CN112114021B - 待测体成分的分离分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及待测体成分的分离分析方法，对待测体中所含的各成分进行准确的分离分析。一种待测体成分的分离分析方法，用于向用流路液体充满的分离流路内导入待测体液体并分析所述待测体液体中所含的待测体成分，其中，得到修正系数，所述修正系数相当于从第一时间点到第二时间点为止的时间相对于从所述第一时间点到第三时间点为止的时间的比例，所述第一时间点是向所述分离流路内导入所述待测体液体的时间点，所述第二时间点是所述流路液体与所述待测体液体的界面到达预定位置的时间点，所述第三时间点是在所述分离流路的所述预定位置测定所述待测体成分的光学特性值的时间点，通过所述修正系数来修正所述待测体成分的被测定的光学特性值。
Description
技术领域
本发明涉及待测体成分的分离分析方法。
背景技术
在使用毛细管电泳法等连续试样导入的成分的分离分析系统中，有如下技术：将以检测器所获取的吸光度等检测数据为纵轴、以时间为横轴来得到的曲线制作为原始波形，使用对该原始波形进行时间微分而得到的电泳图谱等的微分波形来进行成分分析。
微分波形中出现的每个峰与被导入的试样中所含的各成分对应。另外，根据各峰的顶部被确认的时间的差异，可以确定成分。进而，各峰在电泳图谱中所占面积成为该成分在试样中的含量的指标。例如，基于以血液为试样的连续试样导入的血红蛋白测定系统的微分波形变为下述专利文献1和下述专利文献2所示的形状。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2018-72336号公报；
专利文献2：日本特开2013-174625号公报。
发明内容
基于毛细管电泳的血红蛋白的分离分析例如通过如下方式来进行：利用血红蛋白分子表面带正电荷，在毛细管内使其向阴极泳动。在这种情况下，为了防止血红蛋白分子吸附在毛细管管内壁上，使泳动液中含有硫酸软骨素等阴离子聚合物，用带负电荷的分子覆盖毛细管内壁。但是，由于某种原因，即使测定相同的待测体，在每次测定时，各成分的峰面积也可能发生变化。因此，不能进行准确的分离分析。
因此，本发明的实施方式的目的在于，准确地分离分析待测体中所含的各成分。
在本发明的用于向用流路液体充满的分离流路内导入待测体液体并分析所述待测体液体中所含的待测体成分的分析方法中，得到修正系数，所述修正系数相当于从第一时间点到第二时间点为止的时间相对于从所述第一时间点到第三时间点为止的时间的比例，所述第一时间点是向所述分离流路内导入所述待测体液体的时间点，所述第二时间点是所述流路液体与所述待测体液体的界面到达预定位置的时间点，所述第三时间点是在所述分离流路的所述预定位置测定所述待测体成分的光学特性值的时间点，通过所述修正系数来修正所述待测体成分的被测定的光学特性值。
在本发明的实施方式中，即使浓缩率因试剂浓度的变化或环境温度等环境因素而变化，也能够准确地测定各成分，该浓缩率依赖于待测体液体在分离流路内流动的速度与待测体成分在分离流路内流动的速度之间的速度差。
附图说明
图1是示出本发明的分析系统的一个例子的系统概要图；
图2是示出在图1的分析系统中使用的分析芯片的俯视图；
图3是沿着图2的III-III线的剖视图；
图4是示出控制部的硬件结构的框图；
图5是示出本发明的分析方法的流程图；
图6是示出准备工序的顺序的流程图；
图7是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图8是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图9是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图10是示出图6的准备工序的一个工序的剖视图；
图11是示出分析工序的顺序的流程图；
图12是示出通过波形形成工序形成的波形数据的一个例子的曲线图；
图13是示出最远点的决定的曲线图；
图14是界面检测时间点以后的微分波形的一个例子；
图15是根据图14所示的微分波形得到的电泳图。
具体实施方式
在本发明的用于向用流路液体充满的分离流路内导入待测体液体并分析所述待测体液体中所含的待测体成分的分析方法中，得到修正系数，该修正系数相当于从第一时间点到第二时间点为止的时间相对于从该第一时间点到第三时间点为止的时间的比例，该第一时间点是向分离流路内导入待测体液体的时间点，该第二时间点是流路液体与待测体液体的界面到达预定位置的时间点，该第三时间点是在分离流路的预定位置测定待测体成分的光学特性值的时间点。然后，通过所得的修正系数来修正被测定的光学特性值。
分离分析方法只要是基于流路内流动的待测体成分的移动速度之差进行分离分析的方法即可。待测体中所含的各待测体成分在分离流路内以与该各待测体成分的性质对应的各自的移动速度流动。因此，各待测体成分随着在分离流路内流动而被分离。然后，通过检测在分离流路内分离出的各成分，对各成分进行确定或定量。分离分析方法例如可以是电泳、液相色谱、气相色谱。分离分析方法可以考虑待测体和/或待测体成分的种类、性质等而适当选择。尤其在流路内待测体成分的移动速度因温度影响和/或环境影响而变动的分离分析方法中，本发明特别有用。另外，与上述分离方法对应地，上述的分离流路称为柱，也称为毛细管。
作为分离分析方法，特别优选毛细管电泳。毛细管电泳的分离条件可以考虑待测体的种类、性质、分离的待测体成分的种类、待测体成分的性质等而适当地变更。例如，在根据待测体成分所具有的正电荷量的不同来进行分离的情况下，待测体液体朝向分别设置于所述毛细管的两端的阳极和阴极之中的阴极进行泳动。因此，优选在泳动液中含有阴离子聚合物。另外，该阴离子聚合物优选为硫酸软骨素。另外，例如，在根据待测体成分所具有的负电荷量的不同来进行分离的情况下，朝向分别设置于所述毛细管的两端的阳极和阴极之中的阳极进行泳动。因此，优选在泳动液中含有阳离子聚合物。
光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布是如下曲线图：纵轴表示光学特性值的每单位时间的变化量，横轴表示与光学特性值的每单位时间的变化量对应的时间。光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布可以包括：从毛细管电泳法的测定结果中得到的电泳图谱、或从液相色谱法、气相色谱法的测定结果中得到的色谱图。横轴可以将开始分析的时间点作为基准点，或者也可以将待测体成分被导入到分离流路的时间点作为基准点。在毛细管电泳法中，可以将施加电压的时间点作为横轴的基准点来制作电泳图谱。
在分离分析方法中，首先，在待测体成分的分离分析前，用流路液体充满分离流路内。关于流路液体，例如，在毛细管电泳法中为泳动液，在液相色谱法中为洗脱液。可以适当选择使毛细管充满泳动液的方法。例如，可以使用泵，从与毛细管连接的泳动槽向毛细管输送泳动液，由此使毛细管充满泳动液。
然后，向具有检测部的分离流路内，连续导入含有待测体成分的待测体液体。关于朝向分离流路的待测体液体的导入方法，可以适当选择。例如，在利用毛细管电泳法分离分析血红蛋白分子的情况下，在用泳动液充满的毛细管的两端配置一对电极。然后，使待测体液体与毛细管的阳极侧的端部接触。然后，当对毛细管施加电压而开始电泳时，毛细管内部的泳动液作为电渗流从阳极侧向阴极侧流动。于是，随着泳动液从阳极侧向阴极侧流动，含有血红蛋白成分的待测体液体以电渗流的速度从毛细管的阳极侧导入。然后，在待测体液体与充满毛细管的泳动液的界面被维持的状态下，待测体液体以电渗流的速度流过毛细管，界面到达设置在毛细管的检测部。与此同时，以电渗流的速度导入到毛细管的血红蛋白成分以与该各血红蛋白分子的性质对应的各自的移动速度流过毛细管，到达设置在毛细管的检测部。
例如，当在毛细管中所含的泳动液中含有硫酸软骨素之类的阴离子聚合物时，该阴离子聚合物从阴极流向阳极。即，向与电渗流的流动方向相反的方向移动。而且，血红蛋白分子表面的正电荷越多，越容易被静电吸附、捕捉到阴离子聚合物上。即，如上所述，血红蛋白分子在毛细管内受到如下的力：由电渗流产生的从阳极向阴极的方向的力，以及与由阴离子聚合物产生的电渗流相反方向的从阴极向阳极的方向的力。因此，血红蛋白分子表面的正电荷越多，越受到更大的与电渗流相对的力，由此以更慢的泳动速度朝向阴极侧移动。
这样，由于在向毛细管导入待测体中的成分的速度与该成分在毛细管内流动的速度之间产生速度差，因此待测体中的成分到达毛细管的检测部时的待测体成分的浓度根据该速度差而变化。即，由于该成分在毛细管内流动的速度比朝向毛细管导入待测体中的成分的速度慢，因此到达毛细管的检测部时的待测体成分的浓度比被导入到毛细管之前高。
接着，对于到达检测部的待测体液体中所含的待测体成分的光学特性进行检测，并计算光学特性值的每单位时间的变化量。由于待测体液体被连续地输送到分离流路，因此最初在检测部仅测定移动速度快的成分，但移动速度慢的成分逐渐增加。因此，如果使用由检测部测定的待测体成分的光学特性值、将横轴作为经过时间、并将纵轴作为光学特性值来描绘曲线图，则能够得到随着经过时间而单调增加的曲线(例如，吸光度曲线)。换言之，在到达检测部的待测体液体中，除了等速成分即之外，还包括在比等速成分导入到分离流路的时间点更早的时间点导入到分离流路的低速成分、以及在比等速成分导入到分离流路的时间点更晚的时间点导入到分离流路的高速成分，该等速成分是在分离流路内流动的移动速度与待测体液体相同的待测体成分，该低速成分是移动速度比待测体液体更慢的待测体成分，该高速成分是移动速度比待测体液体更快的待测体成分。即，在到达检测部的待测体液体中，除了在分离流路内流动的移动速度与待测体液体相同的待测体成分之外，还包含在分离流路内流动的移动速度与待测体液体不同的待测体成分。因此，光学特性值作为也包含在分离流路内流动的移动速度不同的待测体成分的值而得到，原样的光学特性值不能用于待测体成分的分离分析中。
因此，以预定的时间间隔连续地测定在分离流路内流动的待测体液体的光学特性值，并计算该光学特性值的每单位时间的变化量。该光学特性值的每单位时间的变化量表示到达检测部的待测体液体中所含的待测体成分、且在分离流路内流动的移动速度相同的待测体成分的浓度的变化量。因此，使用光学特性值的每单位时间的变化量，来制作光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布，并求出从该时间分布中得到的峰面积。由此，能够进行在分离流路内流动的移动速度相同的待测体成分的分离分析。光学特性值的每单位时间的变化量也可以说是用时间对光学特性值进行微分而得到的值。
在光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布中，描绘具有峰(波峰)和谷(波谷)的曲线。而且，描绘为峰的波峰是在流路内流动的移动速度相同的待测体成分聚集的区域，其面积表示到达检测部的待测体液体中所含的待测体成分的浓度的变化量的累计值。换言之，该面积是考虑了由于速度差引起的浓缩率的值，该速度差是待测体中的成分导入到分离流路的速度与该成分在分离流路内流动的速度之间的速度差。因此，如果待测体液体在分离流路内流动的速度与待测体成分在分离流路内流动的速度之间的速度差由于环境因素等某种原因而变化、从而待测体成分的浓缩比例发生变化，则该峰面积发生变化。因此，不能进行准确的待测体成分的分离分析。关于该问题，只要是如下方法就会出现：基于待测体成分在分离流路内移动的速度的不同，使待测体液体连续流过分离待测体成分的分离流路，根据该分离流路内流动的待测体液体的光学特性值的每单位时间的变化量，分离分析待测体成分。
以毛细管电泳法为例进行说明，导入到毛细管内的待测体液体中所含的待测体成分在毛细管内以比电渗流慢的速度流动。另一方面，该待测体液体作为电渗流而在毛细管内流动，随之从毛细管外向毛细管内连续地供给新的待测体液体。因此，该待测体中所含的血红蛋白成分在导入到毛细管内时会被浓缩，以比毛细管外的浓度高的浓度到达毛细管的测定部并被检测。因此，关于光学特性值的每单位时间的变化量，不仅考虑了血红蛋白成分的浓度，还考虑了由于待测体成分在上述毛细管内移动的速度与电渗流的速度之间的速度差引起的浓缩的影响的值来得到。
关于毛细管内流动的电渗流的速度或待测体成分的移动速度，根据由于环境温度的变化导致的泳动液或待测体液体的pH变化、由于长期保存导致的泳动液中的盐浓度的增加等的环境因素而变化。因此，向毛细管内供给待测体成分的速度与该待测体成分在毛细管内流动的速度之间的速度差也同样根据环境因素而变化。于是，该血红蛋白成分到达测定部时的浓度发生变化，并且光学特性值的每单位时间的变化量发生变化。因此，根据由光学特性值的每单位时间的变化量得到的电泳图谱来计算出的峰面积也变动，无法进行准确的血红蛋白成分的分离分析。
因此，计算出修正系数，该修正系数相当于待测体成分在分离流路内流动的速度(Vx)相对于待测体液体在分离流路内流动的速度(V0)的比例或比(Vx/V0)。然后，根据检测在分离流路内流动的所述待测体液体的光学特性而得到的光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布，计算用该修正系数修正后的包含待测体成分的区域的峰面积。该修正后的峰面积成为排除了因速度差产生的浓缩所引起的变动的面积之后的面积，该速度差是待测体液体在分离流路内流动的速度与待测体成分在分离流路内流动的速度之间的速度差。因此，即使由于试剂浓度的变化或环境温度等环境因素，待测体液体在分离流路内流动的速度与待测体成分在分离流路内流动的速度之间的速度差发生变化，也能够计算出不依赖于该速度差的待测体成分的峰面积，基于此，能够进行准确的待测体成分的分离分析。该修正系数可以说是，在向分离流路导入待测体液体时，通过待测体液体在分离流路内流动的速度与待测体成分在分离流路内流动的速度之间的速度差，待测体液体中所含的该待测体成分被浓缩的比例的倒数。
在根据光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布计算包含待测体成分的区域的峰面积的工序中，只要使用修正系数计算修正后的峰面积即可。例如，将光学特性值的每单位时间的变化量乘以与光学特性值的每单位时间的变化量对应的待测体成分的修正系数来进行修正。然后，可以根据修正得到的光学特性值的每单位时间的变化量，制作光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布，并计算包含待测体成分的区域的峰面积。另外，修正后的光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布可以仅生成计算峰面积的部分，也可以包含不计算峰面积的部分而生成。
另外，根据光学特性值的每单位时间的变化量，制作光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布，并计算包含待测体成分的区域的峰面积。然后，可以将计算出的包含待测体成分的区域的峰面积除以该待测体成分的修正系数来进行修正。在这种情况下，可以使用检测到区域的峰顶的时间来计算修正系数，并且可以视为该修正系数代表整个区域，来修正峰面积。另外，也可以使用区域内的多个时间来计算各自的修正系数，将其平均的修正系数视为代表区域整体，来修正峰面积。
修正系数可以分别测定待测体液体在分离流路内流动的速度(V0)和待测体成分在所述分离流路内流动的速度(Vx)，并计算所述待测体成分在所述分离流路内流动的速度相对于待测体液体在分离流路内流动的速度的比例(Vx/V0)。待测体液体在分离流路内流动的速度例如可以通过将在分离流路内流动的待测体的每单位时间的量除以分离流路的截面积来计算。另外，待测体成分在分离流路内流动的速度例如可以通过将从待测体流路的导入口到检测部的距离除以如下时间来计算出：该时间是从待测体液体导入到待测体流路的时间点(第一时间点)到由检测部检测到待测体成分的时间点(第三时间点)为止的时间，该检测部设置在待测体流路上并用于检测待测体成分。
此处，当将Vx设为待测体成分的速度、将V0设为待测体液体的速度、将Lx设为待测体成分在分离流路内移动的距离、将L0设为待测体液体在分离流路内移动的距离、将Tx设为待测体成分移动Lx时所需的时间、以及将T0设为待测体液体移动L0时所需的时间时，Vx/V0＝(Lx/Tx)/(L0/T0)。并且，当Lx＝L0时，Vx/V0＝T0/Tx。由此，速度的比例能够由时间的比例来替换。
在通过相同的检测部来检测待测体成分、待测体液体和充满分离流路的流路液体的界面的情况下，可以将如下比例作为修正系数：该比例是从开始向分离流路导入待测体液体的时间点到由待测体流路上的检测部检测到待测体液体与充满分离流路的流路液体的界面的时间点为止的时间(T0)的、相对于从开始向分离流路导入待测体液体的时间点到由检测部检测到待测体成分的时间点为止的时间(Tx)的比例(T0/Tx)。待测体液体和充满分离流路的流路液体的界面以待测体液体移动的速度在分离流路内移动。而且，这是因为，待测体成分、待测体液体和充满分离流路的流路液体的界面移动的距离同时为从分离流路的端部到检测部为止的距离。
以毛细管电泳法为例进行说明，如上所述，当对充满泳动液的毛细管的两端施加电压时，在毛细管内产生朝向一对电极中的一个电极(例如，阴极)的电渗流。于是，充满毛细管的泳动液朝向一方(例如，阴极)流动，与毛细管的另一方(例如，阳极)的导入口接触的待测体液体被导入到毛细管。因此，也可以将开始向待测体流路导入待测体液体的时间点作为开始向毛细管施加电压的时间点来计算修正系数。
上述分析方法进行一系列的待测体测定、图谱的制作、修正系数的计算、光学测定值的修正。除此之外，可以考虑如下那样的各种方法。
(1)工厂出货时预先求出修正系数，并将该修正系数保存在存储器中，在实际的待测体测定时使用所保存的修正系数来进行修正。
(2)在最初使用分析装置时，通过实际的待测体来求出修正系数并进行修正。
(3)每当使用分析装置时，通过实际的待测体来求出修正系数并进行修正。
待测体液体和充满分离流路的流路液体的界面也可以通过将物质添加到待测体液体中来形成，该物质以与待测体液体在分离流路内流动的速度相同的速度在分离流路内流动。换言之，可以通过将即使流过分离流路也不会被分离的物质添加到待测体液体中来形成。可以在待测体中直接添加即使流过分离流路也不会被分离的物质，也可以通过用添加了即使流过分离流路也不会被分离的物质的稀释液稀释待测体液体来添加到待测体液体中。由此，在待测体液体和流路液体中产生即使流过分离流路也不会被分离的物质的浓度差，能够形成界面。此外，也可以将用稀释液稀释了待测体液体的液体作为待测体液体。
以毛细管电泳法为例，对待测体液体和充满分离流路的流路液体的界面进行说明。例如，用含有分子内盐的稀释液来稀释待测体。由此，在用稀释液稀释的待测体液体与充满毛细管管内的泳动液之间产生分子内盐的浓度差，形成界面。分子内盐在一个分子内具有正电荷和负电荷双方，因此在根据待测体成分的电荷量的不同来分离待测体成分的毛细管电泳中，以与在毛细管内流动的待测体液体相同的速度在毛细管内移动。因此，通过检测由分子内盐的浓度差形成的界面，能够测定在毛细管内流动的待测体液体的移动速度。分子内盐优选为低分子的分子内盐。另外，界面只要在待测体液体与泳动液之间产生分子内盐的浓度差来形成即可，也可以通过使用以充分高于待测体液体的浓度含有分子内盐的泳动液来形成。另外，作为这样的分子内盐，优选3-(1-吡啶基)丙磺酸。界面的检测方法可以检测在界面产生的折射率的差异，也可以检测分子内盐本身。
光学特性是能够检测待测体成分的光学性质。例如，可以举出待测体成分所具有的吸光波长、发光波长、激发光的波长。光学特性值是检测光学特性而得到的光学特性值的强度，可以举出吸光度、发光强度、荧光强度。设置在分离流路的检测部可以根据要检测的光学特性而适当使用。例如吸光度计、发光检测器、荧光检测器。
本发明中的待测体液体可以是血液或尿等生物待测体，也可以是除此之外的待测体。另外，也可以是提取了气体或固体中所含的待测体成分的液体。在本发明中，特别优选生物体待测体，更优选血液。另外，待测体液体可以是将血液这样的待测体用缓冲液等适当的稀释液稀释后的液体。例如，在毛细管电泳的情况下，优选通过泳动液或与泳动液类似的组成的溶液来稀释待测体。
另外，本发明中的待测体成分只要是能够成为分析对象的成分即可。例如，可以举出带正电荷或负电荷的成分。作为这样的待测体成分，特别优选血红蛋白。
另外，在上述中，对待测体成分在毛细管内流动的速度比待测体成分被提供到流路内的速度慢的情况进行了说明。但是，在待测体成分在流路内流动的速度比待测体成分被提供到流路内的速度快的情况下，也同样能够实施本发明。即，在待测体成分在流路内流动的速度比待测体成分被提供到流路内的速度快的情况下，该待测体成分以比毛细管外的浓度低的浓度到达毛细管的检测部位并被检测。因此，光学特性值的每单位时间的变化量是作为考虑了如下影响的值来得到的：不仅考虑待测体成分的浓度，还考虑了由上述速度差引起的稀释的影响。即，作为比待测体成分的浓度所示的值低的值来得到。因此，通过使用上述修正系数同样地修正信号强度的每单位时间的变化量，能够准确地分离分析各成分。
以下，参照附图，对本发明的实施方式进行说明。此外，虽然以毛细管电泳为例进行说明，但如上所述，本发明并不限于毛细管电泳。
[分析系统]
图1示出被实施本发明的稳定型A1c的测定方法的分析系统A1的一个例子的简要构成。分析系统A1具备分析装置1和分析芯片2来构成。分析系统A1是如下系统：以从人体采集的血液即血液待测体Sa为对象，根据血液中的血红蛋白的分子表面电荷，执行以阳离子交换为原理的分离分析。
<分析芯片的准备>
分析芯片2保持血液待测体Sa，并且在分析装置1中填装的状态下提供以血液待测体Sa为对象的分析场所。在本实施方式中，分析芯片2构成为打算在进行一次分析结束后废弃的、所谓的一次性分析芯片。如图2及图3所示，分析芯片2包括：主体21、混合槽22、导入槽23、过滤器24、排出槽25、电极槽26、毛细管27和联络流路28。图2是分析芯片2的俯视图，图3是沿着图2的III-III线的剖视图。此外，分析芯片2不限于一次性分析芯片，也可以是用于多次分析的分析芯片。另外，本实施方式的分析系统并不限于将独立的分析芯片2填装到分析装置1中的结构，也可以是将发挥与分析芯片2相同功能的功能部位一体地组装在分析装置1中的结构。
主体21是作为分析芯片2的基座的部件，其材质没有特别限定，例如可以举出玻璃、熔融二氧化硅、塑料等。在本实施方式中，主体21是图3中上侧部分2A与下侧部分2B独立地形成、且它们相互结合的结构。此外，不限于此，例如，也可以一体地形成主体21。
混合槽22是进行后述的将血液待测体Sa和稀释液Ld混合的混合工序的场所的一个例子。混合槽22例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A的贯通孔，构成为向上方开口的凹部。导入槽23是导入待测体液体Sm的槽，该待测体液体Sm是在混合槽22中通过混合工序得到的试样溶液。导入槽23例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A的贯通孔，构成为向上方开口的凹部。
过滤器24设置在导入槽23的开口部，该导入槽23的开口部是朝向导入槽23的导入路径的一个例子。过滤器24的具体结构没有限定，作为优选的例子，例如可以举出醋酸纤维素膜过滤器(ADVANTEC公司制，孔径0.45μm)。
排出槽25是位于电泳法中的电渗流的下游侧的槽。排出槽25例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A的贯通孔，构成为向上方开口的凹部。电极槽26是在基于电泳法的分析工序中插入阳极31的槽。电极槽26例如通过形成在主体21的上述上侧部分2A的贯通孔，构成为向上方开口的凹部。联络流路28连接导入槽23和电极槽26，构成导入槽23与电极槽26的导通路径。
毛细管27是连接导入槽23与排出槽25的微细流路，是电泳法中的电渗流(EOF，electro-osmotic flow)产生的场所。毛细管27例如作为在主体21的上述下侧部分2B上形成的槽而构成。此外，在主体21上，可以适当地形成用于促进朝向毛细管27的光的照射以及透过了毛细管27的光的出射的凹部等。毛细管27的尺寸没有特别限制，当举出其一个例子时，其宽度为25μm～100μm、其深度为25μm～100μm、其长度为5mm～150mm。分析芯片2整体的尺寸根据毛细管27的尺寸以及混合槽22、导入槽23、排出槽25和电极槽26的尺寸和/或配置等来适当设定。
此外，上述结构的分析芯片2是一个例子，能够适当采用可以进行基于电泳法的分析的结构的分析芯片。
<分析装置>
分析装置1在填装了点样血液待测体Sa的分析芯片2的状态下，进行以血液待测体Sa为对象的分析处理。如图1所示，分析装置1包括：阳极31、阴极32、光源41、滤光器42、透镜43、狭缝44、检测器5、分注器6、泵61、稀释液槽71、泳动液槽72和控制部8。另外，光源41、滤光器42、透镜43和检测器5构成本发明中所说的测定部的一个例子。
阳极31和阴极32是用于在电泳法中对毛细管27施加预定电压的一对电极。阳极31被插入到分析芯片2的电极槽26中，阴极32被插入到分析芯片2的排出槽25中。施加在阳极31与阴极32之间的电压没有特别限制，例如为0.5kV～20kV。
光源41是发出光的部位，该光用于在电泳法中测定作为光学测定值的吸光度。光源41例如具备射出预定波长范围的光的LED(Light-emitting Diode，发光二极管)芯片。滤光器42将来自光源41的光中的预定波长的光衰减，并且将其剩余波长的光透过。透镜43用于将透过了滤光器42的光朝向分析芯片2的毛细管27的分析部位聚集。狭缝44用于去除由透镜43聚集的光中的、能够引起散射等的多余的光。
检测器5接收透过了分析芯片2的毛细管27的来自光源41的光，例如具备光电二极管或光电IC(integrate circuit，集成电路)等来构成。
如上所述，从光源41发出的光到达检测器5的路径是光路。然后，在该光路与毛细管27相交的位置上，针对在该毛细管27内流动的溶液(即，对试样溶液和泳动液中的任一种或其混合溶液)测定光学测定值。即，在毛细管27内与从光源41到检测器5的光路相交的位置是光学测定值的测定部。作为该光学测定值，例如可以举出吸光度。吸光度表示该光路的光被在毛细管27内流动的溶液吸收的程度，表示入射光强度与透射光强度之比的常用对数值的绝对值。在该情况下，作为检测器5，可以利用通用的分光光度计。此外，即使不使用吸光度，只要是单纯的透射光强度的值本身等光学测定值，就可以用于本发明。以下，以使用吸光度作为光学测定值的情况为例进行说明。
分注器6用于分注期望量的稀释液Ld和/或泳动液Lm及待测体液体Sm，例如包括喷嘴。分注器6能够通过未图示的驱动机构，在分析装置1内的多个预定位置上自由移动。泵61是朝向分注器6的吸引源及喷出源。另外，泵61也可以作为设置在分析装置1的未图示的端口的吸引源及喷出源来使用。这些端口用于泳动液Lm的填充等。另外，也可以具备与泵61不同的专用的泵。
稀释液槽71是用于储存稀释液Ld的槽。稀释液槽71可以是永久地设置在分析装置1中的槽，也可以将封入了预定量的稀释液Ld的容器装填到分析装置1中。泳动液槽72是用于储存泳动液Lm的槽。泳动液槽72可以是永久地设置在分析装置1中的槽，也可以是将封入了预定量的泳动液Lm的容器填装到分析装置1中的槽。
控制部8控制分析装置1中的各部。如图4的硬件结构所示，控制部8具有CPU(Central Processing Unit，中央处理单元)81、ROM(Read Only Memory，只读存储器)82、RAM(Random Access Memory，随机存取存储器)83和存储器84。各结构经由总线89以能够相互通信的方式连接。
CPU 81是中央运算处理单元，执行各种程序或控制各部。即，CPU 81从ROM 82或存储器84中读取程序，将RAM 83作为工作区域来执行程序。CPU 81按照ROM 82或存储器84中记录的程序，进行上述各结构的控制和各种运算处理。
ROM 82存储各种程序和各种数据。RAM 83作为工作区域而临时存储程序或数据。存储器84由HDD(Hard Disk Drive，硬盘驱动器)、SSD(Solid State Drive，固态驱动器)或闪存来构成，并保存包含操作系统的各种程序、以及各种数据。在本方式中，在ROM 82或存储器84中保存有与测定和/或判定相关的程序和/或各种数据。另外，也可以在存储器84中保存测定数据。
控制部8通过上述硬件结构中的CPU 81执行上述程序，由此在分析装置10中实施图5所示的各工序。关于这些工序的详细情况，将在后面叙述。
<稀释液、泳动液、待测体液体的制备>
稀释液Ld用于通过与血液待测体Sa混合而生成作为试样溶液的待测体液体Sm。稀释液Ld的主剂没有特别限制，可以举出水、生理盐水，作为优选的例子，可以举出与后述的泳动液Lm类似的成分的液体。另外，稀释液Ld除了上述主剂以外，也可以根据需要添加添加物。在本实施方式中，作为该添加物，向稀释液Ld中添加1-(3-磺丙基)吡啶氢氧化物分子内盐。该分子内盐是为了在待测体液体Ld与泳动液Lm中产生浓度差而添加的。该分子内盐不受静电力的影响而以电渗流的流动在毛细管27内移动。因此，直到检测到由于该分子内盐浓度差产生的待测体液体Sm与泳动液Lm的界面为止的时间成为电渗流的速度的基准。
此外，作为这样添加物，只要是除了毛细管27内的液体流动以外不受泳动速度影响的物质即可，除了上述分子内盐以外，可以根据毛细管27内的分离方法而适当选择。但是，由于通过毛细管电泳法进行分离，因此优选低分子的不具有电荷的物质。另外，由于只要在待测体液体Sm与泳动液Lm之间产生该物质的浓度差即可，因此可以在稀释液Ld中含有该成分，也可以在泳动液Lm中含有该成分。进而，只要是产生这样的浓度差，就可以包含于稀释液Ld和泳动液Lm双方中。
另外，稀释液Ld中所含的其他组成也可以根据分离方法而适当选择。
泳动液Lm是在基于电泳法的分析工序中，被填充在排出槽25和毛细管27中，并产生电泳法中的电渗流的介质。对泳动液Lm没有特别限制，但优选使用了酸的泳动液。上述酸例如有柠檬酸、马来酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、邻苯二甲酸、丙二酸、苹果酸。另外，泳动液Lm优选含有弱碱基。作为上述弱碱基，例如有精氨酸、赖氨酸、组氨酸、tris(三羟甲基氨基甲烷)等。泳动液Lm的pH例如为pH4.5～6的范围。泳动液Lm的缓冲液的种类有MES、ADA、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES等。另外，在泳动液Lm中，也可以与稀释液Ld的说明中所述的同样地，根据需要添加添加物。在本实施方式中，作为该添加物，硫酸软骨素被添加到泳动液Lm中。硫酸软骨素除了以阴离子聚合物覆盖毛细管27的内壁的目的之外，还以如下为目的添加：通过与血红蛋白分子表面的正电荷结合，根据正电荷的多少而使泳动速度产生差异化。
另外，泳动液Lm所含有的其他组成也可以根据分离方法而适当选择。
此外，作为泳动液Lm和稀释液Ld，只要是在后述的界面检测时间点由于血液待测体到达用稀释液Ld稀释的待测体液体Sm与泳动液Lm的界面而产生光学测定值的变化的组合，就可以任意选择。
接着，对使用分析系统A1进行的本发明的分析方法的一个例子进行说明。图5是示出本实施方式的分析方法的流程图。本分析方法包括准备工序S1、电泳工序S2和分析工序S3。
<准备工序S1>
图6是示出准备工序S1中的具体步骤的流程图。在本实施方式中，如该图所示，准备工序S1包括：试样采集工序S11、混合工序S12、泳动液填充工序S13和导入工序S14。
<试样采集工序S11>
首先，准备血液待测体Sa。在本实施方式中，血液待测体Sa是从人体采集的血液。作为血液，可以是全血、成分分离血液或实施了溶血处理的血液等。然后，将分注有血液待测体Sa的分析芯片2填装到分析装置1中。
<混合工序S12>
接着，将血液待测体Sa与稀释液Ld混合。具体而言，如图7所示，预定量的血液待测体Sa被点样在分析芯片2的混合槽22中。接着，通过分注器6吸引预定量的稀释液槽71的稀释液Ld，如图8所示，将预定量的稀释液Ld分注到分析芯片2的混合槽22中。然后，将泵61作为吸引源和喷出源，从分注器6反复进行稀释液Ld的吸引和喷出。由此，在混合槽22中将血液待测体Sa与稀释液Ld混合，得到作为试样溶液的待测体液体Sm。血液待测体Sa与稀释液Ld的混合也可以通过分注器6的吸引和喷出以外的方法进行。
<泳动液填充工序S13>
接着，通过分注器6吸引预定量的泳动液槽72的泳动液Lm，如图9所示，将预定量的泳动液Lm分注到分析芯片2的排出槽25中。然后，利用上述端口覆盖排出槽25的上方的开口，通过适当实施从端口向排出槽25的内部排出或吸引空气等的方法，向排出槽25和毛细管27填充泳动液Lm。
<导入工序S14>
接着，如图10所示，利用分注器6从混合槽22采集预定量的待测体液体Sm。然后，从分注器6向导入槽23导入预定量的待测体液体Sm。在该导入中，待测体液体Sm通过设置在导入槽23的开口部的过滤器24，该导入槽23的开口部是朝向导入槽23的导入路径的一个例子。另外，在本实施方式中，待测体液体Sm从导入槽23通过联络流路28被填充到电极槽26中。此时，产生从导入槽23经由联络流路28朝向电极槽26的待测体液体Sm的流动，但在从导入槽23朝向联络流路28，待测体液体Sm向与毛细管27的长度方向大致正交的方向流动(参照图2)。另一方面，毛细管27的泳动液Lm在该阶段几乎不移动。其结果是，在导入槽23与毛细管27的连接部(参照图3)产生剪切流，由此变为产生了待测体液体Sm与泳动液Lm的清晰的界面的状态。此外，只要是产生待测体液体Sm与泳动液Lm的界面的方法，就可以采用在物理上在导入槽23与毛细管27的边界设置可移动的过滤器、或者在控制上变更流动方法等的所有手段。
<电泳工序S2>
接着，将阳极31插入到电极槽26(参照图2)，将阴极32(参照图1)插入到排出槽25。接着，根据来自控制部8的指示，对阳极31和阴极32施加电压。该电压例如为0.5kV～20kV。由此，产生电渗流，在毛细管27中，使待测体液体Sm从导入槽23向排出槽25逐渐移动。此时，由于在导入槽23中填充有待测体液体Sm，因此在毛细管27中连续地供给待测体液体Sm的状态下，使作为上述分析成分的血红蛋白(Hb)电泳。此时，在维持待测体液体Sm与泳动液Lm的上述界面的状态下，待测体液体Sm一边将泳动液Lm朝向下游方向推压一边将毛细管27电泳。另外，开始来自光源41的发光，进行检测器5的吸光度的测定。然后，测定从开始对阳极31和阴极32施加电压时起的经过时间与吸光度之间的关系。
此时，在导入槽23和毛细管27中，血红蛋白受到如下力：通过电渗流而使其朝向阴极32侧移动的力；通过血红蛋白的静电力而使其朝向阴极32侧移动的力；以及通过与硫酸软骨素结合而使其推回到阳极31侧的力。
此处，与毛细管27的截面积相比，导入槽23的与泳动方向垂直的截面积大很多。因此，在该导入槽23内几乎没有电位差，通过血红蛋白的静电力而使其朝向阴极32侧移动的力、以及通过与硫酸软骨素结合而使其推回到阳极31侧的力几乎不起作用。因此，受到电渗流产生的力，血红蛋白被导入到毛细管27。
另一方面，相对于导入槽23的与泳动方向垂直的截面积，毛细管27的截面积非常小，因此毛细管27内的电位差变为大于导入槽23内的电位差。因此，在毛细管27中，血红蛋白受到如下力：通过电渗流而使其朝向阴极32侧移动的力、通过血红蛋白的静电力而使其朝向阴极32侧移动的力、以及通过与硫酸软骨素结合而使其推回到阳极31侧的力。但是，与电渗流产生的力和通过与硫酸软骨素结合而使其推回到阳极31侧的力相比，来自血红蛋白的正电荷的静电力非常小，可以忽略不计。并且，电渗流的力比通过与硫酸软骨素结合而使其推回到阳极31侧的力大。因此，在毛细管27内，血红蛋白受到从电渗流产生的力中减去通过与硫酸软骨素结合而使其推回到阳极31侧的力之后的合力，从阳极31侧向阴极32侧移动。即，血红蛋白以电渗流的速度被供给到毛细管27，但在毛细管27内以比电渗流慢的速度泳动。通过与硫酸软骨素结合而使其推回到阳极31侧的力因血红蛋白的种类而不同。具体而言，分子表面的正电荷越多，与硫酸软骨素的结合也越多，因此使其推回到该阳极31侧的力越大。因此，血红蛋白种类、具体而言是分子表面的正电荷越多的血红蛋白在毛细管流路内的移动速度越慢，由此血红蛋白的各成分被分离。另一方面，向毛细管27内供给待测体液体Sm中所含的血红蛋白的电渗流的速度比该血红蛋白在毛细管27内移动的速度慢，存在速度差。因此，在毛细管27的待测体液体的导入口，血红蛋白被浓缩。而且，血红蛋白分子表面的正电荷越多，上述速度差越大，因此浓缩率越高。
<分析工序S3>
此处，在从上述电压施加开始时(第一时间点)起的经过时间较短的时间点(第三时间点)，出现与待测体液体Sm中的移动速度较快的成分对应的吸光度峰。另一方面，在从上述电压施加开始时(第一时间点)起的经过时间比较长的时间点(第三时间点)，出现与待测体液体Sm中的移动速度较慢的成分对应的吸光度。利用这一点，进行待测体液体Sm中的成分的分析(分离测定)。根据所测定的吸光度，通过控制部8的控制，执行图11所示的分析工序S3。本实施方式的分析工序S3包括波形形成工序S31、界面检测时间决定工序S32、成分确定工序S33。
<波形形成工序S31>
在本工序中，通过控制部8对所测定的上述吸光度进行运算处理，制作电泳图谱。此处，将电压施加开始时作为测定开始时，形成作为测定波形的电泳图谱，该测定波形表示与该测定开始后的经过时间对应的光学测定值即吸光度的变化。本实施方式的波形形成工序S31包括微分波形形成工序S311。微分波形形成工序S311通过对所测定的上述吸光度进行时间微分来形成微分值的波形。图12示出通过微分波形形成工序S311形成的微分波形的一个例子。图中的x轴是时间轴，y轴是微分值轴。在以下的图和说明中，将沿着时间轴x的负方向侧设为方向x1侧，将正方向侧设为方向x2侧，将沿着微分值轴y的负方向侧设为方向y1侧，将正方向侧设为方向y2侧。
<界面检测时间决定步骤S32>
本工序是决定界面到达时间点的工序，该界面到达时间点是通过施加电压而向毛细管的下游方向泳动的混合试样Sm与泳动液Lm的界面到达检测器5的时间点。该混合试样Sm与泳动液Lm的界面是电泳开始后最先出现的波峰。该混合试样Sm与泳动液Lm的界面的波峰如图13所示。接着，如图13所示，在该混合试样Sm与泳动液Lm界面所示的波峰中，决定在该电泳图谱中微分值距基准值Ls最远的点。在图示的例子中，从基准值Ls向方向y2远离的点距基准值Ls最远，该点决定为最远点PL。在这里，将在上述电泳工序S2中开始施加电压的时间点设为0，检测到该最远点PL的时间点设为界面检测时间点，将从电泳开始(第一时间点)到该界面检测时间点(第二时间点)为止的经过时间作为界面检测时间。
<成分确定工序S33>
图14示出在上述波形形成工序S31中得到的、界面检测时间点以后的微分波形的一个例子。在该图中，x轴表示将开始施加电压的时间点设为0的电泳时间(单位：秒)，y轴表示对吸光度进行时间微分后的值、即斜率(slope)值(单位：mAbs/秒)。即，该斜率值是指：随着经过时间而单调递增的吸光度曲线在各时间点的倾斜的值，是按照每个经过时间的光学特性值的每单位时间的变化量。另外，泳动时间11.5秒附近的波峰是图13所示的最远点PL，该最远点PL出现的时间点上的经过时间为在上述界面检测时间决定工序中决定的界面检测时间。该PL表示的波峰实际上表示最初检测到1-(3-磺丙基)吡啶氢氧化物分子内盐的时间点。该1-(3-磺丙基)吡啶氢氧化物分子内盐不与硫酸软骨素结合，在流路内以电渗流的速度从阳极向阴极的方向流动。即，该分子内盐被导入到毛细管27时的速度和在毛细管27内流动的速度均是电渗流的速度，它们之间没有速度差。因此，通过检测该分子内盐，能够检测到待测体液体的前端。在成分确定工序S33中，以该界面检测时间为基准，计算出各经过时间中的斜率值的修正系数，求出修正后的光学特性值的每单位时间的变化量，根据由此制作的电泳图谱，计算含有血红蛋白成分的区域的峰面积。
如上所述，血红蛋白分子表面的正电荷越多，浓缩率越高。因此，例如，经过时间越靠后的血红蛋白，根据图14所示的微分波形的面积测定的待测体成分的成分量越大。即，即使是相同成分量的待测体成分，在流路内流动的速度慢的待测体成分也被测定为成分量比在流路内流动的速度快的成分多。
另一方面，当在稀释液Ld和泳动液Lm的保存中产生试剂浓度的变化、浓缩、环境温度的变化时，电渗流的速度、硫酸软骨素的移动速度发生变化。因此，各种血红蛋白成分被导入到毛细管27前后的移动速度之差也变化，浓缩率也变化。于是，即使测定相同的血液待测体，由于保存影响、环境温度的影响，每单位时间的吸光度的变化量(即，作为光学特性值的每单位时间的变化量的斜率值)发生变化。其结果是，使用该每单位时间的吸光度的测定结果来计算出的预定的血红蛋白成分(例如，HbA1c)的峰面积也发生变化，该预定的血红蛋白成分相对于总血红蛋白的比例也发生变化。因此，当基于使用标准待测体制作的标准曲线来计算该预定的血红蛋白成分的值时，即使是相同的血液待测体，其值也会因测定条件、测定环境而变动，无法测定准确的值。
由此，用于如下的修正在以下的工序中进行：将由于血红蛋白成分在毛细管27内的移动速度而被浓缩的光学特性值的每单位时间的变化量、因测定条件和/或测定环境而被变动的光学特性值的每单位时间的变化量，不依赖于浓缩和/或测定环境而接近表示实际血红蛋白成分的量的值。
首先，在S331所示的修正后变化量决定工序中，得到将各经过时间除以界面检测时间的值。该值被认为是在每个经过时间检测到的成分被浓缩的比率，称为相对检测时间(修正系数的倒数)。然后，得到以该相对检测时间除以斜率值后的修正后变化量，该斜率值是各经过时间中光学特性值的每单位时间的变化量。
接着，在S332所示的电泳图谱制作工序中，通过绘制与各经过时间对应的修正后变化量，得到电泳图谱。图15示出基于图14所示的微分波形而得到的电泳图谱。此外，为了进行对照，图14所示的微分波形用虚线表示。根据该图中可知，由于经过时间越大浓缩率越大，因此实际成分的比率被估计得过大。
此处，即使测定条件、测定环境对血红蛋白成分在毛细管27内的移动速度产生影响、速度差变化、浓缩率变化，也使用表示该测定环境中的浓缩比例的相对检测时间来修正光学特性值的每单位时间的变化量。因此，通过在上述修正后变化量决定工序中以界面检测时间除以各经过时间后得到的相对检测时间来修正光学特性值的每单位时间的变化量，由此可以排除测定条件、测定环境的变化对血红蛋白测定值的影响。
然后，在S333所示的峰面积计算工序中，在根据所得到的电泳图谱确定血红蛋白的各成分的基础上，计算各成分的峰面积。具体而言，具有在界面检测时间点以后最大的波峰的区域被确定为HbA0。而且，关于从界面检测时间点到HbA0的波峰为止出现的各波峰，通过从界面到达时间到该峰检测时间为止的经过时间相对于从界面检测时间点到检测到HbA0的波峰的时间为止的期间的经过时间的比率，来确定该波峰所表示的成分。例如，在图14中，表示HbA1c的波峰(图中的斜线部分的区域)被这样确定。
然后，根据这样确定出的各波峰，计算各成分的量。具体而言，可以将确定为某成分的波峰作为极大值，将包含该极大值的区域的面积作为与该波峰对应的成分的量。此处，该区域的两端可以适当确定，例如，也可以将位于该极大值的两侧的极小值作为其两端。
另外，各波峰的峰面积也可以表示为相对于包含血红蛋白的区域的整个波峰面积(具体而言，图14中的实线部分的面积)的比例。
此外，实际上，经过时间和吸光度成对的数据暂时被保存在存储器84(参照图4)中，根据该数据进行峰面积的计算。因此，也可以省略例如图14所示的得到微分波形的工序，直接计算修正后变化量，根据该修正后变化量制作电泳图谱，该修正后变化量是进一步以相对检测时间除以对吸光度进行时间微分后的值而得到的值。
[实施例1]
作为实施例1，使用从8名受试者分别采集的人静脉血，实施上述实施方式的血红蛋白的分离分析方法。将这些待测体称为待测体1～待测体8。
(1)电泳测定
通过使用了含有阴离子模拟固定相(硫酸软骨素C钠)的泳动液和稀释液的毛细管电泳，进行HbA1c的测定。
将待测体液体通过稀释液来稀释，并将该待测体稀释液导入到导入槽。然后向毛细管施加电压进行电泳。电泳通过67μA的恒流控制来实施。然后，施加电压后，用毛细管下游的检测器以20毫秒的间隔在40秒的期间获取电泳的待测体液体的415nm的吸光度。
此外，稀释液为以下的组成。
柠檬酸：40mM
硫酸软骨素C钠：1％w/v
1-(3-磺丙基)吡啶氢氧化物分子内盐(东京化成工业)：500mM
乳化剂(Emulgen)LS-110(花王)：0.1％w/v
叠氮化钠：0.02％w/v
对于上述组成，通过pH调节用的二甲基氨基乙醇调整至pH6.0。
另外，泳动液为以下的组成。
柠檬酸：40mM
哌嗪：20mM
硫酸软骨素C钠：1.25％w/v
乳化剂(Emulgen)LS-110(花王)：0.1％w/v
叠氮化钠：0.02％w/v
对于上述组成，通过pH调节用的二甲基氨基乙醇调整至pH5.0。
(2)电泳图谱的制作
将所得到的吸光度数据转换为每单位时间的吸光度变化量(斜率值)。然后，横轴取经过时间，纵轴取斜率值，得到图14所示的电泳图谱。在横轴的经过时间中，将开始施加电压的时间点(第一时间点)作为分离分析的基准点，并设为0秒时间点。
(3)电泳图谱的修正
根据所得到的电泳图谱，确定稀释液中所含的1-(3-磺丙基)吡啶氢氧化物分子内盐的波峰，并将该波峰的检测时间设为界面检测时间(T0)。
然后，对于电泳图谱的T0以后的全部数据，将全部数据的各自的经过时间除以T0，由此计算所有数据中的每一个相对于T0的相对检测时间。该相对检测时间具有作为上述实施方式中所说的修正系数的倒数的意义。
然后，对于电泳图谱的T0以后的全部数据的每一个，通过以下的式而得到修正后变化量。
修正后变化量＝斜率(slope)值÷相对检测时间(修正系数的倒数)
然后，横轴取经过时间，纵轴取修正后变化量，得到如图14所示的修正电泳图谱。
(4)HbA1c面积比率的计算
从修正电位图中确定与总血红蛋白量对应的含有血红蛋白的区域和含有HbA1c的区域。然后，计算HbA1c面积比率，该HbA1c面积比率是HbA1c峰面积(例如，图15的画了斜线的波峰的面积)相对于总血红蛋白面积(例如，图15的实线部分的面积)的比例。
(5)标准曲线的制作
在23℃的环境下，按照上述(1)～(3)的步骤，预先测定已知的HbA1c值的标准待测体的HbA1c面积比率，该HbA1c值是HbA1c量相对于总血红蛋白量的比率。然后，制作从HbA1c面积比率中计算HbA1c值的标准曲线。
(6)环境温度影响的确认
按照上述(1)～(4)的步骤，在8℃、13℃、23℃、32℃和37℃的环境温度条件下，测定HbA1c值不同的8个待测体的HbA1c面积比率。然后，从上述(5)中得到的标准曲线中计算HbA1c值。此外，对一个待测体的一个温度条件反复进行四次测定，将该四次测定结果的平均值作为测定值。然后，对于8个待测体中的每一个，求出最大误差，该最大误差定义为最高的值与最低的值之差。
(7)比较例1
对与实施例相同的待测体不进行上述(3)的步骤，而在上述(4)的步骤中，从未修正的电泳图谱中计算出HbAc面积比率，并将其作为比较例1。
(8)结果
实施例1和比较例1的结果分别示于下述表1和表2。此外，各个数值用％表示。
[表1]
[表2]
由上述表1和表2可知，相对于比较例1，在实施例1中，在所有的待测体中，由环境温度的变化引起的测定值的误差变小。因此，认为通过实施本实施方式的血红蛋白的分离分析方法，至少能够更准确地测定HbA1c值。
[实施例2]
作为实施例2，使用从6名受试者分别采集的人静脉血，实施上述实施方式的血红蛋白的分离分析方法。将这些待测体称为待测体9～待测体14。这些待测体中，待测体9～11是通过公知对照法已知以HbC值含有HbC的待测体，该HbC值是HbC量相对于总血红蛋白量的比率，并且，待测体12～14是同样通过公知对照法已知以HbF值含有HbF的待测体，该HbF值是HbF量相对于总血红蛋白量的比率。
(1)电泳测定
与上述实施例1同样地进行。
(2)电泳图谱的制作
与上述实施例1同样地进行。
(3)电泳图谱的修正
与上述实施例1同样地进行。
(4)HbC值及HbF值的计算
对于待测体9～11，从修正电泳图谱中确定与总血红蛋白量对应的含有血红蛋白的区域和含有HbC的区域。然后，计算HbC面积比率，该HbC面积比率是HbC出峰面积相对于总血红蛋白面积(例如，图14的实线部分的面积)的比例。然后，将其作为HbC值。同样地，对于待测体12～14，计算HbF面积比率，该HbF面积比率是HbF峰面积相对于总血红蛋白面积的比例。然后，将其作为HbF值。
(5)环境温度
上述(1)～(4)的步骤分别在23℃的环境温度条件下实施。此外，对各待测体反复进行四次测定，将该四次测定结果的平均值作为测定值。
(6)比较例2
对与实施例2相同的待测体不进行上述(3)的步骤，而在上述(4)的步骤中，从未修正的电泳图谱中计算出HbC值和HbF值，并将其作为比较例2。
(7)结果
关于针对实施例2和比较例2的结果，将HbC值的测定示于下述表3中，将HbF值的测定示于下述表4中。此外，各个数值用％表示。此外，对于各个待测体，还一并记载了通过上述公知的对照法预先已知的测定值。各个数值用％表示。
[表3]
[表4]
由上述表3及表4可知，相对于比较例2，实施例2的HbC值和HbF值在所有待测体中接近于对照法的测定值。这是因为，通过使用修正系数的修正来计算不包含待测体成分的浓缩的影响的峰面积，根据该峰面积计算各血红蛋白区域的面积比率。因此，通过实施本实施方式的血红蛋白的分离分析方法，即使不使用标准曲线，也能够准确地测定HbC值和HbF值，该HbC值是HbC量相对于总血红蛋白量的比率，该HbF值是HbF量相对于总血红蛋白量比率。
工业应用性
本发明可用于通过毛细管电泳法进行的血红蛋白的分离分析方法中。
符号说明
A1：分析系统；1：分析装置；2：分析芯片；2A：上侧部分；2B：下侧部分；5：检测器；6：分注器；8：控制部；21：主体；22：混合槽；23：导入槽；24：过滤器；25：排出槽；26：电极槽；27：毛细管；28：联络流路；31：阳极；32：阴极；41：光源；42：滤光器；43：透镜；44：狭缝；61：泵；71：稀释液槽；72：泳动液槽。
Claims (12)
1.一种待测体成分的分离分析方法，用于向用流路液体充满的分离流路内导入待测体液体并分析所述待测体液体中所含的待测体成分，其中，
向所述分离流路内导入所述待测体液体，
以预定的间隔测定在所述分离流路的预定位置上的所述待测体液体的光学特性值，根据所测定的光学特性值计算光学特性值的每单位时间的变化量，
决定所述流路液体与所述待测体液体的界面到达所述预定位置的界面检测时间点，
通过将从向所述分离流路内导入所述待测体液体的第一时间点到所述界面检测时间点为止的时间相对于从所述第一时间点到在所述预定位置测定到所述光学特性值的时间点为止的时间的比例乘以所述光学特性值的每单位时间的变化量，来修正所述光学特性值的每单位时间的变化量，
制作修正后的光学特性值的每单位时间的变化量的时间分布，
计算所述时间分布中所表现的来自待测体成分的峰的峰面积。
2.根据权利要求1所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述比例相当于所述待测体成分在所述分离流路内流动的速度相对于所述待测体液体在所述分离流路内流动的速度的比。
3.根据权利要求1或2所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述分离分析方法是毛细管电泳法，所述分离流路是毛细管，所述流路液体是泳动液，所述第一时间点是开始对毛细管施加电压的时间点。
4.根据权利要求1或2所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述分离分析方法是毛细管电泳法，所述分离流路是毛细管，所述流路液体是泳动液，所述第一时间点是开始对毛细管施加电压的时间点，所述时间分布是电泳图谱。
5.根据权利要求3所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述毛细管电泳法是使所述待测体液体朝向设置在所述毛细管的阴极进行泳动的方法，
所述泳动液中含有阴离子聚合物。
6.根据权利要求5所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述阴离子聚合物为硫酸软骨素。
7.根据权利要求3所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述泳动液具有分子内盐。
8.根据权利要求1或2所述的待测体成分的分离分析方法，其中，所述待测体液体是用稀释液稀释血液而得到的液体。
9.根据权利要求8所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述稀释液具有分子内盐。
10.根据权利要求7所述的待测体成分的分离分析方法，其中，
所述分子内盐是3-(1-吡啶基)丙磺酸。
11.根据权利要求1或2所述的待测体成分的分离分析方法，其中，所述光学特性值是吸光度。
12.根据权利要求1或2所述的待测体成分的分离分析方法，其中，所述待测体成分是血红蛋白。
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2020
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- 2020-06-19 EP EP20181099.1A patent/EP3754330B1/en active Active
Patent Citations (3)
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| EP3315959A1 (en) * | 2016-10-27 | 2018-05-02 | ARKRAY, Inc. | Analytical method and analytical system |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Michael S. Belle等.Computer-assisted determination of the inner temperature and peak correction for capillary electrophoresis.《Journal of Chromatography A》.1993,第652卷(第2期),第329-336页. * |
Also Published As
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|---|---|
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Legal Events
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