CN112198212B - 稳定型A1c的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及稳定型A1c的测定方法，通过考虑被化学修饰的稳定型A1c的量，更准确地测定稳定型A1c的量。一种稳定型A1c的测定方法，基于流路中测定的血红蛋白的光学测定值的时间分布来测定血液待测体中所含的稳定型A1c，所述流路基于血红蛋白所具有的电荷的多少来分离所述血液待测体中所含的血红蛋白，其中，基于所述时间分布中包含HbA0的组分的峰面积(A)以及包含被化学修饰的HbA0的第一组分的峰面积(G)、或者与确定为HbA0的组分相邻、且包含正电荷量比HbA0低的成分的第二组分的峰面积(D)，得到校正系数，基于所述校正系数来校正所述时间分布中包含稳定型A1c的组分的峰面积。
Description
技术领域
本发明涉及血液中血红蛋白的组分之中稳定型血红蛋白A1c的测定方法。
背景技术
将在血红蛋白分子的β链的N末端的缬氨酸残基上结合有葡萄糖的物质称为HbA1c。更详细地说，经由可逆生成的不稳定型HbA1c(labile HbA1c，以下记为“不稳定型A1c”或“L-A1c”)，生成不可逆反应物质、即稳定型血红蛋白A1c(stable HbA1c，以下记为“稳定型A1c”或“S-A1c”)。稳定型A1c在临床上反映了过去1～2个月的平均血糖值，作为糖尿病管理的指标而重要。
以往，作为HbA1c的测定方法，使用HPLC法(High Performance LiquidChromatography，高效液相色谱法)、免疫法、毛细管电泳法等。关于利用毛细管电泳法的血红蛋白的分析方法，下述专利文献1中所公开。
在用HPLC法或毛细管电泳法进行稳定型A1c的测定的情况下，从血液中的血红蛋白中分离稳定型A1c，根据分离得到的峰的大小，计算相对于总血红蛋白的比例。
此时，例如在肾衰竭患者中，通过由尿素生成的氰酸与血红蛋白结合的氨基甲酰化，血红蛋白被化学修饰。另外，例如，也会通过血液中的乙醛与血红蛋白结合的醛化，血红蛋白被化学修饰。
这样的被化学修饰的血红蛋白组分在与表示稳定型A1c的组分相同的时间溶出，由此表观的稳定型A1c被测定为比实际高的值(参照下述专利文献2)，或者稳定型A1c的比例有较大变动(参照下述专利文献3)。
因此，为了进行稳定型A1c的准确测定，需要充分分离这种被化学修饰的血红蛋白。因此，在毛细管电泳法中，尝试通过改变毛细管内表面的涂层或电泳条件来分离稳定型A1c和被化学修饰的血红蛋白(参照下述专利文献3和下述专利文献4)。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：日本再表2008-139866号公报；
专利文献2：日本特开2004-69640号公报；
专利文献3：日本特开2008-170350号公报；
专利文献4：日本特开2009-186445号公报。
发明内容
如上所述，研究了通过从稳定型A1c中分离出由于肾衰竭患者的尿素所生成的氰酸产生的氨基甲酰化血红蛋白、由于血液中的乙醛产生的醛化血红蛋白，来避免化学修饰血红蛋白的存在对稳定型A1c的测定带来的影响。但是，需要更准确地测定含有氰酸或乙醛的血液中的稳定型A1c的比例。
稳定型A1c本身也是血红蛋白，并受到如氨基甲酰化或醛化那样的化学修饰。因此，为了计算出反映了过去1～2个月的平均血糖值的稳定型A1c的比例，需要计算出被化学修饰的稳定型A1c与未被化学修饰的稳定型A1c这两者。但是，在至今为止的分离分析中，测定包含未被化学修饰的稳定型A1c的组分的峰面积，并根据其结果计算出反映了过去1～2个月的平均血糖值的稳定型A1c的比例，关于包含被化学修饰的稳定型A1c的组分的峰面积，在稳定型A1c的比例的计算中未被考虑。因此，如以往所尝试的那样，即使在分离分析中尝试分离被化学修饰的血红蛋白的组分和未被化学修饰的稳定型A1c的组分并使其溶出，也无法准确地测定反映了肾衰竭患者或血液中的醛浓度高的患者的过去1～2个月的平均血糖值的稳定型A1c的比例，无法适当地进行糖尿病管理。
因此，本公开的稳定型A1c的测定方法基于流路中测定的血红蛋白的光学测定值的时间分布来测定血液待测体中所含的稳定型A1c，所述流路基于血红蛋白所具有的电荷的多少来分离所述血液待测体中所含的血红蛋白，其中，基于所述时间分布中包含HbA0的组分的峰面积(A)以及包含被化学修饰的HbA0的第一组分的峰面积(G)、或者与确定为HbA0的组分相邻、且包含正电荷量比HbA0低的成分的第二组分的峰面积(D)，得到校正系数，基于所述校正系数来校正所述时间分布中包含稳定型A1c的组分的峰面积。
此外，认为HbA0被化学修饰的待测体的稳定型A1c被氨基甲酰化或醛化。因此，对于判断为HbA0被化学修饰的待测体，发现有必要计算未被化学修饰的稳定型A1c和被化学修饰的稳定型A1c两者的比例。另一方面，例如，在通过毛细管电泳对待测体进行分离分析而得到的电泳图谱中包含被化学修饰的HbA0的组分中，除了被化学修饰的HbA0以外，还含有不稳定型A1c。因此，包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积根据待测体中所含的不稳定型A1c的量而变动，无法根据包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的大小，判别HbA0是否为被化学修饰的待测体。因此，发现在计算稳定型A1c的比例时，需要适当地判断是否为要考虑被化学修饰的稳定型A1c的比例的必要性高的待测体。
因此，在本公开的稳定型A1c的测定方法中，优选包括以下工序：判别第一比例是否为第一阈值以上，所述第一比例相当于所述时间分布中所述第二组分的峰面积(D)在包含HbA0的组分的峰面积(A)或所述血红蛋白的时间分布的包含血红蛋白的组分的总峰面积中所占的比例；以及在第一比例为第一阈值以上的情况下，通过所述校正系数来校正包含稳定型A1c的组分的峰面积。
在本发明的实施方式中，通过考虑被化学修饰的稳定型A1c的量，可以更准确地测定稳定型A1c的量。
附图说明
图1是示出本发明涉及的分析系统的一个例子的简要图；
图2是示出在图1的分析系统中使用的分析芯片的俯视图；
图3是沿图2的III-III线的剖视图；
图4是示出控制部的硬件结构的框图；
图5是示出本发明涉及的分析方法的流程图；
图6是示出准备工序的顺序的流程图；
图7是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图8是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图9是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图10是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图11A是示出分析工序的顺序的流程图；
图11B是示出分析工序的顺序的变形例的流程图；
图11C是示出判别工序的顺序的流程图；
图12是示出通过波形形成工序来形成的波形数据的一个例子的曲线图；
图13是示出最远点的决定的曲线图；
图14示出血红蛋白电泳图谱的一个例子；
图15示出实施例1中的待测体1的电泳图谱；
图16示出实施例1中的待测体2的电泳图谱；
图17示出实施例1中的待测体3的电泳图谱；
图18示出实施例1中的待测体4的电泳图谱；
图19是示出实施例1中的稳定型A1c量的校正效果的曲线图；
图20示出实施例2中的待测体5的电泳图谱；
图21示出实施例2中的待测体6的电泳图谱；
图22示出实施例2中待测体7的电泳图谱；
图23是示出实施例2中的稳定型A1c量的校正效果的曲线图；
图24是示出实施例2中的稳定型A1c量的校正效果的曲线图；
图25示出实施例3中的待测体8的电泳图谱；
图26示出实施例3中的待测体9的电泳图谱；
图27示出实施例3中的待测体10的电泳图谱；
图28示出实施例3中的待测体11的电泳图谱；
图29示出实施例3中的待测体12的电泳图谱；
图30是示出实施例3中的稳定型A1c量的校正效果的曲线图；
图31是示出实施例3中的判定工序效果的曲线图。
具体实施方式
本发明的稳定型A1c的测定方法基于流路中测定的血红蛋白的光学测定值的时间分布来测定血液待测体中所含的稳定型A1c，所述流路基于血红蛋白所具有的电荷的多少来分离所述血液待测体中所含的血红蛋白，其中，基于所述时间分布中包含HbA0的组分的峰面积(A)以及包含被化学修饰的HbA0的第一组分的峰面积(G)、或者与确定为HbA0的组分相邻、且包含正电荷量比HbA0低的成分的第二组分的峰面积(D)，得到校正系数，基于所述校正系数来校正所述时间分布中包含稳定型A1c的组分的峰面积。
作为上述分离分析的具体方法，只要是能够根据血红蛋白的分子表面电荷的多少来分离其种类的方法即可，没有特别限定，例如可以举出HPLC(High Performance LiquidChromatography，高效液相色谱法)法或毛细管电泳法。其中，从通过更简便的测定系统而在短时间内分析更多的待测体的观点出发，毛细管电泳法是适合的。
血红蛋白的时间分布是指，以横轴为时间、以纵轴为信号强度来表示时间和信号强度的图表，该时间和信号强度是在流路内分离血红蛋白、并在流路上的特定地点的测定部位上检测出所分离的各血红蛋白的时间和信号强度。横轴的时间表示血红蛋白移动预定距离所需的时间。横轴的时间也可以说是，从开始分离的时间点到在位于流路的特定地点的测定部位上检测出待测体成分的时间点为止的时间。作为血红蛋白的时间分布，例如包括用色谱得到的色谱图、用毛细管电泳得到的电泳图谱。
例如，在毛细管电泳法、以离子交换为原理的HPLC法的情况下，移动速度根据血红蛋白分子表面的电荷的多少而变动。因此，关于从分离开始到该血红蛋白分子在毛细管内或柱内移动而通过特定地点为止的经过时间、即该血红蛋白分子移动预定距离所需的时间，可以视为该血红蛋白分子的分子表面电荷的多少。并且，与从电泳开始起的经过时间对应的信号(例如，吸光度)的强度表现为具有几个波峰(峰)和波谷(谷)的曲线、即电泳图谱或色谱图。基于电泳图谱或色谱图的形状，血红蛋白被分离成几个组分。例如，以特定的峰为中心的组分被确定为血红蛋白的特定的成分。
血红蛋白的时间分布的横轴只要表示分子表面电荷的多少即可。因此，除了如上所述那样移动预定距离所需的时间以外，可以是各血红蛋白分子的移动速度，也可以是特定时间的移动距离。血红蛋白时间分布的纵轴只要是表示血红蛋白的量的即可。例如，也可以是血红蛋白的含量本身或血红蛋白的浓度。另外，可以是从测定部位的检测器输出的信号强度，也可以是吸光度、荧光、发光强度这样的光学测定值。另外，也可以是吸光度变化的每单位时间的变化量。当考虑血红蛋白的吸收光谱时，优选测定波长415nm或其附近的吸光度，并将该吸光度设为纵轴。从该血红蛋白的时间分布的形状得到的组分的峰面积或峰的高度是光学测定值，表示所分离的该血红蛋白分子的量。
如本实施例中的毛细管电泳那样，当通过以阳离子交换为原理的分离分析法来分离分析血液中的血红蛋白时，按照从正电荷量少的血红蛋白到正电荷量多的血红蛋白的顺序，检测各血红蛋白。具体而言，检测包含HbF的组分，然后，检测包含化学修饰的HbA0和不稳定型A1c的组分。再然后，依次检测包含稳定型A1c的组分、与包含HbA0的组分相邻的组分、包含HbA0的组分。这里检测出的包含稳定型A1c的组分是源自未被化学修饰而残留的稳定型A1c的组分。根据该分离分析中所得的含有被化学修饰的HbA0的组分的峰面积、或相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量低的一侧相邻的组分的峰面积，计算残留率(校正系数)，该残留率为HbA0未被化学修饰而残留的比例。
本发明中的化学修饰例如为氨基甲酰化和醛化中的一种或两种。
残留率(校正系数)也可以是，含有HbA0的组分的峰面积相对于含有HbA0的组分的峰面积与含有化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值的比例。另外，也可以使用修饰率来计算残留率，该修饰率是含有被化学修饰的HbA0的组分的峰面积相对于含有HbA0的组分的峰面积与含有被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值的比例。例如，也可以通过从1中减去修饰率来计算残留率。该残留率也可以说是，未被化学修饰的HbA0的量相对于未被化学修饰的HbA0与被化学修饰的HbA0的总量的比例。另一方面，修饰率也可以说是，被化学修饰的HbA0的量相对于未被化学修饰的HbA0与被化学修饰的HbA0的总量的比例。
以下，对修饰率的计算进行说明。在血液中所含的未被化学修饰的HbA0量(此外，在本公开中，当简称为“HbA0”时，是指未被化学修饰的HbA0)与被化学修饰的HbA0量的总量之中，HbA0量占大部分。因此，在用血红蛋白的时间分布得到的、包含HbA0的组分的峰面积与包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值中，含有HbA0的组分的峰面积占大部分。因此，也可以将包含HbA0的组分的峰面积视为包含HbA0的组分的峰面积与包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值，来计算修饰率。另外，在血液中所含的血红蛋白中，HbA0占大部分。因此，在从血红蛋白的时间分布得到的包含血红蛋白的组分的总峰面积中，包含HbA0的组分的峰面积占大部分。因此，也可以将包含HbA0的组分的峰面积视为包含血红蛋白的组分的总峰面积，来计算修饰率。另外，基于相同的理由，也可以将包含血红蛋白的组分的总峰面积视为包含HbA0的组分的峰面积与包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值，来计算修饰率。
此外，在本公开中，可以将从血红蛋白的时间分布的形状得到的所有组分的峰面积作为包括血红蛋白的组分的总峰面积。
包含被化学修饰的HbA0的组分(第一组分)是相对于被确定为稳定型A1c的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分。另外，也可以说是存在于正电荷量比HbF多的一侧的组分。或者，也可以说是，相对于被确定为稳定型A1c的组分而在正电荷量少的一侧相邻、且存在于正电荷量比HbF多的一侧的组分。或者，也可以说是，相对于被确定为稳定型A1c的组分而在正电荷量少的一侧相邻、且存在于正电荷量比HbF多的一侧的组分。或者，包含被化学修饰的HbA0的组分是，检测出的时间比被确定为稳定型A1c的组分早的组分。另外，也可以说是检测出的时间比HbF晚的组分。或者，也可以说是，检测时间比被确定为稳定型A1c的组分早、且检测时间比HbF晚的组分。包含被化学修饰的HbA0的组分包括作为已知成分的被氨基甲酰化或被醛化的HbA0。当血红蛋白氨基甲酰化或醛化时，包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积会增加。
包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积可以直接作为数值来使用，也可以作为进行适当修正后的数值来使用。例如，在包含被化学修饰的HbA0的组分中含有被化学修饰的HbA0量以外的成分的情况下，可以举出从包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积中扣除源自被化学修饰的HbA0以外的成分的峰面积。在已知源自被化学修饰的HbA0以外的组分的峰面积的情况下，可以将该已知的峰面积作为预定的峰面积值来扣除。另外，对多个健康者的待测体进行分离分析，在待测体的稳定型A1c的测定之前，求出预定的峰面积值，该预定的峰面积值是被化学修饰的HbA0以外的成分的峰面积的统计值。然后，可以在测定待测体时，从包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积中扣除该预定的峰面积值。例如，作为该统计值的峰面积校正值是平均值或中央值等。
另外，残留率或修饰率也可以使用相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分(第二组分)来计算。该组分是通过用毛细管电泳分离血红蛋白而最初得到的组分。虽然理由尚不清楚，但当血红蛋白被氨基甲酰化或醛化时，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积会增大。因此，例如，人为地对健康者的待测体进行氨基甲酰化，预先求出相对于被确定为该待测体的HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积与氨基甲酰化HbA0的峰面积之间的相关关系。根据该相关关系，得到预定系数(a)，该预定系数(a)是前者的峰面积相对于后者的峰面积的倍率(换言之，用后者的峰面积除以前者的峰面积的值)。然后，通过用该预定系数除以相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积预定系数，计算峰面积校正值，该峰面积校正值是氨基甲酰化HbA0的峰面积。然后，可以根据该峰面积校正值，计算残留率或修饰率。另外，例如，人为地对健康者的待测体进行醛化，预先求出相对于被确定为该待测体的HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积与醛化HbA0的峰面积之间的相关关系。根据该相关关系，得到预定系数(a)，该预定系数(a)是前者的峰面积相对于后者的峰面积的倍率。然后，通过用该预定系数除以相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积预定系数，计算峰面积校正值，该峰面积校正值是醛化HbA0的峰面积。然后，可以根据该峰面积校正值，计算残留率或修饰率。
此外，在实际的待测体中，也有可能同时发生HbA0的氨基甲酰化和醛化，因此严格区分氨基甲酰化与醛化的意义不大。因此，在以下的记述中，将包括同时发生HbA0的氨基甲酰化和醛化的情况、以及仅发生氨基甲酰化和醛化中的一方的情况，记述为“氨基甲酰化HbA0和/或醛化HbA0”。
如上所述，在相同的组分中检测出被化学修饰的HbA0即氨基甲酰化HbA0和/或醛化HbA0以及不稳定型A1c。因此，当从包含氨基甲酰化HbA0和/或醛化HbA0的组分的峰面积计算出含有较多不稳定型A1c的待测体的残留率和修饰率时，有时会过大地计算残留率。并且，当使用过大地计算出的残留率来校正稳定型A1c的比例时，无法计算出准确的稳定型A1c的比例。另一方面，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分不包含不稳定型A1c。因此，利用根据相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分计算出的氨基甲酰化HbA0和/或醛化HbA0的峰面积，来计算残留率、修饰率，利用该计算出的残留率来计算稳定型A1c的比例，由此即便在计算出含有较多不稳定化A1c的待测体的情况下，也能够计算出考虑了被化学修饰的稳定型A1c的比例的准确的稳定型A1c的比例。
此外，不稳定型A1c被包含在与包含氨基甲酰化HbA0和/或醛化HbA0的组分相同的组分中可以认为是因为，氨基甲酰化HbA0和/或醛化HbA0与不稳定型A1c的分子表面电荷分别接近。另一方面，不稳定型A1c被包含在与相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分中所含的物质不同的组分中可以认为是因为，不稳定型A1c的分子表面电荷充分不同于相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分中所含的物质的表面电荷。另外，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分被认为，包含在HbA0被化学修饰时一起生成的物质的组分。另外，该物质具有对波长415nm进行吸光的性质。由此推测，该物质是某种血红蛋白化合物。
相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分也可以说是，相对于被确定为稳定型A1c的组分而存在于正电荷多的一侧的组分。或者，也可以说是，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻、且相对于被确定为稳定型A1c的组分而存在于正电荷多的一侧的组分。或者，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分也可以说是，检测出的时间比被确定为HbA0的组分早的组分。或者，也可以说是，检测出的时间比被确定为稳定型A1c的组分晚的组分。或者，也可以说是，检测出的时间比被确定为HbA0的组分早、且检测出的时间比被确定为稳定型A1c的组分晚的组分。
关于相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积，也可以与上述关于包含被化学修饰的HbA0的组分描述相同地，可以直接作为数值来使用，也可以作为进行适当修正后的数值来使用。例如，可以举出在相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分中包含HbA0被化学修饰时一起生成的物质以外的成分的情况下，从该组分的峰面积中扣除源自HbA0被化学修饰时一起生成的物质以外的成分的峰面积。在已知源自HbA0被化学修饰时一起生成的物质以外的成分的峰面积的情况下，也可以将该已知的峰面积作为预定的峰面积值来扣除。另外，也可以对多个健康者的待测体进行分离分析，在待测体的稳定型A1c的测定之前，求出预定的峰面积值，该预定的峰面积值是HbA0被化学修饰时一起生成的物质以外的成分的峰面积的统计值。然后，可以在测定待测体时，从包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积中扣除该预定的峰面积值。例如，作为该统计值的峰面积校正值是平均值或中央值等。然后，也可以基于扣除了该预定的峰面积值的值，计算前述峰面积校正值。
接着，根据分离分析中得到的血红蛋白的时间分布，用残留率校正如下比例：该比例是包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例。
本说明书中所述的包含血红蛋白的组分的总峰面积也可以说是，与分离分析的待测体中所含的总血红蛋白量相当的峰面积的值。也可以说是，在所得的血红蛋白的时间分布中源自血红蛋白的组分的峰面积的合计值。此外，在待测体中所含的血红蛋白量中，HbA0占大部分。因此，也可以将包含血红蛋白的组分的总峰面积视为与该HbA0组分的峰面积相同的值来进行校正。另外，也可以将除了HbA0组分的峰面积以外、还包含血红蛋白的时间分布的形状中相邻组分的峰面积来计算出的合计值，视为包含血红蛋白的组分的总峰面积而进行校正。
然后，在稳定型A1c也以上述HbA0被化学修饰的修饰率进行化学修饰、待测体中所含的稳定型A1c是未被化学修饰而残留的稳定型A1c的推定下，对于包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，用残留率进行校正。换言之，使用残留率，计算包含未被化学修饰而残留的稳定型A1c的组分的峰面积与包含被化学修饰的稳定型A1c的组分的峰面积的合计值的、相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例。通过该校正，计算反映了过去1～2个月的平均血糖值的稳定型A1c的比例。
例如，关于用残留率校正包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例的方法，也可以是用残留率除以包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例的方法。
此外，在本公开的稳定型A1c的测定方法中，优选包括以下工序：判别第一比列是否为第一阈值以上，该第一比例相当于所述时间分布中所述第二组分的峰面积(D)在包含HbA0的组分的峰面积(A)或血红蛋白的时间分布的包含血红蛋白的总峰面积中所占的比例；以及在第一比例为第一阈值以上的情况下，通过所述校正系数来校正包含稳定型A1c的组分的峰面积。
针对判别第一比列是否为第一阈值以上的工序进行说明，其中，该第一比例相当于所述时间分布中所述第二组分的峰面积(D)在包含HbA0的组分的峰面积(A)或前述血红蛋白的时间分布的包含血红蛋白的总峰面积中所占的比例。
例如，如毛细管电泳那样，当通过以阳离子交换为原理的分离分析法来分离分析血液中的血红蛋白时，按照从正电荷量少的血红蛋白到正电荷量多的血红蛋白的顺序，检测各血红蛋白。具体而言，检测包含HbF的组分，然后，检测包含氨基甲酰化HbA0、醛化HbA0和不稳定型A1c的组分。再然后，依次检测包含稳定型A1c的组分、与包含HbA0的组分相邻的组分、包含HbA0的组分。这里检测出的包含稳定型A1c的组分是源自未进行氨基甲酰化或醛化等的化学修饰而残留的稳定型A1c的组分。如上所述，由于在相同的组分中检测出氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0与不稳定型A1c，因此根据包含氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0的组分的峰面积的大小，无法判断该待测体是包含氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0，还是包含不稳定型A1c。另一方面，当人为地对待测体中所含的血红蛋白进行氨基甲酰化或醛化时，不仅包含氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0以及不稳定型A1c的组分的峰面积增大，而且相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积也会增大。而且，在相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分中，不包含不稳定型A1c。因此，能够通过判断如下比例是否为第一阈值以上来恰当地判别分离分析后的待测体是否为含有较多氨基甲酰化HbA0或醛HbA0的待测体：该比例是相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分(第二组分)的峰面积的、相对于包含HbA0的组分的峰面积或血红蛋白的时间分布的包含血红蛋白的总峰面积的比例。
此外，不稳定型A1c被包含在与含有氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0的组分相同的组分中可以认为是因为，氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0以及不稳定型A1c的分子表面电荷分别接近。另一方面，不稳定型A1c被包含在与相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分中的物质不同的组分中可以认为是因为，不稳定型A1c的分子表面电荷充分不同于相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分中所含的物质的表面电荷。另外，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分被认为，包含HbA0被氨基甲酰化或醛化时与氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0一起生成的物质的组分。另外，该物质具有对波长415nm进行吸光的性质。由此推测，该物质是某种血红蛋白化合物。
相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分也可以说是，相对于被确定为稳定型A1c的组分而存在于正电荷多的一侧的组分。或者，也可以说是，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻、且相对于被确定为稳定型A1c的组分而存在于正电荷多的一侧的组分。或者，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分也可以说是，检测时间比被确定为HbA0的组分早的组分。或者，也可以说是，，检测时间比被确定为稳定型A1c的组分晚的组分。或者，也可以说是，，检测时间比被确定为HbA0的组分早、且检测时间比被确定为稳定型A1c的组分晚的组分。
在血液中所含的总血红蛋白量中，HbA0量占大部分。因此，包含HbA0的组分的峰面积与前述血红蛋白的时间分布的总峰面积的值近似。因此，即便使用包含HbA0的组分的峰面积或前述血红蛋白的时间分布的总峰面积之中的任一个来计算第一比例，均能够适当地实施本发明。
第一阈值可以适当地设定。如上所述，即便是含有较多不稳定型A1c的待测体，相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积也不会变大，适当地表示待测体中所含的HbA0的氨基甲酰化、醛化的程度。因此，例如，也可以收集多个未被氨基甲酰化或醛化的待测体、可以忽略化学修饰影响的待测体、或者健康者的待测体来进行分离分析，根据由此得到的第一比例设定第一阈值。例如，可以将从多个待测体得到的第一比例的最大值设为第一阈值，也可以将比该最大值大的值设为第一比例。在该组分为这样的大的值以上的情况下，可以判断为确实受到了氨基甲酰化或醛化影响。换言之，当第一比例为这样的大的值、即第一阈值以上时，认为待测体确实受到了氨基甲酰化或醛化影响。另一方面，未被氨基甲酰化或醛化的待测体的第一比例几乎不会达到该第一阈值以上。由此，能够避免将含有较多不稳定型A1c的待测体误判断为含有较多氨基甲酰化HbA0或醛化HbA0的待测体。而且，能够避免对不需要校正氨基甲酰化或醛化影响的待测体进行校正，能够适当地测定稳定型A1c的比例。另外，如果没有要求严格的判别，则也可以将比从多个待测体得到的第一比例的最大值小的值设为第一阈值。例如，可以将所得的第一比例的平均值或中央值等设为该第一阈值。第一阈值例如为4％以上，优选为9％以上。
接着，在第一比例为第一阈值以上的情况下，根据血红蛋白的时间分布中含有被化学修饰的HbA0的组分的峰面积、或者相对于被确定为HbA0的组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积，计算残留率，该残留率是HbA0未被化学修饰而残留的比例，并将以残留率校正包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于血红蛋白的时间分布中包含HbA0的组分的峰面积或包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例而得到的值，作为该组分的测定值、即包含稳定型A1c的组分的测定值。该测定值是具有作为总血红蛋白量中稳定型A1c所占的比例的意义的值。
这里，在第一比例小于第一阈值的情况下，可以视为没有受到化学修饰的影响、或者小到可以忽略的程度，不进行基于上述残留率的校正。在该情况下，将不进行基于上述残留率的校正的、包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于血红蛋白的时间分布中包含HbA0的组分的峰面积或包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，作为该组分的测定值。该测定值的意义如上所述。另外，也可以预先计算未进行基于上述残留率的校正的峰面积的比例和进行了基于残留率的校正的峰面积的比例这两者，进行判别第一比例是否为第一阈值以上的工序，在第一比例小于第一阈值的情况下，可以将未以残留率校正的峰面积的比例作为上述测定值。
除了上述的判别第一比例是否在预定的第一阈值以上的工序之外，还可以包括如下工序：根据上述血红蛋白的时间分布，判别第二比例是否为第二阈值以上，该第二比例是在包含HbA0的组分的峰面积或上述血红蛋白的时间分布的总峰面积中、包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积所占的比例。通过判别分离分析的待测体的第一比例为第一阈值以上、且相对于稳定型A1c组分而在正电荷量少的一侧相邻的组分的峰面积的大小也为一定以上，能够更适当地判断该待测体含有被化学修饰的HbA0。换言之，如果是第一比例为第一阈值以上、且第二比例为第二阈值以上的待测体，则认为该待测体确实受到了氨基甲酰化或醛化影响。并且，在第一比例为第一阈值以上、且第二比例为第二阈值以上的情况下，也可以将用上述的残留率校正后的比例作为上述的测定值。判别第二比例是否为第二阈值以上的工序也可以在判别第一比例是否为第一阈值以上的工序之前或之后执行。
第二阈值例如可以设为如下值：收集多个未进行氨基甲酰化或醛化、认为不稳定型A1c量为通常的待测体并进行分离分析，由此得到的第二比例的最大值。另外，例如，也可以将比从多个待测体得到的第二比例的最大值大的值作为第二阈值。另外，在判别中未要求高精度的情况下，也可以将从多个待测体得到的第二比例的平均值或中央值这样的任意的值作为第二阈值。该第二阈值例如可以相对于总血红蛋白量为3％以上。
而且，即使第一比例为第一阈值以上，第二比例小于该第二阈值的待测体也被认为不含或几乎不含被化学修饰的HbA0。因此，不会将用所述残留率校正包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或上述血红蛋白的时间分布的包含血红蛋白的总峰面积的比例之后的比例作为上述测定值。然后，将未用所述残留率进行校正的、包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或血红蛋白的时间分布的总峰面积的比例作为上述测定值。
另一方面，在第一比例为第一阈值以上、且第二比例为该第二阈值以上的情况下，将用上述残留率校正包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或上述血红蛋白的时间分布的总峰面积的比例而得到的值作为上述测定值。
[分析系统]
图1示出实施本公开的稳定型A1c的测定方法的分析系统A1的一个例子的简要结构。分析系统A1构成为具备分析装置1和分析芯片2。分析系统A1是，将从人体采集的血液的试样Sa作为对象，基于血液中血红蛋白的分子表面电荷，执行以阳离子交换为原理的血红蛋白的分离分析的系统。以下，使用以利用了分子表面的正电荷量之差异的电泳为原理的分析系统来说明本发明，但本发明并不限于以电泳为原理的分离分析。
<分析芯片的准备>
分析芯片2保持试样Sa，并且在装填于分析装置1的状态下，提供以试样Sa为对象的分析场所。在本实施方式中，分析芯片2构成为打算在一次分析结束后要废弃的、所谓的一次性分析芯片。如图2及图3所示，分析芯片2包括主体21、混合槽22、导入槽23、过滤器24、排出槽25、电极槽26、毛细管27和联络流路28。图2是分析芯片2的俯视图，图3是沿图2的III-III线的剖视图。此外，分析芯片2不限于一次性分析芯片，也可以是用于多次分析的芯片。另外，本实施方式的分析系统不限于将独立的分析芯片2装填到分析装置1中的结构，也可以是将发挥与分析芯片2相同功能的功能部位一体地组装到分析装置1中的结构。
主体21是成为分析芯片2的基座的部件，其材质没有特别限定，例如可以举出玻璃、熔融二氧化硅、塑料等。在本实施方式中，主体21是图3中的上侧部分2A和下侧部分2B分体形成、且它们相互结合的结构。此外，不限于此，例如，也可以一体地形成主体21。
混合槽22是进行将后述的试样Sa与稀释液Ld混合的混合工序的场所的一个例子。混合槽22例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A上的贯通孔而构成为向上方开口的凹部。导入槽23是导入混合试样Sm的槽，该混合试样Sm是混合槽22中通过混合工序得到的试样溶液。导入槽23例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A上的贯通孔而构成为向上方开口的凹部。
过滤器24设置于导入槽23的开口部，该导入槽23的开口部是向导入槽23导入的导入路径的一个例子。过滤器24的具体结构没有限制，作为优选的例子，例如可以举出醋酸纤维素膜过滤器(ADVANTEC公司制，孔径0.45μm)。
排出槽25是电泳法中位于电渗流的下游侧的槽。排出槽25例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A上的贯通孔而构成为向上方开口的凹部。电极槽26是在基于电泳法的分析工序中插入电极31的槽。电极槽26例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A上的贯通孔而构成为向上方开口的凹部。联络流路28连接导入槽23与电极槽26，构成导入槽23与电极槽26的导通路径。
毛细管27是连接导入槽23与排出槽25的微细流路，是电泳法中产生电渗流(EOF，electro-osmoticflow)的场所。毛细管27例如构成为在主体21的上述下侧部分2B上形成的槽。此外，在主体21上，也可以适当地形成用于促进朝向毛细管27的光的照射以及透过了毛细管27的光的射出的凹部等。毛细管27的尺寸没有特别限制，若列举其一个例子，则其宽度为25μm～100μm，其深度为25μm～100μm，其长度为5mm～150mm。分析芯片2整体的尺寸根据毛细管27的尺寸以及混合槽22、导入槽23、排出槽25和电极槽26的尺寸和配置等适当设定。
此外，上述结构的分析芯片2是一个例子，可以适当采用能够利用电泳法进行分析的结构的分析芯片。
<分析装置>
分析装置1在装填了点样有试样Sa的分析芯片2的状态下，进行以试样Sa为对象的分析处理。如图1所示，分析装置1包括电极31、32、光源41、滤光器42、透镜43、狭缝44、检测器5、分注器6、泵61、稀释液槽71、泳动液槽72和控制部8。此外，光源41、滤光器42、透镜43和检测器5构成本发明中所说的测定部的一个例子。
电极31和电极32是用于在电泳法中对毛细管27施加预定电压的电极。电极31被插入到分析芯片2的电极槽26中，电极32被插入到分析芯片2的排出槽25中。对电极31和电极32施加的电压没有特别限制，例如为0.5kV～20kV。
光源41是发出光的部位，该光用于在电泳法中测定作为光学测定值的吸光度。光源41例如具备射出预定波长范围的光的LED(Light Emitting Diode，发光二极管)芯片。滤光器42衰减来自光源41的光中预定波长的光，并将其余波长的光透过。透镜43用于将透过了滤光器42的光聚集到分析芯片2的毛细管27的分析部位。狭缝44用于去除用透镜43聚集的光中的、可能引起散射等的多余的光。此外，光源41可以根据检测血红蛋白的原理而适当选择。在测定吸光度的情况下，选择能够照射血红蛋白的吸收波长的光源41。另外，在通过荧光、发光来检测血红蛋白的情况下，选择能够照射激发光的光源41。
检测器5接受透过分析芯片2的毛细管27而来的、来自光源41的光，例如构成为具备光电二极管、光电IC(integrate circuit，集成电路)等。与光源41同样地，检测器5也可以根据检测血红蛋白的原理而适当选择。
如上所述，从光源41发出的光到达检测器5的路径是光路。然后，在该光路与毛细管27交叉的位置上，对于该毛细管27中流动的溶液(即，试样溶液和泳动液中的任一种或其混合溶液)测定光学测定值。即，毛细管27中与从光源41到检测器5的光路相交的位置是光学测定值的测定部。作为该光学测定值，例如可以举出吸光度。吸光度表示该光路的光被毛细管27中流动的溶液吸收的程度，表示入射光强度与透射光强度之比的常用对数的值的绝对值。在这种情况下，作为检测器5，可以利用通用的分光光度计。此外，即使不使用吸光度，只要是单纯的透射光强度的值本身等的光学测定值，就可以用于本发明。以下，以使用吸光度作为光学测定值的情况为例进行说明。
分注器6用于分注期望量的稀释液Ld或泳动液Lm及混合试样Sm，例如包括喷嘴。分注器6能够通过未图示的驱动机构在分析装置1内的多个预定位置自由移动。泵61是向分注器6的吸引源及喷出源。另外，泵61也可以作为设置于分析装置1的未图示的端口的吸引源及喷出源来使用。这些端口用于泳动液Lm的填充等。另外，也可以具备与泵61不同的专用的泵。
稀释液槽71是用于贮藏稀释液Ld槽。稀释液槽71可以是永久地设置于分析装置1的槽，也可以是将封入有预定量的稀释液Ld的容器装填到分析装置1中的槽。泳动液槽72是用于贮藏泳动液Lm的槽。泳动液槽72可以是永久地设置于分析装置1的槽，也可以是将封入有预定量的泳动液Lm的容器装填在分析装置1中的槽。
控制部8控制分析装置1中的各部。如图4的硬件结构所示，控制部8具有CPU(Central Processing Unit，中央处理单元)81、ROM(Read Only Memory，只读存储器)82、RAM(Random Access Memory，随机存取存储器)83以及储存器84。各结构经由总线89以能够相互通信的方式连接。
CPU 81是中央运算处理单元，执行各种程序，或控制各部。即，CPU 81从ROM 82或储存器84读出程序，将RAM 83作为工作区域来执行程序。CPU 81按照ROM 82或储存器84中记录的程序，进行上述各结构的控制和各种运算处理。
ROM 82存储各种程序和各种数据。RAM 83作为工作区域而临时存储程序或数据。储存器84由HDD(Hard Disk Drive，硬盘驱动器)、SSD(Solid State Drive，固态硬盘)或闪存构成，存储包括操作系统在内的各种程序、以及各种数据。在本实施方式中，在ROM 82或储存器84中存储有与测定和/或判定相关的程序、各种数据。另外，也可以在储存器84中保存测定数据。
控制部8通过上述硬件结构中的CPU 81执行上述程序，在分析装置1中实施图5所示的各工序。关于这些工序的详细情况，将在后面叙述。
<稀释液、泳动液、混合试样的制备>
稀释液Ld用于通过与试样Sa混合而生成作为试样溶液的混合试样Sm。稀释液Ld的主剂没有特别限制，可以举出水、生理盐水，作为优选的例子，可以举出与后述的泳动液Lm类似成分的液体。另外，关于稀释液Ld，除了上述主剂以外，也可以根据需要而添加添加物。
泳动液Lm是，在基于电泳法的分析工序中，填充在排出槽25及毛细管27中，电泳法中产生电渗流的介质。对泳动液Lm没有特别限制，但优选使用了酸的泳动液。上述酸例如为柠檬酸、马来酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、邻苯二甲酸、丙二酸、苹果酸。另外，泳动液Lm优选含有弱碱。作为上述弱碱，例如为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)等。泳动液Lm的pH例如为pH4.5～6的范围。泳动液Lm的缓冲液的种类有MES、ADA、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES等。另外，在泳动液Lm中，也可以与稀释液Ld的说明中所述的同样地，根据需要而添加添加物。
虽然泳动液Lm、稀释液Ld和混合试样Sm例示如下，但只要是在后述的界面到达时间点由于试样溶液(混合试样Sm)与泳动液Lm的界面的到达而产生光学测定值的变化的组合，就可以任意选择。
<准备工序、电泳工序、分析工序>
接着，对使用分析系统A1进行的血红蛋白的分离分析的一个例子进行说明。图5是示出本实施方式中的血红蛋白的分离分析方法的流程图。本分离分析方法具有准备工序S1、电泳工序S2和分析工序S3。
<准备工序S1>
图6是示出准备工序S1中的具体顺序的流程图。在本实施方式中，如该图所示，准备工序S1具有试样采集工序S11、混合工序S12、泳动液填充工序S13和导入工序S14。
<试样采集工序S11>
首先，准备试样Sa。在本实施方式中，试样Sa是从人体采集的血液。作为血液，也可以是全血、成分分离血液或实施了溶血处理的血液等。然后，将分注有试样Sa的分析芯片2装填到分析装置1。
<混合工序S12>
接着，将试样Sa和稀释液Ld混合。具体而言，如图7所示，预定量的试样Sa被点样在分析芯片2的混合槽22中。接着，通过分注器6吸引预定量的稀释液槽71中的稀释液Ld，如图8所示，将预定量的稀释液Ld分注到分析芯片2的混合槽22中。然后，将泵61作为吸引源及喷出源，从分注器6反复进行稀释液Ld的吸引和喷出。由此，在混合槽22中混合试样Sa和稀释液Ld，得到作为试样溶液的混合试样Sm。试样Sa和稀释液Ld的混合也可以通过分注器6的吸引和喷出以外的方法进行。
<泳动液填充工序S13>
接着，通过分注器6吸引预定量的泳动液槽72的泳动液Lm，如图9所示，将预定量的泳动液Lm分注到分析芯片2的排出槽25中。然后，利用上述的端口覆盖排出槽25的上方的开口，通过适当地实施从端口向排出槽25内部喷出或吸引空气等方法，向排出槽25及毛细管27填充泳动液Lm。
<导入工序S14>
接着，如图10所示，利用分注器6从混合槽22采集预定量的混合试样Sm。然后，从分注器6向导入槽23导入预定量的混合试样Sm。在该导入中，混合试样Sm通过设置于导入槽23的开口部的过滤器24，该导入槽23的开口部是向导入槽23的导入路径的一个例子。另外，在本实施方式中，混合试样Sm从导入槽23通过联络流路28而被填充到电极槽26。此时，发生混合试样Sm从导入槽23经由联络流路28向电极槽26的流动，然而，混合试样Sm从导入槽23向联络流路28流动时，向与毛细管27的长度方向大致正交的方向流动(参照图2)。另一方面，毛细管27的泳动液Lm在该阶段几乎不移动。其结果是，通过在导入槽23与毛细管27的连接部(参照图3)产生剪切流，变为产生了混合试样Sm与泳动液Lm的清晰界面的状态。此外，只要是产生混合溶液Sm与泳动液Lm的界面的方法，就可以采用在导入槽23与毛细管27的边界处物理上设置可移动的过滤器、或控制性地变更流动方法等的所有手段。
<电泳工序S2>
接着，将电极31(参照图1)插入到电极槽26(参照图2)，将电极32(参照图1)插入排出槽25。接着，根据来自控制部8的指示，对电极31和电极32施加电压。该电压例如为0.5kV～20kV。由此，产生电渗流，使混合试样Sm在毛细管27中从导入槽23向排出槽25逐渐移动。此时，由于在导入槽23中填充有混合试样Sm，因此在毛细管27中连续供给混合试样Sm的状态下，使上述分析成分即血红蛋白(Hb)电泳。此时，在维持混合试样Sm与泳动液Lm的上述界面的状态下，混合试样Sm向下游方向推压泳动液Lm的同时在毛细管27中进行泳动。另外，开始来自光源41的发光，进行基于检测器5的吸光度的测定。然后，测定从电极31和电极32的电压施加开始时起的经过时间与吸光度之间的关系。
<分析工序S3>
在此，与混合试样Sm中的移动速度较快的成分(换言之，分子表面的正电荷量较少的成分)对应的吸光度峰，出现在从上述电压施加开始时起的经过时间较短的时间点。另一方面，与混合试样Sm中的移动速度较慢的成分(换言之，分子表面的正电荷量较多的成分)对应的吸光度峰，出现在从上述电压施加开始时起的经过时间较长的时间点。利用这一点，进行混合试样Sm中的成分的分析(分离测定)。根据所测定的吸光度，通过控制部8的控制，执行图11A所示的分析工序S3。本实施方式的分析工序S3包括波形形成工序S31、界面到达时间点决定工序S32以及成分确定工序S33。
<波形形成工序S31>
在本工序中，通过控制部8对所测定的上述吸光度进行运算处理，由此制作电泳图谱。此处，将电压施加开始时作为测定开始时，形成表示与该测定开始后的经过时间对应的光学测定值的变化的电泳图谱，该电泳图谱是与吸光度相关的测定波形。具体而言，通过对所测定的上述吸光度进行时间微分，形成微分值的波形。图12示出通过吸光度的时间微分来形成的微分波形的一个例子。图中的x轴是时间轴，y轴是微分值轴。在以下的图和说明中，将沿时间轴x的负方向侧设为方向x1侧，将正方向侧设为方向x2侧，将沿微分值轴y的负方向侧设为方向y1侧，将正方向侧设为方向y2侧。
<界面到达时间点决定工序S32>
本工序是决定界面到达时间点的工序，该界面到达时间点是通过施加电压而向毛细管的下游方向泳动的混合试样Sm与泳动液Lm的界面到达检测器5的时间点。该混合试样Sm与泳动液Lm的界面是电泳开始后最先出现的峰。该混合试样Sm与泳动液Lm的界面的峰如图13所示。如图13所示，在该混合试样Sm与泳动液Lm的界面所示的峰中，决定在该电泳图谱中微分值离基准值Ls最远的点。在图示的例子中，从基准值Ls沿方向y2远离的点为离基准值Ls最远的点，该点决定为最远点PL。此处，将在前述的电泳工序S2中开始了电压施加的时间点设为0，将检测到该最远点PL的时间点设为界面到达时间点。
<成分确定工序S33>
图14示出在前述波形形成工序S31中得到的、界面到达时间点以后的微分波形的一个例子。在该图中，x轴表示将开始了电压施加的时间点设为0的泳动时间(单位：秒)，y轴表示对吸光度进行时间微分后的值、即斜度(SLOPE)值(单位：mAbs/秒)。另外，泳动时间11.5秒附近的峰为图13所示的最远点PL，该时间点为界面到达时间点。然后，在本工序中，根据该微分波形来确定血红蛋白成分。具体而言，具有在界面到达时间点以后最大的峰值的组分α被确定为HbA0。而且，对于从界面到达时间点到HbA0峰为止出现的各峰，根据从界面到达时刻到该峰的检测时间为止的时间相对于从界面到达时刻到检测出HbA0的峰的时间为止的时间的比率，鉴定该峰表示的成分。例如，在图14中，这样的方式确定表示稳定型A1c(S-A1c)的峰(组分β)。
然后，根据这样确定出的各峰，计算各成分的量。具体而言，可以将被确定为某成分的峰作为极大值，将包含该极大值的组分的面积作为与该峰对应的成分的量。此处，该组分的两端可以适当决定，例如，也可以以位于该极大值的两侧的极小值作为其两端。
这样，在S331所示的总血红蛋白计算工序中，计算包含血红蛋白的组分的总峰面积。此处，HbA0量占总血红蛋白量的大部分。因此，含有血红蛋白的组分的总峰面积也可以是仅用HbA0组分来计算出的面积，并且可以以HbA0组分及其周边的组分的面积为基准，进而也可以是电泳图谱中归为血红蛋白的组分的全部面积。无论在哪种情况下，都不会对后述的校正前值(X)及校正后值(Y)的计算带来大的影响。
接着，在S332所示的校正前值计算工序中，通过计算包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，计算校正前值(X)。关于用于计算该校正前值(X)的包含稳定型A1c的组分的峰面积，作为位于图14所示的S-A1c峰的两端的极小值间的组分β的面积来求出。即，包含该稳定型A1c的组分β的峰面积是源自未进行化学修饰而残留的稳定型A1c的峰面积。因此，校正前值(X)是，包含未被化学修饰而残留的稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例。换言之，也可以说是，未考虑被被化学修饰的稳定型A1c的峰面积的比例。
接着，在S334所示的残留率计算工序中，计算修饰率(P)，该修饰率(P)是包含被化学修饰的HbA0的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积与包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值的的比例。然后，根据该修饰率(P)，计算残留率(Q)，该残留率(Q)是HbA0相对于包含HbA0的组分的峰面积与包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值的比例。
具体而言，可以认为，在相对于稳定型A1c的组分而在时间早的一侧相邻的组分、换言之在正电荷量少的一侧相邻的、泳动时间19秒附近的组分γ(第一组分)中，如后述的实施例所示，包含氨基甲酰化的HbA0和醛化的HbA0中的任一方或双方。在残留率计算工序S334中，将该组分γ相对于包含HbA0的组分的峰面积(A)与包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积(G)的合计值的比例(G/(A+G))，作为修饰率(P)。此外，如上所述，在组分γ的峰面积与包含HbA0的组分的峰面积的合计值中，包含HbA0的组分的峰面积占大部分。因此，也可以计算组分γ的峰面积(G)相对于包含HbA0的组分的峰面积的比例，作为该修饰率(P)。另外，由于包含HbA0的组分的峰面积与相当于待测体中所含的总血红蛋白的峰面积近似，因此也可以计算组分γ的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，作为该修饰率(P)。
另一方面，可以认为，相对于HbA0组分而在时间早的一侧相邻的组分、换言之在正电荷量少的一侧相邻的、泳动时间25秒附近的组分δ(第二组分)中，含有在HbA0被氨基甲酰化或醛化时与被化学修饰的HbA0一起生成的物质。在残留率计算工序S334中，如上所述，也可以根据该组分δ的峰面积(D)来计算包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积(G)，计算修饰率(P)。具体而言，也可以计算根据组分δ计算出的包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的、相对于包含HbA0的组分的峰面积与根据组分δ计算出的包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积的合计值的比例，计算修饰率(P)。此外，如上所述，在包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积与包含HbA0的组分的峰面积的合计值中，包含HbA0的组分的峰面积占大部分。因此，也可以计算根据组分δ计算出的被化学修饰的HbA0的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积的比例，作为该修饰率(P)。另外，由于包含HbA0的组分的峰面积与相当于待测体中所含的总血红蛋白的峰面积近似，因此也可以计算根据组分δ计算出的被化学修饰的HbA0的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，作为该修饰率(P)。
然后，通过从1中减去计算出的修饰率(P)来计算残留率(Q)。此外，残留率(Q)的计算不限于该计算方法。
然后，在S335所示的校正后值计算工序中，根据上述计算出的校正前值(X)及残留率(Q)，计算校正后值(Y)，该校正后值(Y)是包含未被化学修饰而残留的稳定型A1c的组分的峰面积与包含被化学修饰的稳定型A1c的组分的峰面积的合计值相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例。具体而言，通过用残留率(Q)除以校正前值(X)来计算校正后值(Y)。
此外，如作为本实施方式的其他例子的图11B所示，也可以在S332的校正前值计算工序之后，在S333所示的判别工序中，判别是否进行上述中计算出的校正前值(X)的校正。即，首先，在图11C的S333a的工序中，判断第二比例是否为第二阈值以上。具体而言，判别相对于稳定型A1c组分而在时间早的一侧相邻的组分、换言之在正电荷量少的一侧相邻的、泳动时间19秒附近的组分γ的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或所述血红蛋白的时间分布的总峰面积的比例是否为第二阈值以上。在判断为第二比例是第二阈值以上的情况下，进入S333b所示的工序。另一方面，在判断为第二比例小于第二阈值的情况下，进入S333c所示的工序，将校正前值(X)作为稳定型A1c的组分的测定值，并结束分析工序S3。
接着，在S333所示判别工序的S33b的工序中，判断第一比例是否为第一阈值以上。具体而言，判别相对于HbA0组分而在时间早的一侧相邻的组分、换言之在正电荷量少的一侧相邻的、泳动时间25秒附近的组分δ的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或上述血红蛋白的时间分布的总峰面积的比例是否为第一阈值以上。在判断为第一比例是第一阈值以上的情况下，再次返回图11A，进入S334所示的工序。另一方面，在判断为第一比例小于第一阈值的情况下，进入S333c所示的工序，将校正前值(X)作为稳定型A1c的组分的测定值，并结束分析工序S3。
<其他>
认为在氨基甲酰化的HbA0和醛化的HbA0中分子表面的电荷量接近，在组分γ中有时产生氨基甲酰化的HbA0和醛化的HbA0的合成峰。在该情况下，也可以将合成峰即组分γ的峰面积作为被化学修饰的HbA0的峰面积，根据合成峰、即组分γ的峰面积，计算残留率(Q)。也可以作为在校正前值(X)的校正中使用的、包含被化学修饰的HbA0的组分的峰面积。同样地，在HbA0被氨基甲酰化时同时产生的物质和在HbA0被醛化时同时产生的物质也被认为其分子表面的电荷量接近，有时在组分δ形成合成峰。在这种情况下，也可以同样地根据合成峰、即组分δ的峰面积，计算被化学修饰的HbA0的峰面积，根据计算出的被化学修饰的HbA0的峰面积来计算残留率(Q)。
另外，可以认为在组分γ中出现的氨基甲酰化的HbA0和醛化的HbA0与不稳定型A1c的分子表面的电荷量接近。因此，在以阳离子交换为原理的上述实施方式的测定方法中，有时不稳定型A1c的峰与作为组分γ而出现的氨基甲酰化的HbA0和醛化的HbA0各自的峰形成合成峰，或者与氨基甲酰化的HbA0和醛化的HbA0的合成峰进一步形成合成峰。在该情况下，也可以使用修正值来计算残留率(Q)，对校正前值(X)进行校正，该修正值是从合成峰的峰面积中扣除了包含未被化学修饰的健康者的待测体所表示的平均的不稳定型A1c在内的组分的峰面积的值。或者，也可以用其他手段，测定准确的不稳定型A1c的量，使用通过相当于该量的峰面积来扣除后的修正量，计算残留率(Q)，并对校正前值(X)进行校正。
另外，组分δ中出现的HbA0被氨基甲酰化时与氨基甲酰化HbA0一起生成的物质以及HbA0被醛化时与醛化HbA0一起生成的物质被认为，分子表面的电荷量与在组分δ的泳动时间中出现组分的被推定为HbA1e的血红蛋白接近。因此，在以阳离子交换为原理的上述实施方式的测定方法中，推定为该HbA1e的血红蛋白的峰有时可以与如下物质一体形成合成峰：作为组分δ而出现的与氨基甲酰化HbA0一起生成的物质以及与醛化HbA0一起生成的物质的每一个或两者。在该情况下，也可以使用修正值来计算残留率(Q)，并校正校正前值(X)，该修正值是，从合成峰的峰面积中，将包含未被化学修饰的健康者的待测体所表示的被推定为HbA1e的血红蛋白在内的组分的峰面积作为预定的峰面积值而扣除之后得到的值。作为包含未被化学修饰的健康者的待测体所表示的被推定为HbA1e的血红蛋白在内的组分的峰面积，也可以使用对多个健康者的待测体进行测定、并对所得的包含被推定为HbA1e的血红蛋白在内的组分的峰面积进行平均而得到的峰面积。或者，也可以用其他手段来测定被推定为HbA1e的量，使用通过相当于该量的峰面积来扣除后的修正量，来校正校正前值(X)。
[实施例1]
<氨基甲酰化影响>
作为实施例1，示出本公开的稳定型A1c的测定方法在通常待测体中人为地添加氰酸钠而使血红蛋白氨基甲酰化的待测体中是有效的。
[氨基甲酰化待测体的制备]
作为通常待测体，使用从健康者采集的全血。在该通常待测体中，添加氰酸钠以使得其成为下述表1所示的最终浓度，在37℃下培养，从而制备待测体1～待测体4，将它们分别作为上述试样Sa(参照图7)来使用。根据待测体中的氰酸钠浓度，待测体中的血红蛋白被氨基甲酰化。
[表1]
此外，上述表1中的待测体1的氰酸钠浓度为0mg/dL，这意味着未添加氰酸钠的、通常待测体其本身。
[泳动液]
上述泳动液Lm(参照图9)为以下的组成。
柠檬酸：40mM
硫酸软骨素C钠：1.25％w/v
哌嗪：20mM
聚氧化烯烷基醚(商品名：Emulgen LS-110，花王公司制造)：0.1％w/v
叠氮化钠：0.02％w/v
ProClin 300(注册商标)：0.025％w/v
除了以上的成分以外，还滴加pH调节用的二甲基氨基乙醇而调节为pH5.0。
[稀释液]
上述稀释液Ld(参照图8)具有以下组成。
柠檬酸：38mM
硫酸软骨素C钠：0.95％w/v
1-(3-磺丙基)吡啶羟基化物分子内盐(NDSB-201)：475mM
2-吗啉代乙烷磺酸(MES)：19mM
聚氧化烯烷基醚(商品名：Emulgen LS-110，花王公司制造)：0.4％w/v
叠氮化钠：0.02％w/v
ProClin 300：0.025％w/v
除了以上的成分以外，还滴加pH调节用的二甲基氨基乙醇，调节为pH6.0。
[混合试样Sm]
将1.5μL的试样Sa添加到60μL的稀释液Ld中，制备混合试样Sm(参照图8～图10)。将该混合试样Sm供给所述分析系统A1，进行血红蛋白的分离分析。
[电泳图谱]
将施加电压的时间点作为分离分析的开始的时间点，得到将施加电压的时间点设为0秒时间点的电泳图谱。未添加氰酸钠的待测体1的电泳图谱如图15所示。检测到最远点PL的界面到达时间点是泳动时间11.5秒附近。另外，HbF组分、即组分ε在泳动时间17.3秒附近具有峰。稳定型A1c组分、即组分β在泳动时间21秒附近具有峰。HbA0组分、即组分α在泳动时间27.3秒附近具有峰。并且，在比组分β早的泳动时间19秒附近(19.4秒)具有峰的组分γ被认为包含不稳定型A1c的组分，但该组分也包括被氨基甲酰化的HbA0。另外，在比组分α早的泳动时间25秒附近(25.2秒)具有峰的组分δ包括在HbA0被氨基甲酰化时与氨基甲酰化HbA0一起产生的物质。
以12.5mg/dL的浓度添加有氰酸钠的待测体2的电泳图谱如图16所示。检测到最远点PL的界面到达时间点与待测体1几乎没有变化，但分别在泳动时间16.7秒、19.0秒、20.0秒、23.8秒和25.6秒观察到组分ε、组分γ、组分β、组分δ和组分α的峰。而且，组分γ和组分δ的面积比待测体1增大。
以18.8mg/dL的浓度添加有氰酸钠的待测体3的电泳图谱如图17所示。检测到最远点PL的界面到达时间点与待测体1及待测体2几乎没有变化，但分别在泳动时间16.9秒、18.5秒、19.6秒、23.5秒和25.4秒观察到组分ε、组分γ、组分β、组分δ和组分α的峰，与待测体2的时间大致相同。而且，组分γ和组分δ的面积比待测体2进一步增大。
以25mg/dL的浓度添加有氰酸钠的待测体4的电泳图谱如图18所示。检测到最远点PL的界面到达时间点与从待测体1到待测体3几乎没有变化，观察到组分ε、组分γ、组分β、组分δ和组分α的峰的泳动时间也与待测体3大致相同，但组分γ及组分δ的面积比待测体3进一步增大。此外，在待测体1、待测体2、待测体3、待测体4中观察各自的组分的时间根据待测体而不同，但对本实施例中的稳定型A1c的测定没有影响。
[校正前值(X)的计算]
根据图15～图18中的组分β，如下述表2所示那样计算出校正前值(X)，该校正前值(X)是稳定型A1c的峰面积的比例。
[表2]
在计算上述表2中的校正前值(X)时，首先，计算各电泳图谱中斜度(SLOPE)值为0以上的部分的面积(其中，排除以PL为峰的部分)的总和，将其作为包含血红蛋白的组分的总峰面积。包含血红蛋白的组分的总峰面积包括被确定为组分α的HbA0的峰面积(A)。然后，根据组分β的峰面积相对于包含该血红蛋白的组分的总峰面积的比例，计算出上述表2中的校正前值(X)。
如上述表2所示，确认到随着待测体中的氰酸钠浓度变高而校正前值(X)变低。另外，表示相对于待测体1的校正前值(X)的、增减的比例(即，从各待测体的校正前值(X)中减去作为待测体1的校正前值(X)即6.48％后的值的、相对于待测体1的校正前值(X)的比例)的相对误差的值也随着氰酸钠浓度的增大而增大。这表明，稳定型A1c量由于受到氰酸钠的氨基甲酰化作用而减少。
[基于组分γ的校正]
接着，使用相对于被确定为稳定型A1c的组分β而在正电荷量少的一侧相邻、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分γ，如下述表3所示，进行校正前值(X)的校正。
[表3]
将组分γ面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例列举在上述表3中的左端列，具体而言，在待测体1中为2.9％，待测体2中为6.1％，待测体3中为8.1％，待测体4中为9.6％。
已知有在组分γ中包含不稳定型A1c(L-A1c)。因此，将被认为源自不稳定型A1c的一定的峰面积的比例的3％作为预定的峰面积值，并从上述的组分γ的峰面积的比例中扣除，由此计算出上述表3中所示的修饰率(P)。此外，该源自不稳定型A1c的峰面积的比例可以是，对被认为不受氨基甲酰化或醛化影响的多个健康者的待测体进行分离分析而得到的包含不稳定型A1c(L-A1c)的组分的峰面积的比例的统计上的值，并不限于上述的3％。在此，待测体1中组分γ为2.9％，低于该3％，在该情况下，在计算上作为修饰率(P)为0来处理。可以看出，该修饰率(P)随着待测体中的氰酸钠浓度的升高而增大。此外，该修饰率(P)是包含氨基甲酰化的HbA0的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，但包含血红蛋白的组分的总峰面积近似于包含HbA0的组分的峰面积与包含氨基甲酰化的HbA0的峰面积的合计值。因此，如上所述，即便将包含氨基甲酰化的HbA0的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例作为修饰率(P)，也能够适当地校正。
从1中减去该修饰率(P)后的值为上述表3中的残留率(Q，但以百分率表示)，认为以该比例残留的稳定型A1c作为上述表2中的校正前值(X)、即组分β而出现在电泳图谱中。因此，用该残留率(Q)除以校正前值(X)的值、即上述表3中的校正后值(Y)被认为，包含未被化学修饰而残留的稳定型A1c的组分的峰面积与包含被化学修饰的稳定型A1c的组分的峰面积的合计值相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例。此处，由上述表2可知，基于校正前值(X)的相对误差的绝对值在待测体4中为最大的6.5％，然而，根据上述表3，基于校正后值(Y)的相对误差(即，从各待测体的校正后值(Y)减去被认为不受化学修饰影响的待测体1的校正前值(X)(参照表2)后的值的、相对于待测体1的校正前值(X)的比例)的绝对值在待测体3中为最大的1.8％。因此，通过进行校正，由于化学修饰而产生的相对误差的幅度会变小。
因此，认为通过使用了组分γ的校正，可以减轻或排除由于氨基甲酰化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
[基于组分δ的校正]
在基于组分δ的校正中，从下述表4中的左端列所示的、组分δ的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例中，将被认为不受氨基甲酰化或醛化影响的健康者的待测体通常所具有的组分δ的峰面积的比例即4％作为预定的峰面积值而扣除。此外，该扣除的值可以是对多个健康者的待测体进行分离分析而得到的组分δ的峰面积的比例的统计上的值，并不一定限于该4％。而且，HbA0被化学修饰时一起生成的物质的峰面积表示氨基甲酰化HbA0的峰面积、即组分γ的约1.65倍。由此，用该预定系数(a)、即1.65除以从组分δ中扣除4％后的值而得到的值视为氨基甲酰化HbA0的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，将其作为修饰率(P)。此外，残留率(Q)、校正后值(Y)及相对误差的计算与表3相同。其中，表4中的校正后值(Y)是用表4中的残留率(Q)除以上述表2中的校正前值(X)而得到的值。另外，表4中的相对误差是与表3同样地从各待测体的校正后值(Y)减去被认为不受化学修饰的影响的待测体1的校正前值(X)(参照表2)后的值的、相对于待测体1的校正前值(X)的比例。
[表4]
根据上述表4，也可以说，校正后值(Y)的相对误差的幅度比校正前的校正前值(X)的相对误差(参照表2)的幅度小。因此，认为通过使用了组分δ的校正，可以减轻或排除由于氨基甲酰化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
[关于氨基甲酰化影响的小结]
作为以上的表2～表4的总结，对于各待测体的氰酸钠浓度，将未进行校正的情况、进行了基于组分γ的校正的情况、和进行了基于组分δ的校正的情况下的相对误差表示在下述表5中。
[表5]
由将上述表5图表化的图19可知，无论哪种校正，都至少减轻了由于氰酸钠引起的稳定型A1c的氨基甲酰化影响。
[第一比例和第二比例]
此外，关于上述表2所示的校正前值(X)，以下，对使用第一比例和第二比例来判别是否进行基于上述的组分γ或组分δ的校正的情况进行说明。
组分γ相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例、即第二比例如下述表6所示，该组分γ是相对于被确定为稳定型A1c的组分β、在正电荷量少的一侧、换言之在电泳速度快的一侧相邻的组分。另外，根据组分δ相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积来计算出的第一比例也如下述表6所示，该组分δ是相对于被确定为HbA0的组分α、在正电荷量少的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分。
[表6]
即，组分γ的面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例即第二比例在待测体1中为2.9％、待测体2中为6.1％、待测体3中为8.1％、待测体4中为9.6％。另外，组分δ的面积的比例即第一比例在待测体1中为4.5％、待测体2中为9.3％、待测体3中为11.8％、待测体4为16.1％。
[校正的必要性的判定]
判断上述表6中的第一比例是否为第一阈值以上。作为例子，第一阈值使用超过如下最大值的值、即9％：该最大值是，在被认为不受氨基甲酰化或醛化影响的待测体中，通常观察到的组分δ的峰面积的最大值。同样地，判断第二比例是否为第二阈值以上。作为例子，第二阈值使用超过如下最大值的值、即5％：该最大值是，在未被氨基甲酰化或醛化而被认为不稳定型A1c量为通常的待测体、即健康者的待测体中，在该泳动速度下通常观察到的组分γ的峰面积的最大值。
首先，关于待测体2～4，第一比例均为第一阈值、即9％以上。并且，第二比例也为第二阈值、即5％以上。因此，判断为用残留率校正包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或上述电泳图谱的总峰面积的比例。另一方面，对于待测体1，第二比例小于第二阈值、即5％，并且第一比例小于第一阈值、即9％。因此，判断为不进行上述校正。此外，在本实施例中，判断第一比例是否为第一阈值以上、且第二比例是否为第二阈值以上。但是，也可以仅判断第一比例是否为第一阈值以上，来判断是否进行校正。
[基于组分γ的校正]
接着，使用相对于被确定为稳定型A1c的组分β而在正电荷量少的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分γ，如下述表7所示，进行上述表2的校正前值(X)的校正。
[表7]
在上述表7中的左端列列举了组分γ面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，具体而言，在待测体1中为2.9％、待测体2中为6.1％、待测体3中为8.1％、待测体4中为9.6％。
在待测体1中，如表6所示，第一比例小于第一阈值，第二比例小于第二阈值。因此，不进行基于残留率(Q)的校正，将表2所示的校正前值(X)作为稳定型A1c组分的测定值。此外，为了便于比较从待测体2到待测体4的校正后值(Y)和相对误差，在表7的校正后值(Y)栏中记载校正前值(X)、即6.48％。
另一方面，在待测体2～4中，如表6所示，第一比例为第一阈值以上，且第二比例为第二阈值以上。因此，首先，作为不受氨基甲酰化或醛化影响的、被认为不稳定型A1c量是通常量的健康者的待测体通常所具有的组分γ的峰面积，将多个健康者的组分γ的峰面积的平均值、即3％作为预定的峰面积值而从组分γ的峰面积中扣除。该值为上述表7中的修饰率(P)。认为从1中减去该值的值为上述表7中的残留率(Q，以百分率表示)，以该比例残留的稳定型A1c作为上述表2中的校正前值(X)、即组分β而出现在电泳图谱中。因此，用该残留率(Q)除以校正前值(X)而得到的值、即上述表7中的校正后值(Y)被认为真正的稳定型A1c量，将该校正后值(Y)作为稳定型A1c组分的测定值。此处，由上述表2可知，基于校正前值(X)的相对误差的绝对值在待测体4中为最大的6.5％，然而，根据上述表7，基于校正后值(Y)的相对误差(即，从各待测体的校正后值(Y)中减去被认为不受化学修饰影响的待测体1的校正前值(X)(参照表2)后的值的、相对于待测体1的校正前值(X)的比例)的绝对值在待测体3中为最大的1.8％。因此，通过判定校正的必要性、并在判定为需要校正的情况下进行校正，由于化学修饰而产生的相对误差的幅度会变小。
因此，认为通过判定校正的必要性、并在判定为需要校正的情况下进行使用了组分γ的校正，能够减轻或排除由于氨基甲酰化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
[基于组分δ的校正]
接着，使用相对于被确定为HbA0的组分α而在正电荷量少的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分δ，如下述表8所示，进行上述表2的校正前值(X)的校正。
[表8]
在上述表8中的左端列列举了组分δ的面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，具体而言，在待测体1中为4.5％，待测体2中为9.3％，待测体3中为11.8％，待测体4为16.1％。
此处，如上所述，在待测体1中，如表6所示，第一比例小于第一阈值，另外，第二比例小于第二阈值。因此，不进行基于残留率(Q)的校正。虽然没有校正待测体1的校正前值(X)，但为了便于比较从待测体2到待测体4的校正后值(Y)和相对误差，在表8的校正后值(Y)栏中记载校正前值(X)的6.48％。
另一方面，在待测体2～4中，如表6所示，第一比例为第一阈值以上，且第二比例为第二阈值以上。因此，首先，作为被认为不受氨基甲酰化或醛化影响的健康者的待测体中通常观察到的组分δ的峰面积，将多个健康者的组分δ的峰面积的平均值、即4％作为预定的峰面积值而从组分δ的峰面积中扣除。而且，HbA0被化学修饰时一起生成的物质的峰面积表示氨基甲酰化HbA0的峰面积即组分γ的约1.65倍。由此，用1.65这样的预定系数(a)除以从组分δ中扣除预定的峰面积值即4％后的值而得到的值视为，氨基甲酰化HbA0的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，并将其作为修饰率(P)。此外，残留率(Q)、校正后值(Y)和相对误差的计算与表4相同。其中，表8中的校正后值(Y)是用表8中的残留率(Q)除以上述表2中的校正前值(X)而得到的值。另外，表8中的相对误差是与表4同样地从各待测体的校正后值(Y)减去被认为不受化学修饰影响的待测体1的校正前值(X)(参照表2)后的值的、相对于待测体1的校正前值(X)的比例。
根据上述表8，也可以说，校正后值(Y)的相对误差的幅度比校正前的校正前值(X)的相对误差(参照表2)的幅度小。因此，认为通过判定校正的必要性、并在判定为需要校正的情况下进行使用了组分δ的校正，也能够减轻或排除由于氨基甲酰化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
[关于氨基甲酰化影响的小结]
作为以上的表2、表7及表8的总结，将对以各氰化钠浓度处理后的待测体不进行校正而进行测定的情况、判定校正的必要性并在判定为需要校正的情况下使用基于组分γ的校正进行测定的情况、判定校正的必要性并在判定为需要校正的情况下使用基于组分δ的校正进行测定的情况下的相对误差记载在下述表9中。
[表9]
如果将上述表9所示的相对误差与上述表5所示的相对误差进行比较，则对于使用了组分γ的校正没有变化，但对于使用了组分δ的校正，待测体1的相对误差在表5中为0.3％，表9中相对误差进一步变小为0.0％。由上可知，在进行了使用第一阈值和第二阈值的判定的基础上，根据需要通过残留率(Q)对校正前值(X)进行校正，由此不会因不必要的校正而相对误差反而增加，能够最大程度地排除由于氰酸钠引起的稳定型A1c的氨基甲酰化影响。
[实施例2]
<醛化影响>
作为实施例2，示出本公开的稳定型A1c的测定方法在通常待测体中人为地添加乙醛而使血红蛋白醛化的待测体中也是有效的。
[醛化待测体的制备]
作为通常待测体，使用从健康者采集的全血。在该通常待测体中，添加乙醛以使得其成为下述表10所示的最终浓度，在37℃下培养，从而制备待测体1～待测体4，将它们分别作为所述试样Sa(参照图7)来使用。根据待测体中的乙醛浓度，待测体中的血红蛋白被醛化。
[表10]
此外，上述表10中的待测体5的乙醛浓度为0mg/dL，这意味着未添加乙醛的、通常待测体本身。另外，泳动液Lm、稀释液Ld及混合试样Sm与上述实施例1相同。
[电泳图谱]
将施加电压的时间点作为分离分析的开始的时间点，得到将施加电压的时间点作为0秒时间点的电泳图谱。未添加乙醛的待测体5的电泳图谱如图20所示。施加电压的时间点是分离分析开始的时间点，是电泳图谱上的泳动时间0秒的时间点。检测到最远点PL的界面到达时间点是泳动时间11.9秒附近。另外，HbF组分、即组分ε在泳动时间18.8秒附近具有峰。稳定型A1c组分、即组分β在泳动时间21.9秒附近具有峰。HbA0组分、即组分α在泳动时间28.3秒附近具有峰。并且，在比组分β早的泳动时间20.4秒附近具有峰的组分γ被认为是包含不稳定型A1c的组分，但该组分也包含被醛化的HbA0。另外，在比组分α早的泳动时间26.2秒附近具有峰的组分δ也包括被醛化的HbA0。
以12.5mg/dL的浓度添加有乙醛的待测体6的电泳图谱如图21所示。另外，以25mg/dL的浓度添加有乙醛的待测体7的电泳图谱如图22所示。由图20～图22可知，与上述的氨基甲酰化的情况相同，随着乙醛的浓度增大，组分γ及组分δ的面积会增大。
[校正前值(X)的计算]
根据图20～图22中的组分β，作为稳定型A1c的峰面积的比例的校正前值(X)如下述表11所示那样计算出。另外，校正前值(X)的计算方法与上述实施例1相同。
[表11]
如上述表11所示，确认到随着待测体中的乙醛浓度变高而校正前值(X)变低。另外，表示相对于待测体5的校正前值(X)的、增减的比例(即，从各待测体的校正前值(X)中减去待测体5的校正前值(X)即5.47％后的值的、相对于待测体5的校正前值(X)的比例)的相对误差的值也随着乙醛浓度的增大而增大。这表明，稳定型A1c的量由于受到乙醛的醛化作用而逐渐减少。
[基于组分γ的校正]
接着，使用相对于被确定为稳定型A1c的组分β而在正电荷量少的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分γ，如下述表12所示，进行上述表11的校正前值(X)的校正。
[表12]
首先，在上述表12中的左端列列举了组分γ的面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，具体而言，在待测体5中为2.4％，待测体6中为4.6％，待测体7中为7.3％。
根据与上述实施例1相同的理由，从该组分γ的峰面积的比例中扣除3％，这是作为上述表12中所示的修饰率(P)而记载的数值。此处，待测体5中的组分γ为2.4％，低于该3％，但在该情况下，在计算上以修饰率(P)为0来处理。可以看出，该修饰率(P)随着待测体中的乙醛浓度的升高而增大。另外，由于与上述实施例1相同的理由，即使将包含被醛化的HbA0的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例设为修饰率(P)，也能够适当地校正。
从1中减去该修饰率(P)后的值为上述表中的残留率(Q，以百分率表示)，认为以该比例残留的稳定型A1c作为上述表11中的校正前值(X)、即组分β而出现在电泳图谱中。因此，用该残留率(Q)除以校正前值(X)而得到的值、即上述表12中的校正后值(Y)被认为是，包含未被化学修饰而残留的稳定型A1c的组分的峰面积与包含被化学修饰的稳定型A1c的组分的峰面积的合计值相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例。此处，由上述表11可知，基于校正前值(X)的相对误差的绝对值在待测体7中为最大的5.1％，然而，根据上述表12，基于校正后值(Y)的相对误差(即，从各待测体的校正后值(Y)中减去被认为不受化学修饰影响的待测体5的校正前值(X)(参照表11)后的值的、相对于待测体5的校正前值(X)的比例)的绝对值在待测体7中为最大的0.8％。因此，通过进行校正，由于化学修饰而产生的相对误差的幅度会变小。
因此，认为通过使用了组分γ的校正，可以减轻或排除由于醛化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
[基于组分δ的校正]
对使用相对于被确定为HbA0的组分α而在正电荷量低的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分δ、并进行上述表11的校正前值(X)的校正的情况进行说明。此外，在基于该组分δ的校正中，如下述表13所示，基于与上述实施例1相同的理由，从组分δ的峰面积的比例中，4％作为预定的峰面积值而被扣除。并且，在HbA0被化学修饰时一起生成的物质的峰面积表示组分γ中所含的醛化HbA0的峰面积的约1.65倍。由此，通过用1.65这样的预定系数除以从组分δ中扣除4％后得到的值，计算修饰率(P)。此外，残留率(Q)、校正后值(Y)以及相对误差的计算与表12相同。其中，表13中的校正后值(Y)是用表13中的残留率(Q)除以上述表11中的校正前值(X)而得到的值。另外，表13中的相对误差是与表12同样地，从各待测体的校正后值(Y)中减去被认为不受化学修饰影响的待测体5的校正前值(X)(参照表11)后的值的、相对于待测体5的校正前值(X)的比例。
[表13]
根据上述表13，也可以说，校正后值(Y)的相对误差的幅度小于校正前的校正前值(X)的相对误差的幅度。因此，认为通过使用了组分δ的校正，可以减轻或排除由于醛化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
在使用组分δ进行校正的情况下，在实施例1所示的氨基甲酰化影响的校正中，作为对从组分δ(％)中扣除4％后的值进行去除的预定系数而使用了1.65。而且，在实施例2所示的醛化影响的校正中，也同样地使用该预定系数、即1.65。通过如上所述那样使用相同的系数，即使在HbA0被氨基甲酰化时产生的物质和HbA0被醛化时产生的物质被包含在相同的组分δ中的情况下，也能够避免任何化学修饰的影响。此外，在已知分离分析的待测体的血红蛋白未被氨基甲酰化而被醛化的情况下，也可以使用适合于避免醛化影响的系数。在已知分离分析的待测体的血红蛋白被氨基甲酰化而未被醛化的情况下，也是同样的。
[关于醛化影响的小结]
作为以上的表11～表13的总结，将针对各待测体的乙醛浓度，未进行校正的情况、进行了基于组分γ的校正的情况、以及进行了基于组分δ的校正的情况下的相对误差记载在下述表14中。
[表14]
从将上述表14图表化的图23也可知，无论哪种校正，都至少减轻了由于乙醛引起的稳定型A1c的醛化影响。
[第一比例和第二比例]
此外，关于上述表11所示的校正前值(X)，以下，对使用第一比例和第二比例来判别是否进行基于上述的组分γ或组分δ的校正的情况进行说明。
第二比例和第一比例如下表15所示，该第二比例根据组分γ相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积来计算出，该组分γ是相对于被确定为稳定型A1c的组分β而在正电荷量少的一侧、换言之在电泳速度快的一侧相邻的组分，该第一比例根据组分δ相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积来计算出，该该组分δ是相对于被确定为HbA0的组分α而在正电荷量少的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分。
[表15]
即，组分γ面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例、即第二比例在待测体5中为2.4％、待测体6中为4.6％、待测体7中为7.3％。另外，组分δ面积的比例、即第一比例在待测体5中为4.5％、在待测体6中为8.1％、待测体7中为12.6％。
[校正的必要性的判定]
判断上述表15中的第一比例是否为第一阈值以上。关于第一阈值，与上述实施例1同样地使用9％。同样地，判断第二比例是否为第二阈值以上。第二阈值也与上述实施例1同样地使用5％。
首先，关于待测体7，第一比例为第一阈值即9％以上，并且第二比例为第二阈值即5％以上。因此，判断为用残留率校正包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或上述电泳图谱的总峰面积的比例。另一方面，对于待测体5和待测体6，第一比例小于第一阈值即9％，并且第二比例小于第二阈值即5％。因此，判断为不进行上述校正。
[基于组分γ的校正]
接着，使用相对于被确定为稳定型A1c的组分β而在正电荷量少的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分γ，如下述表16所示，进行上述表11的校正前值(X)的校正。
[表16]
首先，在上述表13中的左端列列举了组分γ面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，具体而言，在待测体5中为2.4％、待测体6中为4.6％、待测体7中为7.3％。
首先，在待测体5和待测体6中，如表15所示，第一比例均小于第一阈值，并且第二比例小于第二阈值。因此，不进行基于残留率(Q)的校正，将校正前值(X)作为稳定型A1c组分的测定值。此外，对于待测体5和待测体6，虽然如上所述那样没有校正校正前值(X)，但为了便于比较待测体7的校正后值(Y)和相对误差，在表13的校正后值(Y)栏中示出校正前值(X)、即5.47％及5.36％。
另一方面，在待测体7中，如表15所示，第一比例为第一阈值以上，且第二比例为第二阈值以上。与上述实施例1同样地，作为被认为不受氨基甲酰化或醛化影响的、不稳定型A1c量为通常量的健康者的待测体通常所具有的组分γ的峰面积，将多个健康者的组分γ的峰面积的平均值、即3％作为预定的峰面积值而从组分γ的峰面积中扣除。该值是上述表16中的修饰率(P)。从1中减去该值后的值为上述表16中的残留率(Q，以百分率表示)，认为以该比例残留的稳定型A1c作为上述表11中的校正前值(X)、即组分β而出现在电泳图谱中。因此，用该残留率(Q)除以校正前值(X)而得到的值、即上述表16中的校正后值(Y)被认为是真正的稳定型A1c量，将该校正后值(Y)作为稳定型A1c组分的测定值。此处，由上述表11可知，基于校正前值(X)的相对误差的绝对值在待测体7中为最大的5.1％，然而，根据上述表16，基于校正后值(Y)的相对误差(即，从各待测体的校正后值(Y)中减去被认为不受化学修饰影响的待测体5的校正前值(X)(参照表11)后的值的、相对于待测体5的校正前值(X)的比例)的绝对值减少至0.8％。因此，通过判定校正的必要性、并在判定为需要校正的情况下进行校正，由于化学修饰而产生的相对误差的幅度会变小。
因此，认为通过判定校正的必要性、并在判定为需要校正的情况下，通过使用了组分γ的校正，能够减轻或排除由于醛化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
[基于组分δ的校正]
接着，使用相对于被确定为HbA0的组分α而在正电荷量少的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分δ，如下述表17所示，进行上述表11的校正前值(X)的校正。
[表17]
首先，在上述表17中的左端列列举了组分δ的面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，具体而言，在待测体5中为4.5％，待测体6中为8.1％，待测体7中为12.6％。
此处，如上所述，在待测体5和待测体6中，如表15所示，第一比例均小于第一阈值，并且第二比例小于第二阈值。因此，不进行基于残留率(Q)的校正。虽然没有对待测体5和待测体6的校正前值(X)进行校正，但为了便于比较待测体7的校正后值(Y)和相对误差，在表17的校正后值(Y)栏中示出校正前值(X)的5.47％及5.36％。
另一方面，在待测体7中，如表15所示，第一比例为第一阈值以上，且第二比例为第二阈值以上。因此，首先，与上述实施例1同样地，作为被认为不受氨基甲酰化或醛化影响的健康者的待测体中通常观察到的组分δ的峰面积，将多个健康者的组分δ的峰面积的平均值、即4％作为预定的峰面积值而从组分δ的峰面积中扣除。并且，与上述实施例1同样地，用前述的预定系数即1.65除以从组分δ中扣除预定的峰面积值即4％后的值，计算醛化HbA0的峰面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，将其作为修饰率(P)。此外，残留率(Q)、校正后值(Y)、以及相对误差的计算与表16相同。其中，表17中的校正后值(Y)是将上述表11中的校正前值(X)用表17中的残留率(Q)校正后的值。另外，表17中的相对误差是与表16同样地从各待测体的校正后值(Y)中减去被认为不受化学修饰影响的待测体5的校正前值(X)(参照表11)后的值的、相对于待测体5的校正前值(X)的比例。
根据上述表17，也可以说，校正后值(Y)的相对误差的幅度小于校正前的校正前值(X)的相对误差(参照表11)的幅度。因此，认为通过判定校正的必要性、并在判定为需要校正的情况下进行使用了组分δ的校正，也能够减轻或排除由于醛化引起的化学修饰的影响，求出更接近稳定型A1c的比例的值，该稳定型A1c的比例反映了过去1～2个月的平均血糖值。
[关于醛化影响的小结]
作为以上的表11、表16和表17的总结，将对以各乙醛浓度处理后的待测体不进行校正而测定的情况、判定校正的必要性并在判定为需要校正的情况下使用基于组分γ的校正进行测定的情况、判定校正的必要性并在判定为需要校正的情况下使用基于组分δ的校正进行测定的情况下的相对误差记载在下述表18中。
[表18]
从以乙醛浓度为横轴对上述表18所示的相对误差进行图表化的图24可知，在进行使用第一阈值和第二阈值的判定的基础上，根据需要通过残留率(Q)对校正前值(X)进行校正，由此可以减轻由于乙醛引起的对稳定型A1c的醛化影响。
[实施例3]
<不稳定型A1c的影响>
本公开的稳定型A1c的测定方法在通常待测体中人为地添加葡萄糖而产生不稳定型A1c的待测体中也是有效的。
[包含不稳定型A1c的待测体的制备]
作为通常待测体，使用从健康者采集的全血。在该通常待测体中，添加D-葡萄糖而使其成为下述表19所示的最终浓度，在37℃下培养，从而制备待测体8～待测体12，将它们分别作为所述试样Sa(参照图7)来使用。根据待测体中的D-葡萄糖浓度的增加，待测体中的不稳定型A1c的浓度会增加。
[表19]
此外，上述表19中的待测体8的D-葡萄糖浓度为0mg/dL，这意味着未添加D-葡萄糖的、通常待测体本身。另外，泳动液Lm、稀释液Ld及混合试样Sm与上述实施例1相同。
[电泳图谱]
得到将施加电压的时间点作为分离分析的开始的时间点、将施加电压的时间点作为0秒时间点的电泳图谱。未添加葡萄糖的待测体8的电泳图谱如图25所示。施加电压的时间点是分离分析开始的时间点，是电泳图谱上的泳动时间0秒的时间点。检测到最远点PL的界面到达时间点是泳动时间12.3秒附近。另外，HbF组分、即组分ε在泳动时间18.3秒附近具有峰。稳定型A1c组分、即组分β在泳动时间22.1秒附近具有峰。HbA0组分、即组分α在泳动时间28.4秒附近具有峰。并且，在比组分β早的泳动时间20.8秒附近具有峰的组分γ被认为是包含不稳定型A1c的组分，但该组分也包含被氨基甲酰化的HbA0、被醛化的HbA0。另外，在比组分α早的泳动时间26.3秒附近具有峰的组分δ包含当HbA0被氨基甲酰化或醛化时产生的物质。
分别以375mg/dL的浓度添加D-葡萄糖的待测体9、以750mg/dL的浓度添加D-葡萄糖的待测体10、以1125mg/dL的浓度添加D-葡萄糖的待测体11、以1500mg/dL的浓度添加D-葡萄糖的待测体12的电泳图谱分别如图26、图27、图28和图29所示。由图25～图29可知，与上述的氨基甲酰化、醛化的情况同样地，随着用于制作不稳定型A1c的D-葡萄糖的浓度的增大，组分γ的峰面积增大。组分δ的峰面积也稍微增大，但可以确认其增加量与组分γ相比极少。这样，通过用D-葡萄糖处理待测体，即使待测体中的不稳定型A1c变高，组分δ的峰面积也不会变大。另一方面，通过用氨基甲酰化、醛化来处理待测体，当待测体中的氨基甲酰化HbA0和/或醛化HbA0增加时，组分δ的峰面积增加。因此，通过使用组分δ的峰面积来进行校正，能够不受包含不稳定型A1c的待测体的影响而适当地校正氨基甲酰化、醛化影响。
[校正前值(X)的计算]
根据图25～图29中组分β，稳定型A1c峰面积的比例即校正前值(X)如下述表20所示那样计算出。此外，校正前值(X)的计算方法与上述实施例1相同。
[表20]
| 待测体 | 校正前值(X)(％) | 相对误差(％) |
| 8 | 5.61 | 0.0 |
| 9 | 5.64 | 0.5 |
| 10 | 5.70 | 1.6 |
| 11 | 5.76 | 2.7 |
| 12 | 5.71 | 1.8 |
如上述表20所示，确认到随着待测体中的葡萄糖浓度变高而校正前值(X)稍微变高，但没有减少。另外，表示相对于待测体8的校正前值(X)的、增减的比例的相对误差的值也几乎不会随着葡萄糖浓度的增大而变化。这符合于稳定型A1c量几乎不会受到葡萄糖的化学修饰。
[基于组分γ的校正]
接着，使用相对于被确定为稳定型A1c的组分β而在正电荷量低的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分γ，如下述表21所示进行校正前值(X)的校正。
[表21]
在上述表21中的左端列列举了组分γ面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，具体而言，在待测体8中为1.84％、待测体9中为3.53％、待测体10中为5.08％、待测体11中为6.76％、待测体12中为8.53％。
根据与上述实施例1同样的理由，作为不受氨基甲酰化或醛化影响的、不稳定型A1c量被认为是通常的健康者的待测体中通常观察到的组分γ的峰面积，将多个健康者的组分γ的峰面积的平均值、即3％作为预定的峰面积值而从该组分γ的峰面积的比例中扣除，这是作为上述表21所示的修饰率(P)而示出的数值。此处，待测体8中的组分γ为1.8％，低于该3％，在该情况下，在计算上作为修饰率(P)为0来处理。
从1中减去该修饰率(P)后的值为上述表21中的残留率(Q，其中以百分率表示)。然后，用残留率(Q)除以校正前值(X)，计算出上述表21中的校正后值(Y)。然后，根据校正后值(Y)，计算出使用组分γ进行校正时的相对误差。即，从各待测体的校正后值(Y)中减去待测体8的校正前值(X)(参照表20)后的值的、相对于待测体8的校正前值(X)的比例是上述表21中的相对误差。
[基于组分δ的校正]
在下述表22中，对使用相对于被确定为HbA0的组分α而在正电荷量低的一侧、换言之在泳动速度快的一侧相邻的组分δ来对上述表20的校正前值(X)进行校正的情况进行说明。此外，在基于该组分δ的校正中，基于与上述实施例1同样的理由，从组分δ的峰面积的比例中作为预定的峰面积值而扣除4％。并且，在对HbA0进行化学修饰时一起生成的物质的峰面积表示组分γ中所含的醛化HbA0的峰面积的约1.65倍。由此，通过用1.65这样的预定系数除以从组分δ中扣除4％后得到的值，计算修饰率(P)。此外，残留率(Q)、校正后值(Y)及相对误差的计算与表21相同。其中，表22中的校正后值(Y)是用表22中的残留率(Q)除以上述表20中的校正前值(X)而得到的值。另外，表22中的相对误差是与表21同样地从各待测体的校正后值(Y)中减去待测体8的校正前值(X)(参照表20)后的值的、相对于待测体8的校正前值(X)的比例。
[表22]
[关于不稳定型A1c影响的小结]
作为以上的表20～表22的总结，将对以各葡萄糖浓度处理后的待测体进行了基于组分γ的校正的情况和进行了基于组分δ的校正的情况下的相对误差记载在下述表23中。
[表23]
从将上述表23图表化的图30也可知，使用了组分δ的校正与使用了组分γ的校正相比，相对误差变小。这是因为，组分γ的峰面积受到不稳定型A1c的影响，与此相对，组分δ的峰面积不受不稳定型A1c量的影响。即，通过进行使用了包含HbA0被化学修饰时与被化学修饰的HbA0一起生成的物质在内的组分的校正，即使是包含不稳定型A1c的待测体，也能够准确地测定稳定化A1c。因此，确认到与使用了包含被化学修饰的HbA0在内的组分的校正相比，进行该校正的稳定型A1c的测定方法更有效。
此外，如下所述，如果在组分δ的峰面积超过一定的值的情况下进行校正，则能够避免错误地校正氨基甲酰化、醛化HbA0的含量少且含有大量不稳定型A1c的待测体。
[第一比例和第二比例]
与实施例1和实施例2同样地，计算出第一比例和第二比例。其结果如下述表24所示。
[表24]
即，组分γ的面积的比例、即第二比例在待测体8中为1.8％、待测体9中为3.5％、待测体10中为5.1％、待测体11中为6.8％、待测体12中为8.5％。另外，组分δ的面积的比例、即第一比例在待测体8中为3.8％、待测体9中为4.5％、待测体10中为4.7％、待测体11中为5.3％、待测体12中为5.9％。
[基于第一阈值的判定]
判断上述表24中的第一比例是否为第一阈值以上。第一阈值与实施例1和实施例2同样地使用9％。
首先，在待测体8～待测体12中的任意一个待测体中，第一比例均小于第一阈值、即9％。因此，对于待测体8～待测体12，关于包含稳定型A1c组分的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或上述电泳图谱的总峰面积的比例，判断为不进行基于残留率的校正。
即，判定校正的必要性，判定为不需要校正的情况下的本发明的测定方法的稳定型A1c组分的校正误差如上述表20所示。
[不进行判定的情况]
此处，对不进行基于上述第一阈值的判定而对待测体8到待测体12进行基于残留率的校正并进行测定的情况进行说明。在该情况下，不具有判别第一比例是否为第一阈值以上的工序。因此，对于从待测体8到待测体12中的任意一个待测体，也用残留率校正包含稳定型A1c的组分的峰面积相对于包含HbA0的组分的峰面积或上述电泳图谱的总峰面积的比例。使用组分γ进行校正时的测定结果如下述表25所示。
[表25]
在上述表25中的左端列列举了组分γ的面积相对于包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例，具体而言，在待测体8中为1.8％、待测体9中为3.5％、待测体10中为5.1％、待测体11中为6.8％、待测体12中为8.5％。
根据与上述实施例1同样的理由，作为不受氨基甲酰化或醛化影响的、不稳定型A1c量被认为是通常的健康者的待测体中通常观察到的组分γ的峰面积，将多个健康者的组分γ的峰面积的平均值、即3％作为预定的峰面积值而从该组分γ的峰面积的比例中扣除，这是作为上述表25中所示的修饰率(P)而示出的数值。此处，待测体8中的组分γ为1.8％，低于该3％，在该情况下，在计算上作为修饰率(P)为0来处理。
从1中减去该修饰率(P)的值为上述表25中的残留率(Q，其中以百分率表示)。然后，用该残留率(Q)除以校正前值(X)，计算出上述表25中的校正后值(Y)。然后，根据校正后值(Y)，计算出使用组分γ进行校正时的相对误差。即，从各待测体的校正后值(Y)中减去待测体8的校正前值(X)(参照表24)后的值的、相对于待测体8的校正前值(X)的比例是上述表25中的相对误差。
[关于不稳定型A1c影响的小结]
作为以上的总结，将对以各葡萄糖浓度处理后的待测体不进行判定工序而进行了校正的情况和基于进行了判定工序的结果而不进行校正的情况下的相对误差记载在下述表26中。
[表26]
关于上述表26所示的相对误差，从以D-葡萄糖浓度为横轴进行图表化的图31也可知，在不进行判定工序而进行校正的情况下，与基于进行判定工序的结果而不进行校正的情况相比，相对误差大。这是因为，将组分γ中所含的不稳定型A1c的峰面积作为氨基甲酰化HbA0、醛化HbA0的峰面积来计算出残留率并进行了校正。另一方面，通过进行判定工序，避免了由于过度的校正引起的相对误差的恶化。这是因为，根据不受不稳定型A1c影响的组分δ的峰面积的值，判定了针对氨基甲酰化和醛化影响的校正的必要性。因此，确认到具有判定工序的该校正至少减轻了待测体中包含的不稳定型A1c的影响。
工业应用性
本发明可用于对血液中血红蛋白的组分中稳定型血红蛋白A1c进行测定的测定装置。
符号说明
A1：分析系统；1：分析装置；2：分析芯片；2A：上侧部分；2B：下侧部分；5：检测器；6：分注器；8：控制部；21：主体；22：混合槽；23：导入槽；24：过滤器；25：排出槽；26：电极槽；27：毛细管；28：联络流路；31：电极；32：电极；41：光源；42：滤光器；43：透镜；44：狭缝；61：泵；71：稀释液槽；72：泳动液槽。
Claims (13)
1.一种稳定型A1c的测定方法，基于流路中测定的血红蛋白的光学测定值的时间分布来测定血液待测体中所含的稳定型A1c，所述流路基于血红蛋白所具有的电荷的多少来分离所述血液待测体中所含的血红蛋白，其中，
基于所述时间分布中包含HbA0的组分的峰面积(A)以及包含被化学修饰的HbA0的第一组分的峰面积(G)、或者与确定为HbA0的组分相邻、且包含正电荷量比HbA0低的成分的第二组分的峰面积(D)，得到校正系数，
基于所述校正系数来校正所述时间分布中包含稳定型A1c的组分的峰面积。
2.根据权利要求1所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述校正系数是相当于未被化学修饰而残留的HbA0的比例的残留率。
3.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，包括以下工序：
判别第一比例是否为第一阈值以上，所述第一比例相当于所述时间分布中所述第二组分的峰面积(D)在包含HbA0的组分的峰面积(A)或所述血红蛋白的时间分布的包含血红蛋白的组分的总峰面积中所占的比例；以及
在所述第一比例为所述第一阈值以上的情况下，通过所述校正系数来校正包含稳定型A1c的组分的峰面积。
4.根据权利要求3所述的稳定型A1c的测定方法，包括以下工序：
根据所述时间分布，判别第二比例是否为第二阈值以上，所述第二比例是所述第一组分的峰面积(G)在包含HbA0的组分的峰面积(A)或所述血红蛋白的时间分布的总峰面积中所占的比例，
在所述第一比例为所述第一阈值以上、且所述第二比例为所述第二阈值以上的情况下，通过所述校正系数来校正包含稳定型A1c的组分的峰面积。
5.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述校正系数根据包含HbA0的组分的峰面积(A)相对于包含HbA0的组分的峰面积(A)与所述第一组分的峰面积(G)的合计值(A+G)的比例而得到。
6.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述校正系数基于第一组分的峰面积(G)相对于所述血红蛋白的时间分布中包含血红蛋白的总组分的面积的比例而得到。
7.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述校正系数根据从所述第一组分的峰面积(G)中扣除预定的峰面积值后的值相对于所述时间分布中包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例而计算出。
8.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述校正系数基于包含HbA0的组分的面积(A)相对于峰面积校正值(D/a)与包含HbA0的组分的面积(A)的合计值的比例(A/((D/a)+A))而得到，所述峰面积校正值(D/a)是用预定系数(a)除以所述第二组分的面积(D)而得到的值。
9.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述校正系数基于峰面积校正值(D/a)相对于所述时间分布中包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例而计算出，所述峰面积校正值(D/a)是用预定系数(a)除以所述第二组分的面积(D)而得到的值。
10.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述校正系数基于峰面积校正值(D/a)相对于所述时间分布中包含血红蛋白的组分的总峰面积的比例而得到，所述峰面积校正值(D/a)是进一步用预定系数(a)除以从所述第二组分的面积(D)中扣除预定的峰面积值后得到的值而得到的值。
11.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述化学修饰是氨基甲酰化和醛化中的任一种或两种。
12.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述时间分布是色谱图。
13.根据权利要求1或2所述的稳定型A1c的测定方法，其中，
所述时间分布是通过毛细管电泳法得到的电泳图谱。
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