JP7368308B2

JP7368308B2 - 安定型Ａ１ｃの測定方法

Info

Publication number: JP7368308B2
Application number: JP2020080798A
Authority: JP
Inventors: 隆成重光; 迅吉田
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2040-04-30
Also published as: JP2021001871A

Description

本発明は、血中ヘモグロビンの分画のうち、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。

ヘモグロビン分子のβ鎖のＮ末端のバリン残基にグルコースが結合したものをＨｂＡ１ｃという。より詳細には、可逆的に生成する不安定型ＨｂＡ１ｃ（ｌａｂｉｌｅＨｂＡ１ｃ。以下、「不安定型Ａ１ｃ」又は「Ｌ－Ａ１ｃ」と表記する。）を経て、不可逆性の反応物質である安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（ｓｔａｂｌｅＨｂＡ１ｃ。以下、「安定型Ａ１ｃ」又は「Ｓ－Ａ１ｃ」と表記する。）が生成される。安定型Ａ１ｃは臨床的には過去１～２ヶ月の平均の血糖値を反映しており、糖尿病管理の指標として重要である、とされる。

従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、キャピラリー電気泳動法等が用いられている。キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法については、下記特許文献１に開示されている。

ＨＰＬＣ法やキャピラリー電気泳動法で安定型Ａ１ｃの測定をする場合は、血中のヘモグロビンから安定型Ａ１ｃを分離して、分離して得られたピークの大きさから総ヘモグロビンに対する割合を算出する。

このとき、たとえば腎不全患者では、尿素から生成されるシアン酸がヘモグロビンと結合するカルバミル化によって、ヘモグロビンが化学修飾を被る。また、たとえば、血中のアセトアルデヒドがヘモグロビンに結合するアルデヒド化によって、ヘモグロビンＨｂが化学修飾を被ることもある。

このような化学修飾されたヘモグロビン分画が、安定型Ａ１ｃを示す分画と同じ時間に溶出してくることで、見かけ状の安定型Ａ１ｃが実際よりは高値として測定されたり（下記特許文献２参照）、あるいは、安定型Ａ１ｃの割合が大きく変動することもある（下記特許文献３参照）。

したがって、安定型Ａ１ｃの正確な測定のためには、このような化学修飾されたヘモグロビンを十分に分離する必要がある。そこで、キャピラリー電気泳動法においては、キャピラリー内面のコーティングや泳動条件を変えることで、安定型Ａ１ｃと化学修飾されたヘモグロビンとを分離する試みがなされている（下記特許文献３及び下記特許文献４参照）。

再表２００８－１３９８６６号公報特開２００４－６９６４０号公報特開２００８－１７０３５０号公報特開２００９－１８６４４５号公報

上記したように、腎不全患者の尿素から生成されるシアン酸によって生じるカルバミル化ヘモグロビンや、血中のアセトアルデヒドによって生じるアルデヒド化ヘモグロビンを安定型Ａ１ｃから分離することで、化学修飾ヘモグロビンの存在が安定型Ａ１ｃの測定に与える影響を回避することについては検討されている。

一方、安定型Ａ１ｃそのものもヘモグロビンであり、カルバミル化やアルデヒド化のような化学修飾を被る。そのため、過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を算出するためには、化学修飾された安定型Ａ１ｃと化学修飾されていない安定型Ａ１ｃの両方を算出する必要がある。しかし、これまでの分離分析においては、化学修飾されていない安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積を測定して、その結果から過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を算出としており、化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積については、安定型Ａ１ｃの割合の算出に考慮されていなかった。そのため、従来から試みられているように、分離分析において化学修飾されたヘモグロビンの分画と化学修飾されていない安定型Ａ１ｃの分画を分離して溶出させることを試みても、腎不全患者や血中のアルデヒド濃度が高い患者の過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を正確に測定できず、糖尿病管理を適切に行うことができない。

そこで本発明の実施態様は、化学修飾された安定型Ａ１ｃの割合を加味した安定型Ａ１ｃの割合を算出することを課題とする。

ＨｂＡ０が化学修飾されている検体は、安定型Ａ１ｃがカルバミル化やアルデヒド化されていると考えられる。そのため、ＨｂＡ０が化学修飾されていると判断される検体については、化学修飾されていない安定型Ａ１ｃと化学修飾された安定型Ａ１ｃの両方の割合を算出する必要があることを見出した。一方、例えば、検体をキャピラリー電気泳動で分離分析して得られるエレクトロフェログラムにおける化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画には、化学修飾されたＨｂＡ０以外に不安定型Ａ１ｃも含まれている。そのため、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、検体に含まれる不安定型Ａ１ｃの量によって変動し、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の大きさから、ＨｂＡ０が化学修飾されている検体であるかどうか判別できない。そのため、安定型Ａ１ｃの割合を算出する際に、化学修飾された安定型Ａ１ｃの割合を考慮する必要性が高い検体であるのかを適切に判断する必要があることを見出した。

本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法は、血中ヘモグロビンの分子表面電荷に基づく分離分析における安定型Ａ１ｃの測定方法であって、
分離分析で得られるヘモグロビンの時間分布から、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積がＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンの時間分布のヘモグロビンを含む全ピーク面積に占める割合である第１の割合が、第１の閾値以上であるかどうかを判別する工程、及び、
第１の割合が第１の閾値以上である場合に、ヘモグロビンの時間分布における化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率を算出し、ヘモグロビンの時間分布におけるＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正して得た値を当該分画の測定値とする工程、
を含んでなる。

本発明の実施態様では、化学修飾された安定型Ａ１ｃの量を適切に考慮することで、安定型Ａ１ｃの量をより正確に測定することが可能となる。

本発明に係る分析システムの一例を示すシステム概略図である。図１の分析システムに用いられる分析チップを示す平面図である。図２のＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿う断面図である。制御部のハードウェア構成をブロック図で示す。本発明に係る分析方法を示すフロー図である。準備工程の手順を示すフロー図である。図６の準備工程の一工程を示す断面図である。図６の準備工程の一工程を示す断面図である。図６の準備工程の一工程を示す断面図である。図６の準備工程の一工程を示す断面図である。分析工程の手順を示すフロー図である。判別工程の手順を示すフロー図である。波形形成工程によって形成された波形データの一例を示すグラフである。最離間点の決定を示すグラフである。ヘモグロビンのエレクトロフェログラムの一例を示す。実施例１における検体１のエレクトロフェログラムを示す。実施例１における検体２のエレクトロフェログラムを示す。実施例１における検体３のエレクトロフェログラムを示す。実施例１における検体４のエレクトロフェログラムを示す。実施例１における安定型Ａ１ｃ量の補正の効果を示すグラフである。実施例２における検体５のエレクトロフェログラムを示す。実施例２における検体６のエレクトロフェログラムを示す。実施例２における検体７のエレクトロフェログラムを示す。実施例２における安定型Ａ１ｃ量の補正の効果を示すグラフである。実施例３における検体８のエレクトロフェログラムを示す。実施例３における検体９のエレクトロフェログラムを示す。実施例３における検体１０のエレクトロフェログラムを示す。実施例３における検体１１のエレクトロフェログラムを示す。実施例３における検体１２のエレクトロフェログラムを示す。実施例３における判定工程の効果を示すグラフである。

上記分離分析の具体的な方法としては、ヘモグロビンの分子表面電荷の多寡に基づいてその種類を分離することのできる方法であれば特に限定されず、たとえば、ＨＰＬＣ（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、高速液体クロマトグラフィー）法、あるいはキャピラリー電気泳動法が挙げられる。このうち、より簡便な測定システムによってより多数の検体を短時間で分析する観点からは、キャピラリー電気泳動法が適している。

ヘモグロビンの時間分布とは、ヘモグロビンを流路内で分離し、分離された各ヘモグロビンを流路上の特定の地点にある測定部位で検出した時間とシグナル強度を、横軸に時間、縦軸にシグナル強度を示すグラフに表したものである。横軸の時間は、ヘモグロビンが所定の距離を移動するために要した時間を示す。横軸の時間は、分離を開始した時点から、検体成分が流路の特定の地点にある測定部位で検出された時点までの時間ともいえる。ヘモグロビンの時間分布としては、たとえば、クロマトグラフィーから得られるクロマトグラム、キャピラリー電気泳動から得られるエレクトロフェログラムが含まれる。

たとえば、キャピラリー電気泳動法やイオン交換を原理としたＨＰＬＣ法の場合、ヘモグロビン分子表面の電荷の多寡に応じて移動速度が変動する。そのため、分離開始からそのヘモグロビン分子がキャピラリー管内又はカラム内を移動して特定の地点を通過するまでの経過時間、つまりそのヘモグロビン分子が所定の距離を移動するためにかかった時間は、そのヘモグロビン分子の分子表面電荷の多寡とみなすことができる。そして、泳動開始からの経過時間に応じたシグナル（たとえば、吸光度）の強度が、いくつかの山（ピーク）と谷（ボトム）とをもった曲線、すなわちエレクトロフェログラム又はクロマトグラムとして表現される。このエレクトロフェログラム又はクロマトグラムの形状を基にして、ヘモグロビンがいくつかの分画に分離される。たとえば、特定のピークを中心とした分画が、ヘモグロビンの特定の成分として同定される。

ヘモグロビンの時間分布の横軸は、分子表面電荷の多寡を示すものであればよい。そのため、上述のように所定の距離を移動するためにかかった時間の他に、各ヘモグロビン分子の移動速度であってもよく、特定の時間における移動距離であってもよい。ヘモグロビンの時間分布の縦軸は、ヘモグロビンの量を示すものであればよい。たとえば、ヘモグロビンの含有量そのものやヘモグロビンの濃度であってもよい。また、測定部位の検出器から出力されるシグナル強度であってもよく、吸光度や蛍光や発光強度といった光学的な測定値であってもよい。また、吸光度変化の単位時間当たりの変化量であってもよい。ヘモグロビンの吸収スペクトルを考慮すると、波長４１５ｎｍ又はその付近の吸光度を測定し、その吸光度を縦軸にすることが望ましい。このヘモグロビンの時間分布の形状から得られた分画のピーク面積やピークの高さは、分離されたそのヘモグロビン成分の量を示す。

分離分析で得られるヘモグロビンの時間分布から、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積が、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布のヘモグロビンを含む全ピーク面積に占める割合である第１の割合が、第１の閾値以上であるかどうかが判別する工程について説明する。

たとえばキャピラリー電気泳動のように、陽イオン交換を原理とする分離分析法で血液中のヘモグロビンを分離分析すると、正電荷量の少ないヘモグロビンから正電荷量の多いヘモグロビンの順に、各ヘモグロビンが検出される。具体的には、ＨｂＦを含む分画が検出され、その後、カルバミル化ＨｂＡ０、アルデヒド化ＨｂＡ０及び不安定型Ａ１ｃを含む分画が検出される。さらにその後、順に、安定型Ａ１ｃを含む分画、ＨｂＡ０を含む分画に隣接する分画、ＨｂＡ０を含む分画が検出される。ここで検出される安定型Ａ１ｃを含む分画は、カルバミル化又はアルデヒド化などの化学修飾がされずに残った安定型Ａ１ｃに由来する分画である。上述のように、カルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒド化ＨｂＡ０と不安定型Ａ１ｃは同じ分画に検出されるため、カルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒド化ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の大きさから、その検体がカルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒド化ＨｂＡ０を含んでいるのか、あるいは不安定型Ａ１ｃを含んでいるのか判断できない。一方、検体に含まれるヘモグロビンを人為的にカルバミル化又はアルデヒド化すると、カルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒド化ＨｂＡ０及び不安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積だけでなく、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積も増大する。そして、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画には、不安定型Ａ１ｃは含まれない。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンの時間分布のヘモグロビンを含む全ピーク面積に対する、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積の割合が第１の閾値以上であるかどうかを判断することで、分離分析した検体がカルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒドＨｂＡ０を多く含む検体であるのかどうかを適切に判別できる。

なお、不安定型Ａ１ｃが、カルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒド化ＨｂＡ０を含む分画と同じ分画に含まれるのは、カルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒド化ＨｂＡ０及び不安定型Ａ１ｃの分子表面電荷がそれぞれ近いからと考えられる。一方、不安定型Ａ１ｃが、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画に含まれる物質とは異なる分画に含まれるのは、不安定型Ａ１ｃの分子表面電荷は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画に含まれる物質の表面電荷と十分に異なることによると考えられる。また、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画は、ＨｂＡ０がカルバミル化又はアルデヒド化される際に、カルバミル化ＨｂＡ０又はアルデヒド化ＨｂＡ０とともに生成される物質を含む分画と考えられる。またこの物質は波長４１５ｎｍに対して吸光する性質を有する。このことから、この物質は何らかのヘモグロビン化合物であると推測される。

このＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷が多い側に存在する分画ともいえる。又は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接し、かつ、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷が多い側に存在する分画ともいえる。又は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、検出される時間が早い分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出される時間が遅い分画ともいえる。又は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、検出される時間が早く、かつ、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出される時間が遅い分画ともいえる。

血液に含まれる総ヘモグロビン量の大部分は、ＨｂＡ０量が占める。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積の値は近似する。よって、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積のいずれを用いて第１の割合を算出しても、適切に本発明を実施できる。

第１の閾値は、適宜設定することができる。上述したように、不安定型Ａ１ｃを多く含む検体であっても、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積は大きくならず、検体に含まれるＨｂＡ０のカルバミル化、アルデヒド化の程度を適切に示す。そこで、たとえば、カルバミル化又はアルデヒド化されていない検体、化学修飾の影響が無視できる検体、又は、健常者の検体を複数集めて分離分析し、そこから得られる第１の割合から第１の閾値を設定してもよい。たとえば、複数の検体から得られた第１の割合の最大値を第１の閾値としてもよいし、その最大値よりも大きい値を第１の割合にしてもよい。この分画がこのような大きい値以上である場合には、カルバミル化又はアルデヒド化の影響を確実に受けていると判断できる。換言すると、第１の割合がこのような大きい値である第１の閾値以上であれば、検体は、カルバミル化又はアルデヒド化の影響を確実に受けていると考えられる。一方、カルバミル化もアルデヒド化もされていない検体の第１の割合はこの第１の閾値以上となることはほとんどない。これにより、不安定型Ａ１ｃを多く含む検体を、カルバミル化ＨｂＡ０やアルデヒド化ＨｂＡ０を多く含む検体と誤って判断することを回避できる。そして、カルバミル化やアルデヒド化された影響を補正する必要がない検体を補正することを回避でき、適切に安定型Ａ１ｃの割合を測定できる。また、厳密な判別が求められていないのであれば、複数の検体から得られた第１の割合の最大値よりも小さい値を第１の閾値としてもよい。たとえば得られた第１の割合の平均値や中央値などを、この第１の閾値としてもよい。第１の閾値は、たとえば、４％以上であり、９％以上とすることが好ましい。

次に、第１の割合が第１の閾値以上である場合に、ヘモグロビンの時間分布における化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率を算出し、ヘモグロビンの時間分布におけるＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正して得た値が当該分画の測定値、すなわち、安定型Ａ１ｃを含む分画の測定値とされる。この測定値とは、全ヘモグロビン量に占める安定型Ａ１ｃの割合としての意義を有する値である。

この残存率は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合としてもよい。また、後述するように、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画から化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を算出する。そして、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と算出した化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合を残存率としてもよい。また、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合である修飾率を用いて残存率を算出してもよい。たとえば、１から修飾率を減じることで残存率を算出してもよい。修飾率は、化学修飾されていないＨｂＡ０と化学修飾されたＨｂＡ０の合計量に対する、化学修飾されたＨｂＡ０の量の割合ともいえる。

以下に修飾率の算出について説明する。血液に含まれる、化学修飾されていないＨｂＡ０量（なお、本開示において、単に「ＨｂＡ０」というときには、化学修飾されていないＨｂＡ０を意味する。）と化学修飾されたＨｂＡ０量との合計量の大部分は、ＨｂＡ０量が占める。そのため、ヘモグロビンの時間分布から得られる、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積との合計値の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。よって、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値とみなして、修飾率を算出してもよい。また、血液に含まれるヘモグロビンの大部分はＨｂＡ０が占める。そのため、ヘモグロビンの時間分布から得られるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。よって、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とみなして、修飾率を算出してもよい。また、同じ理由で、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積を、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値とみなして、修飾率を算出してもよい。また、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積から、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を算出し、修飾率を算出してもよい。

なお、本開示において、ヘモグロビンの時間分布の形状から得られた全ての分画のピーク面積を、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積としてもよい。

化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画である。また、ＨｂＦよりも正電荷量が多い側に存在する分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に存在し、かつ、ＨｂＦよりも正電荷量が多い側に存在する分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接し、かつ、ＨｂＦよりも正電荷量が多い側に存在する分画ともいえる。又は、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出される時間が早い分画である。また、ＨｂＦよりも検出される時間が遅い分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出時間が早く、かつ、ＨｂＦよりも検出時間が遅い分画ともいえる。この化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、ヘモグロビンがカルバミル化あるいはアルデヒド化したときに、増大する。

また、残存率や修飾率は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画を用いて算出してもよい。理由は定かではないが、上述したように、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積はヘモグロビンがカルバミル化あるいはアルデヒド化したときに、増大する。よって、例えば、健常者の検体を人為的にカルバミル化又はアルデヒド化し、その検体のＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積と、カルバミル化ＨｂＡ０及びアルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積の相関関係を予め求めておく。そして、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積に相関関係から得られた所定の係数で除することで、不安定型Ａ１ｃのピーク面積を含まないカルバミル化ＨｂＡ０及びアルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積補正値を算出する。そして、算出したカルバミル化ＨｂＡ０及びアルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積補正値から、残存率や修飾率を算出してもよい。

化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、そのままの数値として用いてもよいし、適宜の修正を加えた後の数値として用いてもよい。たとえば、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画に、化学修飾されたＨｂＡ０量以外の成分が含まれている場合、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から化学修飾されたＨｂＡ０以外の成分に由来するピーク面積を所定のピーク面積値として控除することが挙げられる。化学修飾されたＨｂＡ０以外の成分に由来するピーク面積が既知である場合、その既知のピーク面積を所定のピーク面積値として控除してもよい。また、複数の健常者の検体を分離分析し、化学修飾を被ったＨｂＡ０以外の成分のピーク面積の統計的な値を、検体の安定型Ａ１ｃの測定前に求めておく。そして、検体を測定時に化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積からこの値を所定のピーク面積値として控除してもよい。たとえば、この統計的な値は平均値や中央値などである。

ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積も、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画について上記で述べたのと同様に、そのままの数値として用いてもよいし、適宜の修正を加えた後の数値として用いてもよい。ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画に、ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成する物質以外の成分が含まれている場合も、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画について上記で述べたのと同様である。

次に、分離分析で得られたヘモグロビンの時間分布から、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する。この補正により得られた値が、前記したように、当該分画、すなわち安定型Ａ１ｃを含む分画の測定値とされる。

本明細書で述べるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とは、分離分析した検体に含まれる総ヘモグロビン量に相当するピーク面積の値とも言える。得られたヘモグロビンの時間分布においてヘモグロビンに由来する分画のピーク面積の合計値とも言える。なお、検体に含まれるヘモグロビン量の大部分は、ＨｂＡ０が占める。そのため、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積は、当該ＨｂＡ０分画のピーク面積と同じ値とみなして補正してもよい。また、ＨｂＡ０分画のピーク面積に加え、ヘモグロビンの時間分布の形状において隣接する分画のピーク面積を含んで算出された合計値を、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とみなして補正してもよい。

そして、安定型Ａ１ｃもまた、上記したＨｂＡ０が化学修飾された修飾率にて化学修飾を被っており、検体に含まれる安定型Ａ１ｃは化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃであるとの推定の下に、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する。換言すると、残存率を用いて、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積と化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の合計値の割合を算出する。この補正により、過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を算出する。

たとえば、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する方法は、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で除することとしてもよい。

ここで、第１の割合が第１の閾値未満である場合には、化学修飾の影響を受けていないか、あるいは無視できるほど小さいものとみなして、上記した残存率による補正は行わないこととしてもよい。この場合、上記した残存率による補正が行われていない、ヘモグロビンの時間分布におけるＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合が、当該分画の測定値とされる。この測定値の意義については前記したとおりである。また、あらかじめ、上記した残存率による補正をしていないピーク面積の割合と、残存率による補正をしたピーク面積の割合との両方を算出しておいて、第１の割合が第１の閾値以上であるかどうかを判別する工程を行い、第１の割合が第１の閾値未満である場合に、残存率で補正していないピーク面積の割合を前記した測定値としてもよい。

前記した、第１の割合が所定の第１の閾値以上であるかどうかを判別する工程に加えて、前記ヘモグロビンの時間分布から、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積がＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積に占める割合である第２の割合が、第２の閾値以上であるかどうかを判別する工程を有していてもよい。分離分析した検体の第１の割合が第１の閾値以上であり、安定型Ａ１ｃ分画に対して正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積の大きさも一定以上であることを判別することで、その検体は化学修飾されたＨｂＡ０を含むことがさらに適切に判断できる。換言すると、第１の割合が第１の閾値以上であり、第２の割合が第２の閾値以上の検体であれば、その検体は、カルバミル化又はアルデヒド化の影響を確実に受けていると考えられる。そして第１の割合が第１の閾値以上であり、第２の割合が第２の閾値以上である場合に、上記した残存率で補正した割合を前記した測定値としてもよい。第２の割合が第２の閾値以上であるかどうかを判別する工程は、第１の割合が第１の閾値以上であるかどうかを判別する工程に先立って、又はその後に実行されることとしてもよい。

第２の閾値は、たとえば、カルバミル化又はアルデヒド化されておらず、不安定型Ａ１ｃ量が通常と思われる検体を複数集めて分離分析し、そこから得られる第２の割合の最大値としてもよい。また、たとえば、複数の検体から得られた第２の割合の最大値よりも大きい値を第２の閾値にしてもよい。また、判別に高い精度が求められていない場合は、複数の検体から得られた第２の割合の平均値や中央値といった任意の値を第２の閾値としてもよい。この第２の閾値は、たとえば、総ヘモグロビン量に対し３％以上とすることができる。

そして、第１の割合が第１の閾値以上であっても、第２の割合がこの第２の閾値未満である検体は、化学修飾されたＨｂＡ０を含んでいない、又はほとんど含まれていないと解される。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布のヘモグロビンを含む全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を、前記した残存率で補正した割合を前記した測定値とはしない。そして、前記した残存率で補正していないＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合が前記した測定値とされる。

一方、第１の割合が第１の閾値以上で、第２の割合がこの第２の閾値以上である場合には、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を、前記したように残存率で補正して得た値を前記した測定値とする。

［分析システム］
図１は、本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法が実施される分析システムＡ１の一例の概略構成を示している。分析システムＡ１は、分析装置１及び分析チップ２を備えて構成されている。分析システムＡ１は、人体から採取された血液である試料Ｓａを対象として血中ヘモグロビンの分子表面電荷に基づいて、陽イオン交換を原理とするヘモグロビンの分離分析を実行するシステムである。以下、分子表面の正電荷量の違いを利用した電気泳動を原理とする分析システムを用いて本発明を説明するが、本発明は、電気泳動を原理とする分離分析に限定されない。

＜分析チップの準備＞
分析チップ２は、試料Ｓａを保持し、かつ分析装置１に装填された状態で試料Ｓａを対象とした分析の場を提供するものである。本実施形態においては、分析チップ２は、１回の分析を終えた後に廃棄されることが意図された、いわゆるディスポーザブルタイプの分析チップとして構成されている。図２及び図３に示すように、分析チップ２は、本体２１、混合槽２２、導入槽２３、フィルタ２４、排出槽２５、電極槽２６、キャピラリー管２７及び連絡流路２８を備えている。図２は、分析チップ２の平面図であり、図３は、図２のＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿う断面図である。なお、分析チップ２は、ディスポーザブルタイプのものに限定されず、複数回の分析に用いられるものであってもよい。また、本実施形態の分析システムは、別体の分析チップ２を分析装置１に装填する構成に限定されず、分析チップ２と同様の機能を果たす機能部位が分析装置１に一体に組み込まれた構成であってもよい。

本体２１は、分析チップ２の土台となるものであり、その材質は特に限定されず、たとえば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等があげられる。本実施形態においては、本体２１は、図３における上側部分２Ａと下側部分２Ｂとが別体に形成されており、これらが互いに結合された構成である。なお、これに限らず、たとえば、本体２１を一体的に形成してもよい。

混合槽２２は、後述する試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する混合工程が行われる箇所の一例である。混合槽２２は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。導入槽２３は、混合槽２２における混合工程によって得られた試料溶液としての混合試料Ｓｍが導入される槽である。導入槽２３は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。

フィルタ２４は、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられている。フィルタ２４の具体的構成は限定されず、好適な例として、たとえばセルロースアセテート膜フィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．４５μｍ）が挙げられる。

排出槽２５は、電気泳動法における電気浸透流の下流側に位置する槽である。排出槽２５は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって，上方に開口した凹部として構成されている。電極槽２６は、電気泳動法による分析工程において、電極３１が挿入される槽である。電極槽２６は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。連絡流路２８は、導入槽２３と電極槽２６とを繋いでおり、導入槽２３と電極槽２６との導通経路を構成している。

キャピラリー管２７は、導入槽２３と排出槽２５とを繋ぐ微細流路であり、電気泳動法における電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃｆｌｏｗ）が生じる場である。キャピラリー管２７は、たとえば本体２１の上記下側部分２Ｂに形成された溝として構成されている。なお、本体２１には、キャピラリー管２７への光の照射及びキャピラリー管２７を透過した光の出射を促進するための凹部等が適宜形成されていてもよい。キャピラリー管２７のサイズは特に限定されないが、その一例を挙げると、その幅が２５μｍ～１００μｍ、その深さが２５μｍ～１００μｍ、その長さが５ｍｍ～１５０ｍｍである。分析チップ２全体のサイズは、キャピラリー管２７のサイズ及び混合槽２２、導入槽２３、排出槽２５及び電極槽２６のサイズや配置等に応じて適宜設定される。

なお、上記構成の分析チップ２は一例であって、電気泳動法による分析が可能な構成の分析チップを適宜採用することができる。

＜分析装置＞
分析装置１は、試料Ｓａが点着された分析チップ２が装填された状態で、試料Ｓａを対象とした分析処理を行う。分析装置１は、図１に示すように、電極３１，３２、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３、スリット４４、検出器５、分注器６、ポンプ６１、希釈液槽７１、泳動液槽７２及び制御部８を備えている。なお、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３及び検出器５は、本発明でいう測定部の一例を構成する。

電極３１及び電極３２は、電気泳動法においてキャピラリー管２７に所定の電圧を印加するためのものである。電極３１は、分析チップ２の電極槽２６に挿入されるものであり、電極３２は、分析チップ２の排出槽２５に挿入されるものである。電極３１及び電極３２に印加される電圧は特に限定されないが、たとえば０．５ｋＶ～２０ｋＶである。

光源４１は、電気泳動法において光学測定値としての吸光度を測定するための光を発する部位である。光源４１は、たとえば所定の波長域の光を出射するＬＥＤチップを具備する。光学フィルタ４２は、光源４１からの光のうち所定の波長の光を減衰させつつ、その余の波長の光を透過させるものである。レンズ４３は、光学フィルタ４２を透過した光を分析チップ２のキャピラリー管２７の分析箇所へと集光するためのものである。スリット４４は、レンズ４３によって集光された光のうち、散乱などを引き起こしうる余分な光を除去するためのものである。

検出器５は、分析チップ２のキャピラリー管２７を透過してきた光源４１からの光を受光するものであり、たとえばフォトダイオードやフォトＩＣなどを具備して構成されている。

このように、光源４１から発した光が検出器５へと至る経路が光路である。そして、当該光路がキャピラリー管２７と交わる位置でそのキャピラリー管２７を流れる溶液（すなわち、試料溶液及び泳動液のいずれか又はその混合溶液）について光学測定値が測定される。すなわち、キャピラリー管２７において光源４１から検出器５へ至る光路が交わる位置が、光学測定値の測定部である。この光学測定値としては、たとえば吸光度が挙げられる。吸光度は、該光路の光がキャピラリー管２７を流れる溶液によって吸収された度合いを表すものであり、入射光強度と透過光強度の比の常用対数の値の絶対値を表したものである。この場合、検出器５としては汎用的な分光光度計を利用することができる。なお、吸光度を使用せずとも、単純に透過光強度の値そのものなど、光学測定値であれば本発明に利用することができる。以下においては、光学測定値として吸光度を使用した場合を例に説明する。

分注器６は、所望の量の希釈液Ｌｄや泳動液Ｌｍ及び混合試料Ｓｍを分注するものであり、たとえばノズルを含む。分注器６は図示しない駆動機構によって分析装置１内の複数の所定位置を自在に移動可能である。ポンプ６１は、分注器６への吸引源及び吐出源である。また、ポンプ６１は、分析装置１に設けられた図示しないポートの吸引源及び吐出源として用いてもよい。これらのポートは、泳動液Ｌｍの充填などに用いられる。また、ポンプ６１とは別の専用のポンプを備えてもよい。

希釈液槽７１は、希釈液Ｌｄを貯蔵するための槽である。希釈液槽７１は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の希釈液Ｌｄが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。泳動液槽７２は、泳動液Ｌｍを貯蔵するための槽である。泳動液槽７２は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の泳動液Ｌｍが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。

制御部８は、分析装置１における各部を制御するものである。制御部８は、図４のハードウェア構成に示すように、ＣＰＵ（ＣｅｎｔｒａｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＵｎｉｔ）８１、ＲＯＭ（ＲｅａｄＯｎｌｙＭｅｍｏｒｙ）８２、ＲＡＭ（ＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓＭｅｍｏｒｙ）８３及びストレージ８４を有する。各構成は、バス８９を介して相互に通信可能に接続されている。

ＣＰＵ８１は、中央演算処理ユニットであり、各種プログラムを実行したり、各部を制御したりする。すなわち、ＣＰＵ８１は、ＲＯＭ８２又はストレージ８４からプログラムを読み出し、ＲＡＭ８３を作業領域としてプログラムを実行する。ＣＰＵ８１は、ＲＯＭ８２又はストレージ８４に記録されているプログラムに従って、上記各構成の制御及び各種の演算処理を行う。

ＲＯＭ８２は、各種プログラム及び各種データを格納する。ＲＡＭ８３は、作業領域として一時的にプログラム又はデータを記憶する。ストレージ８４は、ＨＤＤ（ＨａｒｄＤｉｓｋＤｒｉｖｅ）、ＳＳＤ（ＳｏｌｉｄＳｔａｔｅＤｒｉｖｅ）又はフラッシュメモリにより構成され、オペレーティングシステムを含む各種プログラム、及び各種データを格納する。本態様では、ＲＯＭ８２又はストレージ８４には、測定や判定に関するプログラムや各種データが格納されている。また、ストレージ８４には、測定データを保存しておくこともできる。

制御部８は、上記ハードウェア構成のうちＣＰＵ８１が、前記したプログラムを実行することによって、分析装置１において図５に示すような各工程を実施する。これらの工程の詳細については後述する。

＜希釈液、泳動液、混合試料の調製＞
希釈液Ｌｄは、試料Ｓａと混合されることにより、試料溶液としての混合試料Ｓｍを生成するためのものである。希釈液Ｌｄの主剤は特に限定されず、水、生理食塩水が挙げられ、好ましい例として後述する泳動液Ｌｍと類似の成分の液体が挙げられる。また、希釈液Ｌｄは、上記主剤の他に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。

泳動液Ｌｍは、電気泳動法による分析工程において、排出槽２５及びキャピラリー管２７に充填され、電気泳動法における電気浸透流を生じさせる媒体である。泳動液Ｌｍは、特に制限されないが、酸を用いたものが望ましい。上記酸は、たとえば、クエン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸がある。また、泳動液Ｌｍは、弱塩基を含むことが好ましい。上記弱塩基としては、たとえば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等がある。泳動液ＬｍのｐＨは、たとえば、ｐＨ４．５～６の範囲である。泳動液Ｌｍのバッファーの種類は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等がある。また、泳動液Ｌｍにも、希釈液Ｌｄの説明で述べたのと同様に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。

泳動液Ｌｍ、希釈液Ｌｄ、及び混合試料Ｓｍは以下を例示するが、後述する界面到達時点において、試料溶液（混合試料Ｓｍ）と泳動液Ｌｍとの界面の到達に起因する光学測定値の変化が生じる組み合わせであれば任意に選択できる。

＜準備工程、電気泳動工程、分析工程＞
次に、分析システムＡ１を用いて行うヘモグロビンの分離分析の一例について、以下に説明する。図５は、本実施形態におけるヘモグロビンの分離分析方法を示すフロー図である。本分離分析方法は、準備工程Ｓ１、電気泳動工程Ｓ２、及び分析工程Ｓ３を有する。

＜準備工程Ｓ１＞
図６は、準備工程Ｓ１における具体的な手順を示すフロー図である。本実施形態において、準備工程Ｓ１は、同図に示すように、試料採取工程Ｓ１１、混合工程Ｓ１２、泳動液充填工程Ｓ１３、及び導入工程Ｓ１４を有する。

＜試料採取工程Ｓ１１＞
まず、試料Ｓａを用意する。本実施形態においては、試料Ｓａは、人体から採取された血液である。血液としては、全血、成分分離血液又は溶血処理が施されたもの等であってもよい。そして、試料Ｓａが分注された分析チップ２を分析装置１に装填する。

＜混合工程Ｓ１２＞
次いで、試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する。具体的には、図７に示すように、所定量の試料Ｓａが分析チップ２の混合槽２２に点着されている。次いで、分注器６によって希釈液槽７１の希釈液Ｌｄを所定量吸引し、図８に示すように、所定量の希釈液Ｌｄを分析チップ２の混合槽２２に分注する。そして、ポンプ６１を吸引源及び吐出源として、分注器６から希釈液Ｌｄの吸引及び吐出を繰り返す。これにより、混合槽２２において試料Ｓａと希釈液Ｌｄとが混合され、試料溶液としての混合試料Ｓｍが得られる。試料Ｓａと希釈液Ｌｄとの混合は、分注器６の吸引及び吐出以外の方法によって行ってもよい。

＜泳動液充填工程Ｓ１３＞
次いで、分注器６によって泳動液槽７２の泳動液Ｌｍを所定量吸引し、図９に示すように、所定量の泳動液Ｌｍを分析チップ２の排出槽２５に分注する。そして、上述したポートで排出槽２５の上方の開口を覆い、ポートから排出槽２５内部に空気を吐出や吸引を適宜実施するなどの手法により、排出槽２５及びキャピラリー管２７に泳動液Ｌｍを充填する。

＜導入工程Ｓ１４＞
次いで、図１０に示すように、混合槽２２から所定量の混合試料Ｓｍを分注器６によって採取する。そして、分注器６から導入槽２３に所定量の混合試料Ｓｍを導入する。この導入においては、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられたフィルタ２４を混合試料Ｓｍが通過する。また、本実施形態においては、混合試料Ｓｍが導入槽２３から連絡流路２８を通じて電極槽２６へと充填される。この際、導入槽２３から連絡流路２８を介した電極槽２６への混合試料Ｓｍの流動が起こることとなるが、導入槽２３から連絡流路２８へは、キャピラリー管２７の長手方向に対してほぼ直交する方向へ混合試料Ｓｍが流動する（図２参照）。一方、キャピラリー管２７の泳動液Ｌｍはこの段階ではほとんど移動していない。この結果、導入槽２３とキャピラリー管２７との接続部（図３参照）においてせん断流が生じることで、混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの明瞭な界面が生じた状態となる。なお、混合溶液Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が生じる方法であれば、物理的に導入槽２３とキャピラリー管２７との境界に移動可能なフィルタを設けたり、制御的に流動方法を変更したりする等、あらゆる手段を採用することができる。

＜電気泳動工程Ｓ２＞
次いで、電極槽２６（図２参照）に電極３１（図１参照）を挿入し、排出槽２５に電極３２（図１参照）を挿入する。続いて、制御部８からの指示により電極３１及び電極３２に電圧を印加する。この電圧は、たとえば０．５ｋＶ～２０ｋＶである。これにより電気浸透流を生じさせ、導入槽２３から排出槽２５へとキャピラリー管２７中において混合試料Ｓｍを徐々に移動させる。この際、導入槽２３に混合試料Ｓｍが充填されているため、キャピラリー管２７において混合試料Ｓｍが連続的に供給されている状態で、上記分析成分であるヘモグロビン（Ｈｂ）を電気泳動させることとなる。このとき、混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの上記した界面が維持された状態のまま、混合試料Ｓｍは泳動液Ｌｍを下流方向へ押しやりつつキャピラリー管２７を泳動していくことになる。また、光源４１からの発光を開始し、検出器５による吸光度の測定を行う。そして、電極３１及び電極３２からの電圧印加開始時からの経過時間と吸光度との関係を測定する。

＜分析工程Ｓ３＞
ここで、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的速い成分（換言すると、分子表面の正電荷量が比較的少ない成分）に対応した吸光度ピークは、上記電圧印加開始時からの経過時間が比較的短い時点で現れる。一方、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的遅い成分（換言すると、分子表面の正電荷量が比較的多い成分）に対応した吸光度ピークは、上記電圧印加開始時からの経過時間が比較的長い時点で現れる。このことを利用して、混合試料Ｓｍ中の成分の分析（分離測定）が行われる。測定された吸光度を基に、制御部８の制御によって、図１１Ａに示す分析工程Ｓ３が実行される。本実施形態の分析工程Ｓ３は、波形形成工程Ｓ３１、界面到達時点決定工程Ｓ３２及び成分同定工程Ｓ３３を含む。

＜波形形成工程Ｓ３１＞
本工程においては、測定された上記吸光度を制御部８による演算処理により、エレクトロフェログラムを作成する。ここで、電圧印加開始時を測定開始時として、当該測定開始後の経過時間に対応した光学測定値の変化を表す吸光度に関する測定波形としてのエレクトロフェログラムが形成される。具体的には、測定された上記吸光度を時間微分することによって微分値の波形を形成する。図１２は、吸光度の時間微分によって形成された微分波形の一例を示している。図中のｘ軸は時間軸であり、ｙ軸は微分値軸である。以降の図及び説明においては、時間軸ｘに沿った負方向側を方向ｘ１側及び正方向側を方向ｘ２側とし、微分値軸ｙに沿った負方向側を方向ｙ１側及び正方向側を方向ｙ２側とする。

＜界面到達時点決定工程Ｓ３２＞
本工程においては、電圧印加によりキャピラリー管の下流方向に泳動する混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が検出器５に到達した時点である界面到達時点を決定する工程である。この混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面は、電気泳動開始後に最初に現れるピークである。この混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面のピークを図１３に示す。図１３に示すように、この混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が示すピークのうち、このエレクトロフェログラムにおける基準値Ｌｓから微分値が最も離間している点を決定する。図示された例においては、基準値Ｌｓから方向ｙ２に離間した点が基準値Ｌｓから最も離間しており、この点が最離間点ＰＬとして決定される。ここで、前記した電気泳動工程Ｓ２において電圧の印加を開始した時点を０として、この最離間点ＰＬが検出された時点を界面到達時点とする。

＜成分同定工程Ｓ３３＞
前記した波形形成工程Ｓ３１において得られる、界面到達時点以後の微分波形の一例を、図１４に示す。同図においては、ｘ軸は電圧の印加を開始した時点を０とした泳動時間（単位：ｓｅｃ）を示し、ｙ軸は吸光度を時間微分した値であるＳＬＯＰＥ値（単位：ｍＡｂｓ／ｓｅｃ）を示している。また、泳動時間１１．５秒付近のピークは、図１３に示す最離間点ＰＬであり、この時点が界面到達時点である。そして、本工程において、この微分波形からヘモグロビン成分が特定される。具体的には、界面到達時点以降で最大となるピークを有する分画αがＨｂＡ０と特定される。そして、界面到達時点からＨｂＡ０のピークまでに出現する各ピークについては、界面到達時点からＨｂＡ０のピークが検出された時間までの間の時間に対する、界面到達時点から当該ピークの検出時間までの時間の比率によって当該ピークが示す成分を同定した。たとえば、図１４においては、安定型Ａ１ｃ（Ｓ－Ａ１ｃ）を示すピーク（分画β）がこのようにして同定される。

そして、このようにして同定された各ピークから、各成分の量が算出される。具体的には、ある成分として同定されたピークを極大値として、その極大値を含む分画の面積を当該ピークに対応する成分の量とすることができる。ここで、その分画の両端は適宜定めることができ、たとえば、その極大値の両側にある極小値をもってその両端としてもよい。

このようにして、Ｓ３３１に示す総ヘモグロビン算出工程において、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積を算出する。ここで、ＨｂＡ０量は総ヘモグロビン量の大部分を占めている。そのため、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積は、ＨｂＡ０分画のみで算出した面積であってもよく、また、ＨｂＡ０分画とその周辺の分画を含む面積に準拠してもよく、さらには、エレクトロフェログラムのうちヘモグロビンに帰せられる領域の全ての面積としてもよい。いずれの場合も、後述する補正前値（Ｘ）及び補正後値（Ｙ）の計算には大きな影響は及ぼさない。

次に、Ｓ３３２に示す補正前値算出工程において、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を算出することで、補正前値（Ｘ）が算出される。この補正前値（Ｘ）の算出に用いる安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積は、図１４に示すＳ－Ａ１ｃピークの両端にある極小値間の分画βの面積として求められる。つまり、この安定型Ａ１ｃを含む分画βのピーク面積は、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃに由来するピーク面積である。そのため補正前値（Ｘ）は、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合である。換言すると、化学修飾された安定型Ａ１ｃを加味していないピーク面積の割合ともいえる。

次に、Ｓ３３３に示す判別工程において、上記で算出された補正前値（Ｘ）の補正を行うかどうかが判別される。すなわち、まず、図１１ＢのＳ３３３ａの工程において、第２の割合が第２の閾値以上であるかが判断される。具体的には、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃの分画に対して早い時間の側に隣接する分画、換言すると、正電荷量が少ない側に隣接する、泳動時間１９秒付近の分画γのピーク面積の割合が、第２の閾値以上であるかどうかが判別される。第２の割合が第２の閾値以上であると判断された場合は、Ｓ３３３ｂに示す工程へ進む。一方、第２の割合が第２の閾値未満であると判断された場合は、Ｓ３３３ｃに示す工程へ進んで、補正前値（Ｘ）を安定型Ａ１ｃの分画の測定値として、分析工程Ｓ３は終了する。

次に、Ｓ３３３に示す判別工程のＳ３３３ｂの工程において、第１の割合が第１の閾値以上であるかが判断される。具体的には、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積に対する、ＨｂＡ０分画に対して早い時間の側に隣接する分画、換言すると、正電荷量が少ない側に隣接する、泳動時間２５秒付近の分画δのピーク面積の割合が、第１の閾値以上であるかどうかが判別される。第１の割合が第１の閾値以上であると判断された場合は、再び図１１Ａに戻り、Ｓ３３４に示す工程へ進む。一方、第１の割合が第１の閾値未満であると判断された場合は、Ｓ３３３ｃに示す工程へ進んで、補正前値（Ｘ）を安定型Ａ１ｃの分画の測定値として、分析工程Ｓ３は終了する。

次に、Ｓ３３４に示す残存率算出工程において、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する化学修飾されたＨｂＡ０を含むピーク面積の割合である修飾率（Ｐ）が算出される。そして、この修飾率（Ｐ）から、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対するＨｂＡ０の割合である残存率（Ｑ）が算出される。

具体的には、安定型Ａ１ｃの分画に対して早い時間の側に隣接する分画、換言すると、正電荷量が少ない側に隣接する、泳動時間１９秒付近の分画γには、後述の実施例で示すように、カルバミル化したＨｂＡ０及びアルデヒド化したＨｂＡ０のいずれか又は両方が含まれていると考えられる。残存率算出工程Ｓ３３４においては、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対するこの分画γの割合を、修飾率（Ｐ）とする。なお、上述のように、分画γのピーク面積とＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積に対する分画γのピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。また、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、検体に含まれる総ヘモグロビンに相当するピーク面積と近似することから、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γのピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。

一方、ＨｂＡ０分画に対して早い時間の側に隣接する分画、換言すると、正電荷量が少ない側に隣接する、泳動時間２５秒付近の分画δには、ＨｂＡ０がカルバミル化又はアルデヒド化される際に化学修飾したＨｂＡ０とともに生成する物質が含まれていると考えられる。残存率算出工程Ｓ３３４においては、上述したように、この分画δのピーク面積から化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を算出し、修飾率（Ｐ）を算出してもよい。具体的には、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する、分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合を算出して、修飾率（Ｐ）を算出してもよい。なお、上述のように、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積とＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積に対する分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０のピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。また、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、検体に含まれる総ヘモグロビンに相当するピーク面積と近似することから、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０のピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。

そして、１から算出された修飾率（Ｐ）を減じることで残存率（Ｑ）を算出する。なお、残存率（Ｑ）の算出は、この算出方法に限定されるものではない。

そして、Ｓ３３５に示す補正後値算出工程において、上記で算出された補正前値（Ｘ）及び残存率（Ｑ）から、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積と化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の合計値の割合である補正後値（Ｙ）が算出される。具体的には、補正前値（Ｘ）を残存率（Ｑ）で除することによって補正後値（Ｙ）が算出される。

＜カルバミル化の影響＞
実施例１として、通常検体に人為的にシアン酸ナトリウムを添加し、ヘモグロビンをカルバミル化した検体において、本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法が有効であることを示す。

［カルバミル化検体の調製］
通常検体として、健常者から採取した全血を使用した。この通常検体に、下記表１に示すような終濃度となるようシアン酸ナトリウムを添加して３７℃でインキュベートした検体１～検体４を調整し、これらをそれぞれ前記した試料Ｓａ（図７参照）として使用した。

なお、上記表１中の検体１のシアン酸ナトリウム濃度は０ｍｇ／ｄＬであるが、これはシアン酸ナトリウムを添加していない、通常検体そのままであることを意味する。

［泳動液］
前記した泳動液Ｌｍ（図９参照）は、以下の組成とした。
クエン酸：４０ｍＭ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム：１．２５％ｗ／ｖ
ピペラジン：２０ｍＭ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（商品名：エマルゲンＬＳ－１１０、花王社製）：０．１％ｗ／ｖ
アジ化ナトリウム：０．０２％ｗ／ｖ
プロクリン３００：０．０２５％ｗ／ｖ
以上の成分の他、ｐＨ調整用のジメチルアミノエタノールを滴下して、ｐＨ５．０に調整した。

［希釈液］
前記した希釈液Ｌｄ（図８参照）は、以下の組成とした。
クエン酸：３８ｍＭ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム：０．９５％ｗ／ｖ
１－（３－スルホプロピル）ピリジニウムヒドロキシド分子内塩（ＮＤＳＢ－２０１）：４７５ｍＭ
２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）：１９ｍＭ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（商品名：エマルゲンＬＳ－１１０、花王社製）：０．４％ｗ／ｖ
アジ化ナトリウム：０．０２％ｗ／ｖ
プロクリン３０００．０２５％ｗ／ｖ
以上の成分の他、ｐＨ調整用のジメチルアミノエタノールを滴下して、ｐＨ６．０に調整した。

［混合試料Ｓｍ］
１．５μＬの試料Ｓａを６０μＬの希釈液Ｌｄに添加して、混合試料Ｓｍ（図８～図１０参照）を作成した。この混合試料Ｓｍを前記した分析システムＡ１に供して、ヘモグロビンの分離分析を実行した。

［エレクトロフェログラム］
電圧を印加した時点を分離分析の開始の時点とし、電圧を印加した時点を０秒の時点としたエレクトロフェログラムを得た。シアン酸ナトリウムが添加されていない検体１のエレクトロフェログラムは、図１５に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は泳動時間１１．５秒付近である。また、ＨｂＦ分画である分画εは泳動時間１７．３秒付近にピークを有する。安定型Ａ１ｃ分画である分画βは泳動時間２１秒付近にピークを有する。ＨｂＡ０分画である分画αは泳動時間２７．３秒付近にピークを有する。そして、分画βより早い泳動時間１９秒付近（１９．４秒）にピークを有する分画γは、不安定型Ａ１ｃを含む分画とされているが、この分画にはカルバミル化を被ったＨｂＡ０も含まれる。また、分画αより早い泳動時間２５秒付近（２５．２秒）にピークを有する分画δには、ＨｂＡ０がカルバミル化される際にカルバミル化ＨｂＡ０と共に生成される物質が含まれる。

シアン酸ナトリウムが１２．５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体２のエレクトロフェログラムは、図１６に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は検体１とほぼ変わらないが、分画ε、分画γ、分画β、分画δ及び分画αのピークはそれぞれ泳動時間１６．７秒、１９．０秒、２０．０秒、２３．８秒及び２５．６秒に観察されている。そして、分画γ及び分画δの面積は検体１より増大している。

シアン酸ナトリウムが１８．８ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体３のエレクトロフェログラムは、図１７に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は検体１及び検体２とほぼ変わらないが、分画ε、分画γ、分画β、分画δ及び分画αのピークはそれぞれ泳動時間１６．９秒、１８．５秒、１９．６秒、２３．５秒及び２５．４秒と、検体２とほぼ同じ時間に観察されている。そして、分画γ及び分画δの面積は検体２よりもさらに増大している。

シアン酸ナトリウムが２５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体４のエレクトロフェログラムは、図１８に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は検体１から検体３とほぼ変わらず、分画ε、分画γ、分画β、分画δ及び分画αのピークが観察される泳動時間もほぼ検体３と同じであるが、分画γ及び分画δの面積は検体３よりもさらに増大している。なお、検体１、検体２、検体３、検体４でそれぞれの分画が観察される時間が検体によって異なっているが、本実施例での安定型Ａ１ｃの測定には影響しない。

［補正前値（Ｘ）の算出］
図１５～図１８における分画βから、安定型Ａ１ｃのピーク面積の割合としての補正前値（Ｘ）は、下記表２に示すとおりに算出された。

上記表中の補正前値（Ｘ）の算出に当たっては、まず、各エレクトロフェログラムにおけるＳＬＯＰＥ値が０以上の部分の面積（ただし、ＰＬをピークとする部分を除く）の総和が算出され、これをヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とした。このヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積は、分画αとして同定されるＨｂＡ０のピーク面積を含む。そして、このヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画βのピーク面積の割合から上記表中の補正前値（Ｘ）を算出した。

上記表２に示すとおり、検体中のシアン酸ナトリウム濃度が高くなるにつれ、補正前値（Ｘ）が低くなっていくことが認められる。また検体１の補正前値（Ｘ）に対する増減の割合（すなわち、各検体の補正前値（Ｘ）から検体１の補正前値（Ｘ）である６．４８％を減じた値の、検体１の補正前値（Ｘ）に対する割合）を示す相対誤差の値も、シアン酸ナトリウム濃度の増大に伴い、大きくなった。これは、安定型Ａ１ｃ量が、シアン酸ナトリウムによるカルバミル化を被ることで減少していくことを示している。

［第１の割合及び第２の割合］
ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃとして同定される分画βに対し、正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画γの割合である第２の割合は下記表３に示すとおりであった。また、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、ＨｂＡ０として同定される分画αに対し、正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画δから算出される第１の割合も、下記表３に示すとおりであった。

すなわち、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合である第２の割合は、検体１で２．９％、検体２で６．１％、検体３で８．１％、及び検体４で９．６％であった。また、分画δの面積の割合である第１の割合は、検体１で４．５％、検体２で９．３％、検体３で１１．８％、及び検体４で１６．１％であった。

［補正の必要性の判定］
上記表３中の第１の割合が、第１の閾値以上であるかどうかを判断した。第１の閾値は、例として、カルバミル化やアルデヒド化の影響を被っていないと考えられる検体で通常観察される分画δのピーク面積の最大値を上回る値である９％を用いた。同様に、第２の割合が、第２の閾値以上であるかどうかを判断した。第２の閾値は、例として、カルバミル化又はアルデヒド化されておらず、不安定型Ａ１ｃ量が通常と思われる検体、つまり健常者の検体でこの泳動速度で通常観察される分画γのピーク面積の最大値を上回る値である５％を用いた。

まず、検体２～４については、いずれも第１の割合は第１の閾値である９％以上であった。さらに第２の割合も第２の閾値である５％以上であった。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記エレクトロフェログラムの全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正すると判断された。一方、検体１については、第２の割合は第２の閾値である５％未満であり、また、第１の割合は第１の閾値である９％未満であった。そのため、上述の補正はしないと判断された。なお、本実施例では、第１の割合が第１の閾値以上であり、かつ、第２の割合が第２の閾値以上であるかを判断している。しかし、第１の割合が第１の閾値以上であるかのみを判断して、補正をするかどうかを判断してもよい。

［分画γによる補正］
次に、安定型Ａ１ｃとして同定される分画βに対し、正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画γを用いて、下記表３に示すように、上記表２の補正前値（Ｘ）の補正を行った。

ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合を、上記表３中の左端列に挙げており、具体的には、検体１で２．９％、検体２で６．１％、検体３で８．１％、及び検体４で９．６％であった。

検体１では、表３に示すように、第１の割合は第１の閾値未満であり、また、第２の割合は第２の閾値未満であった。よって、残存率（Ｑ）による補正はせずに、補正前値（Ｘ）を安定型Ａ１ｃ分画の測定値とした。なお、検体２から検体４の補正後値（Ｙ）と相対誤差を比較する便宜上、表４の補正後値（Ｙ）欄に補正前値（Ｘ）である６．４８％を示す。

一方、検体２～４では、表３に示すように、第１の割合は第１の閾値以上であり、かつ、第２の割合は第２の閾値以上であった。そこでまず、カルバミル化やアルデヒド化の影響を被っておらず、不安定型Ａ１ｃ量が通常量と考えられる健常者の検体が通常有する分画γのピーク面積として、複数の健常者の分画γのピーク面積の平均的な値である３％を所定のピーク面積値として、分画γのピーク面積から控除した。この値が上記表４中の修飾率（Ｐ）である。この値を１から減じた値が上記表中の残存率（Ｑ、ただし百分率で表示）であり、この割合で残存した安定型Ａ１ｃが、前記した表２中の補正前値（Ｘ）、すなわち分画βとしてエレクトロフェログラムに現れていると考えられる。よって、補正前値（Ｘ）をこの残存率（Ｑ）で除した値である、上記表４中の補正後値（Ｙ）が、真の安定型Ａ１ｃ量と考えられ、この補正後値（Ｙ）を安定型Ａ１ｃ分画の測定値とした。ここで、前記表２から、補正前値（Ｘ）に基づく相対誤差の絶対値は、検体４で最大の６．５％であったところ、上記表３から、補正後値（Ｙ）に基づく相対誤差（すなわち、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体１の補正前値（Ｘ）（表２参照）を減じた値の、検体１の補正前値（Ｘ）に対する割合）の絶対値は、検体３で最大の１．８％であった。そのため、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定した場合に補正を行うことで、化学修飾されることによって生じる相対誤差の幅は小さくなった。

よって、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定した場合に分画γを用いた補正をすることによって、カルバミル化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

［分画δによる補正］
次に、ＨｂＡ０として同定される分画αに対し、正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画δを用いて、下記表５に示すように、上記表２の補正前値（Ｘ）の補正を行った。

ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画δの面積の割合を、上記表５中の左端列に挙げており、具体的には、検体１で４．５％、検体２で９．３％、検体３で１１．８％、及び検体４で１６．１％であった。

ここで、上記したように、検体１では、表３に示すように、第１の割合は第１の閾値未満であり、また、第２の割合は第２の閾値未満であった。よって、残存率（Ｑ）による補正はしなかった。検体１の補正前値（Ｘ）を補正しなかったが、検体２から検体４の補正後値（Ｙ）と相対誤差を比較する便宜上、表５の補正後値（Ｙ）欄に補正前値（Ｘ）の６．４８％を示す。

一方、検体２～４では、表３に示すように、第１の割合は第１の閾値以上であり、かつ、第２の割合は第２の閾値以上であった。そこでまず、カルバミル化やアルデヒド化の影響を被っていないと考えられる健常者の検体において通常観察される分画δのピーク面積として、複数の健常者の分画δのピーク面積の平均的な値である４％を所定のピーク面積値として、分画δのピーク面積から控除した。そして、ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成される物質のピーク面積は、カルバミル化ＨｂＡ０のピーク面積である分画γの約１．６５倍を示す。このことから分画δから所定のピーク面積値としての４％が控除された値をこの１．６５という所定の係数で除した値をヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対するカルバミル化ＨｂＡ０のピーク面積の割合とみなし、これを修飾率（Ｐ）とした。この他、残存率（Ｑ）、補正後値（Ｙ）及び相対誤差の算出は表４と同様である。ただし、表５中の補正後値（Ｙ）は、前記表２中の補正前値（Ｘ）を表５中の残存率（Ｑ）で除した値である。また、表５中の相対誤差は、表４と同様に、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体１の補正前値（Ｘ）（表２参照）を減じた値の、検体１の補正前値（Ｘ）に対する割合である。

上記表５からも、補正後値（Ｙ）の相対誤差の幅は補正前の補正前値（Ｘ）の相対誤差（表２参照）の幅よりも小さくなっているといえる。よって、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に分画δを用いた補正をすることによっても、カルバミル化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

［カルバミル化の影響について小活］
上記の表２～表５のまとめとして、各シアン化ナトリウム濃度で処理した検体を、補正せずに測定した場合と、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に分画γによる補正を用いて測定した場合と、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に分画δによる補正を用いて測定した場合とにおける相対誤差を下記表６に掲げる。

上記表６に掲げた相対誤差を、シアン酸ナトリウム濃度を横軸に取ってグラフ化した図１９からも明らかなように、第１の閾値及び第２の閾値を用いた判定を行った上で、必要に応じ補正前値（Ｘ）を残存率（Ｑ）によって補正することで、シアン酸ナトリウムによる安定型Ａ１ｃのカルバミル化の影響を最も排除することが可能であることが認められた。

＜アルデヒド化の影響＞
実施例２として、通常検体に人為的にアセトアルデヒドを添加し、ヘモグロビンをアルデヒド化した検体においても、本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法が有効であることを示す。

［アルデヒド化検体の調製］
通常検体として、健常者から採取した全血を使用した。この通常検体に、下記表７に示すような終濃度となるようアセトアルデヒドを添加して３７℃でインキュベートした検体１～検体４を調整し、これらをそれぞれ前記した試料Ｓａ（図７参照）として使用した。

なお、上記表７中の検体５のアセトアルデヒド濃度は０ｍｇ／ｄＬであるが、これはアセトアルデヒドを添加していない、通常検体そのままであることを意味する。また、泳動液Ｌｍ、希釈液Ｌｄ及び混合試料Ｓｍについては前記した実施例１と同様である。

［エレクトロフェログラム］
電圧を印加した時点を分離分析の開始の時点とし、電圧を印加した時点を０秒の時点としたエレクトロフェログラムを得た。アセトアルデヒドが添加されていない検体５のエレクトロフェログラムは、図２０に示すとおりである。電圧を印加した時点が分離分析の開始の時点であり、エレクトロフェログラム上の泳動時間０秒の時点である。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は泳動時間１１．９秒付近である。また、ＨｂＦ分画である分画εは泳動時間１８．８秒付近にピークを有する。安定型Ａ１ｃ分画である分画βは泳動時間２１．９秒付近にピークを有する。ＨｂＡ０分画である分画αは泳動時間２８．３秒付近にピークを有する。そして、分画βより早い泳動時間２０．４秒付近にピークを有する分画γは、不安定型Ａ１ｃを含む分画とされているが、この分画にはアルデヒド化を被ったＨｂＡ０も含まれる。また、分画αより早い泳動時間２６．２秒付近にピークを有する分画δにも、アルデヒド化を被ったＨｂＡ０が含まれる。

アセトアルデヒドが１２．５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体６のエレクトロフェログラムは、図２１に示すとおりである。また、アセトアルデヒドが２５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体７のエレクトロフェログラムは、図２２に示すとおりである。図２０～図２２より、前記したカルバミル化の場合と同様、アセトアルデヒドの濃度が増大するにつれて、分画γ及び分画δの面積が増大していくことが認められる。

［補正前値（Ｘ）の算出］
図２０～図２２における分画βから、安定型Ａ１ｃのピーク面積の割合としての補正前値（Ｘ）は、下記表８に示すとおりに算出された。なお、補正前値（Ｘ）の算出方法については前記した実施例１と同様である。

上記表８に示すとおり、検体中のアセトアルデヒド濃度が高くなるにつれ、補正前値（Ｘ）が低くなっていくことが認められる。また、検体５の補正前値（Ｘ）に対する増減の割合（すなわち、各検体の補正前値（Ｘ）から検体５の補正前値（Ｘ）である５．４７％を減じた値の、検体５の補正前値（Ｘ）に対する割合）を示す相対誤差の値も、アセトアルデヒド濃度の増大に伴い、大きくなった。これは、安定型Ａ１ｃ量が、アセトアルデヒドによるアルデヒド化を被ることで減少していくことを示している。

［第１の割合及び第２の割合］
ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃとして同定される分画βに対し正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画γから算出される第２の割合と、ＨｂＡ０として同定される分画αに対し、正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画δから算出される第１の割合とは、下記表９に示すとおりであった。

すなわち、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合である第２の割合は、検体５で２．４％、検体６で４．６％、及び検体７で７．３％であった。また、分画δの面積の割合である第１の割合は、検体１で４．５％、検体２で８．１％、及び検体３で１２．６％であった。

［補正の必要性の判定］
上記表９中の第１の割合が第１の閾値以上であるかどうかを判断した。第１の閾値については、前記実施例１と同様に９％を用いた。同様に、第２の割合が、第２の閾値以上であるかどうかを判断した。第２の閾値もまた、前記実施例１と同様に５％を用いた。

まず、検体７については、第１の割合は第１の閾値である９％以上であり、また、第２の割合は第２の閾値である５％以上であった。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記エレクトロフェログラムの全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正すると判断された。一方、検体５及び検体６については、第１の割合は第１の閾値である９％未満であり、また、第２の割合は第２の閾値である５％未満であった。そのため、上述の補正はしないと判断された。

［分画γによる補正］
次に、安定型Ａ１ｃとして同定される分画βに対し、正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画γを用いて、下記表１０に示すように、上記表８の補正前値（Ｘ）の補正を行った。

まず、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合を、上記表１０中の左端列に挙げており、具体的には、検体５で２．４％、検体２で４．６％、及び検体３で７．３％であった。

まず、検体５及び検体６では、表９に示すように、いずれも第１の割合は第１の閾値未満であり、また、第２の割合は第２の閾値未満であった。よって、残存率（Ｑ）による補正はせずに、補正前値（Ｘ）を安定型Ａ１ｃ分画の測定値とした。なお、検体５及び検体６についてはこのように補正前値（Ｘ）は補正しなかったが、検体７の補正後値（Ｙ）と相対誤差を比較する便宜上、表１０の補正後値（Ｙ）欄に補正前値（Ｘ）である５．４７％及び５．３６％を示す。

一方、検体７では、表９に示すように、第１の割合は第１の閾値以上であり、かつ、第２の割合は第２の閾値以上であった。前記実施例１と同様に、カルバミル化やアルデヒド化の影響を被っておらず、不安定型Ａ１ｃ量も通常と考えられる健常者の検体において通常観察される分画γのピーク面積として、複数の健常者の分画γのピーク面積の平均的な値である３％を所定のピーク面積値として、分画γのピーク面積から控除した。この値が上記表１０中の修飾率（Ｐ）である。この値を１から減じた値が上記表中の残存率（Ｑ、ただし百分率で表示）であり、この割合で残存した安定型Ａ１ｃが、前記した表８中の補正前値（Ｘ）、すなわち分画βとしてエレクトロフェログラムに現れていると考えられる。よって、補正前値（Ｘ）をこの残存率（Ｑ）で除した値である、上記表１０中の補正後値（Ｙ）が、真の安定型Ａ１ｃ量と考えられ、この補正後値（Ｙ）を安定型Ａ１ｃ分画の測定値とした。ここで、前記表８から、補正前値（Ｘ）に基づく検体７の相対誤差の絶対値は、最大の５．１％であったところ、上記表１０から、補正後値（Ｙ）に基づく相対誤差（すなわち、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体５の補正前値（Ｘ）（表８参照）を減じた値の、検体５の補正前値（Ｘ）に対する割合）の絶対値は、０．８％にまで減じた。そのため、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に補正を行うことで、化学修飾されることによって生じる相対誤差の幅は小さくなった。

よって、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に分画γを用いた補正によって、アルデヒド化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

［分画δによる補正］
次に、ＨｂＡ０として同定される分画αに対し、正電荷量が少ない側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画δを用いて、下記表５に示すように、上記表８の補正前値（Ｘ）の補正を行った。

まず、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画δの面積の割合を、上記表１１中の左端列に挙げており、具体的には、検体５で４．５％、検体６で８．１％、及び検体７で１２．６％であった。

ここで、上記したように、検体５及び検体６では、表９に示すように、いずれも第１の割合は第１の閾値未満であり、また、第２の割合は第２の閾値未満であった。よって、残存率（Ｑ）による補正はしなかった。検体５及び検体６の補正前値（Ｘ）を補正しなかったが、検体７の補正後値（Ｙ）と相対誤差を比較する便宜上、表１１の補正後値（Ｙ）欄に補正前値（Ｘ）の５．４７％及び５．３６％を示す。

一方、検体７では、表９に示すように、第１の割合は第１の閾値以上であり、かつ、第２の割合は第２の閾値以上であった。そこでまず、前記実施例１と同様に、カルバミル化やアルデヒド化の影響を被っていないと考えられる健常者の検体において通常観察される分画δのピーク面積として、複数の健常者の分画δのピーク面積の平均的な値である４％を所定のピーク面積値として、分画δのピーク面積から控除した。そして、また前記実施例１と同様に、分画δから所定のピーク面積値としての４％が控除された値を前記した所定の係数としての１．６５で除することにより、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対するアルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積の割合を算出し、これを修飾率（Ｐ）とした。この他、残存率（Ｑ）、補正後値（Ｙ）及び相対誤差の算出は表１０と同様である。ただし、表１１中の補正後値（Ｙ）は、前記表８中の補正前値（Ｘ）を表１１中の残存率（Ｑ）で補正した値である。また、表１１中の相対誤差は、表１０と同様に、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体５の補正前値（Ｘ）（表８参照）を減じた値の、検体５の補正前値（Ｘ）に対する割合である。

上記表１１からも、補正後値（Ｙ）の相対誤差の幅は補正前の補正前値（Ｘ）の相対誤差（表８参照）の幅よりも小さくなっているといえる。よって、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に分画δを用いた補正をすることによっても、アルデヒド化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

［アルデヒド化の影響について小活］
以上の表８～表１１のまとめとして、各アセトアルデヒド濃度で処理した検体を、補正せずに測定した場合と、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に分画γによる補正を用いて測定した場合と、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に分画δによる補正を用いて測定した場合とにおける相対誤差を下記表１２に掲げる。

上記表１２に掲げた相対誤差を、アセトアルデヒド濃度を横軸に取ってグラフ化した図２３からも明らかなように、第１の閾値及び第２の閾値を用いた判定を行った上で、必要に応じ補正前値（Ｘ）を残存率（Ｑ）によって補正することで、アセトアルデヒドによる安定型Ａ１ｃのアルデヒド化の影響を最も排除することが可能であることが認められた。

＜不安定型Ａ１ｃの影響＞
通常検体に人為的にグルコースを添加し、不安定型Ａ１ｃを生じさせた検体においても、本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法が有効であることを示す。

［不安定型Ａ１ｃを含む検体の調製］
通常検体として、健常者から採取した全血を使用した。この通常検体に、下記表１３に示すような終濃度となるようＤ－グルコースを添加して３７℃でインキュベートした検体８～検体１２を調製し、これらをそれぞれ前記した試料Ｓａ（図７参照）として使用した。検体中のＤ－グルコース濃度の増加に応じて、検体中の不安定型Ａ１ｃ濃度は増加する。

なお、上記表中の検体８のＤ－グルコース濃度は０ｍｇ／ｄＬであるが、これはＤ－グルコースを添加していない、通常検体そのままであることを意味する。また、泳動液Ｌｍ、希釈液Ｌｄ及び混合試料Ｓｍについては前記した実施例１と同様である。

［エレクトロフェログラム］
電圧を印加した時点を分離分析の開始の時点とし、電圧を印加した時点を０秒の時点としたエレクトロフェログラムを得た。グルコースが添加されていない検体８のエレクトロフェログラムは、図２４に示すとおりである。電圧を印加した時点が分離分析の開始の時点であり、エレクトロフェログラム上の泳動時間０秒の時点である。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は泳動時間１２．３秒付近である。また、ＨｂＦ分画である分画εは泳動時間１８．３秒付近にピークを有する。安定型Ａ１ｃ分画である分画βは泳動時間２２．１秒付近にピークを有する。ＨｂＡ０分画である分画αは泳動時間２８．４秒付近にピークを有する。そして、分画βより早い泳動時間２０．８秒付近にピークを有する分画γは、不安定型Ａ１ｃを含む分画とされているが、この分画にはカルバミル化を被ったＨｂＡ０、アルデヒド化を被ったＨｂＡ０も含まれる。また、分画αより早い泳動時間２６．３秒付近にピークを有する分画δには、ＨｂＡ０がカルバミル化又はアルデヒド化される際に生成される物質が含まれる。

Ｄ－グルコースが３７５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体９、Ｄ－グルコースが７５０ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体１０、Ｄ－グルコースが１１２５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体１１、Ｄ－グルコースが１５００ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体１２のエレクトロフェログラムは、それぞれ図２５、図２６、図２７、図２８に示すとおりである。図２４～図２８より、前記したカルバミル化、アルデヒド化の場合と同様、不安定型Ａ１ｃを作成するために用いるＤ－グルコースの濃度が増大するにつれて、分画γのピーク面積が増大していくことが認められる。分画δのピーク面積もわずかに増大していくが、その増大量は分画γよりも極めて少ないことが認められる。このように、検体をＤ－グルコースで処理することで検体中の不安定型Ａ１ｃが高くなっても、分画δのピーク面積は大きくならない。一方、検体をカルバミル化、アルデヒド化で処理することで検体中のカルバミル化ＨｂＡ０、アルデヒド化ＨｂＡ０が増加すると、分画δのピーク面積は増加する。そのため、分画δのピーク面積が一定の値を超えた場合に補正をすることで、カルバミル化、アルデヒド化ＨｂＡ０の含有量が少なく不安定型Ａ１ｃを多く含む検体を誤って補正することを回避することができる。

［補正前値（Ｘ）の算出］
図２４～図２８における分画βから、安定型Ａ１ｃピーク面積の割合としての補正前値（Ｘ）は、下記表１４に示すとおりに算出された。なお、補正前値（Ｘ）の算出方法については前記した実施例１と同様である。

上記表１４に示すとおり、検体中のグルコース濃度が高くなるにつれ、補正前値（Ｘ）が僅かに高くなっていくが、ほとんど変化しないことが認められる。検体８の補正前値（Ｘ）に対する増減の割合を示す相対誤差の値も、グルコース濃度の増大に伴ってもほとんど変化しない。これは、安定型Ａ１ｃ量が、グルコースによって化学修飾をほとんど受けないことに符合する。

［第１の割合及び第２の割合］
実施例１及び実施例２と同様に、第１の割合と第２の割合を算出した。その結果は下記表１５に示すとおりであった。

すなわち、分画γの面積の割合である第２の割合は、検体８で１．８％、検体９で３．５％、及び検体１０で５．１％、検体１１で６．８％、検体１２で８．５％であった。また、分画δの面積の割合である第１の割合は、検体８で３．８％、検体９で４．５％、及び検体１０で４．７％、検体１１で５．３％、検体１２で５．９％であった。

［第１の閾値による判定］
上記表中の第１の割合が第１の閾値以上であるかどうかを判断した。第１の閾値は、実施例１及び実施例２と同様に９％を用いた。

まず、検体８～検体１２のいずれの検体においても、第１の割合は第１の閾値である９％未満であった。そのため、検体８～検体１２に対して、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記エレクトロフェログラムの全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合については、残存率による補正は行わないと判断した。

すなわち、補正の必要性を判定し、補正が必要と判定された場合に補正を行う本発明の測定方法による安定型Ａ１ｃ分画の測定値は、前記表１４に示す補正前値（Ｘ）となる。そして、この補正前値（Ｘ）に基づく補正誤差も、前記表１４に示すとおりである。

［判定を行わない場合］
ここで、上記した第１の閾値による判定を行わずに、検体８から検体１２を残存率による補正を行って測定した場合について説明する。この場合は、第１の割合が第１の閾値以上であるかどうかを判別する工程を有さない。そのため、検体８から検体１２のいずれの検体についても、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記エレクトロフェログラムの全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正を行う。分画γを用いて補正を行った場合の測定結果を下記表１６に示す。

ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合を、上記表１６中の左端列に挙げており、具体的には、検体８で１．８％、検体９で３．５％、検体１０で５．１％、検体１１で６．８％、及び検体１２で８．５％であった。

この分画γのピーク面積の割合からは、前記した実施例１と同様の理由でカルバミル化やアルデヒド化の影響を被っておらず、不安定型Ａ１ｃ量が通常と考えられる健常者の検体において通常観察される分画γのピーク面積として、複数の健常者の分画γのピーク面積の平均的な値である３％が所定のピーク面積値として控除され、これが上記表１６中に示す修飾率（Ｐ）として掲げられている数値である。ここで、検体８における分画γは１．８％でありこの３％を下回っているが、この場合は計算上、修飾率（Ｐ）が０であるものとして取り扱った。

この修飾率（Ｐ）を１から減じた値が上記表１６中の残存率（Ｑ、ただし百分率で表示）である。そして、補正前値（Ｘ）をこの残存率（Ｑ）で除して、上記表１６中の補正後値（Ｙ）を算出した。そして、補正後値（Ｙ）から、分画γを用いて補正した場合の相対誤差を算出した。すなわち、各検体の補正後値（Ｙ）から、検体８の補正前値（Ｘ）（表１４参照）を減じた値の、検体８の補正前値（Ｘ）に対する割合が上記表１６中の相対誤差である。

［不安定型Ａ１ｃの影響について小括］
以上の表１３～表１６のまとめとして、各グルコース濃度で処理した検体を、判定工程を行わずに補正を行った場合と、判定工程を行った結果に基づき補正をしなかった場合とにおける相対誤差を下記表１７に掲げる。

上記表１７に掲げた相対誤差を、Ｄ－グルコース濃度を横軸に取ってグラフ化した図２９からも明らかなように、判定工程を行わずに補正を行った場合は、判定工程を行った結果に基づき補正をしなかった場合よりも相対誤差が大きくなった。これは、分画γに含まれる不安定型Ａ１ｃのピーク面積をカルバミル化ＨｂＡ０、アルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積として残存率を算出して補正したためである。一方、判定工程を行うことで、過剰な補正による相対誤差の悪化が回避された。これは、不安定型Ａ１ｃの影響を受けない分画δのピーク面積の値から、カルバミル化およびアルデヒド化の影響に対する補正の必要性を判定したためである。よって、判定工程を有する当該補正は、検体に含まれる不安定型Ａ１ｃの影響を少なくとも軽減されることが認められた。

本発明は、血中ヘモグロビンの分画のうち、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定する測定装置に利用可能である。

Ａ１分析システム
１分析装置
２分析チップ
２Ａ上側部分
２Ｂ下側部分
５検出器
６分注器
８制御部
２１本体
２２混合槽
２３導入槽
２４フィルタ
２５排出槽
２６電極槽
２７キャピラリー管
２８連絡流路
３１電極
３２電極
４１光源
４２光学フィルタ
４３レンズ
４４スリット
６１ポンプ
７１希釈液槽
７２泳動液槽

Claims

血中ヘモグロビンの分子表面電荷に基づく分離分析における安定型Ａ１ｃの測定方法であって、
前記分離分析で得られるヘモグロビンの時間分布から、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積がＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布のヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に占める割合である第１の割合が、第１の閾値以上であるかどうかを判別する工程、及び、
前記第１の割合が前記第１の閾値以上である場合に、前記ヘモグロビンの時間分布における化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率を算出し、前記ヘモグロビンの時間分布におけるＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を前記残存率で補正して得た値を当該分画の測定値とする工程、
を含んでなる、安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記ヘモグロビンの時間分布から、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積がＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積に占める割合である第２の割合が、第２の閾値以上であるかどうかを判別する工程を有し、
前記第１の割合が前記第１の閾値以上であり、前記第２の割合が前記第２の閾値以上である場合に、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又は前記ヘモグロビンの時間分布の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を前記残存率で補正して得た値を当該分画の測定値とする、請求項１に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記残存率は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積との合計値に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合である修飾率から算出される、請求項１又は請求項２に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合である修飾率から算出される、請求項１又は請求項２に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から所定のピーク面積値を控除した値の割合である修飾率から算出される、請求項１又は請求項２に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記残存率は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積を所定の係数で除して得られるピーク面積補正値との合計値に対する、前記ピーク面積補正値の割合である修飾率から算出される、請求項１又は請求項２に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積を所定の係数で除して得られるピーク面積補正値の割合である修飾率から算出される、請求項１又は請求項２に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積から所定のピーク面積値を控除した値をさらに所定の係数で除して得られるピーク面積補正値の割合である修飾率から算出される、請求項１又は請求項２に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記化学修飾は、カルバミル化及びアルデヒド化のいずれか一方又は両方である、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記ヘモグロビンの時間分布は、クロマトグラムである、請求項１から請求項９までのいずれか１項に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
前記ヘモグロビンの時間分布は、キャピラリー電気泳動法で得られるエレクトロフェログラムである、請求項１から請求項１０までのいずれか１項に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。