JP2021001804A - 安定型Ａ１ｃの測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】化学修飾された安定型Ａ１ｃの量を考慮することで、安定型Ａ１ｃの量をより正確に測定する。【解決手段】血中ヘモグロビンの分離分析で得られるヘモグロビンの時間分布における化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率を算出する工程、及び、前記ヘモグロビンの時間分布から得られた、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を前記残存率で補正する工程、を含む。【選択図】図１４

Description

本発明は、血中ヘモグロビンの分画のうち、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。

ヘモグロビン分子のβ鎖のＮ末端のバリン残基にグルコースが結合したものをＨｂＡ１ｃという。より詳細には、可逆的に生成する不安定型ＨｂＡ１ｃ（ｌａｂｉｌｅ ＨｂＡ１ｃ。以下、「不安定型Ａ１ｃ」又は「Ｌ−Ａ１ｃ」と表記する。）を経て、不可逆性の反応物質である安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（ｓｔａｂｌｅ ＨｂＡ１ｃ。以下、「安定型Ａ１ｃ」又は「Ｓ−Ａ１ｃ」と表記する。）が生成される。安定型Ａ１ｃは臨床的には過去１〜２ヶ月の平均の血糖値を反映しており、糖尿病管理の指標として重要である、とされる。

従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、キャピラリー電気泳動法等が用いられている。キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法については、下記特許文献１に開示されている。

ＨＰＬＣ法やキャピラリー電気泳動法で安定型Ａ１ｃの測定をする場合は、血中のヘモグロビンから安定型Ａ１ｃを分離して、分離して得られたピークの大きさから総ヘモグロビンに対する割合を算出する。

このとき、たとえば腎不全患者では、尿素から生成されるシアン酸がヘモグロビンと結合するカルバミル化によって、ヘモグロビンが化学修飾を被る。また、たとえば、血中のアセトアルデヒドがヘモグロビンに結合するアルデヒド化によって、ヘモグロビンが化学修飾を被ることもある。

このような化学修飾されたヘモグロビン分画が、安定型Ａ１ｃを示す分画と同じ時間に溶出してくることで、見かけ状の安定型Ａ１ｃが実際よりは高値として測定されたり（下記特許文献２参照）、あるいは、安定型Ａ１ｃの割合が大きく変動することもある（下記特許文献３参照）。

したがって、安定型Ａ１ｃの正確な測定のためには、このような化学修飾されたヘモグロビンを十分に分離する必要がある。そこで、キャピラリー電気泳動法においては、キャピラリー内面のコーティングや泳動条件を変えることで、安定型Ａ１ｃと化学修飾されたヘモグロビンとを分離する試みがなされている（下記特許文献３及び下記特許文献４参照）。

再表２００８−１３９８６６号公報 特開２００４−６９６４０号公報 特開２００８−１７０３５０号公報 特開２００９−１８６４４５号公報

上記したように、腎不全患者の尿素から生成されるシアン酸によって生じるカルバミル化ヘモグロビンや、血中のアセトアルデヒドによって生じるアルデヒド化ヘモグロビンを安定型Ａ１ｃから分離することで、化学修飾ヘモグロビンの存在が安定型Ａ１ｃの測定に与える影響を回避することについては検討されている。

一方、安定型Ａ１ｃそのものもヘモグロビンであり、カルバミル化やアルデヒド化のような化学修飾を被る。そのため、過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を算出するためには、化学修飾された安定型Ａ１ｃと化学修飾されていない安定型Ａ１ｃの両方を算出する必要がある。しかし、これまでの分離分析においては、化学修飾されていない安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積を測定して、その結果から過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を算出としており、化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積については、安定型Ａ１ｃの割合の算出に考慮されていなかった。そのため、従来から試みられているように、分離分析において化学修飾されたヘモグロビンの分画と化学修飾されていない安定型Ａ１ｃの分画を分離して溶出させることを試みても、腎不全患者や血中のアルデヒド濃度が高い患者の過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を正確に測定できず、糖尿病管理を適切に行うことができない。

そこで本発明の実施態様は、化学修飾された安定型Ａ１ｃの割合を考慮することで、安定型Ａ１ｃの割合をより正確に測定することを課題とする。

本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法は、
血中ヘモグロビンの分離分析における安定型Ａ１ｃの測定方法であって、分離分析で得られるヘモグロビンの時間分布における化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率を算出する工程、及び、ヘモグロビンの時間分布から得られた、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する工程、を含んでなる。

本発明の実施態様では、化学修飾された安定型Ａ１ｃの量を考慮することで、安定型Ａ１ｃの量をより正確に測定することが可能となる。

本発明に係る分析システムの一例を示すシステム概略図である。 図１の分析システムに用いられる分析チップを示す平面図である。 図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿う断面図である。 制御部のハードウェア構成をブロック図で示す。 本発明に係る分析方法を示すフロー図である。 準備工程の手順を示すフロー図である。 図６の準備工程の一工程を示す断面図である。 図６の準備工程の一工程を示す断面図である。 図６の準備工程の一工程を示す断面図である。 図６の準備工程の一工程を示す断面図である。 分析工程の手順を示すフロー図である。 波形形成工程によって形成された波形データの一例を示すグラフである。 最離間点の決定を示すグラフである。 ヘモグロビンのエレクトロフェログラムの一例を示す。 実施例１における検体１のエレクトロフェログラムを示す。 実施例１における検体２のエレクトロフェログラムを示す。 実施例１における検体３のエレクトロフェログラムを示す。 実施例１における検体４のエレクトロフェログラムを示す。 実施例１における安定型Ａ１ｃ量の補正の効果を示すグラフである。 実施例２における検体５のエレクトロフェログラムを示す。 実施例２における検体６のエレクトロフェログラムを示す。 実施例２における検体７のエレクトロフェログラムを示す。 実施例２における安定型Ａ１ｃ量の補正の効果を示すグラフである。 実施例３における検体８のエレクトロフェログラムを示す。 実施例３における検体９のエレクトロフェログラムを示す。 実施例３における検体１０のエレクトロフェログラムを示す。 実施例３における検体１１のエレクトロフェログラムを示す。 実施例３における検体１２のエレクトロフェログラムを示す。 実施例３における安定型Ａ１ｃ量の補正の効果を示すグラフである。

本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法は、血中ヘモグロビンの分離分析における安定型Ａ１ｃの測定方法であって、分離分析で得られるヘモグロビンの時間分布における化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率を算出する工程、及び、ヘモグロビンの時間分布から得られた、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する工程、を含んでなる。

上記分離分析の具体的な方法としては、ヘモグロビンの分子表面電荷の多寡に基づいてその種類を分離することのできる方法であれば特に限定されず、たとえば、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、高速液体クロマトグラフィー）法、あるいはキャピラリー電気泳動法が挙げられる。このうち、より簡便な測定システムによってより多数の検体を短時間で分析する観点からは、キャピラリー電気泳動法が適している。

ヘモグロビンの時間分布とは、ヘモグロビンを流路内で分離し、分離された各ヘモグロビンを流路上の特定の地点にある測定部位で検出した時間とシグナル強度を、横軸に時間、縦軸にシグナル強度を示すグラフに表したものである。横軸の時間は、ヘモグロビンが所定の距離を移動するためにかかった時間を示す。横軸の時間は、分離を開始した時点から、検体成分が流路の特定の地点にある測定部位で検出された時点までの時間とも言える。ヘモグロビンの時間分布としては、たとえば、クロマトグラフィーから得られるクロマトグラム、キャピラリー電気泳動から得られるエレクトロフェログラムが含まれる。
たとえば、キャピラリー電気泳動法やイオン交換を原理としたＨＰＬＣ法の場合、ヘモグロビン分子表面の電荷の多寡に応じて移動速度が変動する。そのため、分離開始からそのヘモグロビン分子がキャピラリー管内やカラム内を移動して特定の地点を通過するまでの経過時間、つまりそのヘモグロビン分子が所定の距離を移動するためにかかった時間は、そのヘモグロビン分子の分子表面電荷の多寡とみなすことができる。そして、泳動開始からの経過時間に応じたシグナル（たとえば、吸光度）の強度が、いくつかの山（ピーク）と谷（ボトム）とをもった曲線、すなわちエレクトロフェログラム又はクロマトグラムとして表現される。このエレクトロフェログラム又はクロマトグラムの形状を基にして、ヘモグロビンがいくつかの分画に分離される。たとえば、特定のピークを中心とした分画が、ヘモグロビンの特定の成分として同定される。

ヘモグロビンの時間分布の横軸は、分子表面電荷の多寡を示すものであればよい。そのため、上述のように所定の距離を移動するためにかかった時間の他に、各ヘモグロビン分子の移動速度であってもよく、特定の時間における移動距離であってもよい。ヘモグロビンの時間分布の縦軸は、ヘモグロビンの量を示すものであればよい。たとえば、ヘモグロビンの含有量そのものやヘモグロビンの濃度であってもよい。また、吸光度や蛍光や発光強度といった光学的な測定値であってもよい。また、吸光度変化の単位時間当たりの変化量であってもよい。ヘモグロビンの吸収スペクトルを考慮すると、波長４１５ｎｍ又はその付近の吸光度を測定し、その吸光度を縦軸にすることが望ましい。このヘモグロビンの時間分布の形状から得られた分画のピーク面積やピークの高さは、分離されたそのヘモグロビン分子の量を示す。

本実施例におけるキャピラリー電気泳動のように、陽イオン交換を原理とする分離分析法で血液中のヘモグロビンを分離分析すると、正電荷量の少ないヘモグロビンから正電荷量の多いヘモグロビンの順に、各ヘモグロビンが検出される。具体的には、ＨｂＦを含む分画が検出され、その後、化学修飾されたＨｂＡ０と不安定型Ａ１ｃとを含む分画が検出される。さらにその後、順に、安定型Ａ１ｃを含む分画、ＨｂＡ０を含む分画に対し隣接する分画、ＨｂＡ０を含む分画が検出される。ここで検出される安定型Ａ１ｃを含む分画は、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃに由来する分画である。この分離分析で得られた化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率が算出される。

本開示における化学修飾とは、たとえば、カルバミル化及びアルデヒド化のいずれか一方又は両方である。

残存率は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積との合計値に対する、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合としてもよい。また、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合である修飾率を用いて残存率を算出してもよい。たとえば、１から修飾率を減じることで残存率を算出してもよい。この残存率は、化学修飾されていないＨｂＡ０と化学修飾されたＨｂＡ０との合計量に対する、化学修飾されていないＨｂＡ０の量の割合ともいえる。一方、修飾率は、化学修飾されていないＨｂＡ０と化学修飾されたＨｂＡ０との合計量に対する、化学修飾されたＨｂＡ０の量の割合ともいえる。

以下に修飾率の算出について説明する。血液に含まれる、化学修飾されていないＨｂＡ０量（なお、本開示において、単に「ＨｂＡ０」というときには、化学修飾されていないＨｂＡ０を意味する。）と化学修飾されたＨｂＡ０量との合計量の大部分は、ＨｂＡ０量が占める。そのため、ヘモグロビンの時間分布から得られる、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積との合計値の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。よって、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積との合計値とみなして、修飾率を算出してもよい。また、血液に含まれるヘモグロビンの大部分はＨｂＡ０が占める。そのため、ヘモグロビンの時間分布から得られるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。よって、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とみなして、修飾率を算出してもよい。また、同じ理由で、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積を、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積との合計値とみなして、修飾率を算出してもよい。

なお、本開示において、ヘモグロビンの時間分布の形状から得られた全ての分画のピーク面積を、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積としてもよい。

化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画である。また、ＨｂＦよりも正電荷量が多い側に存在する分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に存在し、かつ、ＨｂＦよりも正電荷量が多い側に存在する分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接し、かつ、ＨｂＦよりも正電荷量が多い側に存在する分画ともいえる。又は、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出される時間が早い分画である。また、ＨｂＦよりも検出される時間が遅い分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出時間が早く、かつ、ＨｂＦよりも検出時間が遅い分画ともいえる。この化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、ヘモグロビンがカルバミル化あるいはアルデヒド化したときに、増大する。

化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、そのままの数値として用いてもよいし、適宜の修正を加えた後の数値として用いてもよい。たとえば、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画に、化学修飾されたＨｂＡ０量以外の成分が含まれている場合、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から化学修飾されたＨｂＡ０以外の成分に由来するピーク面積を控除することが挙げられる。化学修飾されたＨｂＡ０以外の成分に由来するピーク面積が既知である場合、その既知のピーク面積を所定のピーク面積値として控除してもよい。また、複数の健常者の検体を分離分析し、化学修飾を被ったＨｂＡ０以外の成分のピーク面積の統計的な値としての所定のピーク面積値を、検体の安定型Ａ１ｃの測定前に求めておく。そして、検体を測定時に化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積からこの所定のピーク面積値を控除してもよい。たとえば、この統計的な値としてのピーク面積補正値は平均値や中央値などである。

また、残存率や修飾率は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画を用いて算出してもよい。理由は定かではないが、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積はヘモグロビンがカルバミル化あるいはアルデヒド化したときに、増大する。よって、たとえば、健常者の検体を人為的にカルバミル化し、その検体のＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積と、カルバミル化ＨｂＡ０のピーク面積との相関関係をあらかじめ求めておく。この相関関係から、後者のピーク面積に対する前者のピーク面積の倍率（換言すると、前者のピーク面積を後者のピーク面積で除した値）としての所定の係数が得られる。そして、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積を、この所定の係数で除することで、カルバミル化ＨｂＡ０のピーク面積としてのピーク面積補正値を算出する。そして、このピーク面積補正値から、残存率や修飾率を算出してもよい。また、たとえば、健常者の検体を人為的にアルデヒド化し、その検体のＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積と、アルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積との相関関係をあらかじめ求めておく。この相関関係から、後者のピーク面積に対する前者のピーク面積の倍率としての所定の係数が得られる。そして、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積を、この所定の係数で除することで、アルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積としてのピーク面積補正値を算出する。そして、このピーク面積補正値から、残存率や修飾率を算出してもよい。

なお、実際の検体では、ＨｂＡ０のカルバミル化とアルデヒド化とが同時に生じている場合もあり得るため、カルバミル化とアルデヒド化とを峻別する意義は乏しい。そこで、以下の記述では、ＨｂＡ０のカルバミル化とアルデヒド化とが同時に生じている場合と、カルバミル化及びアルデヒド化の一方のみが生じている場合をと含めて、「カルバミル化ＨｂＡ０及び／又はアルデヒド化ＨｂＡ０」と記述する。

上述のように、化学修飾されたＨｂＡ０であるカルバミル化ＨｂＡ０及び／又はアルデヒド化ＨｂＡ０と不安定型Ａ１ｃとは同じ分画に検出される。そのため、不安定型Ａ１ｃを多く含む検体の残存率や修飾率を、カルバミル化ＨｂＡ０及び／又はアルデヒド化ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から算出すると、残存率を過大に算出してしまうことがある。そして、過大に算出した残存率を用いて安定型Ａ１ｃの割合を補正すると、正確な安定型Ａ１ｃの割合を算出できない。一方、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画は、不安定型Ａ１ｃを含んでいない。そのため、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画から算出したカルバミル化ＨｂＡ０及び／又はアルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積を用いて残存率や修飾率を算出し、その算出した残存率を用いて安定型Ａ１ｃの割合を算出することで、不安定化Ａ１ｃを多く含む検体を測定する場合であっても、化学修飾された安定型Ａ１ｃの割合を加味した正確な安定型Ａ１ｃの割合を算出できる。

なお、不安定型Ａ１ｃが、カルバミル化ＨｂＡ０及び／又はアルデヒド化ＨｂＡ０を含む分画と同じ分画に含まれるのは、カルバミル化ＨｂＡ０及び／又はアルデヒド化ＨｂＡ０と不安定型Ａ１ｃとの分子表面電荷がそれぞれ近いからと考えられる。一方、不安定型Ａ１ｃが、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画に含まれる物質とは異なる分画に含まれるのは、不安定型Ａ１ｃの分子表面電荷は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画に含まれる物質の表面電荷と十分に異なることによると考えられる。また、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画は、ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成する物質を含む分画と考えられる。また、この物質は波長４１５ｎｍに対して吸光する性質を有する。このことから、この物質は何らかのヘモグロビン化合物であると推測される。

このＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷が多い側に存在する分画ともいえる。又は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接し、かつ、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、正電荷が多い側に存在する分画ともいえる。又は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、検出される時間が早い分画ともいえる。又は、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出される時間が遅い分画ともいえる。又は、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、検出される時間が早く、かつ、安定型Ａ１ｃとして同定される分画に対し、検出される時間が遅い分画ともいえる。

ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画のピーク面積も、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画について上記で述べたのと同様に、そのままの数値として用いてもよいし、適宜の修正を加えた後の数値として用いてもよい。たとえば、ＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が少ない側に隣接する分画に、ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成する物質以外の成分が含まれている場合、この分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成する物質以外の成分に由来するピーク面積を控除することが挙げられる。ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成する物質以外の成分に由来するピーク面積が既知である場合、その既知のピーク面積を所定のピーク面積値として控除してもよい。また、複数の健常者の検体を分離分析し、ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成する物質以外の成分のピーク面積の統計的な値としての所定のピーク面積値を、検体の安定型Ａ１ｃの測定前に求めておく。そして、検体を測定時に化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積からこの所定のピーク面積値を控除してもよい。たとえば、この統計的な値としてのピーク面積補正値は平均値や中央値などである。そして、この所定のピーク面積値を控除した値を基に、前記したピーク面積補正値を算出することとしてもよい。

次に、分離分析で得られたヘモグロビンの時間分布から、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する。

本明細書で述べるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とは、分離分析した検体に含まれる総ヘモグロビン量に相当するピーク面積の値とも言える。得られたヘモグロビンの時間分布においてヘモグロビンに由来する分画のピーク面積の合計値とも言える。なお、検体に含まれるヘモグロビン量の大部分は、ＨｂＡ０が占める。そのため、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積は、当該ＨｂＡ０分画のピーク面積と同じ値とみなして補正してもよい。また、ＨｂＡ０分画のピーク面積に加え、ヘモグロビンの時間分布の形状において隣接する分画のピーク面積を含んで算出された合計値を、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とみなして補正してもよい。

そして、安定型Ａ１ｃもまた、上記したＨｂＡ０が化学修飾された修飾率にて化学修飾を被っており、検体に含まれる安定型Ａ１ｃは化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃであるとの推定の下に、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する。換言すると、残存率を用いて、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積と化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の合計値の割合を算出する。この補正により、過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合を算出する。

たとえば、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で補正する方法は、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を残存率で除することとしてもよい。

［分析システム］
図１は、本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法が実施される分析システムＡ１の一例の概略構成を示している。分析システムＡ１は、分析装置１及び分析チップ２を備えて構成されている。分析システムＡ１は、人体から採取された血液である試料Ｓａを対象として血中ヘモグロビンの分子表面電荷に基づいて、陽イオン交換を原理とするヘモグロビンの分離分析を実行するシステムである。以下、分子表面の正電荷量の違いを利用した電気泳動を原理とする分析システムを用いて本発明を説明するが、本発明は、電気泳動を原理とする分離分析に限定されない。

＜分析チップの準備＞
分析チップ２は、試料Ｓａを保持し、かつ分析装置１に装填された状態で試料Ｓａを対象とした分析の場を提供するものである。本実施形態においては、分析チップ２は、１回の分析を終えた後に廃棄されることが意図された、いわゆるディスポーザブルタイプの分析チップとして構成されている。図２及び図３に示すように、分析チップ２は、本体２１、混合槽２２、導入槽２３、フィルタ２４、排出槽２５、電極槽２６、キャピラリー管２７及び連絡流路２８を備えている。図２は、分析チップ２の平面図であり、図３は、図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿う断面図である。なお、分析チップ２は、ディスポーザブルタイプのものに限定されず、複数回の分析に用いられるものであってもよい。また、本実施形態の分析システムは、別体の分析チップ２を分析装置１に装填する構成に限定されず、分析チップ２と同様の機能を果たす機能部位が分析装置１に一体に組み込まれた構成であってもよい。

本体２１は、分析チップ２の土台となるものであり、その材質は特に限定されず、たとえば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等があげられる。本実施形態においては、本体２１は、図３における上側部分２Ａと下側部分２Ｂとが別体に形成されており、これらが互いに結合された構成である。なお、これに限らず、たとえば、本体２１を一体的に形成してもよい。

混合槽２２は、後述する試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する混合工程が行われる箇所の一例である。混合槽２２は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。導入槽２３は、混合槽２２における混合工程によって得られた試料溶液としての混合試料Ｓｍが導入される槽である。導入槽２３は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。

フィルタ２４は、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられている。フィルタ２４の具体的構成は限定されず、好適な例として、たとえばセルロースアセテート膜フィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．４５μｍ）が挙げられる。

排出槽２５は、電気泳動法における電気浸透流の下流側に位置する槽である。排出槽２５は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって，上方に開口した凹部として構成されている。電極槽２６は、電気泳動法による分析工程において、電極３１が挿入される槽である。電極槽２６は、たとえば、本体２１の上記上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。連絡流路２８は、導入槽２３と電極槽２６とを繋いでおり、導入槽２３と電極槽２６との導通経路を構成している。

キャピラリー管２７は、導入槽２３と排出槽２５とを繋ぐ微細流路であり、電気泳動法における電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）が生じる場である。キャピラリー管２７は、たとえば本体２１の上記下側部分２Ｂに形成された溝として構成されている。なお、本体２１には、キャピラリー管２７への光の照射及びキャピラリー管２７を透過した光の出射を促進するための凹部等が適宜形成されていてもよい。キャピラリー管２７のサイズは特に限定されないが、その一例を挙げると、その幅が２５μｍ〜１００μｍ、その深さが２５μｍ〜１００μｍ、その長さが５ｍｍ〜１５０ｍｍである。分析チップ２全体のサイズは、キャピラリー管２７のサイズ及び混合槽２２、導入槽２３、排出槽２５及び電極槽２６のサイズや配置等に応じて適宜設定される。

なお、上記構成の分析チップ２は一例であって、電気泳動法による分析が可能な構成の分析チップを適宜採用することができる。

＜分析装置＞
分析装置１は、試料Ｓａが点着された分析チップ２が装填された状態で、試料Ｓａを対象とした分析処理を行う。分析装置１は、図１に示すように、電極３１，３２、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３、スリット４４、検出器５、分注器６、ポンプ６１、希釈液槽７１、泳動液槽７２及び制御部８を備えている。なお、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３及び検出器５は、本発明でいう測定部の一例を構成する。

電極３１及び電極３２は、電気泳動法においてキャピラリー管２７に所定の電圧を印加するためのものである。電極３１は、分析チップ２の電極槽２６に挿入されるものであり、電極３２は、分析チップ２の排出槽２５に挿入されるものである。電極３１及び電極３２に印加される電圧は特に限定されないが、たとえば０．５ｋＶ〜２０ｋＶである。

光源４１は、電気泳動法において光学測定値としての吸光度を測定するための光を発する部位である。光源４１は、たとえば所定の波長域の光を出射するＬＥＤチップを具備する。光学フィルタ４２は、光源４１からの光のうち所定の波長の光を減衰させつつ、その余の波長の光を透過させるものである。レンズ４３は、光学フィルタ４２を透過した光を分析チップ２のキャピラリー管２７の分析箇所へと集光するためのものである。スリット４４は、レンズ４３によって集光された光のうち、散乱などを引き起こしうる余分な光を除去するためのものである。なお、光源４１は、ヘモグロビンを検出する原理に応じて適宜選択できる。吸光度を測定する場合は、ヘモグロビンの吸収波長を照射できる光源４１が選択される。また、ヘモグロビンを蛍光や発光で検出する場合は、励起光を照射できる光源４１が選択される。

検出器５は、分析チップ２のキャピラリー管２７を透過してきた光源４１からの光を受光するものであり、たとえばフォトダイオードやフォトＩＣなどを具備して構成されている。光源４１と同様に、検出器５もヘモグロビンを検出する原理に応じて適宜選択できる。

このように、光源４１から発した光が検出器５へと至る経路が光路である。そして、当該光路がキャピラリー管２７と交わる位置でそのキャピラリー管２７を流れる溶液（すなわち、試料溶液及び泳動液のいずれか又はその混合溶液）について光学測定値が測定される。すなわち、キャピラリー管２７において光源４１から検出器５へ至る光路が交わる位置が、光学測定値の測定部である。この光学測定値としては、たとえば吸光度が挙げられる。吸光度は、該光路の光がキャピラリー管２７を流れる溶液によって吸収された度合いを表すものであり、入射光強度と透過光強度の比の常用対数の値の絶対値を表したものである。この場合、検出器５としては汎用的な分光光度計を利用することができる。なお、吸光度を使用せずとも、単純に透過光強度の値そのものなど、光学測定値であれば本発明に利用することができる。以下においては、光学測定値として吸光度を使用した場合を例に説明する。

分注器６は、所望の量の希釈液Ｌｄや泳動液Ｌｍ及び混合試料Ｓｍを分注するものであり、たとえばノズルを含む。分注器６は図示しない駆動機構によって分析装置１内の複数の所定位置を自在に移動可能である。ポンプ６１は、分注器６への吸引源及び吐出源である。また、ポンプ６１は、分析装置１に設けられた図示しないポートの吸引源及び吐出源として用いてもよい。これらのポートは、泳動液Ｌｍの充填などに用いられる。また、ポンプ６１とは別の専用のポンプを備えてもよい。

希釈液槽７１は、希釈液Ｌｄを貯蔵するための槽である。希釈液槽７１は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の希釈液Ｌｄが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。泳動液槽７２は、泳動液Ｌｍを貯蔵するための槽である。泳動液槽７２は、分析装置１に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の泳動液Ｌｍが封入された容器が分析装置１に装填されたものであってもよい。

制御部８は、分析装置１における各部を制御するものである。制御部８は、図４のハードウェア構成に示すように、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）８１、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）８２、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）８３及びストレージ８４を有する。各構成は、バス８９を介して相互に通信可能に接続されている。

ＣＰＵ８１は、中央演算処理ユニットであり、各種プログラムを実行したり、各部を制御したりする。すなわち、ＣＰＵ８１は、ＲＯＭ８２又はストレージ８４からプログラムを読み出し、ＲＡＭ８３を作業領域としてプログラムを実行する。ＣＰＵ８１は、ＲＯＭ８２又はストレージ８４に記録されているプログラムに従って、上記各構成の制御及び各種の演算処理を行う。

ＲＯＭ８２は、各種プログラム及び各種データを格納する。ＲＡＭ８３は、作業領域として一時的にプログラム又はデータを記憶する。ストレージ８４は、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｒｉｖｅ）又はフラッシュメモリにより構成され、オペレーティングシステムを含む各種プログラム、及び各種データを格納する。本態様では、ＲＯＭ８２又はストレージ８４には、測定や判定に関するプログラムや各種データが格納されている。また、ストレージ８４には、測定データを保存しておくこともできる。

制御部８は、上記ハードウェア構成のうちＣＰＵ８１が、前記したプログラムを実行することによって、分析装置１において図５に示すような各工程を実施する。これらの工程の詳細については後述する。

＜希釈液、泳動液、混合試料の調製＞
希釈液Ｌｄは、試料Ｓａと混合されることにより、試料溶液としての混合試料Ｓｍを生成するためのものである。希釈液Ｌｄの主剤は特に限定されず、水、生理食塩水が挙げられ、好ましい例として後述する泳動液Ｌｍと類似の成分の液体が挙げられる。また、希釈液Ｌｄは、上記主剤の他に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。

泳動液Ｌｍは、電気泳動法による分析工程において、排出槽２５及びキャピラリー管２７に充填され、電気泳動法における電気浸透流を生じさせる媒体である。泳動液Ｌｍは、特に制限されないが、酸を用いたものが望ましい。上記酸は、たとえば、クエン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸がある。また、泳動液Ｌｍは、弱塩基を含むことが好ましい。上記弱塩基としては、たとえば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等がある。泳動液ＬｍのｐＨは、たとえば、ｐＨ４．５〜６の範囲である。泳動液Ｌｍのバッファーの種類は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等がある。また、泳動液Ｌｍにも、希釈液Ｌｄの説明で述べたのと同様に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。

泳動液Ｌｍ、希釈液Ｌｄ、及び混合試料Ｓｍは以下を例示するが、後述する界面到達時点において、試料溶液（混合試料Ｓｍ）と泳動液Ｌｍとの界面の到達に起因する光学測定値の変化が生じる組み合わせであれば任意に選択できる。

＜準備工程、電気泳動工程、分析工程＞
次に、分析システムＡ１を用いて行うヘモグロビンの分離分析の一例について、以下に説明する。図５は、本実施形態におけるヘモグロビンの分離分析方法を示すフロー図である。本分離分析方法は、準備工程Ｓ１、電気泳動工程Ｓ２、及び分析工程Ｓ３を有する。

＜準備工程Ｓ１＞
図６は、準備工程Ｓ１における具体的な手順を示すフロー図である。本実施形態において、準備工程Ｓ１は、同図に示すように、試料採取工程Ｓ１１、混合工程Ｓ１２、泳動液充填工程Ｓ１３、及び導入工程Ｓ１４を有する。

＜試料採取工程Ｓ１１＞
まず、試料Ｓａを用意する。本実施形態においては、試料Ｓａは、人体から採取された血液である。血液としては、全血、成分分離血液又は溶血処理が施されたもの等であってもよい。そして、試料Ｓａが分注された分析チップ２を分析装置１に装填する。

＜混合工程Ｓ１２＞
次いで、試料Ｓａと希釈液Ｌｄとを混合する。具体的には、図７に示すように、所定量の試料Ｓａが分析チップ２の混合槽２２に点着されている。次いで、分注器６によって希釈液槽７１の希釈液Ｌｄを所定量吸引し、図８に示すように、所定量の希釈液Ｌｄを分析チップ２の混合槽２２に分注する。そして、ポンプ６１を吸引源及び吐出源として、分注器６から希釈液Ｌｄの吸引及び吐出を繰り返す。これにより、混合槽２２において試料Ｓａと希釈液Ｌｄとが混合され、試料溶液としての混合試料Ｓｍが得られる。試料Ｓａと希釈液Ｌｄとの混合は、分注器６の吸引及び吐出以外の方法によって行ってもよい。

＜泳動液充填工程Ｓ１３＞
次いで、分注器６によって泳動液槽７２の泳動液Ｌｍを所定量吸引し、図９に示すように、所定量の泳動液Ｌｍを分析チップ２の排出槽２５に分注する。そして、上述したポートで排出槽２５の上方の開口を覆い、ポートから排出槽２５内部に空気を吐出や吸引を適宜実施するなどの手法により、排出槽２５及びキャピラリー管２７に泳動液Ｌｍを充填する。

＜導入工程Ｓ１４＞
次いで、図１０に示すように、混合槽２２から所定量の混合試料Ｓｍを分注器６によって採取する。そして、分注器６から導入槽２３に所定量の混合試料Ｓｍを導入する。この導入においては、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられたフィルタ２４を混合試料Ｓｍが通過する。また、本実施形態においては、混合試料Ｓｍが導入槽２３から連絡流路２８を通じて電極槽２６へと充填される。この際、導入槽２３から連絡流路２８を介した電極槽２６への混合試料Ｓｍの流動が起こることとなるが、導入槽２３から連絡流路２８へは、キャピラリー管２７の長手方向に対してほぼ直交する方向へ混合試料Ｓｍが流動する（図２参照）。一方、キャピラリー管２７の泳動液Ｌｍはこの段階ではほとんど移動していない。この結果、導入槽２３とキャピラリー管２７との接続部（図３参照）においてせん断流が生じることで、混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの明瞭な界面が生じた状態となる。なお、混合溶液Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が生じる方法であれば、物理的に導入槽２３とキャピラリー管２７との境界に移動可能なフィルタを設けたり、制御的に流動方法を変更したりする等、あらゆる手段を採用することができる。

＜電気泳動工程Ｓ２＞
次いで、電極槽２６（図２参照）に電極３１（図１参照）を挿入し、排出槽２５に電極３２（図１参照）を挿入する。続いて、制御部８からの指示により電極３１及び電極３２に電圧を印加する。この電圧は、たとえば０．５ｋＶ〜２０ｋＶである。これにより電気浸透流を生じさせ、導入槽２３から排出槽２５へとキャピラリー管２７中において混合試料Ｓｍを徐々に移動させる。この際、導入槽２３に混合試料Ｓｍが充填されているため、キャピラリー管２７において混合試料Ｓｍが連続的に供給されている状態で、上記分析成分であるヘモグロビン（Ｈｂ）を電気泳動させることとなる。このとき、混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの上記した界面が維持された状態のまま、混合試料Ｓｍは泳動液Ｌｍを下流方向へ押しやりつつキャピラリー管２７を泳動していくことになる。また、光源４１からの発光を開始し、検出器５による吸光度の測定を行う。そして、電極３１及び電極３２からの電圧印加開始時からの経過時間と吸光度との関係を測定する。

＜分析工程Ｓ３＞
ここで、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的速い成分（換言すると、分子表面の正電荷量が比較的少ない成分）に対応した吸光度ピークは、上記電圧印加開始時からの経過時間が比較的短い時点で現れる。一方、混合試料Ｓｍ中の移動速度が比較的遅い成分（換言すると、分子表面の正電荷量が比較的多い成分）に対応した吸光度ピークは、上記電圧印加開始時からの経過時間が比較的長い時点で現れる。このことを利用して、混合試料Ｓｍ中の成分の分析（分離測定）が行われる。測定された吸光度を基に、制御部８の制御によって、図１１に示す分析工程Ｓ３が実行される。本実施形態の分析工程Ｓ３は、波形形成工程Ｓ３１、界面到達時点決定工程Ｓ３２及び成分同定工程Ｓ３３を含む。

＜波形形成工程Ｓ３１＞
本工程においては、測定された上記吸光度を制御部８による演算処理により、電圧印加開始時を測定開始時として、当該測定開始後の経過時間に対応した光学測定値である吸光度の変化量を表す測定波形としてのエレクトロフェログラムが形成される。具体的には、測定された上記吸光度を時間微分することによって微分値の波形を形成する。形成されたエレクトロフェログラムの縦軸で表される吸光度の時間に対する微分した値は、検出されたヘモグロビンの量を示すものである。図１２は、吸光度の時間微分によって形成された微分波形の一例を示している。図中のｘ軸は時間軸であり、ｙ軸は微分値軸である。以降の図及び説明においては、時間軸ｘに沿った負方向側を方向ｘ１側及び正方向側を方向ｘ２側とし、微分値軸ｙに沿った負方向側を方向ｙ１側及び正方向側を方向ｙ２側とする。

＜界面到達時点決定工程Ｓ３２＞
本工程においては、電圧印加によりキャピラリー管の下流方向に泳動する混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が検出器５に到達した時点である界面到達時点を決定する工程である。この混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面は、電気泳動開始後に最初に現れるピークである。この混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面のピークを図１３に示す。図１３に示すように、この混合試料Ｓｍと泳動液Ｌｍとの界面が示すピークのうち、このエレクトロフェログラムにおける基準値Ｌｓから微分値が最も離間している点を決定する。図示された例においては、基準値Ｌｓから方向ｙ２に離間した点が基準値Ｌｓから最も離間しており、この点が最離間点ＰＬとして決定される。ここで、前記した電気泳動工程Ｓ２において電圧の印加を開始した時点を０として、この最離間点ＰＬが検出された時点を界面到達時点とする。

＜成分同定工程Ｓ３３＞
前記した波形形成工程Ｓ３１において得られる、界面到達時点以後の微分波形の一例を、図１４に示す。同図においては、ｘ軸は電圧の印加を開始した時点を０とした泳動時間（単位：ｓｅｃ）を示し、ｙ軸は吸光度を時間微分した値であるＳＬＯＰＥ値（単位：ｍＡｂｓ／ｓｅｃ）を示している。また、泳動時間１１．５秒付近のピークは、図１３に示す最離間点ＰＬであり、この時点が界面到達時点である。そして、本工程において、この微分波形からヘモグロビン成分が特定される。具体的には、界面到達時点以降で最大となるピークを有する分画αがＨｂＡ０と特定される。そして、界面到達時点からＨｂＡ０のピークまでに出現する各ピークについては、界面到達時点からＨｂＡ０のピークが検出された時間までの間の時間に対する、界面到達時点から当該ピークの検出時間までの時間の比率によって当該ピークが示す成分が同定される。たとえば、図１４においては、安定型Ａ１ｃ（Ｓ−Ａ１ｃ）を示すピーク（分画β）がこのようにして同定される。

そして、このようにして同定された各ピークから、各成分の量が算出される。具体的には、ある成分として同定されたピークを極大値として、その極大値を含む分画の面積を当該ピークに対応する成分の量とすることができる。ここで、その分画の両端は適宜定めることができ、たとえば、その極大値の両側にある極小値をもってその両端としてもよい。

このようにして、Ｓ３３１に示す総ヘモグロビン算出工程において、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積を算出する。ここで、ＨｂＡ０量は総ヘモグロビン量の大部分を占めている。そのため、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積は、ＨｂＡ０分画のみで算出した面積であってもよく、また、ＨｂＡ０分画とその周辺の分画を含む面積に準拠してもよく、さらには、エレクトロフェログラムのうちヘモグロビンに帰せられる領域の全ての面積としてもよい。いずれの場合も、後述する補正値（Ｘ）及び補正後値（Ｙ）の計算には大きな影響は及ぼさない。

次に、Ｓ３３２に示す補正前値算出工程において、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を算出することで、補正前値（Ｘ）が算出される。この補正前値（Ｘ）の算出に用いる安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積は、図１４に示すＳ−Ａ１ｃピークの両端にある極小値間の分画βの面積として求められる。つまり、この安定型Ａ１ｃを含む分画βのピーク面積は、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃに由来するピーク面積である。そのため補正前値（Ｘ）は、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合である。換言すると、化学修飾された安定型Ａ１ｃを加味していないピーク面積の割合ともいえる。

次に、Ｓ３３３に示す残存率算出工程において、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する化学修飾されたＨｂＡ０を含むピーク面積の割合である修飾率（Ｐ）が算出される。そして、この修飾率（Ｐ）から、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対するＨｂＡ０の割合である残存率（Ｑ）が算出される。

具体的には、安定型Ａ１ｃの分画に対して早い時間の側に隣接する分画、換言すると、正電荷量が低い側に隣接する、泳動時間１９秒付近の分画γには、後述の実施例で示すように、カルバミル化したＨｂＡ０及びアルデヒド化したＨｂＡ０のいずれか又は両方が含まれていると考えられる。残存率算出工程Ｓ３３３においては、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対するこの分画γの割合を、修飾率（Ｐ）とする。なお、上述のように、分画γのピーク面積とＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積に対する分画γのピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。また、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、検体に含まれる総ヘモグロビンに相当するピーク面積と近似することから、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γのピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。

一方、ＨｂＡ０分画に対して早い時間の側に隣接する分画、換言すると、正電荷量が少ない側に隣接する、泳動時間２５秒付近の分画δには、ＨｂＡ０がカルバミル化又はアルデヒド化される際に化学修飾したＨｂＡ０とともに生成する物質が含まれていると考えられる。残存率算出工程Ｓ３３３においては、上述したように、この分画δのピーク面積から化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積を算出し、修飾率（Ｐ）を算出してもよい。具体的には、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値に対する、分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合を算出して、修飾率（Ｐ）を算出してもよい。なお、上述のように、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積とＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の合計値の大部分は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積が占める。そのため、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積に対する分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０のピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。また、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積は、検体に含まれる総ヘモグロビンに相当するピーク面積と近似することから、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画δから算出した化学修飾されたＨｂＡ０のピーク面積の割合を算出して、この修飾率（Ｐ）としてもよい。

そして、１から算出された修飾率（Ｐ）を減じることで残存率（Ｑ）を算出する。なお、残存率（Ｑ）の算出は、この算出方法に限定されるものではない。

そして、Ｓ３３４に示す補正後値算出工程において、上記で算出された補正前値（Ｘ）及び残存率（Ｑ）から、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積と化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の合計値の割合である補正後値（Ｙ）が算出される。具体的には、補正前値（Ｘ）を残存率（Ｑ）で除することによって補正後値（Ｙ）が算出される。

＜その他＞
カルバミル化されたＨｂＡ０と、アルデヒド化されたＨｂＡ０とでは分子表面の電荷量が近いと考えられ、分画γに、カルバミル化されたＨｂＡ０とアルデヒド化されたＨｂＡ０の合成ピークが生じる場合がある。その場合は、合成ピークである分画γのピーク面積を化学修飾されたＨｂＡ０のピーク面積とし、合成ピークである分画γのピーク面積から残存率（Ｑ）を算出してもよい。を、補正前値（Ｘ）の補正に用いる化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積としてもよい。同様に、ＨｂＡ０がカルバミル化される際にともに生じる物質と、ＨｂＡ０がアルデヒド化される際にともに生じる物質も、その分子表面の電荷量が近いと考えられ、分画δに合成ピークを形成する場合がある。その場合も同様に、合成ピークである分画δピーク面積から化学修飾されたＨｂＡ０のピーク面積を算出し、算出した化学修飾されたＨｂＡ０のピーク面積から残存率（Ｑ）を算出してもよい。

また、分画γに現れるカルバミル化されたＨｂＡ０及びアルデヒド化されたＨｂＡ０は、不安定型Ａ１ｃと分子表面の電荷量が近いと考えられる。そのため、陽イオン交換を原理とする上記実施形態の測定方法では、不安定型Ａ１ｃのピークは、分画γとして現れるカルバミル化されたＨｂＡ０及びアルデヒド化されたＨｂＡ０のそれぞれのピークと合成ピークを形成したり、あるいは、カルバミル化されたＨｂＡ０とアルデヒド化されたＨｂＡ０との合成ピークと、さらに合成ピークを形成することがある。その場合、合成ピークのピーク面積から、化学修飾されていない健常者の検体が示す平均的な不安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積を控除した修正値を用いて残存率（Ｑ）を算出し、補正前値（Ｘ）を補正してもよい。あるいは、別の手段で、正確な不安定型Ａ１ｃの量を測定して、その量に相当するピーク面積で控除した修正量を用いて残存率（Ｑ）を算出し、補正前値（Ｘ）を補正してもよい。

また、分画δに現れるＨｂＡ０がカルバミル化された際にカルバミル化ＨｂＡ０とともに生成する物質及びＨｂＡ０がアルデヒド化される際にアルデヒド化ＨｂＡ０とともに生成する物質は、分画δの泳動時間に分画が現れるＨｂＡ１ｅと推定されるヘモグロビンと分子表面の電荷量が近いと考えられる。そのため、陽イオン交換を原理とする上記実施形態の測定方法では、このＨｂＡ１ｅと推定されるヘモグロビンのピークは、分画δとして現れるカルバミル化ＨｂＡ０とともに生成する物質及びアルデヒド化ＨｂＡ０とともに生成する物質のそれぞれ、または両方と合成ピークを形成することがある。その場合、合成ピークのピーク面積から、化学修飾されていない健常者の検体が示すＨｂＡ１ｅと推定されるヘモグロビンを含む分画のピーク面積を所定のピーク面積値として控除した修正値を用いて残存率（Ｑ）を算出し、補正前値（Ｘ）を補正してもよい。化学修飾されていない健常者の検体が示すＨｂＡ１ｅと推定されるヘモグロビンを含む分画のピーク面積は、複数の健常者の検体を測定し、得られたＨｂＡ１ｅと推定されるヘモグロビンを含む分画のピーク面積を平均したものを用いてもよい。あるいは、別の手段で、ＨｂＡ１ｅと推定されるの量を測定して、その量に相当するピーク面積で控除した修正量を用いて補正前値（Ｘ）を補正してもよい。

＜カルバミル化の影響＞
実施例１として、通常検体に人為的にシアン酸ナトリウムを添加してヘモグロビンをカルバミル化した検体において、本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法が有効であることを示す。

［カルバミル化検体の調製］
通常検体として、健常者から採取した全血を使用した。この通常検体に、下記表１に示すような終濃度となるようシアン酸ナトリウムを添加して３７℃でインキュベートした検体１〜検体４を調製し、これらをそれぞれ前記した試料Ｓａ（図７参照）として使用した。検体中のシアン酸ナトリウム濃度に応じて、検体中のヘモグロビンはカルバミル化される。

なお、上記表１中の検体１のシアン酸ナトリウム濃度は０ｍｇ／ｄＬであるが、これはシアン酸ナトリウムを添加していない、通常検体そのままであることを意味する。

［泳動液］
前記した泳動液Ｌｍ（図９参照）は、以下の組成とした。
クエン酸：４０ｍＭ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム：１．２５％ｗ／ｖ
ピペラジン：２０ｍＭ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（商品名：エマルゲンＬＳ−１１０、花王社製）：０．１％ｗ／ｖ
アジ化ナトリウム：０．０２％ｗ／ｖ
プロクリン３００：０．０２５％ｗ／ｖ
以上の成分の他、ｐＨ調整用のジメチルアミノエタノールを滴下して、ｐＨ５．０に調整した。

［希釈液］
前記した希釈液Ｌｄ（図８参照）は、以下の組成とした。
クエン酸：３８ｍＭ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム：０．９５％ｗ／ｖ
１−（３−スルホプロピル）ピリジニウムヒドロキシド分子内塩（ＮＤＳＢ−２０１）：４７５ｍＭ
２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）：１９ｍＭ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（商品名：エマルゲンＬＳ−１１０、花王社製）：０．４％ｗ／ｖ
アジ化ナトリウム：０．０２％ｗ／ｖ
プロクリン３００ ０．０２５％ｗ／ｖ
以上の成分の他、ｐＨ調整用のジメチルアミノエタノールを滴下して、ｐＨ６．０に調整した。

［混合試料Ｓｍ］
１．５μＬの試料Ｓａを６０μＬの希釈液Ｌｄに添加して、混合試料Ｓｍ（図８〜図１０参照）を調製した。この混合試料Ｓｍを前記した分析システムＡ１に供して、ヘモグロビンの分離分析を実行した。

［エレクトロフェログラム］
電圧を印加した時点を分離分析の開始の時点とし、電圧を印加した時点を０秒の時点としたエレクトロフェログラムを得た。シアン酸ナトリウムが添加されていない検体１のエレクトロフェログラムは、図１５に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は泳動時間１１．５秒付近である。また、ＨｂＦ分画である分画εは泳動時間１７．３秒付近にピークを有する。安定型Ａ１ｃ分画である分画βは泳動時間２１秒付近にピークを有する。ＨｂＡ０分画である分画αは泳動時間２７．３秒付近にピークを有する。そして、分画βより早い泳動時間１９秒付近（１９．４秒）にピークを有する分画γは、不安定型Ａ１ｃを含む分画とされているが、この分画にはカルバミル化を被ったＨｂＡ０も含まれる。また、分画αより早い泳動時間２５秒付近（２５．２秒）にピークを有する分画δには、ＨｂＡ０がカルバミル化される際にカルバミル化ＨｂＡ０と共に生成される物質が含まれる。

シアン酸ナトリウムが１２．５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体２のエレクトロフェログラムは、図１６に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は検体１とほぼ変わらないが、分画ε、分画γ、分画β、分画δ及び分画αのピークはそれぞれ泳動時間１６．７秒、１９．０秒、２０．０秒、２３．８秒及び２５．６秒に観察されている。そして、分画γ及び分画δの面積は検体１より増大している。

シアン酸ナトリウムが１８．８ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体３のエレクトロフェログラムは、図１７に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は検体１及び検体２とほぼ変わらないが、分画ε、分画γ、分画β、分画δ及び分画αのピークはそれぞれ泳動時間１６．９秒、１８．５秒、１９．６秒、２３．５秒及び２５．４秒と、検体２とほぼ同じ時間に観察されている。そして、分画γ及び分画δの面積は検体２よりもさらに増大している。

シアン酸ナトリウムが２５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体４のエレクトロフェログラムは、図１８に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は検体１から検体３とほぼ変わらず、分画ε、分画γ、分画β、分画δ及び分画αのピークが観察される泳動時間もほぼ検体３と同じであるが、分画γ及び分画δの面積は検体３よりもさらに増大している。なお、検体１、検体２、検体３、検体４でそれぞれの分画が観察される時間が検体によって異なっているが、本実施例での安定型Ａ１ｃの測定には影響しない。

［補正前値（Ｘ）の算出］
図１５〜図１８における分画βから、安定型Ａ１ｃピーク面積の割合としての補正前値（Ｘ）は、下記表２に示すとおりに算出された。

上記表中の補正前値（Ｘ）の算出に当たっては、まず、各エレクトロフェログラムにおけるＳＬＯＰＥ値が０以上の部分の面積（ただし、ＰＬをピークとする部分を除く）の総和が算出され、これをヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積とした。このヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積は、分画αとして同定されるＨｂＡ０のピーク面積を含む。そして、このヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画βのピーク面積の割合から上記表中の補正前値（Ｘ）を算出した。

上記表２に示すとおり、検体中のシアン酸ナトリウム濃度が高くなるにつれ、補正前値（Ｘ）が低くなっていくことが認められる。また検体１の補正前値（Ｘ）に対する増減の割合（すなわち、各検体の補正前値（Ｘ）から検体１の補正前値（Ｘ）である６．４８％を減じた値の、検体１の補正前値（Ｘ）に対する割合）を示す相対誤差の値も、シアン酸ナトリウム濃度の増大に伴い、大きくなった。これは、安定型Ａ１ｃ量が、シアン酸ナトリウムによるカルバミル化を被ることで減少していくことを示している。

［分画γによる補正］
次に、安定型Ａ１ｃとして同定される分画βに対し、正電荷量が低い側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画γを用いて、下記表３に示すように補正前値（Ｘ）の補正を行った。

まず、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合を、上記表３中の左端列に挙げており、具体的には、検体１で２．９％、検体２で６．１％、検体３で８．１％、及び検体４で９．６％であった。

分画γには、不安定型Ａ１ｃ（Ｌ−Ａ１ｃ）が含まれることが分かっている。そこで、不安定型Ａ１ｃに由来する一定のピーク面積の割合と考えられる３％が所定のピーク面積値として上記した分画γのピーク面積の割合から控除され、これにより上記表３中に示す修飾率（Ｐ）を算出した。なお、この不安定型Ａ１ｃに由来するピーク面積の割合は、複数のカルバミル化やアルデヒド化の影響を被っていないと考えられる健常者の検体を分離分析して得た不安定型Ａ１ｃ（Ｌ−Ａ１ｃ）を含む分画のピーク面積の割合の統計上の値であってもよく、上記した３％には限定されない。ここで、検体１における分画γは２．９％でありこの３％を下回っているが、この場合は計算上、修飾率（Ｐ）が０であるものとして取り扱った。この修飾率（Ｐ）は、検体中のシアン酸ナトリウム濃度が高くなるにつれ増大していることが見て取れる。なお、この修飾率（Ｐ）はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対するカルバミル化されたＨｂＡ０を含むピーク面積の割合であるが、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積はＨｂＡ０を含む分画のピーク面積とカルバミル化されたＨｂＡ０を含むピーク面積の合計値と近似する。そのため、このように、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対するカルバミル化されたＨｂＡ０を含むピーク面積の割合を修飾率（Ｐ）としても適切に補正できる。

この修飾率（Ｐ）を１から減じた値が上記表中の残存率（Ｑ、ただし百分率で表示）であり、この割合で残存した安定型Ａ１ｃが、前記した表２中の補正前値（Ｘ）、すなわち分画βとしてエレクトロフェログラムに現れていると考えられる。よって、補正前値（Ｘ）をこの残存率（Ｑ）で除した値である、上記表３中の補正後値（Ｙ）は、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積と化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の合計値の割合と考えられる。ここで、前記表２から、補正前値（Ｘ）に基づく相対誤差の絶対値は、検体４で最大の６．５％であったところ、上記表３から、補正後値（Ｙ）に基づく相対誤差（すなわち、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体１の補正前値（Ｘ）（表２参照）を減じた値の、検体１の補正前値（Ｘ）に対する割合）の絶対値は、検体３で最大の１．８％であった。そのため、補正を行うことで、化学修飾されることによって生じる相対誤差の幅は小さくなった。

よって、分画γを用いた補正によって、カルバミル化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

［分画δによる補正］
分画δによる補正では、表４中の左端列に掲げるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画δのピーク面積の割合から、カルバミル化やアルデヒド化の影響を被っていないと考えられる健常者の検体が通常有する分画δのピーク面積の割合である４％を所定のピーク面積値として控除した。なお、この控除する値は複数の健常者の検体を分離分析して得た分画δのピーク面積の割合の統計上の値であってもよく、必ずしもこの４％には限定されない。そして、ＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成される物質のピーク面積は、カルバミル化ＨｂＡ０のピーク面積である分画γの約１．６５倍を示す。このことから分画δから４％が控除された値をこの所定の係数である１．６５で除した値をヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対するカルバミル化ＨｂＡ０のピーク面積の割合とみなし、これを修飾率（Ｐ）とした。この他、残存率（Ｑ）、補正後値（Ｙ）及び相対誤差の算出は表３と同様である。ただし、表４中の補正後値（Ｙ）は、前記表２中の補正前値（Ｘ）を表４中の残存率（Ｑ）で除した値である。また、表４中の相対誤差は、表３と同様に、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体１の補正前値（Ｘ）（表２参照）を減じた値の、検体１の補正前値（Ｘ）に対する割合である。

上記表４からも、補正後値（Ｙ）の相対誤差の幅は補正前の補正前値（Ｘ）の相対誤差（表２参照）の幅よりも小さくなっているといえる。よって、分画δを用いた補正によって、カルバミル化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

［カルバミル化の影響について小活］
以上の表２〜表４のまとめとして、各検体のシアン酸ナトリウム濃度に対して、補正をしなかった場合と、分画γによる補正を行った場合と、分画δによる補正を行った場合とにおける相対誤差を下記表５に掲げる。

上記表５をグラフ化した図１９からも明らかなように、いずれの補正によっても、シアン酸ナトリウムによる安定型Ａ１ｃのカルバミル化の影響が少なくとも軽減されることが認められた。

＜アルデヒド化の影響＞
実施例１として、通常検体に人為的にアセトアルデヒドを添加してヘモグロビンをアルデヒド化した検体においても、本開示の安定型Ａ１ｃの測定方法が有効であることを示す。

［アルデヒド化検体の調製］
通常検体として、健常者から採取した全血を使用した。この通常検体に、下記表６に示すような終濃度となるようアセトアルデヒドを添加して３７℃でインキュベートした検体１〜検体４を調製し、これらをそれぞれ前記した試料Ｓａ（図７参照）として使用した。検体中のアセトアルデヒド濃度に応じて、検体中のヘモグロビンはアルデヒド化される。

なお、上記表７中の検体５のアセトアルデヒド濃度は０ｍｇ／ｄＬであるが、これはアセトアルデヒドを添加していない、通常検体そのままであることを意味する。また、泳動液Ｌｍ、希釈液Ｌｄ及び混合試料Ｓｍについては前記した実施例１と同様である。

［エレクトロフェログラム］
電圧を印加した時点を分離分析の開始の時点とし、電圧を印加した時点を０秒の時点としたエレクトロフェログラムを得た。アセトアルデヒドが添加されていない検体５のエレクトロフェログラムは、図２０に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は泳動時間１１．９秒付近である。また、ＨｂＦ分画である分画εは泳動時間１８．８秒付近にピークを有する。安定型Ａ１ｃ分画である分画βは泳動時間２１．９秒付近にピークを有する。ＨｂＡ０分画である分画αは泳動時間２８．３秒付近にピークを有する。そして、分画βより早い泳動時間２０．４秒付近にピークを有する分画γは、不安定型Ａ１ｃを含む分画とされているが、この分画にはアルデヒド化を被ったＨｂＡ０も含まれる。また、分画αより早い泳動時間２６．２秒付近にピークを有する分画δには、ＨｂＡ０がアルデヒド化される際に生成される物質が含まれる。

アセトアルデヒドが１２．５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体６のエレクトロフェログラムは、図２１に示すとおりである。また、アセトアルデヒドが２５ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体７のエレクトロフェログラムは、図２２に示すとおりである。図２０〜図２２より、前記したカルバミル化の場合と同様、アセトアルデヒドの濃度が増大するにつれて、分画γ及び分画δの面積が増大していくことが認められる。

［補正前値（Ｘ）の算出］
図２０〜図２２における分画βから、安定型Ａ１ｃピーク面積の割合としての補正前値（Ｘ）は、下記表７に示すとおりに算出された。なお、補正前値（Ｘ）の算出方法については前記した実施例１と同様である。

上記表７に示すとおり、検体中のアセトアルデヒド濃度が高くなるにつれ、補正前値（Ｘ）が低くなっていくことが認められる。また検体５の補正前値（Ｘ）に対する増減の割合（すなわち、各検体の補正前値（Ｘ）から検体５の補正前値（Ｘ）である５．４７％を減じた値の、検体５の補正前値（Ｘ）に対する割合）を示す相対誤差も、アセトアルデヒド濃度の増大に伴い、大きくなった。これは、安定型Ａ１ｃ量が、アセトアルデヒドによるアルデヒド化を被ることで減少していくことを示している。

［分画γによる補正］
次に、安定型Ａ１ｃとして同定される分画βに対し、正電荷量が低い側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画γを用いて、下記表８に示すように補正前値（Ｘ）の補正を行った。

まず、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合を、上記表８中の左端列に挙げており、具体的には、検体５で２．４％、検体６で４．６％、及び検体７で７．３％であった。

この分画γのピーク面積の割合からは、前記した実施例１と同様の理由で３％が控除され、これが上記表８中に示す修飾率（Ｐ）として掲げられている数値である。ここで、検体５における分画γは２．４％でありこの３％を下回っているが、この場合は計算上、修飾率（Ｐ）が０であるものとして取り扱った。この修飾率（Ｐ）は、検体中のアセトアルデヒド濃度が高くなるにつれ増大していることが見て取れる。また、前記した実施例１と同じ理由で、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対するアルデヒド化されたＨｂＡ０を含むピーク面積の割合を修飾率（Ｐ）としても、適切に補正できる。

この修飾率（Ｐ）を１から減じた値が上記表中の残存率（Ｑ、ただし百分率で表示）であり、この割合で残存した安定型Ａ１ｃが、前記した表７中の補正前値（Ｘ）、すなわち分画βとしてエレクトロフェログラムに現れていると考えられる。よって、補正前値（Ｘ）をこの残存率（Ｑ）で除した値である、上記表８中の補正後値（Ｙ）は、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積と化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の合計値の割合と考えられる。ここで、前記表７から、補正前値（Ｘ）に基づく相対誤差の絶対値は、検体７で最大の５．１％であったところ、上記表８から、補正後値（Ｙ）に基づく相対誤差（すなわち、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体５の補正前値（Ｘ）（表７参照）を減じた値の、検体５の補正前値（Ｘ）に対する割合）の絶対値は、検体７で最大の０．８％であった。そのため、補正を行うことで、化学修飾されることによって生じる相対誤差の幅は小さくなってた。

よって、分画γを用いた補正によって、アルデヒド化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

［分画δによる補正］
ＨｂＡ０として同定される分画αに対し、正電荷量が低い側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画δを用いて、前記表７の補正前値（Ｘ）の補正を行った場合について説明する。なお、この分画δによる補正では、前記実施例１と同様の理由から分画δのピーク面積の割合から４％が所定のピーク面積値として控除されている。そしてＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成される物質のピーク面積は、分画γに含まれるアルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積の約１．６５倍を示す。このことから分画δから４％が控除された値をこの１．６５という所定の係数で除することにより修飾率（Ｐ）を算出した。この他、残存率（Ｑ）、補正後値（Ｙ）及び相対誤差の算出は表８と同様である。ただし、表９中の補正後値（Ｙ）は、前記表７中の補正前値（Ｘ）を表９中の残存率（Ｑ）で除した値である。また、表９中の相対誤差は、表８と同様に、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体５の補正前値（Ｘ）（表７参照）を減じた値の、検体５の補正前値（Ｘ）に対する割合である。

上記表９からも、補正後値（Ｙ）の相対誤差の幅は補正前の補正前値（Ｘ）の相対誤差の幅よりも小さくなっているといえる。よって、分画δを用いた補正によって、アルデヒド化による化学修飾の影響が軽減ないし排除されて、過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映した安定型Ａ１ｃの割合により近い値が求められると考えられる。

分画δを用いて補正する場合、実施例１で示したカルバミル化の影響の補正では分画δ（％）から４％を控除した値を除する所定の係数として１．６５を用いた。そして実施例２で示したアルデヒド化の影響の補正でも同様にこの所定の係数である１．６５を用いた。このように同じ係数を用いることで、ＨｂＡ０がカルバミル化される際に生じる物質と、ＨｂＡ０がアルデヒド化される際に生じる物質とが同じ分画δに含まれる場合であっても、いずれの化学修飾の影響も回避することができる。なお、分離分析する検体のヘモグロビンがカルバミル化されていないことがわかっており、アルデヒド化されていることがわかっている場合は、アルデヒド化の影響を回避するために適した係数を用いてもよい。分離分析する検体のヘモグロビンがカルバミル化されており、アルデヒド化されていないことがわかっている場合も同様である。

［アルデヒド化の影響について小活］
以上の表７〜表９のまとめとして、各検体のアセトアルデヒド濃度に対して、補正をしなかった場合と、分画γによる補正を行った場合と、分画δによる補正を行った場合とにおける相対誤差を下記表１０に掲げる。

上記表１０をグラフ化した図２３からも明らかなように、いずれの補正によっても、アセトアルデヒドによる安定型Ａ１ｃのアルデヒド化の影響が少なくとも軽減されることが認められた。

＜不安定型Ａ１ｃの影響＞
実施例３として、通常検体に人為的にグルコースを添加し、不安定型Ａ１ｃを生じさせた。この検体を用いた検討から、本開示のＨｂＡ０が化学修飾される際に化学修飾されたＨｂＡ０とともに生成される物質を含む分画を用いて補正する安定型Ａ１ｃの測定方法が、さらに有効であることを示す。

［不安定型Ａ１ｃを含む検体の調製］
通常検体として、健常者から採取した全血を使用した。この通常検体に、下記表１１に示すような終濃度となるようＤ−グルコースを添加して３７℃でインキュベートした検体８〜検体１２を調製し、試料Ｓａ（図７参照）を調製した。検体中のＤ−グルコース濃度の増加に応じて、検体中の不安定型Ａ１ｃ濃度は増加する。

なお、上記表中の検体８のＤ−グルコース濃度は０ｍｇ／ｄＬであるが、これはＤ−グルコースを添加していない、通常検体そのままであることを意味する。また、泳動液Ｌｍ、希釈液Ｌｄ及び混合試料Ｓｍについては前記した実施例１と同様である。

［エレクトロフェログラム］
電圧を印加した時点を分離分析の開始の時点とし、電圧を印加した時点を０秒の時点としたエレクトロフェログラムを得た。グルコースが添加されていない検体８のエレクトロフェログラムは、図２４に示すとおりである。最離間点ＰＬが検出された界面到達時点は泳動時間１２．３秒付近である。また、ＨｂＦ分画である分画εは泳動時間１８．３秒付近にピークを有する。安定型Ａ１ｃ分画である分画βは泳動時間２２．１秒付近にピークを有する。ＨｂＡ０分画である分画αは泳動時間２８．４秒付近にピークを有する。そして、分画βより早い泳動時間２０．８秒付近にピークを有する分画γは、不安定型Ａ１ｃを含む分画とされているが、この分画にはカルバミル化を被ったＨｂＡ０、アルデヒド化を被ったＨｂＡ０も含まれる。また、分画αより早い泳動時間２６．３秒付近にピークを有する分画δには、ＨｂＡ０がカルバミル化又はアルデヒド化される際に生成される物質が含まれる。

Ｄ−グルコースがそれぞれ３７５ｍｇ／ｄＬ、７５０ｍｇ／ｄＬ、１１２５ｍｇ／ｄＬ及び１５００ｍｇ／ｄＬの濃度で添加されている検体９、検体１０、検体１１及び検体１２のエレクトロフェログラムは、それぞれ図２５、図２６、図２７及び図２８に示すとおりである。図２４〜図２８より、前記したカルバミル化、アルデヒド化の場合と同様、不安定型Ａ１ｃを作成するために用いるＤ−グルコースの濃度が増大するにつれて、分画γのピーク面積が増大していくことが認められる。分画δのピーク面積もわずかに増大していくが、その増大量は分画γよりも極めて低いことが認められる。このように、検体をＤ−グルコースで処理することで検体中の不安定型Ａ１ｃが高くなっても、分画δのピーク面積は大きくならない。一方、検体をカルバミル化、アルデヒド化で処理することで検体中のカルバミル化ＨｂＡ０量、アルデヒド化ＨｂＡ０量が増加すると、分画δのピーク面積は増加する。そのため、分画δのピーク面積を用いて補正をすることで、不安定型Ａ１ｃを含む検体の影響を受けずにカルバミル化、アルデヒド化の影響を適切に補正することができる。

［補正前値（Ｘ）の算出］
図２４〜図２８における分画βから、安定型Ａ１ｃピーク面積の割合としての補正前値（Ｘ）は、下記表１２に示すとおりに算出された。なお、補正前値（Ｘ）の算出方法については前記した実施例１と同様である。

上記表１２に示すとおり、検体中のグルコース濃度が高くなるにつれ、補正前量（Ｘ）が僅かに高くなっていくが、減少はしないことが認められる。また、検体８の補正前値（Ｘ）に対する増減の割合を示す相対誤差の値も、グルコース濃度が増大してもほとんど変化しない。これは、安定型Ａ１ｃ量はグルコースによって化学修飾をほとんど受けないことを示している。

［分画γによる補正］
次に、安定型Ａ１ｃとして同定される分画βに対し、正電荷量が低い側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画γを用いて、下記表１３に示すように補正前値（Ｘ）の補正を行った。

ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する分画γの面積の割合を、上記表１３中の左端列に挙げており、具体的には、検体８で１．８４％、検体９で３．５３％、検体１０で５．０８％、検体１１で６．７６％、及び検体１２で８．５３％であった。

この分画γのピーク面積の割合からは、前記した実施例１と同様の理由で３％が控除され、これが上記表１３中に示す修飾率（Ｐ）として掲げられている数値である。ここで、検体８における分画γは１．８４％でありこの３％を下回っているが、この場合は計算上、修飾率（Ｐ）が０であるものとして取り扱った。

この修飾率（Ｐ）を１から減じた値が上記表１３中の残存率（Ｑ、ただし百分率で表示）である。そして、補正前値（Ｘ）をこの残存率（Ｑ）で除して、上記表１３中の補正後値（Ｙ）を算出した。そして、補正後値（Ｙ）から、分画γを用いて補正した場合の相対誤差を算出した。すなわち、各検体の補正後値（Ｙ）から、検体８の補正前値（Ｘ）（表１２参照）を減じた値の、検体８の補正前値（Ｘ）に対する割合が上記表１３中の相対誤差である。

［分画δによる補正］
ＨｂＡ０として同定される分画αに対し、正電荷量が低い側、換言すると泳動速度が速い側で隣接する分画δを用いて、前記表１２の補正前値（Ｘ）の補正を行った場合について説明する。なお、この分画δによる補正では、前記実施例１と同様の理由から分画δのピーク面積の割合から４％が所定のピーク面積値として控除されている。そしてＨｂＡ０が化学修飾される際にともに生成される物質のピーク面積は、分画γに含まれるアルデヒド化ＨｂＡ０のピーク面積の約１．６５倍を示す。このことから分画δから４％が控除された値をこの所定の係数である１．６５で除することにより修飾率（Ｐ）を算出した。この他、残存率（Ｑ）、補正後値（Ｙ）及び相対誤差の算出は表１３と同様である。ただし、表１４中の補正後値（Ｙ）は、前記表１２中の補正前値（Ｘ）を表１４中の残存率（Ｑ）で除した値である。また、表１４中の相対誤差は、表１３と同様に、各検体の補正後値（Ｙ）から、検体８の補正前値（Ｘ）（表７参照）を減じた値の、検体８の補正前値（Ｘ）に対する割合である。

［不安定型Ａ１ｃの影響について小活］
以上の表１１〜表１４のまとめとして、各グルコース濃度で処理した検体を、分画γによる補正を行った場合と、分画δによる補正を行った場合とにおける相対誤差を下記表１５に掲げる。

上記表１５をグラフ化した図からも明らかなように、分画δを用いた補正は、分画γを用いた補正よりも相対誤差が小さくなった。これは、分画γのピーク面積は不安定型Ａ１ｃの影響を受けるのに対し、分画δのピーク面積は不安定型Ａ１ｃ量の影響を受けないからである。つまり、ＨｂＡ０が化学修飾される際に化学修飾されたＨｂＡ０とともに生成される物質を含む分画を用いた補正を行うことによって、不安定型Ａ１ｃを含む検体であっても正しく安定化Ａ１ｃを測定することができる。よって、当該補正を行う安定型Ａ１ｃの測定方法は、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画を用いた補正よりも、さらに有効であることが認められた。

本発明は、血中ヘモグロビンの分画のうち、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定する測定装置に利用可能である。

Ａ１ 分析システム
１ 分析装置
２ 分析チップ
２Ａ 上側部分
２Ｂ 下側部分
５ 検出器
６ 分注器
８ 制御部
２１ 本体
２２ 混合槽
２３ 導入槽
２４ フィルタ
２５ 排出槽
２６ 電極槽
２７ キャピラリー管
２８ 連絡流路
３１ 電極
３２ 電極
４１ 光源
４２ 光学フィルタ
４３ レンズ
４４ スリット
６１ ポンプ
７１ 希釈液槽
７２ 泳動液槽

このようにして、Ｓ３３１に示す総ヘモグロビン算出工程において、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積を算出する。ここで、ＨｂＡ０量は総ヘモグロビン量の大部分を占めている。そのため、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積は、ＨｂＡ０分画のみで算出した面積であってもよく、また、ＨｂＡ０分画とその周辺の分画を含む面積に準拠してもよく、さらには、エレクトロフェログラムのうちヘモグロビンに帰せられる領域の全ての面積としてもよい。いずれの場合も、後述する補正前値（Ｘ）及び補正後値（Ｙ）の計算には大きな影響は及ぼさない。

この修飾率（Ｐ）を１から減じた値が上記表中の残存率（Ｑ、ただし百分率で表示）であり、この割合で残存した安定型Ａ１ｃが、前記した表７中の補正前値（Ｘ）、すなわち分画βとしてエレクトロフェログラムに現れていると考えられる。よって、補正前値（Ｘ）をこの残存率（Ｑ）で除した値である、上記表８中の補正後値（Ｙ）は、ヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されずに残った安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積と化学修飾された安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の合計値の割合と考えられる。ここで、前記表７から、補正前値（Ｘ）に基づく相対誤差の絶対値は、検体７で最大の５．１％であったところ、上記表８から、補正後値（Ｙ）に基づく相対誤差（すなわち、各検体の補正後値（Ｙ）から、化学修飾の影響を受けていないと考えられる検体５の補正前値（Ｘ）（表７参照）を減じた値の、検体５の補正前値（Ｘ）に対する割合）の絶対値は、検体７で最大の０．８％であった。そのため、補正を行うことで、化学修飾されることによって生じる相対誤差の幅は小さくなった。

上記表１２に示すとおり、検体中のグルコース濃度が高くなるにつれ、補正前値（Ｘ）が僅かに高くなっていくが、減少はしないことが認められる。また、検体８の補正前値（Ｘ）に対する増減の割合を示す相対誤差の値も、グルコース濃度が増大してもほとんど変化しない。これは、安定型Ａ１ｃ量はグルコースによって化学修飾をほとんど受けないことを示している。

Claims (10)

1. 血中ヘモグロビンの分離分析における安定型Ａ１ｃの測定方法であって、
   前記分離分析で得られるヘモグロビンの時間分布における化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から、又はＨｂＡ０として同定される分画に対し、正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積から、ＨｂＡ０が化学修飾されずに残った割合である残存率を算出する工程、及び、
   前記ヘモグロビンの時間分布から得られた、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積又はヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、安定型Ａ１ｃを含む分画のピーク面積の割合を前記残存率で補正する工程、
   を含んでなる、安定型Ａ１ｃの測定方法。
2. 前記残存率は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積との合計値に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合である修飾率から算出される、請求項１に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
3. 前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積の割合である修飾率から算出される、請求項１に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
4. 前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、化学修飾されたＨｂＡ０を含む分画のピーク面積から所定のピーク面積値を控除した値の割合である修飾率から算出される、請求項１に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
5. 前記残存率は、ＨｂＡ０を含む分画のピーク面積と、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積を所定の係数で除して得られるピーク面積補正値との合計値に対する、前記ピーク面積補正値の割合である修飾率から算出される、請求項１に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
6. 前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積を所定の係数で除して得られるピーク面積補正値の割合である修飾率から算出される、請求項１に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
7. 前記残存率は、前記ヘモグロビンの時間分布におけるヘモグロビンを含む分画の全ピーク面積に対する、ＨｂＡ０として同定される分画に対し正電荷量が低い側に隣接する分画のピーク面積から所定のピーク面積値を控除した値をさらに所定の係数で除して得られるピーク面積補正値の割合である修飾率から算出される、請求項１に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
8. 前記化学修飾は、カルバミル化及びアルデヒド化のいずれか一方又は両方である、請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
9. 前記ヘモグロビンの時間分布は、クロマトグラムである、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。
10. 前記ヘモグロビンの時間分布は、キャピラリー電気泳動法で得られるエレクトロフェログラムである、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の安定型Ａ１ｃの測定方法。