JP7171959B1 - 安定型ＨｂＡ１ｃ割合の算出方法、液体クロマトグラフィー装置及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】修飾ヘモグロビンによる影響を抑制した糖化ヘモグロビン割合の算出方法、液体クロマトグラフィー装置及びプログラムの提供。【解決手段】不安定型Ａ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、糖化ヘモグロビンとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離してクロマトグラムを取得し、クロマトグラムにおいて、糖化ヘモグロビンのピークを検出し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を算出し、糖化ヘモグロビンのピークの開始点の吸光度、糖化ヘモグロビンのピークの頂点の吸光度、及び糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合に対応する補正式に基づいて糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を補正し、補正された糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビンの濃度の割合を算出することを含む、糖化ヘモグロビン割合の算出方法。【選択図】図２

Description

本発明は、糖化ヘモグロビンの割合の算出方法、液体クロマトグラフィー装置及びプログラムに関する。

ヘモグロビンは、血中に存在する糖やその代謝物と非酵素的に結合して糖化ヘモグロビンを形成する。ヘモグロビンＡ１は、全ヘモグロビンの大半を占めるヘモグロビンＡの糖化ヘモグロビンである。ヘモグロビンＡ１は、更にＡ１ａ、Ａ１ｂ及びＡ１ｃに分類される。ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、単にＨｂＡ１ｃと表すことがある）は、赤血球の寿命である約１２０日間、血中に存在し続ける。ヘモグロビンの糖化反応速度は遅いため、ヘモグロビン総量に対する糖化ヘモグロビンの割合（以下、単に糖化ヘモグロビン％、又はＨｂＡ１ｃ％と表すことがある）は食事等による一時的な血糖値の上昇に影響されにくい。従って、ＨｂＡ１ｃ％を測定することで、過去１～２カ月の間の血糖の状態を推定することができる。このように、ＨｂＡ１ｃ％は、比較的長期にわたる血糖値の推移を確認できることから、臨床的に有意義である。

糖化ヘモグロビンの定量法としては、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、免疫法及び酵素法等が知られている。液体クロマトグラフィー法には、イオン交換クロマトグラフィーによる測定方法と、アフィニティクロマトグラフィーによる測定方法とがある。イオン交換クロマトグラフィーによる測定方法では、イオン交換物質を固定した充填材を用い、種々のヘモグロビンをその電荷の相違を利用して分画して測定する。アフィニティクロマトグラフィーによる測定方法では、糖に対して親和性の高い充填材を用いる。例えば、特許文献１は、イオン交換クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定について開示している。

特開平９－１７８７１９号公報

糖化ＨｂＡ１ｃには、安定型ＨｂＡ１ｃと不安定型ＨｂＡ１ｃ（レイバイルＡ１ｃ）がある。両者は液体クロマトグラフィー法で分離でき、通常は安定型ＨｂＡ１ｃを測定する。また、ヘモグロビンには、アルデヒド化ヘモグロビン及びカルバミル化ヘモグロビン等の修飾ヘモグロビンが含まれる。血液由来成分を含む試料がレイバイルＡ１ｃや修飾ヘモグロビンを含むと、液体クロマトグラフィー法により得られるクロマトグラムにおいて、糖化ヘモグロビンのピークが検出される溶出時間付近に、糖化ヘモグロビン由来のピークに加え、レイバイルＡ１ｃや修飾ヘモグロビン由来のピークが検出される場合がある。

レイバイルＡ１ｃは、ヘモグロビンにグルコースが結合して生成する。健常人にも含まれる成分である。修飾ヘモグロビンは、特定の疾患で上昇することが知られている。例えば腎不全の患者では、尿素から生成されるシアン酸によってカルバミル化ヘモグロビンが生じる。また、健常人であっても、食事等の影響で修飾ヘモグロビン濃度が上昇することが知られている。例えば飲酒後は、血中のアセトアルデヒドによってアルデヒド化ヘモグロビンが生じる。レイバイルＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンは、全ての検体に含まれる可能性がある成分である。

レイバイルＡ１ｃや修飾ヘモグロビンのピークは、安定型ＨｂＡ１ｃのピーク付近に現れるため、安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積に影響を及ぼし、全ヘモグロビン濃度に対する安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合が正確に算出されない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、修飾ヘモグロビンによる影響を抑制した糖化ヘモグロビン割合の算出方法、液体クロマトグラフィー装置及びプログラムを提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を有する。
［１］不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、安定型ＨｂＡ１ｃとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離してクロマトグラムを取得し、
前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出し、
全ピーク面積に対する前記糖化安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を算出し、
前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を補正し、前記補正された安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出することを含む、安定型ＨｂＡ１ｃ割合の算出方法。
［２］前記補正式Ｅ１は、吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１の二次以上の関数である、［１］に記載の算出方法。
［３］前記補正式Ｅ１は、予め設定された全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に対応する少なくとも２つ以上の補正式を含む、［１］又は［２］に記載の算出方法。
［４］２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に最も近い割合に対応する補正式を用いる、［３］に記載の算出方法。
［５］２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に１番目に近い割合に対応する補正式Ｅ１－１及び２番目に近い割合に対応する補正式Ｅ１－２を用いる、［３］に記載の算出方法。
［６］算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に基づいて前記補正式Ｅ１－１及びＥ１－２の使用率を決定し、
前記補正式Ｅ１－１、前記補正式Ｅ１－２及び前記使用率を用いて前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出する、［５］に記載の算出方法。
［７］前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出する工程において、
前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃが検出される溶出時間の範囲に存在する複数のピークのうち溶出時間が遅い順に、ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるかを判定し、次に、前記ピークの頂点における溶出時間に対する前記ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるか否かを判定する工程を前記複数のピークについて繰り返し、
前記ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であり、前記ピークの頂点における溶出時間に対する前記ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるピークであると判定した場合、このピークより溶出時間が早いピークについて判定を行わない、［１］～［６］の何れか一項に記載の算出方法。
［８］前記判定する工程において、判定対象の前記ピークの頂点の溶出時間が溶出時間Ｃ１、前記ピークの頂点より溶出時間が早い側の前記ピークの極小値の溶出時間が溶出時間Ｄ１であり、
前記ピークの頂点の吸光度と前記ピークの極小値の吸光度の差であるｙ１と、前記溶出時間Ｃ１と前記溶出時間Ｄ１の差であるｘ１の比がｙ１／ｘ１であるとき、
前記ｙ１／ｘ１が所定の閾値より大きいと判定されたピークを前記安定型ＨｂＡ１ｃの候補ピークとして抽出し、
前記候補ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるか否かを判定し、次に前記候補ピークの頂点の溶出時間に対する前記候補ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるか否かを判定する、［７］に記載の算出方法。
［９］前記クロマトグラムの溶出時間が最も早いピークが立ち上がる前のポイントから、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の溶出時間Ａに係数Ｒ１を乗じた時間の吸光度までの直線をベースラインとし、
前記溶出時間Ａに係数Ｒ２を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点と設定し、
前記溶出時間Ａに係数Ｒ３を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの終点と設定することをさらに含む、［１］～［８］の何れか一項に記載の算出方法。
［１０］前記全ピーク面積を補正式Ｅ２を用いて補正し、
補正された前記全ピーク面積と前記安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて、前記全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出することを含む、前記算出方法であって、
前記補正式Ｅ２は、全ヘモグロビン濃度に対する安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の割合が同一であって、全ヘモグロビン濃度が異なる複数の標準試料についてクロマトグラムを取得し、それぞれの標準試料の全ピーク面積を、前記標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合、及び各標準試料の安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて作成される補正式である、［１］～［９］の何れか一項に記載の算出方法。
［１１］前記補正式Ｅ２は、以下の式（１）を用いて補正後の全ピーク面積を算出し、前記複数の標準試料について、全ピーク面積の実測値に対する補正後の全ピーク面積をプロットしたときの近似式である、［１０］に記載の算出方法。
補正後の全ピーク面積＝（安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積／Ｖ）×１００・・・(１)
（式(１)中、Ｖは、前記複数の標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合を示す。）
［１２］前記修飾ヘモグロビンは、カルバミル化ヘモグロビン及びアルデヒド化ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種のヘモグロビンである、［１］～［１１］の何れか一項に記載の算出方法。
［１３］不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、安定型ＨｂＡ１ｃとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料を導入する導入部と、
前記導入部から導入された前記試料及び溶離液を移送する液送部と、
前記液送部から前記試料及び前記溶離液が導入されるイオン交換クロマトグラフィーカラムと、
前記イオン交換クロマトグラフィーカラムにより分画された前記血液由来成分を検出する検出部と、
前記検出部が検出した情報に基づいてクロマトグラムを作成し、前記クロマトグラムを分析する分析部と、を含み、
前記分析部は、
前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出し、
全ピーク面積に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を算出し、
前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を補正し、前記補正された安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出することを含む、液体クロマトグラフィー装置。
［１４］前記補正式Ｅ１は、吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１の二次以上の関数である、［１３］に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［１５］前記補正式Ｅ１は、予め設定された全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に対応する少なくとも２つ以上の補正式を含む、［１３］又は［１４］に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［１６］前記分析部は、２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に最も近い割合に対応する補正式を用いる、［１５］に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［１７］前記分析部は、２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に１番目に近い割合に対応する補正式Ｅ１－１及び２番目に近い割合に対応する補正式Ｅ１－２を用いる、［１５］に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［１８］前記分析部は、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に基づいて前記補正式Ｅ１－１及びＥ１－２の使用率を決定し、
前記補正式Ｅ１－１、前記補正式Ｅ１－２及び前記使用率を用いて前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出する、［１７］に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［１９］前記分析部は、溶出時間が最も早いピークが立ち上がる前のポイントから、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の溶出時間Ａに係数Ｒ１を乗じた時間の吸光度までの直線をベースラインとし、
前記溶出時間Ａに係数Ｒ２を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点と設定し、
前記溶出時間Ａに係数Ｒ３を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの終点と設定する、［１３］～［１８］の何れか一項に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［２０］前記分析部は、前記全ピーク面積を補正式Ｅ２を用いて補正し、
補正された前記全ピーク面積と前記安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて、前記全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出することを含む、液体クロマトグラフィー装置であって、
前記補正式Ｅ２は、全ヘモグロビン濃度に対する安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の割合が同一であって、全ヘモグロビン濃度が異なる複数の標準試料についてクロマトグラムを取得し、それぞれの標準試料の全ピーク面積を、前記標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合、及び各標準試料の安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて作成される補正式である、［１３］～［１９］の何れか一項に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［２１］前記補正式Ｅ２は、以下の式（１）を用いて補正後の全ピーク面積を算出し、前記複数の標準試料について、全ピーク面積の実測値に対する補正後の全ピーク面積をプロットしたときの近似式である、［２０］に記載の安定型ＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー装置。
補正後の全ピーク面積＝（安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積／Ｖ）×１００・・・(１)
（式(１)中、Ｖは、前記複数の標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合を示す。）
［２２］前記修飾ヘモグロビンは、カルバミル化ヘモグロビン及びアルデヒド化ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種のヘモグロビンである、［１３］～［２１］の何れか一項に記載の液体クロマトグラフィー装置。
［２３］安定型ＨｂＡ１ｃを測定するためのプログラムであって、
コンピューターに、
不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、安定型ＨｂＡ１ｃとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離させたクロマトグラムのデータを取得させ、
前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出させ、
全ピーク面積に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を算出させ、
前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を補正し、前記補正された安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出させることを含む、プログラム。
［２４］前記補正式Ｅ１は、吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１の二次以上の関数である、［２３］に記載のプログラム。
［２５］前記補正式Ｅ１は、予め設定された全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に対応する少なくとも２つ以上の補正式を含む、［２３］又は［２４］に記載のプログラム。
［２６］前記コンピューターに、
２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に最も近い割合に対応する補正式を用いさせる、［２５］に記載のプログラム。
［２７］前記コンピューターに、
２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に１番目に近い割合に対応する補正式Ｅ２－１及び２番目に近い割合に対応する補正式Ｅ１－２を用いさせる、［２５］に記載のプログラム。
［２８］前記コンピューターに、
算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に基づいて前記補正式Ｅ１－１及びＥ１－２の使用率を決定させ、
前記補正式Ｅ１－１、前記補正式Ｅ１－２及び前記使用率を用いて前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出させる、［２７］に記載のプログラム。
［２９］前記コンピューターに、
前記クロマトグラムの溶出時間が最も早いピークが立ち上がる前のポイントから、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の溶出時間Ａに係数Ｒ１を乗じた時間の吸光度までの直線をベースラインとし、
前記溶出時間Ａに係数Ｒ２を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点と設定させ、
前記溶出時間Ａに係数Ｒ３を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの終点と設定させる、［２３］～［２８］の何れか一項に記載のプログラム。
［３０］前記コンピューターに、
前記全ピーク面積を補正式Ｅ２を用いて補正させ、
補正された前記全ピーク面積と前記安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて、前記全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出させることを含む、プログラムであって、
前記補正式Ｅ２は、全ヘモグロビン濃度に対する安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の割合が同一であって、全ヘモグロビン濃度が異なる複数の標準試料についてクロマトグラムを取得し、それぞれの標準試料の全ピーク面積を、前記標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合、及び各標準試料の安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて作成される補正式である、［２３］～［２９］の何れか一項に記載のプログラム。
［３１］前記補正式Ｅ２は、以下の式（１）を用いて補正後の全ピーク面積を算出し、前記複数の標準試料について、全ピーク面積の実測値に対する補正後の全ピーク面積をプロットしたときの近似式である、［３０］に記載のプログラム。
補正後の全ピーク面積＝（安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積／Ｖ）×１００・・・(１)
（式(１)中、Ｖは、前記複数の標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合を示す。）
［３２］前記修飾ヘモグロビンは、カルバミル化ヘモグロビン及びアルデヒド化ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種のヘモグロビンである、［２３］～［３１］の何れか一項に記載のプログラム。

上記態様によれば、修飾ヘモグロビンによる影響を抑制した糖化ヘモグロビン割合の算出方法、液体クロマトグラフィー装置及びプログラムを提供することができる。

血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。 本発明の一態様における糖化ヘモグロビン割合の算出方法のフローチャートである。 本発明の一態様における糖化ヘモグロビンの検出方法のフローチャートである。 血液由来成分を含む試料のクロマトグラムを元に作成した本発明の一態様における糖化ヘモグロビンの検出方法を説明するための概念図である。 血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。 血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。 血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。 本発明の一態様における液体クロマトグラフィー装置の一態様における概略図である。 本発明の一態様における分析部の機能構成の一例を示す構成図である。 正常検体のヘモグロビン濃度変動試料のクロマトグラムである。 ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体のクロマトグラムである。 ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体を用いて調製したレイバイルＡ１ｃを含む試料のクロマトグラムである。 ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体を用いて調製したアルデヒド化ヘモグロビンを含む試料のクロマトグラムである。 ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体を用いて調製したカルバミル化ヘモグロビンを含む試料のクロマトグラムである。 糖化ヘモグロビンＥを含む試料のクロマトグラムである。 ＨｂＡ１ｃ％が５．２％であり、全ヘモグロビン濃度が５．０μｍｏｌ／Ｌである試料のクロマトグラムである。 ＨｂＡ１ｃ％が５．２％であり、全ヘモグロビン濃度が７０μｍｏｌ／Ｌである試料のクロマトグラムである。 糖化ヘモグロビンピークがブロードとなったクロマトグラムである。 補正前の全ピーク面積に基づいて算出されたＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正後の全ピーク面積に基づいて算出されたＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 ＨｂＡ１ｃ％が５．２％の試料の吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１比とΔＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。 ＨｂＡ１ｃ％が８．０％の試料の吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１比とΔＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。 ＨｂＡ１ｃ％が１０．１％の試料の吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１比とΔＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。 補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。

以下、本発明の一態様について図を参照して説明する。

本明細書において、糖化ヘモグロビンとはヘモグロビンＡ１、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ及びヘモグロビンＡ１ｃの何れか１つである。血糖コントロール状態を知るのに有益であるという観点から、安定型のヘモグロビンＡ１ｃであることが好ましい。本発明においては、糖化ヘモグロビンとして安定型ＨｂＡ１ｃを選択する。

＜糖化ヘモグロビン割合の算出方法＞
本発明の一態様における糖化ヘモグロビン割合の算出方法は、不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、糖化ヘモグロビンとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離してクロマトグラムを取得する。クロマトグラムにおいて、糖化ヘモグロビンのピークを検出する。全ピーク面積に対する前記糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を算出し、前記糖化ヘモグロビンのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記糖化ヘモグロビンのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記糖化ヘモグロビンの面積の割合を補正する。前記補正された糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記糖化ヘモグロビンの濃度の割合を算出する。

（糖化ヘモグロビン割合の算出方法）
試料にレイバイルＡ１ｃや修飾ヘモグロビンが含まれると、修飾ヘモグロビンのピークは、糖化ヘモグロビンが検出される溶出時間の範囲Ｔに現れる。修飾ヘモグロビンとは、カルバミル化ヘモグロビン及びアルデヒド化ヘモグロビン等である。以下、レイバイルＡ１ｃと修飾ヘモグロビンを総称し、修飾ヘモグロビン等と記載することがある。修飾ヘモグロビン等は、糖化ヘモグロビンの溶出時間より早く溶出される。また、修飾ヘモグロビン等のピークは、糖化ヘモグロビンのピークに隣接して現れる。そのため、糖化ヘモグロビンのピークと修飾ヘモグロビン等のピークが干渉し、糖化ヘモグロビンのピーク面積に影響を及ぼす。例えば、図６は、血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。ＰＡは、糖化ヘモグロビンのピークを示し、ＰＭは、修飾ヘモグロビン等のピークを示す。ＰＭピークの低い線（実線）からＰＭピークの高い線（一点鎖線）の順に、それぞれシアン酸ナトリウムの最終濃度が０ｍｇ／ｄＬ、５ｍｇ／ｄＬ、１０ｍｇ／ｄＬ、１５ｍｇ／ｄＬ、及び２５ｍｇ／ｄＬである血液由来成分を含む試料を示す。修飾ヘモグロビン等の濃度が上昇すると、糖化ヘモグロビンピークＰＡの開始点の吸光度Ｘ０が上昇し、糖化ヘモグロビンピークＰＡの頂点の吸光度Ｘ１が低下している。修飾ヘモグロビン等による干渉の影響を抑えるため、以下の方法で糖化ヘモグロビンの割合を補正する。なお、糖化ヘモグロビンピークＰＡの開始点とは、糖化ヘモグロビンピークの頂点より溶出時間が早い側の前記ピークの極小値を示す。

まずは、糖化ヘモグロビンの割合を補正するための補正式Ｅ１を作成する。まず、糖化ヘモグロビンの割合が同一であり、修飾ヘモグロビン等の濃度の異なる複数の標準試料について、液体クロマトグラフィー装置を用いてクロマトグラムを取得する（図１参照）。このときの糖化ヘモグロビンの割合は、３～２０％の間に設定することができる。得られたクロマトグラムから吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１及び全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピーク面積の割合を取得する。吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１に対し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピーク面積の割合をプロットし、近似式を得て補正式Ｅ１とする。補正式Ｅ１は、二次以上の関数であってよい。

図２は、本発明の一態様における糖化ヘモグロビン割合の算出方法のフローチャートである。実際に糖化ヘモグロビンの割合を補正する場合、まず目的試料のクロマトグラムを取得する（Ｓ１１）。クロマトグラムから糖化ヘモグロビンのピークを検出し（Ｓ１２）、吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１及び全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピーク面積の割合（以下、補正前の値と記載することがある）を算出する（Ｓ１３及びＳ１４）。吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１を補正式Ｅ１に代入し、補正値を得る（Ｓ１５）。補正前の値から補正値を差し引き（Ｓ１６）、補正された糖化ヘモグロビンの割合が得られる（Ｓ１７）。

補正式Ｅ１は、２つ以上であってもよい。この場合、糖化ヘモグロビンの割合を変え、同様に複数の標準試料を用いてクロマトグラムを取得する。糖化ヘモグロビンの割合を３～２０％の間の少なくとも２つの値に設定し、修飾ヘモグロビン等の濃度の異なる複数の標準試料を調製することができる。例えば、糖化ヘモグロビンの割合が５％、８％及び１０％のときの補正式をそれぞれ作成することができるが、本発明はこれに限定されない。

一例として、糖化ヘモグロビンの割合がＱ％の補正式を補正式Ｅ１－１、糖化ヘモグロビンの割合がＲ％の補正式を補正式Ｅ１－２とする。ここで、Ｑ＜Ｒである。実際に糖化ヘモグロビンの割合を補正する場合、補正前の値がＱ％以下であるとき、補正式Ｅ１－１のみを用いて補正値を算出する。補正前の値がＲ％以上であるとき、補正式Ｅ１－２のみを用いて補正値を算出する。補正前の値がＱ％より大きくＲ％未満であるとき、補正式Ｅ１－１及びＥ１－２を用いて補正値を算出する。

また、補正式Ｅ１－１及びＥ１－２に加え、糖化ヘモグロビンの割合がＳ％の補正式Ｅ１－３を用いる場合（Ｒ＜Ｓである）、補正前の値がＱ％以下であるとき、補正式Ｅ１－１のみを用いて補正値を算出する。補正前の値がＱ％より大きくＲ未満であるとき、補正式Ｅ１－１及びＥ１－２を用いて補正値を算出する。補正前の値がＲ％である場合、補正式Ｅ１－２のみを用いて補正値を算出する。補正前の値がＲ％より大きくＳ％未満であるとき、補正式Ｅ１－２及びＥ１－３を用いて補正値を算出する。補正前の値がＳ以上であるとき、補正式Ｅ１－３のみを用いて補正値を算出する。以上のように、補正式が３以上である場合、補正前の値より大きく、最も近い割合に対応する補正式と、補正前の値より小さく、最も近い割合に対応する補正式の２つを選択して用いることができる。

２つ以上の補正式Ｅ１を用いて補正値を算出する際、各補正式の使用率を等分ずつとしてもよい。また、各補正式の使用率に重み付けを行ってもよい。例えば、補正前の値がＸ％であり、補正式Ｅ１－１及びＥ１－２を用いて補正する場合、補正式Ｅ１－１及びＥ１－２の使用率を以下式（１）及び（２）のように定めることができる。
補正式Ｅ１－１の使用率（％）＝｛（Ｘ－Ｑ）／（Ｘ－Ｒ）｝×１００・・・（１）
補正式Ｅ１－２の使用率（％）＝１００－（補正式Ｅ１－１の使用率）・・・（２）

以上の算出方法によれば、修飾ヘモグロビンによる影響を抑制して糖化ヘモグロビン割合を算出することができる。

（糖化ヘモグロビン％の算出）
糖化ヘモグロビン％は、全ヘモグロビン画分に相当するクロマトグラムの総面積に対する、糖化ヘモグロビンピークの面積の比率（以下、ＨｂＡ１ｃ％と記載することがある）で評価することができる。全ヘモグロビン画分とは、液体クロマトグラフィーにおいて、非糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ０）やＨｂＤ、ＨｂＳといった溶出時間の遅いヘモグロビンも含めた、主要なヘモグロビンの総和である。全ヘモグロビン画分は、上述の主要なヘモグロビンの溶出がすべて完了した時点における、クロマトグラムの曲線とベースラインに囲まれる面積として算出することができる。

また、糖化ヘモグロビン％は、全ヘモグロビンの画分の総面積から、異常ヘモグロビンの面積を差し引いた面積に対する比率で評価されることがある。異常ヘモグロビンとは、例えばＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＦ、及びＨｂＳなどが挙げられる。これらの異常ヘモグロビンのピーク位置は、用いる液体クロマトグラフィー装置のカラム長、溶離液の流速及び溶離液の組成等により異なる。よって、異常ヘモグロビンを含む任意の試料を液体クロマトグラフィー装置で設定した条件で溶出して得たクロマトグラムと、既知の試料のクロマトグラムとを比較することで、個々の条件において異常ヘモグロビンがどの程度の溶出時間で溶出されるかを知ることができる。異常ヘモグロビンのピークを特定し、そのピーク面積を算出し、全ヘモグロビンのピーク面積から差し引いた値に対する、糖化ヘモグロビン面積の比率として糖化ヘモグロビン割合を評価することができる。差し引く異常ヘモグロビンの種類は、１つでもよく、複数でもよい。本明細書で「全ヘモグロビンの量に対する」と記載する場合、この「全ヘモグロビンの量から、異常ヘモグロビンの量を差し引く」場合を含むものとする。

本明細書ではクロマトグラム上のピーク面積をヘモグロビンの濃度を反映するものとして議論しているが、生体試料中または希釈後の測定試料中の質量を反映するものとして議論することも可能である。

（糖化ヘモグロビンのピークの検出）
上記糖化ヘモグロビンの割合の算出方法において、以下の方法で糖化ヘモグロビンのピークを検出することが好ましい。図３は、本発明の一態様における糖化ヘモグロビンの検出方法に関するフローチャートである。血液由来成分を含む試料を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離してクロマトグラムを取得する（Ｓ２１）。図４は、血液由来成分を含む試料のクロマトグラムを元に作成した本発明の一態様における糖化ヘモグロビンの検出方法を説明するための概念図を示す。

得られるクロマトグラムのピーク形状及び糖化ヘモグロビンのピーク頂点における溶出時間Ａ（以下、単に溶出時間Ａと記載することがある）は、用いる液体クロマトグラフィー装置のカラム長、溶離液の流速及び溶離液の組成等により異なる。また、試料にレイバイルＡ１ｃ、修飾ヘモグロビン、及び糖化異常ヘモグロビンが含まれる場合は、溶出時間Ａ付近に複数のピークが検出される。また、溶出時間Ａは、カラムの劣化や装置の使用環境により変動することがある。そのため、糖化ヘモグロビンが検出される溶出時間の範囲Ｔ（以下、単に溶出時間の範囲Ｔと記載することがある）は、ある程度の幅をもって設定される。糖化ヘモグロビンを含む任意の試料を液体クロマトグラフィー装置で設定した条件で溶出して得たクロマトグラムと、既知の試料のクロマトグラムとを比較することで、個々の条件において糖化ヘモグロビンがどの程度の溶出時間で溶出されるかを予め想定することができ、この情報を元に溶出時間の範囲Ｔを設定することができる。本実施形態においては、一例として溶出時間の範囲Ｔは、溶出時間が３０秒～６０秒の間の範囲であるとして説明する。

得られたクロマトグラムにおいて、溶出時間の範囲Ｔに現れる複数のピークを選定する（Ｓ２２）。本明細書において、あるピークの頂点が溶出時間の範囲Ｔに存在する場合、そのピークは、溶出時間の範囲Ｔに存在するピークであると判断される。複数のピークは、糖化ヘモグロビンの他、レイバイルＡ１ｃ、カルバミル化ヘモグロビン、アルデヒド化ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンＥからなる群から選択される少なくとも１種のヘモグロビンのピークを含んでいてもよい。

図４に示すクロマトグラムでは溶出時間の範囲Ｔに複数のピークＰ１～Ｐ３が存在する。まず、複数のピークのうち溶出時間が最も遅いＰ１を選定する（Ｓ２３）。ピークＰ１について、ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるか否かの判定を行う（Ｓ２４）。

ピークＰ１の頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるか否かの判定により、異常に小さい又は大きいピークを除外することができる。「所定の数値範囲」は、使用する液体クロマトグラフィー装置において、種々の濃度の糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度の範囲を予め測定して設定することができる。例えば、一般的に用いられる血液検体の前処理条件で分析した際の糖化ヘモグロビンピーク吸光度の値に対して５０～２００％を所定の数値範囲とする。

ピークＰ１の頂点の吸光度が所定の数値範囲内である場合、ピーク頂点の溶出時間に対する前記ピークの半値幅の割合（以下、単にピークの半値幅の割合と記載することがある）が１０～４５％であるか否かを判定する（Ｓ２５）。これにより、複数ピークの重複や、送液不良等の異常によるピークを検出することができる。

ここで、ピークＰ１の頂点の吸光度が所定の数値範囲外である場合、ピークＰ１は、糖化ヘモグロビンのピークではないと判定し、糖化ヘモグロビンが検出される溶出時間の範囲に存在する複数のピークのうち溶出時間が２番目に遅いピークＰ２を選定する（Ｓ２６）。ピークＰ１の頂点の吸光度が所定の数値範囲内である場合、引き続き、ピークの半値幅の割合を判定する。ピークの半値幅の割合が１０％未満または４５％を超える場合、ピークＰ１は、糖化ヘモグロビンのピークではないと判定し、ピークＰ２を選定する。図４では、ピークＰ１の半値幅の割合が１０％以下の例を示している。

ピークＰ２について、ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であり、ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるか否かの判定を行う。

図４では、ピークＰ２の頂点の吸光度は、所定の数値範囲内であり、ピークの半値幅の割合が１８％であり１０～４５％に含まれる。この場合、ピークＰ２は、糖化ヘモグロビンのピークとして検出される（Ｓ２７）。

ピークＰ２が糖化ヘモグロビンのピークとして検出されたため、このピークより溶出時間が早いピーク、すなわち溶出時間の範囲Ｔに存在する複数のピークのうち溶出時間が３番目に遅いピークＰ３については、上記判定工程を行わないことが好ましい。これにより、糖化ヘモグロビンのピーク検出時間を短縮することができる。

もう一つの態様として、溶出時間の範囲Ｔに存在する複数のピークのうち溶出時間が遅い順に全てのピークについて上記判定工程を行い、その後に複数のピークのうちの１つのピークを糖化ヘモグロビンのピークとして検出してもよい。上記判定工程の結果、糖化ヘモグロビンのピークとして２以上のピークが判定された場合、最も遅い溶出時間のピークを糖化ヘモグロビンのピークとして検出する。

さらにもう一つの態様として、前記判定する工程においてさらに以下の判定を行ってもよい。判定対象のピークをピークＰ１として、図５を参照して説明する。図５は、血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。

ピークＰ１の頂点の溶出時間が溶出時間Ｃ１、ピークＰ１の頂点より溶出時間が早い側のピークＰ１の極小値の溶出時間が溶出時間Ｄ１である。ピークＰ１の頂点の吸光度とピークＰ１の極小値の吸光度の差は、ｙ１である。溶出時間Ｃ１と溶出時間Ｄ１の差は、ｘ１である。ピークＰ１の傾きｙ１／ｘ１が、所定の閾値より大きいか否かを判定する。つまり、上述の前記判定する工程で行われる（１）ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるか否か、（２）ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるか否か、に加え、（３）ｙ１／ｘ１が所定の閾値より大きいか否か、についても判定してもよい。ピークＰ１の傾きｙ１／ｘ１が所定の閾値より大きい場合に糖化ヘモグロビンのピークであると判定する。このｙ１／ｘ１に基づく判定は、（１）及び（２）の前に判定してもよい。溶出時間の範囲Ｔにおける全てのピークについてｙ１／ｘ１に基づく判定を行い、糖化ヘモグロビンピークの候補ピークを抽出してから、（１）及び（２）を判定してもよい。溶出時間の範囲Ｔにおけるピークについて、ピーク毎にｙ１／ｘ１に基づく判定を行ってから、（１）及び（２）を判定してもよい。溶出時間の範囲Ｔにおける全てのピークについてｙ１／ｘ１に基づく判定を行い、糖化ヘモグロビンピークの候補ピークを抽出してから、（１）及び（２）を判定することが好ましい。

ピークＰ１の傾きｙ１／ｘ１が、所定の閾値より大きいか否かを判定する際の「所定の閾値」は、使用する液体クロマトグラフィー装置において、種々の濃度の糖化ヘモグロビンを含む試料を予め測定して設定することができる。

また、種々の濃度のレイバイルＡ１ｃ、修飾ヘモグロビン及び糖化異常ヘモグロビンをそれぞれ含む試料を予め測定し、それらの傾きと区別できるようにピークＰ１の傾きｙ１／ｘ１の閾値を設定することができる。

以上により、糖化ヘモグロビンが検出される溶出時間の範囲に複数のピークが存在する場合においても、正確に糖化ヘモグロビンのピークを検出することができる。

（糖化異常ヘモグロビンの検出）
検出した糖化ヘモグロビンのピークの形状から、試料が糖化異常ヘモグロビンを含んでいるかを判定することができる。図６は、血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。

図６において、ＰＡは糖化ヘモグロビンのピーク、Ａは糖化ヘモグロビンのピーク頂点の溶出時間を示す。糖化ヘモグロビンのピークのうち溶出時間Ａより溶出時間が遅く、かつ糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度に対し２０％の吸光度であるときの溶出時間を溶出時間Ｂとする。溶出時間Ｂと溶出時間Ａとの差が、溶出時間Ａに対し５０％以上である場合、前記試料が糖化異常ヘモグロビンを含むと判定する。ここで検出される糖化異常ヘモグロビンは、糖化異常ヘモグロビンＥであってもよい。

溶出時間Ｂの吸光度は、糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度に対し２０％の数値に設定すると、糖化異常ヘモグロビンのブロードなピークを検出しやすい。なお、溶出時間Ｂの吸光度は、糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度に対し２０％の数値に限定されず、１０～３０％の範囲で適宜設定してもよく、１５～２５％であることが好ましく、２０％であることがより好ましい。好ましい数値は、用いる液体クロマトグラフィー装置のカラム長、溶離液の流速及び溶離液の組成等により異なる。糖化ヘモグロビンＥを含む任意の試料と、糖化ヘモグロビンＥを含まない任意の試料を、液体クロマトグラフィー装置で設定した条件で溶出して得たクロマトグラムを比較する。糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度に対する糖化ヘモグロビンＥのピーク頂点の吸光度の割合が取りうる範囲を把握し、その割合を元に決定することが好ましい。例えば図４では、破線で示したクロマトグラムが、糖化ヘモグロビンＥに由来するピークである。５０秒～７０秒の溶出時間の範囲において、破線と実線のクロマトグラムが乖離している。破線と実線のクロマトグラムが乖離している吸光度範囲において、破線の吸光度が糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度に対し何％に相当するかを検証することで、当該数値を設定することができる。

前述の糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度に対する数値として１０％の数値を採用する場合、溶出時間Ｂと溶出時間Ａとの差が、溶出時間Ａに対し７０％以上である場合、前記試料が糖化異常ヘモグロビンを含むと判定することができる。前述の糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度に対する数値として３０％の数値を採用する場合、溶出時間Ｂと溶出時間Ａとの差が、溶出時間Ａに対し３０％以上である場合、前記試料が糖化異常ヘモグロビンを含むと判定することができる。

（糖化ヘモグロビンのピーク面積の決定）
全ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビンの濃度の割合（ＨｂＡ１ｃ％）は、クロマトグラム上の全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピーク面積の割合から算出される。ここで、全ヘモグロビン濃度とは、生体試料中の全ヘモグロビン濃度（単位：ｍｏｌ／Ｌ）とすることができる。ここで生体試料は、全血であっても血球であってもよい。血球は、全血より自然沈降で得た血球であってもよく、遠心分離によって得た血球であっても良い。生体試料は適宜希釈されて測定試料とされ、液体クロマトグラフィー装置へ導入される。全ヘモグロビン濃度とは、この希釈後の測定試料中の全ヘモグロビン濃度とすることもできる。このとき、以下の方法で糖化ヘモグロビンのピーク面積を決定することが好ましい。図７は、血液由来成分を含む試料のクロマトグラムの他の一例である。

溶出時間Ａは、糖化ヘモグロビンのピークＰＡのピーク頂点の溶出時間である。経時的なドリフトによるエリア変動を抑制する目的で、ベースラインを設定する。溶出時間Ａに対し、係数Ｒ１を乗じ、クロマトグラムの溶出時間の最も早いピークが立ち上がる前のポイントから溶出時間Ａ×Ｒ１の吸光度をつなぐ直線をベースラインとする。係数Ｒ１は、使用する液体クロマトグラフィー装置によって適宜設定できるが、１．２≦Ｒ１であり、例えば１．２以上１．７以下であってよく、１．３以上１．６以下であってもよく、１．４以上１．６以下であってもよい。Ｒ１が１．２より小さいと、糖化ヘモグロビンピークテールの傾きが大きいポイントでベースラインを作成することとなり、測定毎のばらつきなどの影響で、ベースラインの高さのばらつきが拡大する恐れがある。Ｒ１が１．７を超えると、糖化ヘモグロビンピークから離れすぎ、他成分の溶出ピークの影響を受けることがある。つまり、Ｒ１が１．２以上であると、糖化ヘモグロビンピークテールの傾きが小さいポイントでベースラインを作成することとなり、測定毎のばらつきなどの影響を受けにくく、ベースラインの高さのばらつきが生じにくい。Ｒ１が１．７以下であると、糖化ヘモグロビンピークから離れすぎず、他成分の溶出ピークの影響を受けにくい。

溶出時間の最も早いピークとは、図７において５秒付近から開始するピークを示す。溶出時間の最も早いピークには、溶媒ショックピークのほか、溶出の早いヘモグロビン成分に由来するピークが含まれることがある。ピークが立ち上がる前のポイントとは、溶出開始時点から最も早いピークの溶出開始時間の間の一点を示し、図７において０秒から５秒付近を示す。当業者は、この吸光度がほぼゼロである任意のポイントを起点とし、ベースラインを設定することができる。このようにベースラインを設定することで、ドリフトによる糖化ヘモグロビンピーク面積の変動を抑制することができる。

次に糖化ヘモグロビンピークＰＡの算出開始点を設定する。糖化ヘモグロビンピークＰＡの溶出時間の短い側の極小の位置は、測定対象である試料に含まれる成分に依存して変動する傾向にある（図７、３０～３８秒付近）。このばらつきを抑制する目的で、溶出時間Ａに係数Ｒ２を乗じ、溶出時間Ａ×Ｒ２を糖化ヘモグロビンピークＰＡの算出開始点とする。係数Ｒ２は、使用する液体クロマトグラフィー装置によって適宜設定できるが、Ｒ２＜１であり、例えば０．６以上０．９５未満であってよく、０．７以上０．９以下であってもよく、０．８以上０．９以下であってもよい。Ｒ２が０．６以上であると、糖化ヘモグロビンの前に溶出される成分のピークの影響を受けにくく、試料の種類や測定毎のばらつきの影響を受けにくくなる。Ｒ２が０．９５未満であると、糖化ヘモグロビンピークのリーディングの傾きが大きくなり過ぎず、測定毎のばらつきなどの影響を受けにくい。

次に糖化ヘモグロビンピークＰＡの算出終点を設定する。液体クロマトグラフィー装置に実装されているカラム及び使用する溶離液等による糖化ヘモグロビンピークＰＡの溶出時間の変動の影響を抑制する目的で、溶出時間Ａに係数Ｒ３を乗じ、溶出時間Ａ×Ｒ３を糖化ヘモグロビンピークＰＡの算出終点とする。係数Ｒ３は、使用する液体クロマトグラフィー装置によって適宜設定できるが、Ｒ２＜Ｒ３であり、例えば１．０５以上１．３以下であってよく、１．０５以上１．２以下であってもよい。Ｒ３が１．０５未満であると、糖化ヘモグロビンピークテールの傾きが大きいポイントが糖化ヘモグロビンピークＰＡの算出終点となり、測定毎のばらつきなどの影響で、糖化ヘモグロビンピークエリアのばらつきが拡大する恐れがある。つまり、Ｒ３が１．０５以上であると、糖化ヘモグロビンピークテールの傾きが大きすぎないポイントが糖化ヘモグロビンピークＰＡの算出終点となり、測定毎のばらつきなどの影響を受けにくく、糖化ヘモグロビンピークエリアのばらつきが生じにくい。Ｒ３が１．３以下であると、糖化ヘモグロビンピークの後に溶出される他成分の溶出ピークの影響を受けにくい。また、係数Ｒ３は実数であってよく、ＰＡを含む一次関数であってよく、ＰＡを含む二次関数であってもよい。

クロマトグラムの曲線とベースラインに囲まれる範囲であって、溶出時間がＡ×Ｒ２からＡ×Ｒ３の範囲を糖化ヘモグロビンピークＰＡの範囲と規定し、その面積を算出することができる。

（全ピーク面積の補正）
糖化ヘモグロビンの測定方法は、糖化ヘモグロビンのピーク面積と、全ピーク面積に基づいて、全ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を算出することを含む。この際、以下のように全ヘモグロビン濃度に対応する全ピーク面積を補正することが好ましい。

まず、全ヘモグロビン濃度に対応する全ピーク面積を補正するための補正式Ｅ２を作成する。全ヘモグロビン濃度の異なる複数の標準試料について、液体クロマトグラフィー装置を用い、それぞれクロマトグラムを取得する。このクロマトグラムから糖化ヘモグロビンのピーク面積及び全ピーク面積を算出する。複数の標準試料のうち、１つの全ヘモグロビン濃度の試料を基準試料とし、基準試料の全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピーク面積、即ち糖化ヘモグロビンの割合を基準値Ｖとする。

複数の標準試料について、以下の式（３）を用いて、補正後の全ピーク面積を算出する。
補正後の全ピーク面積＝（糖化ヘモグロビンのピーク面積／Ｖ）×１００・・・(３)

全ピーク面積の実測値に対する補正後の全ピーク面積をプロットし、その近似式を補正式Ｅ２として得る。この補正式Ｅ２は、二次以上の関数であってよい。補正式Ｅ２を用いて、目的の試料のクロマトグラムから得られる全ピーク面積を補正する。これにより、より正確な糖化ヘモグロビンの割合が得られる。

基準試料は、全ヘモグロビン濃度が健常人の基準値（１２～１８ｇ／ｄＬ）である試料について、用いる液体クロマトグラフィー装置の特性に応じて希釈した試料とすることができる。例えば、健常人の基準値の中央値付近の試料、すなわち、全ヘモグロビン濃度が１３～１７ｇ／ｄＬ又は１４～１６ｇ／ｄＬの試料を用いることができる。

＜液体クロマトグラフィー装置＞
本発明の一態様における液体クロマトグラフィー装置は、導入部と、液送部と、イオン交換クロマトグラフィーカラムと、検出部と、分析部とを含む。導入部は、不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、糖化ヘモグロビンとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料を導入する。液送部は、導入部から導入された試料及び溶離液を移送する。イオン交換クロマトグラフィーカラムは、液送部から試料及び溶離液が導入される。検出部は、イオン交換クロマトグラフィーカラムにより分画された血液由来成分を検出する。分析部は、検出部が検出した情報に基づいてクロマトグラムを作成し、クロマトグラムを分析する。分析部は、クロマトグラムにおいて、糖化ヘモグロビンのピークを検出し、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を算出し、糖化ヘモグロビンのピークの開始点の吸光度Ｘ０、糖化ヘモグロビンのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を補正し、補正された糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビンの濃度の割合を算出することを含む。

図８は、本実施形態の液体クロマトグラフィー装置の一態様における概略図である。本実施形態の液体クロマトグラフィー装置１は、導入部１１、送液部１２、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム１３、検出部１４及び分析部１５を含む。本実施形態の液体クロマトグラフィー装置は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣともいう）であることが好ましい。

導入部１１は、血液由来成分を含む試料を導入する部分である。導入部１１としては、オートサンプラー等を用いることができる。血液由来成分を含む試料は、血球成分を含む血液試料を低張液に添加する等により溶血して調製することができる。溶血による試料の調製は、導入部１１で実施してもよいし、溶血操作を実施後に試料を導入部１１に供してもよい。

送液部１２は、導入部１１から導入された血液由来成分を含む試料やヘモグロビンを溶出させるための溶離液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム１３に移送する。送液部１２としては、ポンプ等を例示することができる。なお、溶離液としては、例えば塩濃度の異なる溶離液を利用することができる。溶離液の数は、２種類でもよく、３種類でもよい。この場合グラジエント溶出させるための溶離液ミキサー等を更に有していてもよい。

陽イオン交換クロマトグラフィーカラム１３は、陽イオン交換能を有する固定相が充填されたカラムである。陽イオン交換クロマトグラフィーカラム１３としては、陽イオン交換基が結合した樹脂を充填したカラム等を使用することができる。陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基などが挙げられ、このうちスルホン酸基が好ましい。

陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに用いる固定相の充填材粒子は、イオン交換液体クロマトグラフィー用として用いられる充填材粒子であれば特に限定されず、無機系粒子や有機系粒子が挙げられる。無機系粒子としては、シリカ又はジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸及びキトサン等の天然高分子粒子；ポリスチレン及びポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子等が挙げられる。陽イオン交換基を有する固定相の好ましい例として、特開２０１１－０４７８５８号公報に開示されている、非架橋性の親水性アクリル系単量体とポリグリシジルエーテル類との混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、この架橋重合体粒子の表面に重合された陽イオン交換基を有するアクリル系単量体の層とを含む充填材が挙げられる。

検出部１４は、ヘモグロビンを検出し、クロマトグラムを得る。検出部１４は、ヘモグロビンを検出できるものであれば特に制限されないが、吸光検出器が挙げられる。

分析部１５は、検出部１４が検出したクロマトグラムを分析する。図９は、本実施形態の分析部１５の機能構成の一例を示す構成図である。分析部１５は、演算部１００と、記憶部１０７とを備えている。記憶部１０７は、フラッシュメモリ、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、レジスタ等の記憶装置を備えている。記憶部１０７には、演算部１００が実行するプログラム（ファームウェア）が予め格納される。また、記憶部１０７には、演算部１００が演算処理を行った演算結果が格納される。

演算部１００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を備えており、各種の演算を行う。演算部１００は、その機能部として、少なくともデータ取得部１０１と、ピーク検出部１０２と、糖化ヘモグロビンピーク判定・検出部１０３とを含む。演算部１００は、全ピーク面積補正部１０４と、ピーク面積割合判定部１０５と、補正部１０６をさらに備えていてもよい。

データ取得部１０１は、検出部１４が検出したクロマトグラムのデータを取得する。ピーク検出部１０２は、データ取得部１０１で取得したクロマトグラムのデータを用い、糖化ヘモグロビンが検出される溶出時間の範囲Ｔに現れる複数のピークを検出する。糖化ヘモグロビンピーク判定・検出部１０３は、検出した複数のピークについて、（糖化ヘモグロビンピークの検出）に記載の方法で糖化ヘモグロビンのピークを検出する。なお、ピークＰ１の頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるか否かの判定における「所定の数値範囲」は、記憶部１０７に保存されていてもよい。また、「所定の数値範囲」は、液体クロマトグラフィー装置１の仕様に基づいて、書き換えられるようにしておいてもよい。また、糖化ヘモグロビンピーク判定・検出部１０３は、（糖化異常ヘモグロビンの検出）に記載の方法で糖化異常ヘモグロビンを検出してもよい。

全ピーク面積補正部１０４は、データ取得部１０１で取得したクロマトグラムのデータを用い、（全ピーク面積の補正）に記載の方法で全ピーク面積を補正する。ピーク面積割合判定部１０５は、（糖化ヘモグロビンのピーク面積の決定）に記載の方法で糖化ヘモグロビンピーク判定・検出部１０３で検出された糖化ヘモグロビンのピークの面積を決定する。次いで、全ピーク面積補正部１０４で補正された全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を算出する。

補正部１０６は、ピーク面積割合判定部１０５で算出された糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を（糖化ヘモグロビン割合の算出方法）に記載の方法で補正する。

以上の液体クロマトグラフィー装置１によれば、修飾ヘモグロビンによる影響を抑制して糖化ヘモグロビン割合を算出することができる。

＜プログラム＞
本発明の一態様におけるプログラムは、コンピューターに、不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、糖化ヘモグロビンとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離させたクロマトグラムのデータを取得させ、前記クロマトグラムにおいて、糖化ヘモグロビンのピークを検出させ、全ピーク面積に対する前記糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を算出させ、前記糖化ヘモグロビンのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記糖化ヘモグロビンのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を補正し、前記補正された糖化ヘモグロビンのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記糖化ヘモグロビンの濃度の割合を算出させることを含む。

上述した各実施形態における糖化ヘモグロビン割合の算出方法の一部を、コンピューターで実現するようにしてもよい。その場合、この制御機能を実現するためのプログラムをコンピューター読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピューターシステムに読み込ませ、実行することによって実現してもよい。なお、ここでいう「コンピューターシステム」とは、液体クロマトグラフィー装置１に内蔵されたコンピューターシステムであって、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピューター読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ及びＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピューターシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピューター読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピューターシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでもよい。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピューターシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。また、上述した実施形態における液体クロマトグラフィー装置１の各機能ブロックの一部を、ＬＳＩ（Large Scale Integration）等の集積回路として実現してもよい。液体クロマトグラフィー装置１の各機能ブロックは個別にプロセッサ化してもよいし、一部、又は全部を集積してプロセッサ化してもよい。また、集積回路化の手法はＬＳＩに限らず専用回路、又は汎用プロセッサで実現してもよい。また、半導体技術の進歩によりＬＳＩに代替する集積回路化の技術が出現した場合、その技術による集積回路を用いてもよい。

以上のプログラムによれば、修飾ヘモグロビンによる影響を抑制して糖化ヘモグロビン割合を算出することができる。

以下、実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって限定されるものではない。

（試料）
検体として、ＥＤＴＡ添加採血管で採取したＨｂＡ１ｃ％が異なる全血３種（ＨｂＡ１ｃ％が、５．２％、８．０％、及び１０．１％）を用いた。これらの検体に含まれるレイバイルＡ１ｃ、各種修飾ヘモグロビンの量は正常範囲内であり、異常ヘモグロビンは含まれなかった。以降、これら全血３種を「正常検体」とする。

・正常検体のヘモグロビン濃度変動試料
全ヘモグロビン濃度が２．５、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０又は７０μｍｏｌ／Ｌとなるよう、全血をグリコヘモグロビン分析装置ＲＣ２０専用検体希釈液（積水メディカル社製）で希釈し、９個の試料を調製した。

・アルデヒド化ヘモグロビンを含む試料
アセトアルデヒド０．１７４ｇを生理食塩水１１．６ｍＬで溶解し、溶液Ａａを調製した。正常検体１００μＬに３．３μＬの溶液Ａａを添加した（Ａａ_５０とする）。また、正常検体１００μＬに生理食塩水３．３μＬを添加した（Ａａ_０とする）。Ａａ_５０及びＡａ_０を３７℃の水浴で２時間インキュベートした。アセトアルデヒドの終濃度が０、５、１０、１５、２０及び２５ｍｇ／ｄＬとなるようＡａ_５０とＡａ_０を混合し、アルデヒド化ヘモグロビン試料を得た。

・カルバミル化ヘモグロビンを含む試料
シアン酸ナトリウム０．０７６ｇを生理食塩水１０．１ｍＬで溶解し、溶液Ｃを調製した。正常検体１００μＬに６．６μＬの溶液Ｃを添加した（Ｃ_５０とする）。また、正常検体１００μＬに生理食塩水６．６μＬを添加した（Ｃ_０とする）。Ｃ_５０及びＣ_０を３７℃の水浴で２時間インキュベートした。シアン酸ナトリウムの終濃度が０、５、１０、１５、２０及び２５ｍｇ／ｄＬとなるようＣ_５０とＣ_０を混合し、カルバミル化ヘモグロビン試料を得た。

・レイバイルＡ１ｃを含む試料
グルコース１．０５ｇを生理食塩水１０．０ｍＬで溶解し、溶液Ｇを調製した。正常検体１００μＬに１９μＬの溶液Ｇを添加した（Ｇ_２０００とする）。また、正常検体１００μＬに生理食塩水１９μＬを添加した（Ｇ_０とする）。Ｇ_２０００及びＧ_０を３７℃の水浴で２時間インキュベートした。グルコースの終濃度が０、５００、１０００、１５００及び２０００ｍｇ／ｄＬとなるようＧ_２０００とＧ_０を混合し、レイバイルヘモグロビン試料を得た。
・糖化ヘモグロビンＥを含む試料
Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎより購入した試料を使用した。

・ヘモグロビン低濃度試料
ＨｂＡ１ｃが５．２％である全血検体について全ヘモグロビン濃度が５μｍｏｌ／Ｌとなるよう、ＲＣ２０専用検体希釈液で希釈し調製した。
・ヘモグロビン高濃度試料
ＨｂＡ１ｃが５．２％である全血検体について全ヘモグロビン濃度が７０μｍｏｌ／Ｌとなるよう、ＲＣ２０専用検体希釈液で希釈し調製した。

［実施例１］
（糖化ヘモグロビンのピーク溶出時間の範囲Ｔの設定）
グリコヘモグロビン分析装置（液体クロマトグラフィー装置、積水メディカル社製、ＲＣ２０、以下記載がない限り同一の装置を使用）を用い、正常検体のヘモグロビン濃度変動試料を測定し、それぞれクロマトグラムを取得した（図１０）。図１０において、４０秒付近のピークの低い線（一点鎖線）からピークの高い線（実線）の順に、それぞれ全ヘモグロビンの最終濃度が２．５μｍｏｌ／Ｌ、５．０μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、３０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、６０μｍｏｌ／Ｌ、及び７０μｍｏｌ／Ｌである血液由来成分を含む試料を示す。得られたクロマトグラムより、糖化ヘモグロビンのピーク溶出時間の範囲Ｔを３０～６０秒と設定した。

［実施例２］
（糖化ヘモグロビンピークの傾きｙ１／ｘ１の閾値の設定）
前述の試験より、糖化ヘモグロビンピークの傾きｙ１／ｘ１の閾値を設定した。閾値は、ＨｂＡ１ｃが５．２％である全血検体であって、全ヘモグロビン濃度が５．０μｍｏｌ／Ｌである試料の傾きの値より小さい値を設定した。

［実施例３］
（糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度範囲の設定）
前述の試験より、糖化ヘモグロビンのピーク頂点の吸光度範囲を０．００１～０．０４０ＯＤと設定した。

［実施例４］
（糖化ヘモグロビンの溶出時間に対する半値幅の割合の範囲の設定）
前述の試験より、糖化ヘモグロビンの溶出時間に対する半値幅の割合の範囲を、１７～２７％と設定した。

［実施例５］
（糖化ヘモグロビンのピーク検出）
以下の検体についてＲＣ２０を用いてクロマトグラムを取得した。なお、図１１～１４において、上段は、ＨｂＡ１ｃ％が５．２％のクロマトグラム、下段は、ＨｂＡ１ｃ％が１０．１％のクロマトグラムである。
・ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体（図１１）
・ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体を用いて調製したレイバイルＡ１ｃを含む試料（図１２）
・ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体を用いて調製したアルデヒド化ヘモグロビンを含む試料（図１３）
・ＨｂＡ１ｃ％が５．２％及び１０．１％の正常検体を用いて調製したカルバミル化ヘモグロビンを含む試料（図１４）
・糖化ヘモグロビンＥを含む試料（図１５）
・ヘモグロビン低濃度試料（ＨｂＡ１ｃ％：５．２％）（図１６）
・ヘモグロビン高濃度試料（ＨｂＡ１ｃ％：５．２％）（図１７）

また、充填材の充填密度を下げて製造したグリコヘモグロビン分析装置ＲＣ２０専用カラムを用い、ＨｂＡ１ｃ％が５．２％であって、全ヘモグロビン濃度が２０μｍｏｌ／Ｌである正常検体のクロマトグラムを取得した。この結果を「糖化ヘモグロビンピークがブロード化したクロマトグラム」として評価した（図１８）。カラム内の充填材の充填密度が低下すると、カラムの劣化現象の一つであるトップオフ現象が発生しやすくなり、ピークのブロード化が発生することが知られている。

図１１～１５の試料の糖化ヘモグロビンのピーク高及び半値幅の割合は、基準範囲内であり、糖化ヘモグロビンピークを正しく検出することを意図した試料であった。一方、図１６、図１７の試料は、糖化ヘモグロビンのピーク高が基準範囲外であり、糖化ヘモグロビンピークが検出されないことを意図した試料であった。図１８の試料は、糖化ヘモグロビンのピークの半値幅が基準範囲外であり、糖化ヘモグロビンピークが検出されないことを意図した試料であった。

これらのクロマトグラムに対して、実施例１で設定した糖化ヘモグロビンのピーク溶出時間の範囲Ｔ（３０～６０秒）の範囲に存在する全てのピークに対して、傾きｙ１／ｘ１の値を、実施例２で設定した糖化ヘモグロビンピークの傾きｙ１／ｘ１の閾値と比較し、閾値以上の傾きであったピークを糖化ヘモグロビン候補ピークとした。

続いて、以下の３つの判定を順に行った。
判定１：ピーク頂点の吸光度範囲が所定範囲内、すなわち０．００１～０．０４０ＯＤであるか（実施例３で求めた吸光度の範囲）
判定２：ピークの半値幅の割合が所定範囲内、すなわちピークの溶出時間に対して１７～２７％であるか（実施例４で求めた半値幅の割合）
判定３：ピーク頂点の吸光度に対し２０％の数値であるときの溶出時間と、ピーク頂点の溶出時間の差が、ピーク頂点の溶出時間に対して５０％以上であるか
判定の順序は（Ａ）溶出時間の範囲Ｔのうち溶出の遅いピークから判定する、（Ｂ）溶出時間の範囲Ｔのうち溶出の早いピークから判定する、２パターンを実施し、判定精度を検証した。

ピーク検出方法を、ＨｂＡ１ｃ％が１０．１％、アルデヒド化ヘモグロビンの終濃度が２５ｍｇ／ｄＬの試料を例に、詳細に説明する。取得した図１３の下段に示すクロマトグラムにおいて、糖化ヘモグロビンが検出される溶出時間の範囲である３０～６０秒を満たすピークは、Ｐ１及びＰ２であった。両ピークの傾きは、糖化ヘモグロビンピークの傾きｙ１／ｘ１の閾値以上であった。従って、図１３に示すクロマトグラムのピークＰ１及びピークＰ２を糖化ヘモグロビンのピーク候補として選定した。

溶出時間が最も遅いＰ１について、ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるか否かの判定を行った。Ｐ１のピーク頂点の吸光度は、０．０１１であった。また、ピークの溶出時間である４５秒に対するピークＰ１の半値幅の割合が１０～４５％であるか否かを判定した。ピークＰ１の半値幅の割合は２２％であった。よって、Ｐ１を糖化ヘモグロビンのピークとして正しく検出することができた。

なお、溶出時間が２番目に遅いピークＰ２もピーク頂点の吸光度及びピークの半値幅の割合の値を満たしていた（ピーク頂点の吸光度：０．０１４、ピークの半値幅の割合：３９％）。よって、ピークの溶出時間が最も遅いピークＰ１を糖化ヘモグロビンのピークとして検出することにより正しいピークを検出することができた。

以上の手順で前述の検体について判定を行い、結果を表１に示した。表１中、〇は糖化ヘモグロビンピークを正しく検出できたこと、×は糖化ヘモグロビンピークを正しく検出できなかったことを示す。また、表１中、Ａ１ｃ５％はＨｂＡ１ｃ％が５．２％である試料、Ａ１ｃ１０％はＨｂＡ１ｃ％が１０．１％である試料を示す。

まず、（Ａ）溶出の遅いピークから判定した場合、判定１のみでは、糖化ヘモグロビンＥを含む試料と、ブロード化したクロマトグラムにて、糖化ヘモグロビンピークを正しく検知できなかった。糖化ヘモグロビンＥを含む試料では、糖化ヘモグロビンＥのピークを糖化ヘモグロビンピークとして誤検知した。ブロード化したクロマトグラムでは、ブロード化した好ましくない糖化ヘモグロビンピークを、正常な糖化ヘモグロビンピークとして誤検知した。これに対し、判定１と２を組み合わせると、双方で糖化ヘモグロビンピークを正しく検知した。さらに判定１、２及び３を組み合わせると、試料中に糖化ヘモグロビンＥが含まれるか否かを検知することができた。

一方、判定１を行わない場合、検体中のヘモグロビン濃度が異常に低い、または高い場合であって、糖化ヘモグロビンピークを検出すべきではないクロマトグラムにおいても糖化ヘモグロビンピークを誤検知した。以上より、糖化ヘモグロビンＥを含む試料、ピークがブロード化するような測定、ヘモグロビン濃度が異常に低い、又は高い試料において、判定１と２を組み合わせることで、糖化ヘモグロビンピークを正しく検知できることがわかった。さらに判定３を行うことで、糖化ヘモグロビンＥの存在有無も検知できた。

次に、（Ｂ）溶出の早いピークから判定した場合、判定１、２及び３のいずれを組み合わせても、アルデヒド化ヘモグロビン及びカルバミル化ヘモグロビンが含まれる試料において、糖化ヘモグロビンピークを正しく検知できなかった。このことから、溶出の遅いピークから判定することがよいことがわかった。

［実施例６］
（糖化ヘモグロビンのピーク面積の決定）
正常検体のヘモグロビン濃度変動試料及びアルデヒド化ヘモグロビン試料の測定結果に対し、ベースラインを算出するための係数Ｒ１として、１．４、１．５及び１．６を検討した。また、糖化ヘモグロビンピークの算出開始点を決定するための係数Ｒ２として、０．８、０．８５及び０．９を検討した。また、糖化ヘモグロビンピークの終点を決定するための係数Ｒ３として、１．１、１．２及び１．３を検討した。いずれの組み合わせであっても、糖化ヘモグロビンピーク面積を良好に算出できた。特にＲ１が１．５、Ｒ２が０．８５、Ｒ３が１．２の組み合わせや、Ｒ１が１．６、Ｒ２が０．９、Ｒ３が１．３２の組み合わせが良好であった。

（全ヘモグロビン濃度の補正）
ＲＣ２０を用い、正常検体のヘモグロビン濃度変動試料を測定し、それぞれクロマトグラムを取得した。このクロマトグラムから糖化ヘモグロビンのピーク面積及びクロマトグラムの全ピーク面積を算出した。全ヘモグロビン濃度が２０μｍｏｌ／Ｌの試料を基準とし、全ピーク面積に対する糖化ヘモグロビンのピーク面積の割合（Ｖ＝７．２％）を算出した。なお、基準試料の希釈前の全ヘモグロビン濃度は、１３ｇ／ｄLであった。

全ての試料について、以下の式（４）を用いて、補正後の全ピーク面積を算出した。
補正後の全ピーク面積＝（糖化ヘモグロビンのピーク面積／Ｖ）×１００・・・(４)

全ピーク面積の実測値に対する補正後の全ピーク面積をプロットし、補正式ｙ＝０．００２３ｘ^２＋０．９６３ｘ－０．８７７３を得た。

次に、前述の正常検体のヘモグロビン濃度変動試料のクロマトグラムに対して、補正式により各試料の全ピーク面積を補正し、補正された全ピーク面積と、糖化ヘモグロビンのピーク面積に基づいて、全ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビンの濃度の割合（つまり糖化ヘモグロビン割合、ＨｂＡ１ｃ％）を算出した。図１９は、補正前の全ピーク面積に基づいて算出された糖化ヘモグロビン割合を示すグラフである。図２０は、補正後の全ピーク面積に基づいて算出された糖化ヘモグロビン割合を示すグラフである。なお、ＲＣ２０装置は、４台用いて検証した（１、２、４及び５号機）。

補正前の全ピーク面積に基づいて算出された糖化ヘモグロビンの割合は、全ヘモグロビン濃度に依存して変動した。一方で、補正後の全ピーク面積に基づいて算出された糖化ヘモグロビン割合は、一般的な測定対象である全ヘモグロビン濃度が２０μｍｏｌ／Ｌ以上の試料において変動が少なく、より正確な値が算出された。

［実施例７］
（修飾ヘモグロビンを用いた糖化ヘモグロビン割合の補正）
試料にレイバイルＡ１ｃ、修飾ヘモグロビンであるアルデヒド化ヘモグロビン又はカルバミル化ヘモグロビンのいずれかが含まれる場合の糖化ヘモグロビンピークに対する影響を検討した。

上述の通り調製した血液試料を、ＲＣ２０を用い、液体クロマトグラフィー分析を行い、クロマトグラムを得た。このクロマトグラムから各試料の吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１（Ｘ０：Ａ１ｃのピークの開始点の吸光度、Ｘ１：Ａ１ｃのピークの頂点の吸光度）とＨｂＡ１ｃ％（全ピーク面積に対するＡ１ｃのピーク面積の割合）を算出した。さらにΔＡ１ｃ％として、各試料のＨｂＡ１ｃ％測定値から、対応するブランク試料であるＡa_０、Ｃ_０、又はＧ_０のＨｂＡ１ｃ％測定値を差し引いた値を算出した。図２１は、ＨｂＡ１ｃ％が５．２％の試料の吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１比とΔＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。図２２は、ＨｂＡ１ｃ％が８．０％の試料の吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１比とΔＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。図２３は、ＨｂＡ１ｃ％が１０．１％の試料の吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１比とΔＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。図２１～２３中、丸はレイバイルＡ１ｃ試料、四角はアセトアルデヒドヘモグロビン試料、三角はカルバミル化ヘモグロビン試料を示す。

この結果から、修飾ヘモグロビンの濃度と吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１に相関があることがわかった。また、ＨｂＡ１ｃ％が高い試料ほど修飾ヘモグロビンの濃度に影響を受けることがわかった。さらに、修飾ヘモグロビン種によって、修飾ヘモグロビン濃度の濃度と吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１に相関に大きな差がないことが分かった。

図２１～図２３のプロットからＨｂＡ１ｃ％ごとに二次関数でフィッティングを行い、以下の３つの補正式Ｅ_Ｌ（ＨｂＡ１ｃ％が５．２％）、補正式Ｅ_Ｍ（ＨｂＡ１ｃ％が８．０％）及び補正式Ｅ_Ｈ（ＨｂＡ１ｃ％が１０．１％）を得た。
ｙ＝０．１７２ｘ^２－０．５２７ｘ＋０．１３４・・・Ｅ_Ｌ
ｙ＝５．９８４ｘ^２－５．８７９ｘ＋０．９８６・・・Ｅ_Ｍ
ｙ＝３．７２５ｘ^２－７．１８４ｘ＋１．２４１・・・Ｅ_Ｈ

Ｅ_Ｌ、Ｅ_Ｍ及びＥ_Ｈを用いて、上述の試料のＨｂＡ１ｃ％の補正を行った。図２４～３２は、補正前後における修飾ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ％を示すグラフである。図２４～３２において、横軸「終濃度（ｍｇ／ｍL）は、各修飾ヘモグロビンを調製するために添加したアセトアルデヒド、シアン酸ナトリウム、またはグルコースの終濃度を示す。図２４～３２中、丸は補正する前のＨｂＡ１ｃ％を示し、四角は補正した後のＨｂＡ１ｃ％を示す。図２４～２６は、アルデヒド化ヘモグロビンを含む試料の補正結果であり、図２７～２９は、カルバミル化ヘモグロビンを含む試料の補正結果であり、図３０～３２は、レイバイルＡ１ｃを含む試料の補正結果である。また、図２４、２７及び３０は、ＨｂＡ１ｃ％が５．２％、図２５、２８及び３１は、ＨｂＡ１ｃ％が８．０％、図２６、２９及び３２は、ＨｂＡ１ｃ％が１０．１％の試料である。Ｅ_Ｌ、Ｅ_Ｍ及びＥ_Ｈを用いて補正をおこなうことにより、各種修飾ヘモグロビンの濃度が増加しても、測定値が変動せず、高い精度でＨｂＡ１ｃ％を測定できていることが分かった。

次に、２つの補正式を用いて補正値を算出する際、使用率に重み付けを行う方法について検討した。例として、ＨｂＡ１ｃ％の実測値が６．０％、吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１が０．３であるときのＨｂＡ１ｃ％の補正を、補正式Ｅ_Ｌ、Ｅ_Ｍ及びＥ_Ｈを用いて行った。ＨｂＡ１ｃ％が６．０％であるため、補正式として補正式Ｅ_Ｌ及び補正式Ｅ_Ｍを用いた。またそれぞれの補正式の使用率を以下のように設定した。
補正式Ｅ_Ｍの使用率（％）＝｛（６．０－５．２）／（８．０－５．２）｝×１００＝２８．６
補正式Ｅ_Ｌの使用率（％）＝１００－２８．５７＝７１．４

補正式Ｅ_Ｌ及び補正式Ｅ_Ｍのｘに吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１の０．３を入れ、それぞれ補正値－０．００８６２％及び－０．２３９％を算出した。また、その使用率を適用し、以下の通り補正値（％）を以下のように算出した。
補正値（％）＝－０．００８６２×０．７１４－０．２３９×０．２８６＝－０．０７４５

よって、補正値は、６．０－（－０．０７４５）＝６．０７４５（％）と計算され、測定結果は、６．０７（％）となった。

本発明によれば、修飾ヘモグロビンによる影響を抑制した糖化ヘモグロビン割合の算出方法、液体クロマトグラフィー装置及びプログラムを提供することができる。

１…液体クロマトグラフィー装置、１１…導入部、１２…送液部、１３…陽イオン交換クロマトグラフィーカラム、１４…検出部、１５…分析部、１００…演算部、１０１…データ取得部、１０２…ピーク検出部、１０３…糖化ヘモグロビンピーク判定・検出部、１０４…全ピーク面積補正部、１０５…ピーク面積割合判定部、１０６…補正部、１０７…記憶部

Claims (14)

1. 不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、安定型ＨｂＡ１ｃとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離してクロマトグラムを取得し、
   前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出し、
   全ピーク面積に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を算出し、
   前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を補正し、前記補正された安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出することを含む、安定型ＨｂＡ１ｃ割合の算出方法。
2. 前記補正式Ｅ１は、吸光度Ｘ０／吸光度Ｘ１の二次以上の関数である、請求項１に記載の算出方法。
3. 前記補正式Ｅ１は、予め設定された全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に対応する少なくとも２つ以上の補正式を含む、請求項１又は２に記載の算出方法。
4. ２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に最も近い割合に対応する補正式を用いる、請求項３に記載の算出方法。
5. ２つ以上の前記補正式のうち、算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に１番目に近い割合に対応する補正式Ｅ１－１及び２番目に近い割合に対応する補正式Ｅ１－２を用いる、請求項３に記載の算出方法。
6. 算出された前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合に基づいて前記補正式Ｅ１－１及びＥ１－２の使用率を決定し、
   前記補正式Ｅ１－１、前記補正式Ｅ１－２及び前記使用率を用いて前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出する、請求項５に記載の算出方法。
7. 前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出する工程において、
   前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃが検出される溶出時間の範囲に存在する複数のピークのうち溶出時間が遅い順に、ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるかを判定し、次に、前記ピークの頂点における溶出時間に対する前記ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるか否かを判定する工程を前記複数のピークについて繰り返し、
   前記ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であり、前記ピークの頂点における溶出時間に対する前記ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるピークであると判定した場合、このピークより溶出時間が早いピークについて判定を行わない、請求項１又は２に記載の算出方法。
8. 前記判定する工程において、判定対象の前記ピークの頂点の溶出時間が溶出時間Ｃ１、前記ピークの頂点より溶出時間が早い側の前記ピークの極小値の溶出時間が溶出時間Ｄ１であり、
   前記ピークの頂点の吸光度と前記ピークの極小値の吸光度の差であるｙ１と、前記溶出時間Ｃ１と前記溶出時間Ｄ１の差であるｘ１の比がｙ１／ｘ１であるとき、
   前記ｙ１／ｘ１が所定の閾値より大きいと判定されたピークを前記安定型ＨｂＡ１ｃの候補ピークとして抽出し、
   前記候補ピークの頂点の吸光度が所定の数値範囲内であるか否かを判定し、次に前記候補ピークの頂点の溶出時間に対する前記候補ピークの半値幅の割合が１０～４５％であるか否かを判定する、請求項７に記載の算出方法。
9. 前記クロマトグラムの溶出時間が最も早いピークが立ち上がる前のポイントから、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の溶出時間Ａに係数Ｒ１を乗じた時間の吸光度までの直線をベースラインとし、
   前記溶出時間Ａに係数Ｒ２を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点と設定し、
   前記溶出時間Ａに係数Ｒ３を乗じた溶出時間を、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの終点と設定することをさらに含む、請求項１又は２に記載の算出方法。
10. 前記全ピーク面積を補正式Ｅ２を用いて補正し、
    補正された前記全ピーク面積と前記安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて、前記全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出することを含む、前記算出方法であって、
    前記補正式Ｅ２は、全ヘモグロビン濃度に対する安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の割合が同一であって、全ヘモグロビン濃度が異なる複数の標準試料についてクロマトグラムを取得し、それぞれの標準試料の全ピーク面積を、前記標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合、及び各標準試料の安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積を用いて作成される補正式である、請求項１又は２に記載の算出方法。
11. 前記補正式Ｅ２は、以下の式（１）を用いて補正後の全ピーク面積を算出し、前記複数の標準試料について、全ピーク面積の実測値に対する補正後の全ピーク面積をプロットしたときの近似式である、請求項１０に記載の算出方法。
    補正後の全ピーク面積＝（安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積／Ｖ）×１００・・・(１)
    （式(１)中、Ｖは、前記複数の標準試料のうちの１つの標準試料の全ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積の割合を示す。）
12. 前記修飾ヘモグロビンは、カルバミル化ヘモグロビン及びアルデヒド化ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種のヘモグロビンである、請求項１又は２の何れか一項に記載の算出方法。
13. 不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、安定型ＨｂＡ１ｃとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料を導入する導入部と、
    前記導入部から導入された前記試料及び溶離液を移送する液送部と、
    前記液送部から前記試料及び前記溶離液が導入されるイオン交換クロマトグラフィーカラムと、
    前記イオン交換クロマトグラフィーカラムにより分画された前記血液由来成分を検出する検出部と、
    前記検出部が検出した情報に基づいてクロマトグラムを作成し、前記クロマトグラムを分析する分析部と、を含み、
    前記分析部は、
    前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出し、
    全ピーク面積に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を算出し、
    前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を補正し、前記補正された安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出することを含む、液体クロマトグラフィー装置。
14. コンピューターに、
    不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンの少なくとも一方と、安定型ＨｂＡ１ｃとを少なくとも含む血液由来成分を含む試料をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離させたクロマトグラムのデータを取得させ、
    前記クロマトグラムにおいて、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークを検出させ、
    全ピーク面積に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を算出させ、
    前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの開始点の吸光度Ｘ０、前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの頂点の吸光度Ｘ１、及び前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合に対応する補正式Ｅ１に基づいて前記安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を補正し、前記補正された安定型ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合を用いて全ヘモグロビン濃度に対する前記安定型ＨｂＡ１ｃの濃度の割合を算出させることを含む、プログラム。

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