型ＨｂＡ１ｃ複合体および不安定型ＨｂＡ１ｃ複合体を形成する。前記安定型ＨｂＡ１ｃと前記不安定型ＨｂＡ１ｃの荷電状態は互いに異なるが、前記各複合体は、複合体全体としては、共にマイナス（−）に荷電している。前述のように、本発明の分析方法に用いるカオトロピックイオンは、疎水性分子の水溶性を高める働きを持つ。したがって、前記カオトロピックイオンの存在下では、前記複合体の前記疎水的結合が弱められ、前記複合体の荷電状態は、各ＨｂＡ１ｃの荷電状態に大きく影響されるようになる。この結果、前記安定型ＨｂＡ１ｃ複合体と前記不安定型ＨｂＡ１ｃ複合体は、荷電状態の差異が拡大し、キャピラリー電気泳動法による分離が可能になると考えられる。この機構は、前記安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂを分離する機構においても、同様である。なお、前記機構は、推定であり、本発明を何ら限定および制限するものではない。
前記緩衝液は、特に限定されないが、例えば、酸を含んでいてもよい。前記酸としては、例えば、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸等が挙げられる。また、前記緩衝液は、例えば、弱塩基を含んでいてもよい。前記弱塩基としては、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等が挙げられる。前記緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ４．５〜６の範囲である。前記緩衝液の種類は、特に限定されないが、例えば、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。
本発明の分析方法における前記キャピラリー流路としては、特に限定されず、例えば、キャピラリー管、およびマイクロチップの基板上に形成されたキャピラリー流路等が挙げられる。
まず、前記キャピラリー管を用いた本発明の分析方法について説明する。
前記キャピラリー管の内径は、特に限定されず、例えば、１０〜２００μｍの範囲、好ましくは、２５〜１００μｍの範囲である。また、前記キャピラリー管の長さは、特に限定されず、例えば、０．１〜１０００ｍｍの範囲である。
前記キャピラリー管の材質は、特に限定されず、例えば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等が挙げられる。前記ガラス製または溶融シリカ製のキャピラリー管は、例えば、市販品を用いてもよい。前記プラスチック製のキャピラリー管としては、市販品を使用してもよく、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等から形成されたキャピラリー管等が挙げられる。
前記キャピラリー管の内壁は、例えば、陽極性基含有化合物あるいは陰極性基含有化合物により被覆してもよい。前記陽極性基含有化合物としては、例えば、前記陽極性基および反応基を含む化合物を用いればよい。例えば、前記キャピラリー管が、ガラス製もしくは溶融シリカ製である場合は、陽極性基およびケイ素を有する化合物（シリル化剤）を使用することができる。前記陽極性基としては、アミノ基、アンモニウム基が好ましい。前記陽極性基含有化合物として好ましいのは、アミノ基およびアンモニウム基の少なくとも一方の陽極性基を有するシリル化剤である。アミノ基は、一級、二級、三級のいずれであってもよい。
前記シリル化剤としては、例えば、Ｎ−（２−ジアミノエチル）−３−プロピルトリメトキシシラン、アミノフェノキシジメチルビニルシラン、３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン、３−アミノプロピルメチルビス（トリメチルシロキシ）シラン、３−アミノプロピルペンタメチルジシロキサン、３−アミノプロピルシラントリオール、ビス（Ｐ−アミノフェノキシ）ジメチルシラン、１，３−ビス（３−アミノプロピル）テトラメチルジシロキサン、ビス（ジメチルアミノ）ジメチルシラン、ビス（ジメチルアミノ）ビニルメチルシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−シアノプロピル（ジイソプロピル）ジメチルアミノシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルトリエトキシシラン、テトラキス（ジエチルアミノ）シラン、トリス（ジメチルアミノ）クロロシラン、トリス（ジメチルアミノ）シラン等があげられる。
前記シリル化剤において、ケイ素原子をチタンもしくはジルコニウムに置換したものを用いてもよい。前記シリル化剤は、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記シリル化剤を用いたキャピラリー管内壁の被覆は、例えば、つぎのようにして実施する。まず、シリル化剤を有機溶媒に溶解もしくは分散させて処理液を調製する。前記処理液の調製に使用する前記有機溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、トルエン等が使用できる。前記処理液中のシリル化剤の濃度は、特に限定されない。この処理液を、ガラス製もしくは溶融シリカ製のキャピラリー管に通液し、加熱する。この加熱によって、前記シリル化剤が、前記キャピラリー管内壁に共有結合で結合し、その結果、陽極性基が前記キャピラリー管内壁に配置されることになる。その後、有機溶媒（ジクロロメタン、メタノール、アセトン等）、酸性溶液（リン酸等）、アルカリ性溶液および界面活性剤溶液の少なくとも一つで洗浄（後処理）する。なお、この洗浄は任意であるが、実施することが好ましい。前記シリル化剤で内壁が被覆されたキャピラリー管は、市販品を用いてもよい。
前記キャピラリー管を用いた場合、本発明の分析方法は、例えば、つぎのように実施できる。
まず、前記カオトロピックイオンを含む緩衝液を、ポンプ等により圧力をかけて、前記キャピラリー管に通液する。この通液の時間は、例えば、１〜６０分間であり、通液の圧力は、例えば、０．０５〜０．１ＭＰａである。
そして、前記キャピラリー管内に、前記緩衝液が存在する状態で、前記ヘモグロビンを含む試料を前記緩衝液中に導入し、前記キャピラリー管の両端に電圧を印加して、電気泳動を行う。前記試料の導入は、前記キャピラリー管の陽極側から行う。電圧印加により、前記キャピラリー管内の緩衝液において電気浸透流が生じ、導入された試料中のヘモグロビンは、前記キャピラリー管の陰極側に向かって移動する。前記電気泳動時に、例えば、前記緩衝液中に前記陰極性基含有化合物が存在する場合には、導入された試料中のヘモグロビンは、前記陰極性基含有化合物と複合体を形成した状態で、前記キャピラリー管の陰極側に向かって移動する。前記キャピラリー管への前記電圧印加の程度は、例えば、１〜３０ｋＶである。前記ヘモグロビンの移動は、光学的手法により検出する。前記光学的手法による検出方法は、特に制限されないが、４１５ｎｍの波長で行うことが好ましい。
つぎに、前記マイクロチップを用いた場合の、本発明の分析方法について説明する。
前記マイクロチップを用いた場合の前記キャピラリー流路としては、例えば、マイクロチップの基板上に溝を掘って形成されたキャピラリー流路、マイクロチップの基板上に形成された溝に埋設されたキャピラリー管等が挙げられる。
前記基板上に溝を掘って形成されたキャピラリー流路の材質としては、例えば、ガラス、ポリマー材料等から形成されたものが使用できる。前記ガラス材料としては、例えば、合成石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等が挙げられる。前記ポリマー材料としては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸等が挙げられる。
前記基板上に形成された溝に埋設されたキャピラリー管の材質としては、特に限定されず、例えば、前記キャピラリー管と同様の材質を用いることができる。また、前記基板上に形成された溝に埋設されたキャピラリー管の内壁は、例えば、前記キャピラリー管と同様に被覆することができる。
前記マイクロチップを用いた場合の前記キャピラリー流路は、その内径の最大径が、例えば、１０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは、２５〜１００μｍの範囲であり、その最大長さは、例えば、０．５〜１５ｃｍの範囲である。なお、前記マイクロチップ上に形成したキャピラリー流路の内径の最大径とは、前記キャピラリー流路の断面形状が円でない場合には、断面積が最も大きい部分のその断面積に対応する面積の円の直径をいう。
前記マイクロチップ上に形成したキャピラリー流路を用いた場合、本発明の分析方法は、例えば、つぎのようにして実施できる。
まず、基板上に十字状に交差させて形成した試料導入用および試料分析用キャピラリー流路に、前記カオトロピックイオンを添加した緩衝液を充填する。前記試料導入用キャピラリー流路の一端に形成した導入槽に、前記ヘモグロビンを含む試料を導入後、前記試料導入用キャピラリー流路の両端に０．５〜１０ｋＶの範囲の電圧を印加する。この印加により、前記ヘモグロビンを含む試料は、前記試料導入用キャピラリー流路と前記試料分析用キャピラリー流路が連通する交差部分まで移動する。さらに、前記試料分析用キャピラリー流路の両端に０．５〜１０ｋＶの範囲の電圧を印加すると、前記ヘモグロビンを含む試料が、その一端に形成した回収槽に向かって移動する。この移動速度の差により分離された前記ヘモグロビンを含む試料中の各成分を、検出器を用いて検出する。これにより、前記ヘモグロビン含有試料中の各成分を分離して分析することが可能である。
本発明において、分析対象となるヘモグロビンは、特に限定されず、例えば、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ０）、糖化ヘモグロビン（例えば、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＧＨｂＬｙｓ等）、修飾ヘモグロビン（例えば、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等）、遺伝的変異型ヘモグロビン（例えば、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＭ、ＨｂＨ等）、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）等がある。
本発明の試薬は、前記本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動用の試薬であって、陰イオン性のカオトロピックイオンを含むことを特徴とする。また、本発明の試薬は、前記マイクロチップ電気泳動法にも用いることができる。前記試薬は、前記陰イオン性のカオトロピックイオンに加え、他の成分を含有していてもよい。前記他の成分としては、例えば、前記緩衝液等が挙げられる。
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。なお、以下に示す実施例１−１〜１−６は、安定型ＨｂＡ１ｃと不安定型ＨｂＡ１ｃを分離した分析方法、実施例２は、安定型ＨｂＡ１ｃとカルバミル化Ｈｂを分離した分析方法、実施例３は、安定型ＨｂＡ１ｃとアセチル化Ｈｂを分離した分析方法の実施例である。
（実施例１−１）
ヘモグロビンを含む試料は、以下のように準備した。まず、ヒト全血にグルコースを添加し、３７℃で３時間インキュベーションした。得られた試料を純水で１５倍希釈し、ヘモグロビンを含む試料とした。なお、前記グルコースは、試料中の濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように、ヒト全血に添加した。そして、キャピラリー流路には、溶融シリカ製キャピラリー流路（全長３２ｃｍ、有効長８．５ｃｍ、内径５０μｍ）を準備した。また、緩衝液としては、５０ｍＭフマル酸−アルギニン酸水溶液に、０．８重量％のコンドロイチン硫酸Ｃを添加した緩衝液（ｐＨ４．８）を準備した。この緩衝液に、３０ｍＭの過塩素酸を添加した。前記過塩素酸を添加した緩衝液を、前記キャピラリー流路に、圧力０．１ＭＰａ（１０００ｍｂａｒ）で通液して充填した後、前記試料を前記キャピラリー流路の陽極側に注入した。前記キャピラリー流路の両端に対して１０ｋＶの電圧を印加して電気泳動を行い、電気泳動により移動したヘモグロビンを、４１５ｎｍの吸光度で検出した。
（実施例１−２）
本例の分析方法は、前記過塩素酸に代えて、３０ｍＭのチオシアン酸を前記緩衝液に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（実施例１−３）
本例の分析方法は、前記過塩素酸に代えて、３０ｍＭのヨウ化カリウムを前記緩衝液に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（実施例１−４）
本例の分析方法は、前記過塩素酸に代えて、３０ｍＭの臭化カリウムを前記緩衝液に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（実施例１−５）
本例の分析方法は、前記過塩素酸に代えて、３０ｍＭのトリクロロ酢酸イオンを前記緩衝液に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（実施例１−６）
本例の分析方法は、前記過塩素酸に代えて、３０ｍＭのトリフルオロ酢酸イオンを前記緩衝液に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（比較例１−１）
本例の分析方法は、前記過塩素酸を前記緩衝液に添加しなかったこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（比較例１−２）
本例の分析方法は、前記過塩素酸に代えて、陽イオン性のカオトロピックイオンであるグアニジンを３０ｍＭの濃度で前記緩衝液に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（比較例１−３）
本例の分析方法は、前記過塩素酸に代えて、中性のカオトロピックイオンである尿素を３０ｍＭの濃度で前記緩衝液に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
実施例１−１の検出結果を図１に、実施例１−２の検出結果を図２に、実施例１−３の検出結果を図３に、実施例１−４の検出結果を図４に、実施例１−５の検出結果を図５に、実施例１−６についての検出結果を図６に示す。また、比較例１−１の検出結果を図７に、比較例１−２の検出結果を図８に、比較例１−３の検出結果を図９に示す。前記図１〜図９において、グラフの縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値で、横軸は、時間（分）である。陰イオン性のカオトロピックイオンを前記緩衝液に添加した実施例１−１〜１−６では、いずれも、安定型ＨｂＡ１ｃのピークが、不安定型ＨｂＡ１ｃのピークと分離して検出され、かつ、ＨｂＡ０のピークとも分離して検出された。また、これら全ての実施例について、安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０を、５分以内に測定することができた。一方、陰イオン性のカオトロピックイオンを添加していない比較例１−１では、不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク幅が広くなり、安定型ＨｂＡ１ｃのピークから分離して検出できなかった。さらに、比較例１−１は、ピークの出現が遅く、５分以内に測定することができなかった。また、陽イオン性のカオトロピックイオンであるグアニジンを添加した比較例１−２では、不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク幅が広くなり、安定型ＨｂＡ１ｃのピークから分離して検出できなかった。そして、中性のカオトロピックイオンである尿素を添加した比較例１−３では、安定型ＨｂＡ１ｃおよび不安定型ＨｂＡ１ｃ共に、分離して検出できなかった。すなわち、陰イオン性のカオトロピックイオンの添加により、安定型ＨｂＡ１ｃが、不安定型ＨｂＡ１ｃと分離して検出され、測定時間が大幅に短縮された。
（実施例２）
本例の分析方法は、試料準備工程において、前記グルコースに代えて、シアン酸ナトリウムを、試料中の濃度が３０ｍｇ／ｄＬとなるように、ヒト全血に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（比較例２）
本例の分析方法は、前記過塩素酸を前記緩衝液に添加しなかったこと以外は、実施例２と同様にして行った。
実施例２についての検出結果を図１０に示し、比較例２についての検出結果を図１１に示す。前記図１０および図１１において、グラフの縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値で、横軸は、時間（分）である。実施例２では、いずれも、安定型ＨｂＡ１ｃのピークが、カルバミル化Ｈｂのピークと分離して検出された。また、実施例２では、安定型ＨｂＡ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂのピークが、測定開始から５分以内に検出され、短時間での測定が可能であった。一方、比較例２では、カルバミル化Ｈｂのピークは、安定型ＨｂＡ１ｃのピークから分離して検出できなかった。また、比較例２では、安定型ＨｂＡ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂのピークの出現が遅く、前記２つのピークを、測定開始から５分以内に検出することができなかった。すなわち、前記陰イオン性のカオトロピックイオンの添加により、安定型ＨｂＡ１ｃが、カルバミル化Ｈｂと分離して検出され、測定時間が大幅に短縮された。
（実施例３）
本例の分析方法は、試料準備工程において、前記グルコースに代えて、アセトアルデヒドを、試料中の濃度が３０ｍｇ／ｄＬとなるように、ヒト全血に添加したこと以外は、実施例１−１と同様にして行った。
（比較例３）
本例の分析方法は、前記過塩素酸を前記緩衝液に添加しなかったこと以外は、実施例３と同様にして行った。
実施例３についての検出結果を図１２に示し、比較例２についての検出結果を図１３に示す。前記図１２および図１３において、グラフの縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値で、横軸は、時間（分）である。実施例３および比較例３では、いずれも、安定型ＨｂＡ１ｃのピークが、アセチル化Ｈｂのピークと分離して検出された。しかし、比較例３では、ピークの出現が遅く、測定開始６分以降にアセチル化Ｈｂおよび安定型ＨｂＡ１ｃのピークが検出された。それに対し、実施例３では、前記２つのピークが、測定開始から３分以内に検出された。すなわち、前記陰イオン性のカオトロピックイオンの添加により、測定時間が大幅に短縮された。
以上のように、本発明のキャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法は、装置の小型化が可能であり、分析精度が高く、短時間で分析可能な方法である。本発明は、臨床検査、生化学検査、医学研究等のヘモグロビンを分析する全ての分野に適用することができ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。
図１は、本発明の実施例１−１におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例１−２におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例１−３におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例１−４におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例１−５におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例１−６におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図７は、比較例１−１におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図８は、比較例１−２におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図９は、比較例１−３におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施例２におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図１１は、比較例２におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図１２は、本発明の実施例３におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。 図１３は、比較例３におけるヘモグロビンの分析結果を示すグラフである。

Claims (9)

  1. キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法であって、
    ヘモグロビンを含む試料を準備する試料準備工程と、
    緩衝液を含むキャピラリー流路を準備するキャピラリー流路準備工程と、
    前記キャピラリー流路の緩衝液中に前記試料を導入し、前記キャピラリー流路の両端に電圧を印加して前記試料を電気泳動する電気泳動工程とを含み、
    前記電気泳動工程において、陰イオン性のカオトロピックイオンの存在下、前記緩衝液中で前記試料を電気泳動することを特徴とする分析方法。
  2. 前記陰イオン性のカオトロピックイオンが、過塩素酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、トリクロロ酢酸イオンおよびトリフルオロ酢酸イオンからなる群から選択される少なくとも一つのイオンである請求項１記載の分析方法。
  3. 前記緩衝液中に、陰極性基含有化合物を添加し、前記ヘモグロビンと前記陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動する請求項１または２に記載の分析方法。
  4. 前記陰極性基含有化合物が、陰極性基含有多糖類である請求項３記載の分析方法。
  5. 前記陰極性基含有多糖類が、コンドロイチン硫酸である請求項４記載の分析方法。
  6. 分析対象のヘモグロビンが、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＦおよび修飾Ｈｂからなる群から選択される少なくとも一つのヘモグロビンである請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
  7. 前記ＨｂＡ１ｃが、安定型ＨｂＡ１ｃおよび不安定型ＨｂＡ１ｃの少なくとも一方のヘモグロビンである請求項６記載の分析方法。
  8. 前記修飾Ｈｂが、カルバミル化Ｈｂおよびアセチル化Ｈｂの少なくとも一方のヘモグロビンである請求項６記載の分析方法。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動用の試薬であって、陰イオン性のカオトロピックイオンを含むことを特徴とする試薬。
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