JP5509060B2 - 電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法 - Google Patents
電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法に関する。
血液中のヘモグロビンは、血液中のグルコースと反応して糖化ヘモグロビンとなる。前記糖化ヘモグロビンの中でも、特に、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）は、糖尿病の診断や治療等において、重要な指標である。ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ０）のβ鎖Ｎ末端のバリンが糖化したものであり、糖化反応の段階によって、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「安定型Ａ１ｃ」または「ｓ−Ａ１ｃ」ともいう。）および不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「不安定型Ａ１ｃ」または「Ｌ−Ａ１ｃ」ともいう。）が存在する。不安定型Ａ１ｃは、ＨｂＡ０のβ鎖Ｎ末端のバリンに、グルコースがシッフ塩基結合して、アルジミンとなったものである。前記不安定型Ａ１ｃが、さらにアマドリ転移を受けてケトアミン化合物となったものが、安定型Ａ１ｃである。安定型Ａ１ｃは、過去数ヶ月間の血糖値を反映し、日本糖尿病学会の標準測定法の測定項目となっている。
血液中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、例えば、免疫法、酵素法、アフィニティクロマトグラフィ法、ＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法等がある。前記免疫法および前記酵素法は、自動分析装置に適用可能である。このため、検体を大量に処理できるという長所を有するが、糖尿病患者の血糖コントロール指標および／または合併症の発症予防マーカーとして用いるには、測定精度に欠ける。前記アフィニティクロマトグラフィ法は、分離原理上、β鎖Ｎ末端の糖化バリンに対する特異性が低く、Ｈｂ分子中の糖化リジンが測定値に含まれてしまうため、ＨｂＡ１ｃの測定精度が低い。また、前記ＨＰＬＣ法は、糖尿病患者の治療における糖化ヘモグロビンの測定方法として汎用されているが（特許文献１）、大型で高価な専用の装置を必要とし、装置の小型化および低コスト化が困難である。集団検診への利用等の理由から、ヘモグロビンの分析装置に対しては、小型化が求められているが、前述のように、前記ＨＰＬＣ法は、この要請に応えることは困難である。
他方、前記キャピラリー電気泳動法では、キャピラリー流路の内壁に集合したイオンが、印加によって移動することで電気浸透流が生じ、これにより試料が移動して電気泳動が行われる。前記キャピラリー電気泳動法は、例えば、前記キャピラリー流路の短縮化、キャピラリー電気泳動装置の一部のマイクロチップ化によって、装置全体の小型化が可能である。前記キャピラリー電気泳動法によるＨｂＡ１ｃの分析方法は、例えば、キャピラリーの内壁に、陰極性層が積層されたキャピラリー管を使用した方法（特許文献２および３）が報告されている。
しかしながら、ｓ−Ａ１ｃの分析精度は、ｓ−Ａ１ｃと、不安定型Ａ１ｃおよび修飾ヘモグロビンとの分離精度に大きく影響される。このため、短時間で、高精度に分析可能なｓ−Ａ１ｃ分析方法の開発が望まれていた。
そこで、本発明は、電気泳動法によるヘモグロビン分析方法であって、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）および他のヘモグロビンの分離精度に優れ、かつ分析時間を短縮可能な分析方法を提供することを目的とする。
本発明の分析方法は、泳動液中にカルボキシル基を二つ以上有する酸性物質を有する条件下で電気泳動を実施し、前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする、電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法である。
本発明によれば、ＨｂＡ１ｃと他のヘモグロビンとの分離精度が向上するため、例えば、分離キャピラリー流路の流路長を短縮化しても、高精度に分析可能であり、分析時間の短縮化が可能となる。
本発明の分析方法は、前記酸性物質の二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことが好ましい。
本発明の分析方法は、前記泳動液が、緩衝剤および分離改善剤を含み、前記分離改善剤が、前記酸性物質を含むことが好ましい。
本発明の分析方法は、前記酸性物質の二つ以上のカルボキシル基の各酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも０．７以上低いことが好ましい。
本発明の分析方法は、前記泳動液が、緩衝剤を含み、前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨ−０．３の値以上であることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記泳動液が、緩衝剤および分離改善剤を含み、前記分離改善剤が、前記酸性物質を含み、前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａ）から、前記分離改善剤の前記酸性物質のカルボキシル基の第二酸解離定数（ｐＫａ２）を引いた差が、０．２以上であることが好ましい。
本発明の分析方法は、ヘモグロビンを含む試料液のｐＨと、前記泳動液のｐＨとの差が、０．３未満であることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記酸性物質が、シクロヘキサン環を有する構造であることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記電気泳動法によるヘモグロビンの分離が、分離キャピラリー流路で実施されることが好ましい。
本発明の分析方法は、ヘモグロビンを含む試料液を、連続して前記分離キャピラリー流路に導入する、連続試料導入法により実施されることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記分離キャピラリー流路が、マイクロチップに形成されており、前記電気泳動法が、マイクロチップ電気泳動法であるという態様でもよい。
本発明の分析方法は、前記分離キャピラリー流路が、キャピラリー管であり、前記電気泳動法が、キャピラリー電気泳動法であるという態様でもよい。
本発明の分析方法は、前記ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃであることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記ヘモグロビンＡ１ｃが、安定型ヘモグロビンＡ１ｃおよび不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの少なくとも一方であることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記ヘモグロビンが、カルバミル化ヘモグロビン、アルデヒド化ヘモグロビンおよびアセチル化ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも一種の修飾ヘモグロビンであることが好ましい。
つぎに、本発明の分離改善剤は、カルボキシル基を二つ以上有する酸性物質を含有し、前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする、前記本発明の分析方法に用いる分離改善剤である。本発明の分離改善剤において、好ましい条件および態様は、本発明のヘモグロビンの分析方法と同じである。
つぎに、本発明の泳動液試薬は、前記本発明の分析方法に用いる前記分離改善剤を含むことを特徴とする。本発明の泳動液試薬において、好ましい条件および態様は、本発明のヘモグロビンの分析方法と同じである。
つぎに、本発明のマイクロチップは、分離キャピラリー流路および複数の液槽を含み、前記複数の液槽は、前記分離キャピラリー流路で連通され、前記分離キャピラリー流路および前記液槽の少なくとも一方に、泳動液が充填され、前記泳動液が、カルボキシル基を二つ以上有する酸性物質を含有し、前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする、前記本発明の分析方法に使用するマイクロチップである。本発明のマイクロチップにおいて、好ましい条件および態様は、本発明のヘモグロビンの分析方法と同じである。
つぎに、本発明の試薬は、前記本発明の分離改善剤を含むことを特徴とする、前記本発明の分析方法に使用する試薬である。本発明の試薬は、前記分離改善剤に加え、例えば、泳動液、緩衝剤、添加剤、界面活性剤、安定化剤等を含んでもよい。本発明の試薬は、例えば、泳動液試薬、希釈液試薬、試料液試薬等として使用してもよい。
本発明の分析キットは、前記本発明の試薬を含むことを特徴とする。本発明の分析キットは、前記本発明の分析方法に用いる分離改善剤を含み、前記分離改善剤が、カルボキシル基を二つ以上有する酸性物質を含有し、前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする。すなわち、本発明の分析キットは、前記本発明の分離改善剤を含む。
以下、本発明について詳細に説明する。以下、ヘモグロビンを「Ｈｂ」と記載する。
本発明の分析方法は、前述のように、泳動液中にカルボキシル基を二つ以上有する酸性物質を有する条件下で電気泳動を実施し、前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする、電気泳動法によるＨｂの分析方法である。本発明の分析方法は、特に制限されず、例えば、後述するように、前記電気泳動が、キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動であることが好ましい。
本発明において、前記泳動液は、電圧を印加してＨｂを電気泳動により分離するための液をいう。前記泳動液は、例えば、電気泳動前の泳動液と、電気泳動時の泳動液に分けることができる。本発明において、電気泳動前の泳動液を「分析前の泳動液」と言い、電気泳動時の泳動液を「分析時の泳動液」と言うことができる。「電気泳動前」または「分析前」は、例えば、前記泳動液に電圧を印可する前を意味し、「電気泳動時」または「分析時」は、例えば、前記泳動液に電圧を印可している状態を意味し、試料が添加されている状態である。前記分析時の泳動液は、前記酸性物質を含んでいるが、前記分析前の泳動液は、前記酸性物質を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。前記分析前の泳動液および前記分析時の泳動液は、例えば、緩衝剤等を含んでいてもよい。
前記酸性物質は、分析時に、前記泳動液中に存在していればよい。このため、前記酸性物質は、例えば、前記分析前の泳動液に予め添加してもよいし、Ｈｂを含む試料液に予め添加してもよい。前者の場合は、例えば、分離キャピラリー流路内に、分析前に充填する液として、前記酸性物質を含む液を使用することが好ましい。前記分離キャピラリー流路は、例えば、キャピラリー管、キャピラリー流路等があげられる。後者の場合、例えば、前記酸性物質を、溶血試料等のような液体試料に直接添加してもよいし、後述するような、試料を希釈する溶媒に予め添加してもよい。
前記酸性物質は、前述のように、カルボキシル基を二つ以上有する。前記酸性物質における前記カルボキシル基の数は、例えば、２〜６であり、好ましくは、２〜４である。
前記酸性物質は、例えば、さらに、カルボキシル基以外の官能基を有してもよい。その他の官能基は、特に制限されず、例えば、水素原子、アミノ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜５のアルキル基、前記炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基等があげられる。前記官能基における水素原子は、例えば、その一つ以上が任意の置換基によって置換されていてもよい。前記置換基は、例えば、フルオロ基、ブロモ基、クロロ基、ヨード基等のハロゲン基があげられ、好ましくはフルオロ基である。
前記酸性物質は、二つ以上のカルボキシル基を有し、それぞれのカルボキシル基毎に酸解離定数（ｐＫａ）を有する。本発明において、少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）の範囲は、例えば、２〜５であり、好ましくは、２〜４である。
前記酸性物質の二つ以上のカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）は、分析時の前記泳動液のｐＨよりも、好ましくは、０．５以上低く、より好ましくは、０．７以上低く、さらにより好ましくは、１．０以上低い。
前記酸性物質は、具体的には、例えば、カルボン酸、アミノ酸等があげられる。
前記カルボン酸は、例えば、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ペンタカルボン酸、ヘキサカルボン酸、ヘプタカルボン酸、オクタカルボン酸、ノナカルボン酸、デカカルボン酸等があげられ、好ましくは、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ペンタカルボン酸、ヘキサカルボン酸である。前記カルボン酸は、例えば、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を使用してもよい。
前記カルボン酸は、例えば、脂肪族カルボン酸、炭素環カルボン酸等があげられる。前記脂肪族カルボン酸は、例えば、フマル酸、Ｄ−酒石酸等があげられ、好ましくは、Ｄ−酒石酸である。前記炭素環カルボン酸は、例えば、シクロヘキサンカルボン酸等があげられる。
前記シクロヘキサンカルボン酸は、シクロヘキサン環を有する構造である。前記シクロヘキサンカルボン酸は、例えば、下記一般式（１）で表される化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、またはそれらの塩、溶媒和物もしくは水和物が好ましい。
ただし、前記一般式（１）は、少なくとも二つのカルボキシル基を有し、前記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１２は、それぞれ同一であるかまたは異なる官能基である。前記Ｒ１〜Ｒ１２の中で、少なくとも二つの官能基が、カルボキシル基を有する官能基である、および／または、少なくとも一つの官能基が、少なくとも二つのカルボキシル基を有する官能基である。前者、すなわち、少なくとも一つのカルボキシル基を有する官能基は、例えば、カルボキシル基、カルボキシアルキル基である。前記カルボキシアルキル基において、アルキル基部分は、例えば、炭素数１〜５であり、炭素数１が好ましく、前記カルボキシアルキル基の具体例は、例えば、−ＣＨ２ＣＯＯＨがあげられる。後者、すなわち、少なくとも二つのカルボキシル基を有する官能基は、例えば、ビス（カルボキシアルキル）アミノ基である。前記ビス（カルボキシアルキル）アミノ基において、アルキル基部分は、例えば、炭素数１〜５であり、炭素数１が好ましく、前記ビス（カルボキシアルキル）アミノ基の具体例は、例えば、−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ）２があげられる。前記官能基は、具体的には、前記カルボキシル基を含む官能基の他に、例えば、水素原子、アミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基または炭素数１〜５のアルキルチオ基である。前記Ｒ１〜Ｒ１２上の水素原子は、その一つ以上が任意の置換基によって置換されていてもよい。前記Ｒ１〜Ｒ１２上の水素原子および前記置換基のうち少なくとも二つが、カルボキシル基に置換されていてもよい。前記置換基は、特に制限されず、例えば、カルボキシル基、アシル基、アミノ基、アルキル基、水酸基等があげられる。前記水酸基は、例えば、異性化し、オキソ基（＝Ｏ）として存在してもよい。前記置換基における水素原子は、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等の置換基によって置換されていてもよい。
前記アルキル基は、特に限定されず、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基等があげられ、アルキル基を構造中に含む、アルコキシ基およびアルキルチオ基においても同様である。前記アルキル基は、例えば、その一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アルキル基における置換基は、特に制限されず、例えば、前述の置換基等があげられる。
前記アルコキシ基は、特に限定されず、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基等があげられる。前記アルコキシ基は、例えば、その一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アルコキシ基における置換基は、特に制限されず、例えば、前述の置換基等があげられる。
前記アルキルチオ基は、特に制限されず、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基等があげられる。前記アルキルチオ基は、例えば、その一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アルキルチオ基における置換基は、特に制限されず、例えば、前述の置換基等があげられる。
前記Ｒ１〜Ｒ１２について、前記カルボキシル基を有する官能基の具体例は、特に制限されず、例えば、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、前記カルボキシアルキル基、前記ビス（カルボキシアルキル）アミノ基等があげられ、前記カルボキシアルキル基は、−ＣＨ２−ＣＯＯＨが好ましく、前記ビス（カルボキシアルキル）アミノ基は、−Ｎ−(ＣＨ２ＣＯＯＨ)２が好ましい。
前記シクロヘキサンカルボン酸は、具体的には、例えば、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，１−シクロヘキサン二酢酸、（１α，２α，４α）−１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸、１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサカルボン酸一水和物等が好ましい。前記シクロヘキサンカルボン酸は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記アミノ酸は、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられ、好ましくは、グルタミン酸である。前記アミノ酸は、一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記酸性物質は、前述のように、例えば、二つ以上のカルボキシル基を有し、それぞれのカルボキシル基毎に酸解離定数（ｐＫａ）を有する。少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）の範囲は、例えば、２〜５であり、好ましくは、２〜４である。このような範囲の酸解離定数を有する酸性物質は、例えば、ＣｙＤＴＡ、（１α，２α，４α）−１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−酒石酸、L−酒石酸、フマル酸、クエン酸、アスパラギン酸、フタル酸、Ｄ−リンゴ酸等があげられる。
前記酸性物質の二つ以上のカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）は、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことが好ましく、より好ましくは、０．５以上低く、さらに好ましくは、０．７以上低く、特に好ましくは、１．０以上低い。このような酸性物質は、特に制限されず、例えば、ＣｙＤＴＡ、Ｄ−酒石酸、フマル酸、アスパラギン酸等があげられる。このような酸性物質は、例えば、金属のキレート剤としても使用可能であり、これによって、例えば、試料中のカルシウムイオン、マグネシウムイオン等のイオンを除去することも可能である。また、これらのイオンを除去することによって、例えば、後述するような陰極性基含有化合物の凝集を抑制することも可能である。
前記泳動液は、前記酸性物質のうち、いずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。前記酸性物質の組み合わせおよび割合は、特に制限されず、適宜設定できる。
前記泳動液における前記酸性物質の濃度は、特に制限されず、例えば、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらにより好ましくは、１〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。
前記泳動液は、例えば、分離改善剤と緩衝剤とを含み、前記分離改善剤が、前記酸性物質を含んでもよい。
前記分離改善剤は、例えば、前記酸性物質の他に、さらに、任意の物質を含んでもよい。前記物質の組み合わせおよび割合は、特に制限されず、適宜設定できる。
前記分離改善剤は、例えば、分析時に、前記泳動液中に存在していればよい。このため、前記分離改善剤は、例えば、分析前の前記泳動液に予め添加してもよいし、前記試料液に予め添加してもよい。前者の場合は、例えば、分離キャピラリー流路内に、分析前に充填する液として、前記分離改善剤を含む液を使用することが好ましい。前記分離キャピラリー流路は、例えば、キャピラリー管、キャピラリー流路等があげられる。後者の場合、例えば、前記分離改善剤を、前記試料に直接添加してもよいし、後述するような、試料を希釈する溶媒に予め添加してもよい。
前記緩衝剤は、例えば、従来公知の緩衝物質があげられる。前記緩衝物質は、具体的には、例えば、リン酸、ホウ酸等の無機酸、Ｌ−酒石酸、酢酸、マレイン酸、マロン酸、フタル酸、クエン酸、ギ酸、乳酸、安息香酸、コハク酸、プロピオン酸、リンゴ酸、グルタル酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ)、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）等の有機酸、システイン、チロシン、ヒスチジン、リシン、アルギニン等のアミノ酸等があげられる。前記泳動液は、前記緩衝剤として、前記緩衝物質のうち、いずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。前記緩衝物質の組み合わせおよび割合は、特に制限されず、適宜設定できる。前記泳動液が緩衝剤と分離改善剤とを含む場合、前記緩衝剤は、例えば、前記酸性物質以外の緩衝物質でもよいし、前記酸性物質でもよい。
前記緩衝剤は、例えば、分析時に、前記泳動液中に存在していればよい。このため、前記緩衝剤は、例えば、分析前の前記泳動液に予め添加してもよいし、前記試料液に予め添加してもよい。前者の場合は、例えば、分離キャピラリー流路内に、分析前に充填する液として、前記緩衝剤を含む液を使用することが好ましい。前記分離キャピラリー流路は、例えば、キャピラリー管、キャピラリー流路等があげられる。後者の場合、例えば、前記緩衝剤を前記試料に直接添加してもよいし、後述するような、試料を希釈する溶媒に予め添加してもよい。前記緩衝剤は、例えば、分析前の前記泳動液に予め添加するのが好ましい。分析前の前記泳動液に前記緩衝剤を添加することにより、例えば、前記試料液と分析前の前記泳動液とのｐＨの差を、後述の範囲に設定できる。
前記緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）は、特に制限されず、例えば、４．５〜６であり、好ましくは、４．５〜５．５である。このような範囲の酸解離定数を有する緩衝剤は、例えば、Ｌ−酒石酸、クエン酸、グルタル酸、コハク酸、酢酸、フタル酸、マロン酸、マレイン酸、リンゴ酸、プロピオン酸等があげられる。
前記緩衝剤が複数の酸解離定数（ｐＫａ）を有する場合、前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））は、例えば、前記緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）のうち、分析時の前記泳動液のｐＨ（Ｘ）に最も近い値の酸解離定数をいう。前記緩衝剤が一つの酸解離定数（ｐＫａ）を有する場合、例えば、前記酸解離定数が、前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））である。前記緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）のうち、前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））は、例えば、分析時の前記泳動液のｐＨ−０．３の値以上であるのが好ましい。つまり、分析時の前記泳動液のｐＨの値を「Ｘ」とした場合、前記酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））は、例えば、［Ｘ−０．３］以上が好ましい。
前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））と、前記分析時の前記泳動液のｐＨ（Ｘ）との差は、例えば、−０．３以上である。このような範囲の酸解離定数を有する緩衝剤は、例えば、Ｌ−酒石酸、グルタル酸、酢酸、フタル酸、リンゴ酸、プロピオン酸等があげられる。
前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））は、例えば、前記分離改善剤の前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）より高いことが好ましい。前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））と、前記分離改善剤の前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の各酸解離定数（ｐＫａ（Ａ））との差、すなわち、［ｐＫａｎ（Ｂ）−ｐＫａ（Ａ）］は、例えば、０．２以上であり、好ましくは、０．５以上であり、より好ましくは、０．７以上である。具体的には、前記緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａｎ（Ｂ））と、前記分離改善剤の前記酸性物質の第２酸解離定数（ｐＫａ２）との差、すなわち、［ｐＫａｎ（Ｂ）−ｐＫａ２］は、例えば、０．２以上であり、好ましくは、０．５以上であり、より好ましくは、０．７以上である。このような関係を満たす前記緩衝剤と前記酸性物質との組み合わせは、特に制限されず、例えば、Ｌ−酒石酸とＣｙＤＴＡの組み合わせ、Ｌ−酒石酸とＬ−グルタミン酸の組み合わせ、リンゴ酸とＣｙＤＴＡの組み合わせ、リンゴ酸とＤ−酒石酸の組み合わせ、クエン酸とＣｙＤＴＡの組み合わせ、クエン酸とフマル酸の組み合わせ等があげられる。
前記泳動液は、例えば、さらに、添加剤、界面活性剤、安定化剤等を含んでもよい。前記添加剤は、例えば、分析時に、前記泳動液中に存在していればよい。このため、前記添加剤は、例えば、分析前の前記泳動液に予め添加してもよいし、前記試料液に予め添加してもよい。前者の場合は、例えば、分離キャピラリー流路内に、分析前に充填する液として、前記添加剤を含む液を使用することが好ましい。前記分離キャピラリー流路は、例えば、キャピラリー管、キャピラリー流路等があげられる。後者の場合、例えば、前記添加剤を、前記試料に直接添加してもよいし、後述するような、試料を希釈する溶媒に予め添加してもよい。前記界面活性剤および安定化剤も、例えば、分析時に、前記泳動液中に存在していればよい。前記界面活性剤および安定化剤は、例えば、前述の添加剤と同様にして、前記泳動液、前記試料液等に添加すればよい。
前記添加剤は、特に制限されず、例えば、陰極性基含有化合物、陰イオン性カオトロピックイオン等があげられる。
前記陰極性基含有化合物は、特に制限されず、例えば、陰極性基含有多糖類等があげられる。前記陰極性基含有多糖類は、特に限定されず、例えば、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、リン酸化多糖類等があげられ、この中で、硫酸化多糖類およびカルボン酸化多糖類が好ましい。前記硫酸化多糖類は、例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパリンまたはこれらの塩等が好ましく、より好ましくは、コンドロイチン硫酸またはその塩である。前記カルボン酸化多糖類は、例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸またはこれらの塩が好ましい。前記塩は、例えば、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等があげられる。前記コンドロイチン硫酸は、例えば、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｈおよびコンドロイチン硫酸Ｋ等があげられる。前記陰極性基含有化合物は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。前記陰極性基含有化合物の組み合わせおよび割合は、特に制限されず、適宜設定できる。
分析時の前記泳動液における前記陰極性基含有化合物の濃度は、特に限定されず、例えば、約０．０１〜５重量％であり、好ましくは、約０．１〜２重量％である。前述のように、前記陰極性基含有化合物は、例えば、前記泳動液に予め添加してもよいし、前記試料液に予め添加してもよい。したがって、前者の場合、前記泳動液中の前記陰極性基含有化合物の濃度は、特に制限されず、例えば、分析時において、前述の範囲になるように添加することが好ましい。後者の場合、前記試料液中の前記陰極性基含有化合物の濃度は、特に制限されず、例えば、分析時において、前述の範囲になるように添加することが好ましい。
前記陰極性基含有化合物の存在下で前記試料液を電気泳動する場合、例えば、前記試料液中のＨｂは、前記陰極性基含有化合物と複合体を形成した状態で、前記泳動液中を電気泳動する。この複合体形成により、例えば、分析精度をさらに向上させ、前記分離キャピラリー流路の長さ（分離長）をさらに短縮可能である。このため、例えば、分析時間をさらに短縮できる。
カオトロピックイオンは、一般的に、水分子間の相互作用を破壊して、疎水性分子との接触による水のエントロピーの減少を抑制することにより、疎水性分子の水溶性を高めるイオンである。前記陰イオン性カオトロピックイオンは、特に制限されず、例えば、過塩素酸イオン（ＣｌＯ４ −）、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）、トリクロロ酢酸イオン（ＣＣｌ３ＣＯＯ−）、トリフルオロ酢酸イオン（ＣＦ３ＣＯＯ−）、硝酸イオン（ＮＯ３ −）、ジクロロ酢酸イオン（ＣＣｌ２ＣＯＯ−）、ハロゲン化物イオン等があげられる。前記ハロゲン化物イオンは、特に制限されず、例えば、フッ化物イオン（Ｆ−）、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、アスタチン化物イオン（Ａｔ−）等があげられ、好ましくは、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）である。前記カオトロピックイオンは、例えば、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。前記カオトロピックイオンの組み合わせおよび割合は、特に制限されず、適宜設定できる。
前記泳動液は、例えば、前記陰イオン性カオトロピックイオンを含んでもよいし、前記陰イオン性カオトロピックイオンを含む塩、および、電離して前記陰イオン性カオトロピックイオンを生じる物質の少なくともいずれかを含んでもよい。本発明では、後述のように、前記陰イオン性カオトロピックイオンは、例えば、使用しないか、低濃度で用いることが好ましい。前記塩は、例えば、酸性塩、中性塩、塩基性塩があげられる。前記陰イオン性カオトロピックイオンを含む塩、および前記電離して陰イオン性カオトロピックイオンを生じる物質は、特に限定されず、具体的には、例えば、ヨウ化カリウム、臭化カリウム等のハロゲン化カリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、トリクロロ酢酸カリウム、トリフルオロ酢酸カリウム等があげられる。したがって、本発明において、前記陰イオン性カオトロピックイオンは、例えば、前記陰イオン性カオトロピックイオンを含む塩、または前記電離して陰イオン性カオトロピックイオンを生じる物質等も含まれる。前記陰イオン性カオトロピックイオンは、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。前記陰イオン性カオトロピックイオンの組み合わせおよび割合は、特に制限されず、適宜設定できる。
前述のように、前記陰イオン性カオトロピックイオンを使用すれば、例えば、分離精度は向上するが、高濃度の陰イオン性カオトロピックイオン存在下で電気泳動法を実施すると、電流量の増加により、発熱量が増加する場合がある。この発熱量の増加により、例えば、Ｈｂの分離精度が低下し、泳動速度は遅くなる。本発明によれば、前述のように、前記泳動液中に前記酸性物質を有する条件下で電気泳動が実施されることにより、Ｈｂの分離精度が向上する。このため、例えば、前記陰イオン性カオトロピックイオンの濃度を低減した条件下でも、Ｈｂを高精度に分離できる。したがって、本発明は、例えば、前記陰イオン性カオトロピックイオンの低減により、前述のＨｂの分離精度および泳動速度への影響を抑制でき、より高精度に分析可能である。
分析時の前記泳動液における前記陰イオン性カオトロピックイオンは、例えば、含まれないか、比較的低濃度であるのが好ましい。分析時の前記泳動液における前記陰イオン性カオトロピックイオンの濃度は、具体的には、例えば、１〜３０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記陰イオン性カオトロピックイオンは、例えば、分析時に前述のような範囲になるように、前記泳動液に予め添加してもよいし、前記試料液に予め添加してもよい。
前記界面活性剤は、特に限定されず、例えば、非イオン性界面活性剤等があげられる。前記非イオン性界面活性剤は、特に制限されず、例えば、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００」）等があげられる。
前記安定化剤は、特に制限されず、例えば、アジ化ナトリウム、グルタチオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等があげられる。
分析前および分析時の前記泳動液のイオン強度は、特に制限されない。前記泳動液のｐＨは、特に制限されず、例えば、４．５〜６であり、好ましくは、４．５〜５．５である。
本発明の分析方法は、例えば、試料液を前記泳動液に導入して、電気泳動するのが好ましい。前記試料液は、Ｈｂを含む試料である。前記試料は、例えば、生体由来の試料でもよいし、Ｈｂを含有する市販品を含む試料でもよい。前記生体由来の試料は、例えば、血液試料があげられ、具体的には、例えば、全血、血球画分等の血球含有物があげられる。前記試料液は、例えば、生体から採取した試料そのものでもよいし、前記採取した試料を溶媒で希釈した希釈試料でもよい。
前記血液試料は、特に制限されず、前記血球含有物を溶血処理した溶血試料等があげられる。前記溶血処理は、特に制限されず、例えば、超音波処理、凍結解凍処理、加圧処理、浸透圧処理、界面活性剤処理等があげられ、好ましくは、浸透圧処理である。前記浸透圧処理は、特に制限されず、例えば、前記血球含有物を低張液等で処理してもよい。前記低張液は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前述の緩衝剤、添加剤等を含んでもよい。
前記希釈用の溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前述の分離改善剤、緩衝剤、添加剤、界面活性剤、安定化剤等を含んでもよい。
前述のように、前記試料液に前記分離改善剤を添加する場合、前記分離改善剤は、例えば、溶血処理時に添加してもよく、希釈時に添加してもよい。前者の場合、例えば、浸透圧処理に使用する前記低張液に、予め前記分離改善剤を添加してもよい。後者の場合、例えば、前記希釈用の溶媒に、予め前記分離改善剤を添加してもよい。前記緩衝剤、添加剤、界面活性剤、安定化剤を前記試料液に添加する場合も、例えば、前述の分離改善剤と同様である。
前記試料液のイオン強度は、特に制限されない。前記試料液のｐＨは、特に制限されず、例えば、４．５〜６が好ましく、より好ましくは、４．５〜５．５である。
試料液によって泳動液にｐＨ変動を与える場合、前記試料液のｐＨと、前記泳動液のｐＨとの差は、小さいほど好ましく、前記差は、例えば、０〜０．３であり、好ましくは、０〜０．１である。前記泳動液のｐＨは、例えば、分析前および分析時のいずれかの前記泳動液のｐＨであり、好ましくは、分析時の前記泳動液のｐＨである。
前記ｐＨの差は、例えば、前記試料液に前記緩衝剤を添加することにより調整してもよいし、前述のように、分析前の前記泳動液に前記緩衝剤を添加することにより調整してもよい。好ましくは、後者である。前記分離改善剤のみで調整した試料液のｐＨと、分析時の泳動液のｐＨとの差は、例えば、０．３以上であるが、緩衝剤を添加してｐＨの前記差を、０．３未満とすることが好ましい。
前記Ｈｂは、特に限定されず、例えば、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型Ａ１ｃ、ｓ−Ａ１ｃ）、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（不安定型Ａ１ｃ、Ｌ−Ａ１ｃ）等の糖化ヘモグロビン；カルバミル化ヘモグロビン（カルバミル化Ｈｂ）、アセチル化ヘモグロビン（アセチル化Ｈｂ）等の修飾ヘモグロビン；ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、ヘモグロビンＭ（ＨｂＭ）、ヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）等の変異型ヘモグロビン；正常ヘモグロビン（ＨｂＡ０）；胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）；ＨｂＡ２等があげられる。本発明は、例えば、ＨｂＡ１ｃと他のＨｂとを、高精度かつ短時間に分離して検出できる。したがって、本発明の分析対象は、例えば、ＨｂＡ１ｃを含むことが好ましく、ＨｂＡ１ｃおよび修飾Ｈｂを含むのがより好ましい。
本発明は、前記Ｈｂに加えて、さらに、その他の成分を分析対象としてもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、例えば、アルブミン（Ａｌｂ）、グロブリン（α１、α２、β、γグロブリン）、フィブリノーゲン、グルコース、グリコアルブミン等があげられる。
本発明の分析方法は、電気泳動法によるＨｂの分離が、例えば、分離キャピラリー流路で実施されてもよい。この場合、前記電気泳動法を、キャピラリー電気泳動法ともいう。前記分析方法は、例えば、連続試料導入法により実施されるのが好ましく、これは、一般に、Ｈｂを含む試料液を、連続的に前記分離キャピラリー流路に導入する方法である。
前記分離キャピラリー流路は、特に制限されず、例えば、キャピラリー管、マイクロチップ等の基板に形成されたキャピラリー流路等があげられる。したがって、前記分析方法は、例えば、前記分離キャピラリー流路が、マイクロチップに形成されており、前記電気泳動法が、マイクロチップ電気泳動法でもよい。また、前記分析方法は、例えば、前記分離キャピラリー流路が、キャピラリー管であり、前記電気泳動法が、キャピラリー電気泳動法でもよい。
本発明の分析方法は、例えば、キャピラリー管、キャピラリー流路を備えるマイクロチップ等を、前記分離キャピラリー流路を備えるデバイスとして使用できる。前記分離キャピラリー流路を備えるデバイスは、例えば、自家作製してもよいし、市販品を用いてもよい。
まず、前記キャピラリー管について、以下に説明する。本発明は、これには制限されない。
前記キャピラリー管の内径は、特に限定されず、例えば、１０〜２００μｍ、好ましくは、２５〜１００μｍである。前記キャピラリー管の長さは、特に限定されず、例えば、１０〜１０００ｍｍであり、好ましくは、１５〜３００ｍｍである。
前記キャピラリー管の材質は、特に限定されず、例えば、ガラス、ポリマー等があげられる。前記キャピラリー管は、例えば、市販品を用いてもよい。前記ガラスは、特に制限されず、例えば、合成石英ガラス、溶融シリカ、ホウケイ酸ガラス等があげられる。前記ポリマーは、特に制限されず、具体的には、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ乳酸等があげられる。
前記キャピラリー管の内壁は、例えば、陽極性基を有する被覆剤または陰極性基を有する被覆剤により被覆されてもよい。
前記陽極性基を有する被覆剤は、例えば、前記陽極性基および反応基を含む化合物を使用できる。前記反応基は、例えば、シリル基（例えば、アルキルシリル基およびアルコキシシリル基）、アルコキシ基、ハロゲン基等があげられる。前記アルコキシ基は、例えば、メトキシ基、エトキシ基等があげられる。前記ハロゲン基は、例えば、フルオロ基、ブロモ基、クロロ基、ヨード基等があげられ、好ましくはクロロ基である。前述のように、例えば、前記キャピラリー管がガラス製の場合、前記陽極性基を有する被覆剤は、例えば、陽極性基およびケイ素を有する化合物（シリル化剤）を使用することが好ましい。前記陽極性基は、例えば、アミノ基、アンモニウム基等があげられる。前記陽極性基を有する被覆剤は、例えば、アミノ基およびアンモニウム基の少なくとも一方の陽極性基を有するシリル化剤が好ましい。前記アミノ基は、一級、二級、三級のいずれでもよい。前記陽極性基を有する被覆剤として、前記陽極性基を有するシリル化剤を用いることにより、例えば、分析精度をさらに向上できる。
前記陽極性基を有するシリル化剤は、例えば、Ｎ−（２−ジアミノエチル）−３−プロピルトリメトキシシラン、アミノフェノキシジメチルビニルシラン、３−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン、３−アミノプロピルメチルビス（トリメチルシロキシ）シラン、３−アミノプロピルペンタメチルジシロキサン、３−アミノプロピルシラントリオール、ビス（Ｐ−アミノフェノキシ）ジメチルシラン、１，３−ビス（３−アミノプロピル）テトラメチルジシロキサン、ビス（ジメチルアミノ）ジメチルシラン、ビス（ジメチルアミノ）ビニルメチルシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−シアノプロピル（ジイソプロピル）ジメチルアミノシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルトリエトキシシラン、テトラキス（ジエチルアミノ）シラン、トリス（ジメチルアミノ）クロロシラン、トリス（ジメチルアミノ）シラン等があげられる。
前記陽極性基を有するシリル化剤として、例えば、ケイ素原子をチタンまたはジルコニウムに置換したものを用いてもよい。前記陽極性基を有するシリル化剤は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記陽極性基を有するシリル化剤を用いる場合、前記キャピラリー管の内壁の被覆は、例えば、つぎのようにして行うことができる。まず、前記シリル化剤を有機溶媒に溶解もしくは分散させて処理液を調製する。前記有機溶媒は、例えば、ジクロロメタン、トルエン等があげられる。前記処理液中の前記シリル化剤の濃度は、特に限定されない。前記処理液を、ガラス製のキャピラリー管に通液し、加熱する。この加熱によって、前記シリル化剤が、前記キャピラリー管の内壁に共有結合で結合する。その結果、前記シリル化剤の前記陽極性基が前記キャピラリー管の内壁に配置されることになる。その後、洗浄液により、前記キャピラリー管の内壁を洗浄する。前記洗浄液は、例えば、有機溶媒、酸性溶液、アルカリ性溶液および界面活性剤溶液からなる群から選択される少なくとも一つが使用できる。前記有機溶媒は、例えば、ジクロロメタン、メタノール、アセトン等、前記酸性溶液は、リン酸溶液等があげられる。この洗浄は、任意であるが、実施することが好ましい。前記陽極性基を有するシリル化剤で内壁が被覆されたキャピラリー管は、市販品を用いてもよい。
前記陰極性基を有する被覆剤は、特に制限されず、例えば、前述した陰極性基含有化合物が使用でき、中でも、陰極性基および反応基を含む化合物が好ましい。前記反応基は、例えば、シリル基（例えば、アルキルシリル基およびアルコキシシリル基）、アルコキシ基、ハロゲン基等があげられる。前記アルコキシ基は、例えば、メトキシ基、エトキシ基等があげられる。前記ハロゲン基は、例えば、フルオロ基、ブロモ基、クロロ基、ヨード基等があげられ、好ましくはクロロ基である。前記陰極性基および反応基を含む化合物は、例えば、陰極性基およびケイ素を有する化合物（シリル化剤）等があげられる。前記陰極性基を有する被覆剤は、例えば、陰極性基を有するシリル化剤が好ましい。前記陰極性基は、例えば、硫酸基、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基等があげられる。前記陰極性基を有する被覆剤として、前記陰極性基を有するシリル化剤を用いることにより、例えば、分析精度をさらに向上できる。前記陰極性基を有するシリル化剤を用いる場合、前記キャピラリー管の内壁の被覆は、例えば、前記陽極性基を有するシリル化剤による被覆と同様にして行うことができる。
前記陰極性基を有するシリル化剤は、例えば、クロロスルホニルフェニルエチルトリメトキシシラン、クロロスルホニルフェニルエチルトリクロロシラン等があげられる。
前記陰極性基含有化合物は、これらの他に、例えば、陰極性基含有多糖類があげられる。前記陰極性基含有多糖類は、前述と同様のものが使用できる。前記陰極性基含有多糖類を有する被覆も、例えば、前記シリル化剤による被覆と同様にして行うことができる。また、例えば、既存の方法（例えば、特許第２７１１１１２号等を参照）を用いることによって、前記内壁を共有結合により被覆することもできる。
前記キャピラリー管を用いた場合、本発明の分析方法は、例えば、つぎのように実施できる。
まず、前記酸性物質を含む泳動液を、ポンプ等により減圧または加圧して、前記キャピラリー管に通液する。通液の時間は、例えば、１〜６０分間であり、通液の圧力は、例えば、０．０５〜０．１ＭＰａである。
つぎに、前記キャピラリー管内に、前記泳動液が存在する状態で、Ｈｂを含む前記試料液を前記泳動液中に導入する。そして、前記キャピラリー管の両端に配置した電極間に電圧を印加して、電気泳動を行う。前記試料液の導入は、前記キャピラリー管の陽極側から行う。電圧印加により、前記キャピラリー管内の前記泳動液において電気浸透流が生じ、導入された前記試料液中のＨｂは、前記キャピラリー管の陰極側に向かって移動する。分析時に、例えば、前記泳動液中に前記陰極性基含有化合物が存在する場合は、導入された前記試料液中のＨｂは、前記陰極性基含有化合物と複合体を形成した状態で、前記キャピラリー管の陰極側に向かって移動する。前記キャピラリー管への前記電圧印加の程度は、例えば、１〜３０ｋＶである。前記Ｈｂの移動は、例えば、光学的手法により検出する。前記光学的手法による検出方法は、特に制限されず、例えば、４１５ｎｍの波長で行うことが好ましい。前記試料液中の各Ｈｂは、移動速度の差により分離される。分離された前記試料液中の各Ｈｂを、検出器を用いて検出する。本実施形態において、前記分離キャピラリー流路における、前記試料液の泳動開始点から前記検出器による検出点までの長さを、分離長という。前記キャピラリー管における分離長は、例えば、１０〜１０００ｍｍであり、好ましくは、１５〜３００ｍｍである。
つぎに、前記分離キャピラリー流路を備えるマイクロチップについて、以下に説明する。本発明は、これには制限されない。
前記マイクロチップに形成された分離キャピラリー流路は、特に制限されず、例えば、前記マイクロチップの基板上に溝を掘って形成されたキャピラリー流路、マイクロチップの基板上に形成された溝に埋設されたキャピラリー管等があげられる。
前記基板上に溝を掘って形成されたキャピラリー流路は、例えば、その断面形状は、制限されず、円形、半円形、矩形等があげられる。前記断面形状とは、例えば、前記キャピラリー流路の試料の流れ方向に対して垂直方向に切断した際の断面形状である。前記キャピラリー流路の内壁は、例えば、前述のキャピラリー管の内壁と同様に、被覆してもよい。
前記基板上に溝を掘って形成されたキャピラリー流路の材質は、特に制限されない。前記材質は、例えば、ガラス、ポリマー等があげられる。前記ガラスは、特に制限されず、例えば、合成石英ガラス、溶融シリカ、ホウケイ酸ガラス等があげられる。前記ポリマーは、特に制限されず、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等があげられる。前記基板に溝を掘って形成されることから、前記基板が、これらの材質でもよい。
前記基板上に形成された溝に埋設されたキャピラリー管の材質は、特に限定されない。前記材質は、例えば、前述のキャピラリー管と同様の材質があげられる。また、前記埋設されたキャピラリー管の内壁は、例えば、前述のキャピラリー管と同様に、被覆してもよい。
前記マイクロチップにおいて、前記分離キャピラリー流路は、その内径の最大径が、例えば、１０〜２００μｍであり、好ましくは、２５〜１００μｍである。その最大長さは、例えば、０．１ｍｍ〜１５ｃｍであり、好ましくは、０．５ｍｍ〜１５ｃｍである。前記マイクロチップに形成された前記分離キャピラリー流路の内径の最大径とは、例えば、前記分離キャピラリー流路の断面形状が半円形の場合は、前記半円の直径であり、前記分離キャピラリー流路の断面形状が半円形でない場合は、断面積が最も大きい部分のその断面積に対応する面積の円の直径をいう。
前記マイクロチップに形成された分離キャピラリー流路を用いた場合、本発明の分析方法は、例えば、つぎのようにして実施できる。
前記マイクロチップとして、基板上に、両端に溶液槽を持つ分離キャピラリー流路が形成されたマイクロチップを使用する。具体的には、前記基板が、前記分離キャピラリー流路と前記２つの溶液槽とを有し、前記流路の両端が、それぞれ前記溶液槽と連通しており、前記流路の両端に、印可可能なように電極が配置されている。前記基板において、前記溶液槽は、例えば、前記基板に設けられた凹状の空隙である。前記溶液槽は、一方が、前記試料液を導入する導入槽であり、他方が、前記分離キャピラリー流路を流れた前記試料液が到達する回収槽である。
前記分離キャピラリー流路に、前記酸性物質を含む泳動液を充填する。前記分離キャピラリー流路の一端に形成された前記導入槽に、Ｈｂを含む前記試料液を導入した後、前記分離キャピラリー流路の両端に配置した電極間に、電圧を印可する。電圧は、例えば、０．５〜１０ｋＶである。この印可により、前記試料液が、前記分離キャピラリー流路の他端に形成された前記回収槽に向かって移動する。前記Ｈｂの移動は、例えば、光学的手法により検出する。前記光学的手法による検出方法は、特に制限されず、例えば、４１５ｎｍの波長で行うことが好ましい。前記試料液中の各Ｈｂは、移動速度の差により分離される。分離された前記試料液中の各Ｈｂを、検出器を用いて検出する。前記分離キャピラリー流路における分離長は、例えば、０．１ｍｍ〜１５ｃｍであり、好ましくは、０．５ｍｍ〜１５ｃｍである。このようにして、前記試料液中の各成分を分離して、分析することが可能である。前記マイクロチップの使用により、例えば、分析装置の一層の小型化が可能である。
前記マイクロチップに形成された分離キャピラリー流路を用いた場合、本発明の分析方法は、例えば、試料液を連続的に導入する、前述の電気泳動法に限られず、例えば、つぎのようにして実施してもよい。特に示さない限り、前述の方法と同様である。
前記マイクロチップとして、基板上に、導入キャピラリー流路および分離キャピラリー流路が、十字状に交差して形成されたマイクロチップを使用する。前記導入キャピラリー流路と前記分離キャピラリー流路とは、前記交差部分で連通している。具体的には、前記基板が、前記導入キャピラリー流路および分離キャピラリー流路と２つの溶液槽とを有し、前記導入キャピラリー流路の一端が一方の溶液槽と連通し、前記分離キャピラリー流路の一端が他方の溶液槽と連通し、前記導入キャピラリー流路の両端および前記分離キャピラリー流路の両端に、それぞれ、印可可能なように電極が配置されている。前記導入キャピラリー流路と連通する前記溶液槽が、前記試料液を導入する導入槽であり、前記分離キャピラリー流路と連通する前記溶液槽が、前記分離キャピラリー流路を流れた前記試料液が到達する回収槽である。
前記導入キャピラリー流路および前記分離キャピラリー流路に、前記酸性物質を含む泳動液を充填する。前記導入キャピラリー流路の一端に形成された前記導入槽に、Ｈｂを含む前記試料液を導入した後、前記導入キャピラリー流路の両端に配置した電極間に、電圧を印可する。電圧は、例えば、０．５〜１０ｋＶである。この印加により、前記試料液が、前記交差部分まで移動する。さらに、前記分離キャピラリー流路の両端に配置した電極間に、電圧を印可する。電圧は、例えば、０．５〜１０ｋＶである。この印可により、前記試料液が、前記分離キャピラリー流路の一端に形成された前記回収槽に向かって移動する。前記Ｈｂの移動は、例えば、光学的手法により検出する。前記光学的手法による検出方法は、特に制限されず、例えば、４１５ｎｍの波長で行うことが好ましい。前記試料液中の各Ｈｂは、移動速度の差により分離される。分離された前記試料液中の各Ｈｂを、検出器を用いて検出する。本実施形態において、前記分離キャピラリー流路おける、前記交差部分、すなわち、分離キャピラリー流路における前記試料液の泳動開始点から、前記検出器による検出点までの長さを、前記分離長という。前記分離キャピラリー流路における分離長は、例えば、０．１ｍｍ〜１５ｃｍであり、好ましくは、０．５ｍｍ〜１５ｃｍである。このようにして、前記試料液中の各成分を分離して、分析することが可能である。前記マイクロチップの使用により、例えば、分析装置の一層の小型化が可能である。
つぎに、本発明の分析キットは、前述のように、前記本発明の分離改善剤を含む。本発明の分析キットは、例えば、その他に、さらに、泳動液、緩衝剤、添加剤、界面活性剤、安定化剤等を含んでもよい。本発明分析キットは、例えば、さらに、前記分離キャピラリー流路を備えてもよい。前記分離キャピラリー流路は、例えば、前述と同様であり、キャピラリー管、基板に形成されたキャピラリー流路等があげられ、後者としては、例えば、マイクロチップがあげられる。本発明の分析キットは、例えば、さらに使用説明書を備えてもよい。
以下に、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。本発明は、下記実施例および比較例により制限されない。
（実施例１）
本例では、前記分離改善剤として、前記酸性物質であるシクロヘキサンカルボン酸を用いて、カルバミル化Ｈｂを含む試料液を分析した。
本例では、前記分離改善剤として、前記酸性物質であるシクロヘキサンカルボン酸を用いて、カルバミル化Ｈｂを含む試料液を分析した。
下記表の組成の泳動液を調製した。前記泳動液は、まず、緩衝液として、下記Ｌ−酒石酸−アルギニン水溶液を調製し、これに種々の成分を添加して調製した。前記泳動液において、前記分離改善剤は、前記シクロヘキサンカルボン酸である、ＣｙＤＴＡ（ｐＫａ１＝２．４２、ｐＫａ２＝３．５３）、１，１−シクロヘキサン二酢酸、１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸（ｐＫａ１＝２．６、ｐＫａ２＝４．５９）および１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサカルボン酸一水和物を使用した。Ｌ−酒石酸の酸解離定数は、ｐＫａ１＝３．０２であり、ｐＫａ２＝４．５４である。
また、試料液の調製に使用する希釈液として、前記各泳動液を１．１倍濃度に設定した溶液（ｐＨ４．８）を、それぞれ調製した。
Ｈｂコントロールサンプル（ＢＭＬ社製）に、シアン酸ナトリウムを１０ｍｇ／１００ｍＬとなるように添加し、３７℃で２時間反応させた。この反応によって、Ｈｂをシアン化した。この反応液と、前記各希釈液とを、１：１０の体積比で混合し、試料液（ｐＨ４．８）を調製した。
分離キャピラリー流路（全長３５ｍｍ、内径５０μｍ）を有するＰＭＭＡ製マイクロチップを使用した。前記マイクロチップの前記分離キャピラリー流路に、０．０１重量％のアルギン酸水溶液を通液し、前記分離キャピラリー流路の内壁を被覆処理した。
前記キャピラリー流路に、前記泳動液を、０．１ＭＰａ（１０００ｍｂａｒ）で加圧して充填後、前記試料液を前記キャピラリー流路の陽極側に注入した。前記キャピラリー流路の両端に配置した電極間に１４００Ｖの電圧を印加し、前記試料液を電気泳動させた。分光光度計を使用し、検出点において、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。本例では、前記試料液の注入箇所から２０ｍｍ陰極側を検出点とし、分離長を２０ｍｍとした。検出時間と吸光度との関係を示すグラフを作成し、下記式を用いて、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）と修飾Ｈｂ（本例ではカルバミル化Ｈｂ）のピークとの分離度を算出した。
分離度＝１．１８×（ｔ２−ｔ１）／（ｐ１＋ｐ２）
ｔ１＝修飾Ｈｂのピークの検出時間
ｔ２＝安定型ＨｂＡ１ｃのピークの検出時間
ｐ１＝修飾Ｈｂのピークのピーク半値幅※
ｐ２＝安定型ＨｂＡ１ｃのピークのピーク半値幅※
※ピーク半値幅：ピーク高さの中点におけるピーク幅
分離度＝１．１８×（ｔ２−ｔ１）／（ｐ１＋ｐ２）
ｔ１＝修飾Ｈｂのピークの検出時間
ｔ２＝安定型ＨｂＡ１ｃのピークの検出時間
ｐ１＝修飾Ｈｂのピークのピーク半値幅※
ｐ２＝安定型ＨｂＡ１ｃのピークのピーク半値幅※
※ピーク半値幅：ピーク高さの中点におけるピーク幅
図１のグラフに、実施例１の検出結果を示す。図１において、（Ａ）は、Ｌ−酒石酸およびＣｙＤＴＡを添加した結果であり、（Ｂ）は、Ｌ−酒石酸および１，１−シクロヘキサン二酢酸を添加した結果であり、（Ｃ）は、Ｌ−酒石酸および１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸を添加した結果である。図１のグラフにおいて、太線は、４１５ｎｍにおける吸光度を示し、細線は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）を示す。これらのグラフにおいて、左の縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値（ｍＡｂｓ）であり、右の縦軸は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）であり、横軸は、時間（秒）である。これらのグラフにおいて、矢印で指し示すピークは、左から順に、修飾Ｈｂ（カルバミル化Ｈｂ）および安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）である。
図１（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、実施例１では、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂのピークが、測定開始から約４０秒以内に、分離して検出された。分離度は、（Ａ）Ｌ−酒石酸およびＣｙＤＴＡを添加した場合、（Ｂ）Ｌ−酒石酸および１，１−シクロヘキサン二酢酸を添加した場合、（Ｃ）Ｌ−酒石酸および１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸を添加した場合、ともに１．３であった。特に、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、（Ａ）Ｌ−酒石酸とＣｙＤＴＡまたは（Ｂ）Ｌ−酒石酸と１，１−シクロヘキサン二酢酸とを添加した場合、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂのピークが、より明瞭に分離され、測定開始から約３０秒以内に検出された。また、図示していないが、１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサカルボン酸一水和物を添加した場合も、同様に、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂが分離して検出され、分離度は、１．２であった。なお、実施例１において、分析時の前記泳動液のｐＨは、４．８であった。このように、前記酸性物質の添加により、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂの分離精度が向上し、分析時間が短縮した。
（実施例２）
本例では、Ｈｂコントロールサンプルに代えて、ヒト全血を使用し、前記シアン酸ナトリウムに代えて、Ｈｂのアルデヒド化のためにアセトアルデヒドを使用した。そして、アセトアルデヒドが１０ｍｇ／１００ｍＬとなるようにヒト全血に添加した以外は、前記実施例１と同様にして、試料液（ｐＨ４．８）を調製した。この試料液を使用した以外は、実施例１と同様にして分析した。
本例では、Ｈｂコントロールサンプルに代えて、ヒト全血を使用し、前記シアン酸ナトリウムに代えて、Ｈｂのアルデヒド化のためにアセトアルデヒドを使用した。そして、アセトアルデヒドが１０ｍｇ／１００ｍＬとなるようにヒト全血に添加した以外は、前記実施例１と同様にして、試料液（ｐＨ４．８）を調製した。この試料液を使用した以外は、実施例１と同様にして分析した。
図２のグラフに、実施例２においてＣｙＤＴＡを添加した場合の検出結果を示す。図２のグラフにおいて、太線は、４１５ｎｍにおける吸光度を示し、細線は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）を示す。図２のグラフにおいて、左の縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値（ｍＡｂｓ）であり、右の縦軸は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）であり、横軸は、時間（秒）である。図２のグラフにおいて、矢印で指し示すピークは、左から順に、修飾Ｈｂ（アルデヒド化Ｈｂ）および安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）である。
図２に示すように、実施例２では、ＣｙＤＴＡを添加した結果、ｓ−Ａ１ｃおよびアルデヒド化Ｈｂのピークが、測定開始から約３０秒以内に、分離して検出された。また、図示していないが、前記実施例１で使用したその他のシクロヘキサンカルボン酸を添加した場合も、ＣｙＤＴＡと同様に、ｓ−Ａ１ｃおよびアルデヒド化Ｈｂが分離して検出された。特に、図２に示すように、ＣｙＤＴＡを添加した場合、ｓ−Ａ１ｃおよびアルデヒド化Ｈｂのピークが、より明瞭に分離された。なお、実施例２において、分析時の泳動液のｐＨは、４．８であった。このように、前記酸性物質の添加により、ｓ−Ａ１ｃおよびアルデヒド化Ｈｂの分離精度が向上した。
（実施例３）
本例では、Ｈｂコントロールサンプルに代えて、ヒト全血を使用し、前記シアン酸ナトリウムに代えて、Ｈｂの糖化のためにグルコースを使用した。そして、グルコースが１５００ｍｇ／１００ｍＬとなるようにヒト全血に添加した以外は、前記実施例１と同様にして、試料液（ｐＨ４．８）を調製した。この試料液を使用した以外は、実施例１と同様にして分析した。
本例では、Ｈｂコントロールサンプルに代えて、ヒト全血を使用し、前記シアン酸ナトリウムに代えて、Ｈｂの糖化のためにグルコースを使用した。そして、グルコースが１５００ｍｇ／１００ｍＬとなるようにヒト全血に添加した以外は、前記実施例１と同様にして、試料液（ｐＨ４．８）を調製した。この試料液を使用した以外は、実施例１と同様にして分析した。
図３のグラフに、実施例３においてＣｙＤＴＡを添加した場合の検出結果を示す。図３のグラフにおいて、太線は、４１５ｎｍにおける吸光度を示し、細線は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）を示す。図３のグラフにおいて、左の縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値（ｍＡｂｓ）であり、右の縦軸は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）であり、横軸は、時間（秒）である。図３のグラフにおいて、矢印で指し示すピークは、左から順に、不安定型Ａ１ｃ（Ｌ−Ａ１ｃ）および安定型Ａ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）である。
図３に示すように、実施例３では、ＣｙＤＴＡを添加した結果、ｓ−Ａ１ｃおよび不安定型Ａ１ｃのピークが、測定開始から約３０秒以内に、分離して検出された。また、図示していないが、前記実施例１で使用したその他のシクロヘキサンカルボン酸を添加した場合も、ＣｙＤＴＡと同様に、ｓ−Ａ１ｃおよび不安定型Ａ１ｃが分離して検出された。特に、図３に示すように、ＣｙＤＴＡを添加した場合、ｓ−Ａ１ｃおよび不安定型Ａ１ｃのピークは、より明瞭に分離された。なお、実施例３において、分析時の泳動液のｐＨは、４．８であった。このように、前記酸性物質の添加により、ｓ−Ａ１ｃおよび不安定型Ａ１ｃの分離精度が向上した。
（実施例４）
本例では、前記分離改善剤として、前記シクロヘキサンカルボン酸に代えて、Ｌ−グルタミン酸（ｐＫａ１＝２．１８、ｐＫａ２＝４．２０）を用いた以外は、実施例１と同様にして分析した。
本例では、前記分離改善剤として、前記シクロヘキサンカルボン酸に代えて、Ｌ−グルタミン酸（ｐＫａ１＝２．１８、ｐＫａ２＝４．２０）を用いた以外は、実施例１と同様にして分析した。
図４のグラフに、実施例４の検出結果を示す。図４のグラフにおいて、太線は、４１５ｎｍにおける吸光度を示し、細線は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）を示す。図４のグラフにおいて、左の縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値（ｍＡｂｓ）であり、右の縦軸は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）であり、横軸は、時間（秒）である。図４のグラフにおいて、矢印で指し示すピークは、左から順に、修飾Ｈｂ（カルバミル化Ｈｂ）および安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）である。
図４に示すように、実施例４では、Ｌ−グルタミン酸を添加した結果、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂのピークが、測定開始から約３５秒以内に、分離して検出された。その分離度は、１．２４であった。なお、実施例４において、分析時の泳動液のｐＨは、４．８であった。このように、前記酸性物質の添加により、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂの分離精度が向上し、分析時間が短縮した。
（実施例５）
本例では、前記表１の泳動液の組成において、前記分離改善剤を無添加とし、緩衝剤であるＬ−酒石酸に代えて、前記酸性物質であるＤ−酒石酸を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加して、泳動液を調製した。また、この泳動液の組成に基づいて、前記実施例１と同様にして、希釈液を調製した。前記泳動液および前記希釈液を用いた以外は、実施例１と同様にして分析した。Ｄ−酒石酸の酸解離定数は、ｐＫａ１＝２．８２であり、ｐＫａ２＝３．９６である。
本例では、前記表１の泳動液の組成において、前記分離改善剤を無添加とし、緩衝剤であるＬ−酒石酸に代えて、前記酸性物質であるＤ−酒石酸を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加して、泳動液を調製した。また、この泳動液の組成に基づいて、前記実施例１と同様にして、希釈液を調製した。前記泳動液および前記希釈液を用いた以外は、実施例１と同様にして分析した。Ｄ−酒石酸の酸解離定数は、ｐＫａ１＝２．８２であり、ｐＫａ２＝３．９６である。
図５のグラフに、実施例５の検出結果を示す。図５のグラフにおいて、太線は、４１５ｎｍにおける吸光度を示し、細線は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）を示す。図５のグラフにおいて、左の縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値（ｍＡｂｓ）であり、右の縦軸は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）であり、横軸は、時間（秒）である。図５のグラフにおいて、矢印で指し示すピークは、左から順に、修飾Ｈｂ（カルバミル化Ｈｂ）および安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）である。
図５に示すように、実施例５では、Ｄ−酒石酸を添加した結果、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂのピークが、測定開始から約３５秒以内に、分離して検出された。なお、実施例５において、分析時の泳動液のｐＨは、４．８であった。このように、Ｄ−酒石酸の添加により、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂの分析精度が向上し、分析時間が短縮した。
（比較例１）
本例では、前記表１の泳動液の組成において、前記分離改善剤を無添加として、緩衝液として、Ｌ−酒石酸−アルギニン水溶液に代えて、１００ｍｍｏｌ／Ｌ グルタル酸−アルギニン水溶液または１００ｍｍｏｌ／Ｌ プロピオン酸−アルギニン水溶液を使用して、泳動液を調製した。また、この泳動液の組成に基づいて、前記実施例１と同様にして、希釈液を調製した。前記泳動液および前記希釈液を用いた以外は、実施例１と同様にして分析した。グルタル酸は、２つのカルボキシル基を有し、前記カルボキシル基の酸解離定数は、ｐＫａ１＝４．１３、ｐＫａ２＝５．０１である。また、プロピオン酸は、カルボキシル基を１つのみ有し、酸解離定数は、ｐＫａ＝４．８６である。
本例では、前記表１の泳動液の組成において、前記分離改善剤を無添加として、緩衝液として、Ｌ−酒石酸−アルギニン水溶液に代えて、１００ｍｍｏｌ／Ｌ グルタル酸−アルギニン水溶液または１００ｍｍｏｌ／Ｌ プロピオン酸−アルギニン水溶液を使用して、泳動液を調製した。また、この泳動液の組成に基づいて、前記実施例１と同様にして、希釈液を調製した。前記泳動液および前記希釈液を用いた以外は、実施例１と同様にして分析した。グルタル酸は、２つのカルボキシル基を有し、前記カルボキシル基の酸解離定数は、ｐＫａ１＝４．１３、ｐＫａ２＝５．０１である。また、プロピオン酸は、カルボキシル基を１つのみ有し、酸解離定数は、ｐＫａ＝４．８６である。
図６のグラフに、比較例１の検出結果を示す。図６において、（Ａ）はグルタル酸−アルギニン水溶液を用いた結果であり、（Ｂ）はプロピオン酸−アルギニン水溶液を用いた結果である。図６のグラフにおいて、太線は、４１５ｎｍにおける吸光度を示し、細線は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）を示す。両グラフにおいて、左の縦軸は、４１５ｎｍにおける吸光度値（ｍＡｂｓ）であり、右の縦軸は、勾配（吸光度変化率、ｍＡｂｓ／秒）であり、横軸は、時間（秒）である。図６（Ａ）のグラフにおいて、矢印で指し示すピークは、左から順に、修飾Ｈｂ（カルバミル化Ｈｂ）および安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）である。
図６（Ａ）に示すように、グルタル酸−アルギニン水溶液を用いた場合、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂのピークは、低くかつブロードとなり、分離して検出できなかった。その分離度は、０．５であった。図６（Ｂ）に示すように、プロピオン酸−アルギニン水溶液を用いた場合、ピークを検出できなかった。なお、比較例１において、分析時の泳動液のｐＨは、５．０であった。このように、グルタル酸またはプロピオン酸の存在下では、ｓ−Ａ１ｃおよびカルバミル化Ｈｂを分離して検出できなかった。
前記実施例１〜５および前記比較例１の結果から明らかなように、前記酸性物質の存在下で、試料液を電気泳動することにより、Ｈｂの分離精度が向上し、分析時間が短縮した。特に、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−Ａ１ｃ）と、修飾Ｈｂまたは不安定型Ａ１ｃとの分離精度が向上した。
以上のように、本発明は、例えば、ＨｂＡ１ｃおよび修飾ヘモグロビン等のＨｂの分析精度を向上し、分析時間を短縮可能である。本発明は、例えば、臨床検査、生化学検査、医学研究等のヘモグロビンを分析する全ての分野に適用することができ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。
Claims (24)
- 泳動液中にカルボキシル基を二つ以上有する酸性物質を有する条件下で電気泳動を実施し、
前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低く、
下記（１）および（２）の少なくとも一方を満たすことを特徴とする、電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法。
（１）ヘモグロビンを含む試料液のｐＨと、前記泳動液のｐＨとの差が、０．３未満である
（２）前記酸性物質が、炭素環カルボン酸およびＬ−グルタミン酸の少なくとも一方である - 前記酸性物質の二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする、請求項１記載の分析方法。
- 前記泳動液が、緩衝剤および分離改善剤を含み、
前記分離改善剤が、前記酸性物質を含むことを特徴とする、請求項１または２記載の分析方法。 - 前記酸性物質の二つ以上のカルボキシル基の各酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも０．７以上低いことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記泳動液が、緩衝剤を含み、前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨ−０．３の値以上であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記泳動液が、緩衝剤および分離改善剤を含み、
前記分離改善剤が、前記酸性物質を含み、
前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫａ）から、前記分離改善剤の前記酸性物質のカルボキシル基の第二解離定数（ｐＫａ２）を引いた差が、０．２以上であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。 - 前記炭素環カルボン酸が、シクロヘキサン環を有する構造であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記電気泳動法によるヘモグロビンの分離が、分離キャピラリー流路で実施されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
- ヘモグロビンを含む試料液を、連続して前記分離キャピラリー流路に導入する、連続試料導入法により実施されることを特徴とする、請求項８記載の分析方法。
- 前記分離キャピラリー流路が、マイクロチップに形成されており、
前記電気泳動法が、マイクロチップ電気泳動法であることを特徴とする、請求項８または９記載の分析方法。 - 前記分離キャピラリー流路が、キャピラリー管であり、
前記電気泳動法が、キャピラリー電気泳動法であることを特徴とする、請求項８または９記載の分析方法。 - 前記ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記ヘモグロビンＡ１ｃが、安定型ヘモグロビンＡ１ｃおよび不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの少なくとも一方であることを特徴とする、請求項１２記載の分析方法。
- 前記ヘモグロビンが、カルバミル化ヘモグロビン、アルデヒド化ヘモグロビンおよびアセチル化ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも一種の修飾ヘモグロビンであることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記炭素環カルボン酸が、シクロヘキサンカルボン酸であることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記シクロヘキサンカルボン酸が、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，１−シクロヘキサン二酢酸、（１α，２α，４α）−１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸および１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサカルボン酸一水和物からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１５記載の分析方法。
- 緩衝剤および分離改善剤を含み、
前記分離改善剤が、炭素環カルボン酸およびＬ−グルタミン酸の少なくとも一方の酸性物質を含み、
前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫ ａ ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の分析方法に用いる分離改善剤を含む泳動液試薬。 - 前記緩衝剤の緩衝能に関与する酸解離定数（ｐＫ ａ ）から、前記分離改善剤の前記酸性物質のカルボキシル基の第二解離定数（ｐＫ ａ２ ）を引いた差が、０．２以上であることを特徴とする、請求項１７記載の泳動液試薬。
- 前記炭素環カルボン酸が、シクロヘキサンカルボン酸であることを特徴とする、請求項１７または１８記載の泳動液試薬。
- 前記シクロヘキサンカルボン酸が、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，１−シクロヘキサン二酢酸、（１α，２α，４α）−１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸および１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサカルボン酸一水和物からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１９記載の泳動液試薬。
- 炭素環カルボン酸およびＬ−グルタミン酸の少なくとも一方の酸性物質を含み、
前記酸性物質の少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が、分析時の前記泳動液のｐＨよりも低いことを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の分析方法に用いる分離改善剤。 - 前記炭素環カルボン酸が、シクロヘキサンカルボン酸であることを特徴とする、請求項２１記載の分離改善剤。
- 前記シクロヘキサンカルボン酸が、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，１−シクロヘキサン二酢酸、（１α，２α，４α）−１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸および１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサカルボン酸一水和物からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、請求項２２記載の分離改善剤。
- 請求項２１から２３のいずれか一項に記載の分離改善剤を含むことを特徴とする、分析キット。
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