JP2001228133A

JP2001228133A - ヘモグロビン類の測定方法

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Publication number: JP2001228133A
Application number: JP2000041181A
Authority: JP
Inventors: Yuji Setoguchi; 雄二瀬戸口; Kazuyuki Oishi; 和之大石; Kazuhiko Shimada; 一彦嶋田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2001-08-24

Abstract

(57)【要約】【課題】より短時間にしかも高精度に安定型ＨｂＡ１
ｃを測定することのできるヘモグロビン類の測定方法を
提供する。【解決手段】カチオン交換液体クロマトグラフィー
によるヘモグロビン類の測定方法において、ＨｂＡ１
ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ−ＨｂＡ１ｃ、Ｓ−ＨｂＡ
１ｃ及びＨｂＡ０の順序でヘモグロビン類を溶出させ、
ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＦの各ピークの最隣接
ピーク間の分離度が、０．８以下となるよう溶離条件を
設定することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビン類の
測定方法に関し、より詳細には安定型ヘモグロビンＡ１
ｃの測定を目的とした、カチオン交換液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘモグロビンＡ１ｃ（本明細書中ではＨ
ｂＡ１ｃと略す）は、すべてのヘモグロビンに対するそ
の構成比率が、過去１〜２カ月間の平均的な血糖値（血
液中のグルコース濃度）を反映しているため、糖尿病の
スクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握
する検査項目として繁用されている。

【０００３】ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモ
グロビンＡ（以下、ＨｂＡと略す）とが反応して生成さ
れた糖化ヘモグロビン( 以下、ＧＨｂと略す) であり、
可逆的に反応したものを不安定型ＨｂＡ１ｃ（unstable
HbA1c、本明細書中ではＬ−ＨｂＡ１ｃと略す）と呼
び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に反応したもの
を安定型ＨｂＡ１ｃ(stable HbA1c 、本明細書中ではＳ
−ＨｂＡ１ｃと略す) と呼んでいる。

【０００４】普通、ヘモグロビンは２種類のサブユニッ
ト２つずつから構成される４量体のタンパク質である。
ＨｂＡのサブユニットはα鎖とβ鎖であり、このβ鎖の
Ｎ末端アミノ酸にグルコースが結合したものがＨｂＡ１
ｃである。過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を良く反
映するのは安定型ＨｂＡ１ｃであり、臨床検査分野で
は、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）を得ることがで
きる測定法の開発が望まれている。

【０００５】従来、ＨｂＡ１ｃの主な測定法としては、
血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン
類を、カチオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異
なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロ
マトグラフィー（以下、ＬＣと略す）が用いられてき
た。（例えば、特公平８−７１９８号公報等）。

【０００６】カチオン交換ＬＣにより、十分な時間を掛
けて溶血試料中のヘモグロビン類を分離すると、通常は
ヘモグロビンＡ１ａ（本明細書中ではＨｂＡ１ａと略
す）及びヘモグロビンＡ１ｂ（本明細書中ではＨｂＡ１
ｂと略す）、ヘモグロビンＦ（本明細書中ではＨｂＦと
略す）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びヘ
モグロビンＡ０（本明細書中ではＨｂＡ０と略す）の順
に溶離されてくる。ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＡ
１ｃはＨｂＡが糖化されたＧＨｂ、ＨｂＦはα鎖とγ鎖
から成る胎児性ヘモグロビン、ＨｂＡ０はＨｂＡを主成
分とする一群のヘモグロビン成分であって、ＨｂＡ１ｃ
より強くカチオン交換カラムに保持される性質を有す
る。

【０００７】従来の技術では、Ｓ−ＨｂＡ１ｃからＬ−
ＨｂＡ１ｃを十分に分離することができないばかりでな
く、時にアセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂと略
す）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂと略
す）等の「修飾ヘモグロビン」がＳ−ＨｂＡ１ｃと重な
って溶離してくるという問題があった。また、上記Ｌ−
Ａ１ｃ及び修飾ヘモグロビンとＳ−Ａ１ｃを分離できる
方法が開発されているが測定時間が２．２分もかかる問
題があった（全自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ-
７２３ＧＨｂＶ型の基礎的検討：日本臨床自動化学会会
誌１９９６；２１；８４０- ８４３）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、より
短時間にしかも高精度にＳ−ＨｂＡ１ｃを測定するため
に、上述した従来技術の欠点を解消したヘモグロビン類
の測定方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明（以
下、本発明１という）は、カチオン交換液体クロマトグ
ラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、Ｈ
ｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ−ＨｂＡ１ｃ、Ｓ−
ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順序でヘモグロビン類を溶出さ
せ、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦの各ピークの最隣
接ピーク間の分離度が、０．８以下となるように溶離条
件を設定することを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法である。

【００１０】請求項２記載の発明（以下、本発明２とい
う）は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘ
モグロビン類の測定方法において、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ
１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ−ＨｂＡ１ｃ、Ｓ−ＨｂＡ１ｃ、Ｈｂ
Ａ０の順序でヘモグロビン類を溶出させ、ＨｂＡ１ａ、
ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ−ＨｂＡ１ｃの各ピークの最隣
接ピーク間の分離度が、０．８以下となるように溶離条
件を設定することを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法である。

【００１１】請求項３記載の発明（以下、本発明３とい
う）は、Ｌ−ＨｂＡ１ｃピークとＳ−ＨｂＡ１ｃピーク
との分離度、および／または、Ｓ−ＨｂＡ１ｃピークと
ＨｂＡ０ピークとの分離度が、それぞれ０．９以上とな
るように溶離条件を設定する請求項１または２記載のヘ
モグロビン類の測定方法である。

【００１２】請求項４記載の発明（以下、本発明４とい
う）は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘ
モグロビン類の測定方法において、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ
１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ−ＨｂＡ１ｃ、Ｓ−ＨｂＡ１ｃ、Ｈｂ
Ａ０の順序でヘモグロビン類を溶出させ、ＨｂＡ１ａの
溶出開始時からＬ−ＨｂＡ１ｃの溶出終了時までの時間
が、１検体測定時間の６０％以下となるように溶離条件
を設定することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法
である。

【００１３】請求項５記載の発明（以下、本発明５とい
う）は、請求項１〜４のいずれか１項記載のヘモグロビ
ン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有
し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を有する無機酸、
有機酸及び／またはこれらの塩を含む溶離液を用いるこ
とを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。

【００１４】以下、本発明の詳細について説明する。カ
チオン交換ＬＣにより、十分な時間をかけて溶血試料中
のヘモグロビン類を分離すると、通常、ＨｂＡ１ａ、Ｈ
ｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、Ｌ−ＨｂＡ１ｃ、Ｓ−ＨｂＡ１ｃ、
ＨｂＡ０の順にカラムから溶離されてくる。

【００１５】本発明１では、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、
ＨｂＦの各ピークの最隣接ピーク間の分離度、すなわ
ち、ＨｂＡ１ａピークとＨｂＡ１ｂピーク、ＨｂＡ１ｂ
ピークとＨｂＦピークの分離度が、０．８以下となるよ
うに溶離条件が設定される。

【００１６】本発明において、分離度は以下のように定
義される。分離度= １．１８×（ｔ₁−ｔ₂）／（ｗ₁＋ｗ₂）ｔ₁：遅いピークの保持時間、ｔ₂：早いピークの保持
時間ｗ₁：遅いピークの半値幅、ｗ₂：早いピークの半値
幅

【００１７】上記ＨｂＡ１ａピークとＨｂＡ１ｂピーク
の分離度の算出においては、遅いピークがＨｂＡ１ｂで
あり、早いピークがＨｂＡ１ａである。また、ＨｂＡ１
ｂピークとＨｂＦピークの分離度の算出においては、遅
いピークがＨｂＦで、早いピークがＨｂＡ１ｂである。

【００１８】上記溶離条件とは、後述の実施例のよう
に、溶離液のｐＨや塩濃度、溶出力が異なる２種以上の
溶離液の切替のタイミング、溶離液の送液時間や流速、
カラム温度等の各条件を意味し、これらの条件を適宜設
定することによって、本発明方法を実施することができ
る。

【００１９】上記溶離条件においては、溶出力の異なる
２種の溶離液を用い、この２種の溶離液を交互に送液す
るのが好ましい。交互に送液するとは、上記２種の溶離
液をＡ及びＢで表わすと、例えばＡ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ、
Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａの様に送液するこ
とを意味する。なお、溶出力の異なる３種以上の溶離液
を用い、これを順番に送液する溶離条件とすることも可
能である。

【００２０】本発明２では、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、
ＨｂＦ、Ｌ−ＨｂＡ１ｃの各ピークの最隣接ピーク間の
分離度が、０．８以下となるように溶離条件を設定す
る。具体的には、ＨｂＡ１ａとＨｂＡ１ｂの分離度、Ｈ
ｂＡ１ｂとＨｂＦの分離度、ＨｂＦとＬ−ＨｂＡ１ｃの
各ピーク間の分離度がそれぞれ０．８以下となるよう溶
離条件を設定する。本発明２の溶離条件については、上
記本発明１で例示したのと同様の各条件を挙げることが
できる。

【００２１】本発明３では、上記本発明１及び２の分離
条件に加え、Ｌ−ＨｂＡ１ｃピークとＳ−ＨｂＡ１ｃピ
ークとの分離度、及び、Ｓ−ＨｂＡ１ｃピークとＨｂＡ
０ピークとの分離度が、それぞれ０．９以上となるよう
溶離条件を設定する。本発明３の溶離条件も、上記本発
明１で例示したのと同様の各条件を例示することができ
る。

【００２２】本発明４では、ＨｂＡ１ａの溶出開始時か
ら、Ｌ−ＨｂＡ１ｃの溶出終了時までの時間が、１検体
測定時間の６０％以下となるよう溶離条件を設定する。
より本発明４の溶離条件も、上記本発明１で例示したの
と同様の各条件を挙げることができる。

【００２３】ここで、１検体測定時間とは、クロマトグ
ラム上でのＨｂＡ１ａの溶出開始時から、ＨｂＡ０の溶
出終了時までの時間を意味する。

【００２４】また、あるＨｂ成分の溶出開始時とは、当
該Ｈｂ成分ピークの保持時間の早い方の裾部分がクロマ
トグラム上に出現する時をいい、あるＨｂ成分の溶出終
了時とは、当該Ｈｂ成分ピークの保持時間の遅い方の裾
部分がクロマトグラム上に出現する時をいう。ここで上
記裾部分とは、ピークと基線との両接点部分を意味す
る。

【００２５】本発明５は、請求項１〜４のヘモグロビン
類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有
し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有
機酸及び／またはこれらの塩を含む溶離液を用いること
を特徴とする。

【００２６】上記カオトロピックイオンとは、化合物が
水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであ
り、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したとき
に起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。

【００２７】陰イオンのカオトロピックイオンとして
は、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チ
オシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、
ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化
物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオン
のカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カ
ルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カ
リウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン
等が挙げられる。

【００２８】上記カオトロピックイオンの中でも、陰イ
オンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イ
オン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸
イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオ
ン等を、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウム
イオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウ
ムイオン、グアニジンイオン等を用いるのが好ましい。
さらに、より好ましくは、チオシアン酸イオン、トリブ
ロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオ
ン、硝酸イオン、ヨウ化物イオン、グアニジンイオン等
が用いられる。

【００２９】上記溶離液中のカオトロピックイオンの濃
度が、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定にお
いて、分離効果が低下するおそれがあり、また、３００
０ｍＭよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ
以上向上しないので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ま
しく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、更に、１
０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。

【００３０】また、カオトロピックイオンは複数種混合
して用いても良い。上記カオトロピックイオンは、測定
試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に
添加しても良い。

【００３１】本発明５においては、溶離液に用いる緩衝
能を有する物質として、無機酸、有機酸またはこれらの
塩が含まれる。上記無機酸としては、例えば、炭酸、リ
ン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カ
ルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキ
シカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が
挙げられる。

【００３２】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸として
は、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられ
る。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−
ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が
挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミ
ノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン
等が挙げられる。

【００３３】上記無機酸または有機酸の塩としては、公
知のもので良く、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等
が挙げられる。

【００３４】上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、
複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合し
て用いても良い。

【００３５】上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの
塩の溶離液中の濃度、複数種用いる場合には複数種の合
計の濃度は、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝
作用があれば良く、１〜１０００ｍＭが好ましく、１０
〜５００ｍＭが特に好ましい。

【００３６】本発明５においては、上記溶離液のｐＨ
は、４．０〜６．８に限定され、好ましくは４．５〜
５．８である。溶離液のｐＨが４未満であると、ヘモグ
ロビン類が変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超え
ると、ヘモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン
交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が
悪くなる。

【００３７】上記溶離液には、以下の物質を添加しても
良い。

【００３８】（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特
に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭであ
る。

【００３９】（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基
を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、
硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、
水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。こ
れらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好まし
くは、０．００１〜５００ｍＭである。

【００４０】（３）メタノール、エタノール、アセトニ
トリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良
い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、
好ましくは０〜８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピッ
クイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない
程度で用いるのが好ましい。

【００４１】（４）アジ化ナトリウム、チモール等の防
腐剤を添加しても良い。

【００４２】（５）ヘモグロビンの安定剤として、公知
の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム
等の還元剤・酸化防止剤等を添加しても良い。

【００４３】本発明５における溶離液には、以下に示す
ような酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９の
範囲及び６．４０〜１０．５０の範囲にある緩衝剤を添
加することができる。上記緩衝剤として、ｐＫａを、
２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に
少なくとも一つずつもつ単一の物質を用いても良く、あ
るいは、２．１５〜６．３９の範囲に少なくとも一つの
ｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲に少な
くとも一つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤
として用いても良い。また、上記緩衝剤を複数組み合わ
せて用いても良い。

【００４４】上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的の
ピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近におい
て、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜
６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲が好ましく、
より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１
０．００の範囲である。さらに好ましくは、３．５０〜
６．２５及び７．００〜９．５０の範囲である。

【００４５】上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホ
ウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン
酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリ
ンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダ
ゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。ま
た、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、
カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジ
ン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピ
リジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリ
ン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。

【００４６】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。

【００４７】上記ジカルボン酸としては、例えば、マロ
ン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン
酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。

【００４８】上記カルボン酸誘導体としては、例えば、
β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，
５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビ
ン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙
げられる。

【００４９】上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられ
る。

【００５０】上記アニリンまたはアニリン誘導体として
は、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられ
る。

【００５１】上記アミノ酸としては、例えば、アスパラ
ギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−
アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられ
る。

【００５２】上記アミン類としては、例えば、エチレン
ジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエ
タノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類と
しては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシ
イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５
（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。

【００５３】上記アルコール類としては、例えば、２−
アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−
アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−
アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられ
る。

【００５４】また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モ
リホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）
メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）
イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビ
ス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロ
パン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセト
アミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、
３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸
（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリ
シルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシ
ン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰ
Ｓ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれる
ものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫ
ａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平
蛋白質・酵素の基礎実験法南江堂１９８５年）。

【００５５】

【表１】

【００５６】

【表２】

【００５７】溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用が
ある範囲であれば良く、好ましくは１〜１０００ｍＭ、
より好ましくは１０〜５００ｍＭである。また、上記緩
衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、
有機物と無機物を混合して用いても良い。

【００５８】本発明５においては、ｐＨの異なる少なく
とも２種類以上の上記溶離液を用いるのが好ましい。ま
た、その場合、測定目的のピークを分離するにあたって
用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用いるのが
好ましいが、溶離液を切り替える際の、（検出器出力
の）ベースライン変動が、測定値に悪影響を与えなけれ
ば、その必要はない。

【００５９】上記ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を、
勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良
い。

【００６０】ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン
類を分離するための溶離液のｐＨは、４．０未満である
と、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、６．８を
超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、陽イオン
交換基に保持されにくくなり、分離能が低下するので
４．０〜６．８が好ましく、４．５〜５．８がより好ま
しい。

【００６１】また、本発明では、ＨｂＡ０の溶出に際
し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填剤に保持された
ＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶出するために
は、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点
（ｐＨ６．８〜７．０、理化学辞典（第４版、１９８７
年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記
載）と等しいか、等電点よりアルカリ側になるように設
定した溶離液を用いるのが好ましい。これは、ヘモグロ
ビン類はｐＨが等電点よりアルカリ側になると、総荷電
がプラスからマイナスに変わるため、充填剤の陽イオン
交換基との「電気的反発力によってＨｂＡ０成分を溶
出」させることができるためである。この条件を満たす
ため、測定に用いる溶離液の内、少なくともひとつの溶
離液のｐＨが６．８以上であることが必要である。本溶
離液のｐＨは望ましくは７．０〜１２．０であり、７．
５〜１１．０がより好ましく、更には８．０〜９．５が
好ましい。溶離液のｐＨが６．８未満になるとＨｂＡ０
成分の溶出が不十分となる。溶離液のｐＨは、用いる充
填剤の分解が起こらない範囲に設定すれば良い。また、
上記溶離液は、カオトロピックイオンを含有することが
より好ましい。このカオトロピックイオンの種類につい
ては上述のものと同様のものが挙げられ、その濃度は、
１〜３０００ｍＭが好ましく、より好ましくは、１０〜
１０００ｍＭ、５０〜５００ｍＭが特に好ましい。

【００６２】上記ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられ
る、ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、
例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その
塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメ
チルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等の
ジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩
からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリ
ホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥ
ＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス
−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔ
ｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐ
ａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰ
ＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グ
リシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド
（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。ま
た、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴ
Ａ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダ
ゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルア
ミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエ
タノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等
の有機物も使用できる。

【００６３】また、無機酸；有機酸；無機酸または有機
酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、
有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。

【００６４】ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン
類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも
２種類以上用い、塩濃度勾配法やｐＨ勾配法またはこの
２つの組み合わせにより、安定型ＨｂＡ１ｃ等の測定対
象ピークをシャープに溶出させることも可能である。

【００６５】本発明においては、ＨｂＡ０よりも前に溶
出するヘモグロビン類（ＨｂＡ１ａ及びｂ、ＨｂＦ、Ｌ
−ＨｂＡ１ｃ、Ｓ−ＨｂＡ１ｃ）の溶出においては、少
なくとも２種類以上の溶離液を用いるのが好ましい。

【００６６】また、Ｓ−ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与
える可能性のあるＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等のヘモグ
ロビン成分を含む血液検体を測定する場合、ＨｂＡ０ピ
ークを、ＨｂＡ成分のピークと、それ以外の成分（Ｈｂ
Ａ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等）のピークとを分離し、先にＨ
ｂＡを溶出させ、それより後にＨｂＡ２、ＨｂＳ、Ｈｂ
Ｃ等を溶出させるように溶離条件を設定することが好ま
しい。これにより、ＨｂＡ０ピークからＨｂＡ以外のヘ
モグロビン成分を除けるため、より正確な安定型ＨｂＡ
１ｃ（％）を算出できる。

【００６７】本発明のヘモグロビン類の測定方法におけ
るカチオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少
なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よ
りなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換
基を導入することで得られる。

【００６８】該カチオン交換基は、公知のものでよく特
に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。

【００６９】上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２
０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。また、粒
度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平
均直径×１００）として、好ましくは４０％以下、より
好ましくは３０％以下である。

【００７０】上記高分子粒子としては、例えば、シリ
カ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。これらの粒子は、多孔性であっても非多
孔性であってもよい。上記高分子粒子は、導入されるイ
オン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが
好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高い
ものが好ましい。

【００７１】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応
でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこ
とができる。

【００７２】また、カチオン交換基を有する単量体を重
合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交
換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単
量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下
に重合する方法などが挙げられる。

【００７３】また、（メタ）アクリル酸メチル、（メ
タ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有
エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在
下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エス
テルをカチオン交換基に変換させてもよい。

【００７４】更に、特公平８−７１９７号公報に記載の
ように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基
を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、
該単量体を重合させても良い。

【００７５】上記充填剤はカラムに充填されて液体クロ
マトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知の
ステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されな
い。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長
さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０
ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填
剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用で
きるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例
えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたス
ラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することに
より行う。

【００７６】本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のも
ので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプ
ラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付
属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付
加されても良い。

【００７７】上記カラムの測定時の温度は、測定再現
性、分離度向上のため、20〜60℃に設定するのが良い。
更に、好ましくは、30〜60℃が良い。

【００７８】上記ＬＣ装置の、試料及び溶離液の流路上
にはフィルターを設けてもよい。このフィルターの材質
としてはイナートな素材を用いるか、あるいはフィルタ
ーの表面をイナートな素材で被覆するのが好ましい。上
記イナートな素材としては、セルロースエステル、セル
ロースアセテート、セルローストリアセテート、セルロ
ース、セルロースナイトレート、ポリテトラフルオロエ
チレン、ポリビニリデンジフロライド、ポリスルフォ
ン、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリ
エーテルスルホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフ
ッ化ビニリデン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化
物セラミック、炭化物セラミック、窒化物セラミック、
珪化物セラミック、硼化物セラミック、チタン等が挙げ
られる。また、これらの素材を複数種組み合わせて用い
てもよい。

【００７９】上記フィルター形状としは、メンブレンフ
ィルター、繊維を積層し焼結したもの、微粒子を焼結成
型したものなどが挙げられる。

【００８０】上記測定法における、他の測定条件として
は、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは
０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ
／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可
視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけでは
ない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有す
る物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したも
のを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により
異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。

【００８１】短時間でより高分離測定を行う場合は、以
下の（１）〜（１０）のような条件の装置を用いるのが
より好ましい。

【００８２】（１）装置の接液部（ポンプ、ポンプヘッ
ド、サンプラ、特に、試料が接する部位（配管、プレフ
ィルター：ホルダー、フィルター、カラム、検出器セ
ル、サンプルバイアルなど）は、イナートな素材（PEE
K、テフロン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのプ
ラスチック）を用いることが好ましい。（２）装置の接液部であるポンプ、ミキシングカラム、
サンプラ、配管、プレフィルター（ホルダー、フィル
ター）、カラム、検出器（セル）のデッドボリュームを
極めて小さくする方が好ましい。（３）ミキシングカラムの容量は、500 μl 以下が好ま
しく、250 μl 以下がより好ましい。（４）サンプラのインジェクションバルブ容量は10μl
以下が好ましく、より好ましくは5 μl 以下、特に好ま
しくは2 μl 以下である。（５）配管は内径0.25mm以下が好ましく、より好ましく
は0.13mm以下、特に好ましくは0.065mm 以下である。（６）配管長さは、サンプラ・プレフィルタ・カラム・
検出器などを配管で連結する場合、配管長さは、可能な
限り短い方が好ましい。（７）検出器セル容量は、20μl 以下が好ましく、より
好ましくは10μl 以下、特に好ましくは5 μl 以下であ
る。（８）送液ポンプは、脈流が極めて少なく安定した送液
が可能なものが好ましい。（９）移動相の流速は0.001 〜2ml/min が好ましく、よ
り好ましくは0.01〜1.8ml/min 、特に好ましくは0.03〜
1ml/min である。これは0.001ml/分より遅いと流速の精
度が悪くなり、2ml/分より早いと分離が悪くなるからで
ある。（１０）他の測定条件としては、公知の条件を用いるこ
とができる。検出は、415nm の可視光が好ましいが、特
にこれに限定されない。また、測定試料は、界面活性剤
など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された
溶血液（溶血試薬）を希釈したものを用いるのが好まし
いが、特にこれに限定されない。試料注入量は、希釈倍
率により異なるが、好ましくは0.1 〜100 μL 程度であ
る。

【００８３】

【実施例】以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定
されるものではない。

【００８４】（実施例１）充填剤の調製テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイ
ル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量
％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２
５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７
５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥し
た後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。

【００８５】充填剤のカラムへの充填得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒
子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３
０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌し
た。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０
ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入し
た。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続
し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ²で定圧充填した。

【００８６】ヘモグロビン類の測定得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビ
ン類の測定を行った。（測定条件）システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）カラム恒温槽：ＣＴＯ−１０Ａ（島津製作所社製）溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：６０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）測定開始より０〜０．４分の間は溶離液Ａを送液し、０．４〜０．８分の間は溶離液Ｂを送液し、０．８〜１．０分の間は溶離液Ａを送液し、１．０〜１．１分の間は溶離液Ｃを送液し、１．１〜１．５分の間は溶離液Ａを送液した。流速：２．０ｍＬ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μＬカラム温度：３５℃

【００８７】（測定試料）健常人血をフッ化ナトリウム
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモ
ノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１０
０）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液
（ｐＨ７．０）に防腐剤として０．０３％アジ化ナトリ
ウムを添加したものを用いた。ａ）糖負荷血：全血検体に５００ｍｇ／ｄＬのグルコー
ス水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上
記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ａと
した。ｂ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量
％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加
し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。ｃ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量
％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加
し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。

【００８８】（測定結果）上記測定条件により、試料を
測定して得られたクロマトグラムを図１〜３に示す。図
１は試料ａ、図２は試料ｂ、図３は試料ｃを測定した結
果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ、ピーク２はＨｂＡ１
ｂ、ピーク３はＨｂＦ、ピーク４は不安定型ＨｂＡ１
ｃ、ピーク５は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク６はＨｂＡ
０、ピーク７はＣＨｂ、ピーク８はＡＨｂを示す。

【００８９】図１では、ピーク４および５が良好に分離
されている。また、図２ではピーク７（ＣＨｂ）、図３
ではピーク８（ＡＨｂ）がピーク５から良好に分離され
ている。

【００９０】（実施例２）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同
様に良好であった。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸 −２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：６０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸 −２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）また、溶離液Ａ〜Ｃには、防腐剤として０．０３％アジ
化ナトリウムを添加した。

【００９１】（実施例３）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同
様に良好であった。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する１０ｍＭマレイン酸−４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：６０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する１０ｍＭマレイン酸−４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２００ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する１０ｍＭマレイン酸−４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）また、溶離液Ａ〜Ｃには、防腐剤として０．０３％アジ
化ナトリウムを添加した。

【００９２】（実施例４）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同
様に良好であった。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する１０ｍＭマレイン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：６０ｍＭの過塩素酸を含有する１０ｍＭマレイン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する８ｍＭマレイン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）

【００９３】（実施例５）溶離液の組成と送液条件を以
下のようにしたことの他は、実施例１と同様に操作して
ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラ
ムを図４〜６に示した。溶離液：溶離液Ａ：６２ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）（測定条件）測定開始より０〜０．１分の間は溶離液Ａ
を送液し、０．１〜０．３分の間は、溶離液Ｂを送液
し、０．３〜０．５の間は、溶離液Ａを送液し、０．５
〜０．６の間は、溶離液Ｃを送液し、０．６〜１．０の
間は、溶離液Ａを送液した。

【００９４】（実施例６）溶離液の組成と測定装置・測
定装置を以下のようにしたことの他は、実施例５と同様
に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたク
ロマトグラムを図７〜９に示した。溶離液：溶離液Ａ：６２ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）（測定条件）システム：送液ポンプ：イナートポンプ2001：NANOSPACE SI-1 （資生堂製）オートサンプラ：オートサンプラー2003（資生堂製）検出器：UV-VIS検出器2002（資生堂製）カラム恒温槽：カラム恒温槽2004（資生堂製）カラム温度は、４０℃設定測定開始より０〜０．１分の間は溶離液Ａを送液し、
０．１〜０．３分の間は、溶離液Ｂを送液し、０．３〜
０．５の間は、溶離液Ａを送液し、０．５〜０．６の間
は、溶離液Ｃを送液し、０．６〜１．０の間は、溶離液
Ａを送液した。実施例６で得られた結果を図７〜９に示
した。実施例５（図４〜６）に比べて、S-HbA1c ピーク
がシャープに分離された。

【００９５】（比較例１）溶離液の組成と送液条件を以
下のようにしたことの他は、実施例１と同様に操作して
ヘモグロビン類の測定を行った。溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：６０ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）また、溶離液Ａ〜Ｃには、防腐剤として０．０３％アジ
化ナトリウムを添加した。測定開始より０〜０．７分の
間は溶離液Ａを送液し、０．７〜１．６分の間は溶離液
Ｂを送液し、１．６〜１．９分の間は溶離液Ｃを送液
し、１．９〜２．２分の間は溶離液Ａを送液した。得ら
れたクロマトグラムを図１０〜１２に示す。図１０は試
料ａ、図１１は試料ｂ、図１２は試料ｃを測定した結果
である。図１０では、ピーク４および５が良好に分離さ
れている。また、図１１ではピーク７（ＣＨｂ）、図１
２ではピーク８（ＡＨｂ）がピーク５から良好に分離さ
れている。また、図１０〜１２では、図１〜３と異な
り、ピーク１〜４も良好に分離されているため、測定時
間が長くなっている。

【００９６】（分離度の比較）実施例１〜７と比較例１
において、ＨｂＡ１ａとＨｂＡ１ｂの分離度を分離度
Ｘ、ＨｂＡ１ｂとＨｂＦの分離度を分離度Ｙ、ＨｂＦと
Ｌ−ＨｂＡ１ｃ（不安定型Ａ１ｃ）の分離度を分離度Ｚ
を求めて表３に示した。実施例１〜７では、分離度Ｘ、
Ｙ及びＺは、０．４〜０．８であったが、比較例１で
は、分離度Ｘが０．９、分離度Ｙが１．０、分離度Ｚが
１．１であった。つまり、比較例１のように分離度Ｘ、
Ｙ、Ｚが０．８より大きいと、測定時間が２．２分と、
実施例の２倍以上の時間を要する結果となった。。

【００９７】

【表３】

【００９８】（安定型ＨｂＡ１ｃ値の比較）実施例１〜
７及び比較例１の条件で、試料ａ、ｂ、ｃの安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ値の測定を行い、表４に示した。実施例・比較例
ともに、全ての試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値は同一であ
り、実施例では比較例の１／２の時間で測定しているに
もかかわらず、実施例は、比較例と同一の測定精度を有
していることが分かった。

【００９９】

【表４】

【０１００】

【発明の効果】本願発明の測定方法によれば、従来の測
定方法の半分以下の測定時間で、従来と同等の精度でも
って安定型ＨｂＡ１ｃ値を測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図３】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図４】実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図５】実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図６】実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図７】実施例６の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図８】実施例６の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図９】実施例６の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図１０】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン
類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。

【図１１】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン
類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。

【図１２】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン
類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。

【符号の説明】

１ＨｂＡ１ａのピーク２ＨｂＡ１ｂのピーク３ＨｂＦのピーク４不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク５安定型ＨｂＡ１ｃのピーク６ＨｂＡ０のピーク７ＣＨｂのピーク８ＡＨｂのピーク

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 AA25 BB39 BB41 BB52 CA25 DA45 DA46 DA47 DA48 FA26 FA29 GC10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カチオン交換液体クロマトグラフィーによ
るヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１
ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）、不安定
型ヘモグロビンＡ１ｃ（Ｌ−ＨｂＡ１ｃ）、安定型ヘモ
グロビンＡ１ｃ（Ｓ−ＨｂＡ１ｃ）及びヘモグロビンＡ
０（ＨｂＡ０）の順序でヘモグロビン類を溶出させ、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＦの各ピークの最隣接
ピーク間の分離度が、０．８以下となるように溶離条件
を設定することを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法。
【請求項２】カチオン交換液体クロマトグラフィーによ
るヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１
ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）、不安定
型ヘモグロビンＡ１ｃ（Ｌ−ＨｂＡ１ｃ）、安定型ヘモ
グロビンＡ１ｃ（Ｓ−ＨｂＡ１ｃ）及びヘモグロビンＡ
０（ＨｂＡ０）の順序でヘモグロビン類を溶出させ、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ及びＬ−ＨｂＡ１ｃの
各ピークの最隣接ピーク間の分離度が、０．８以下とな
るように溶離条件を設定することを特徴とするヘモグロ
ビン類の測定方法。
【請求項３】Ｌ−ＨｂＡ１ｃピークとＳ−ＨｂＡ１ｃピ
ークとの分離度、および／または、Ｓ−ＨｂＡ１ｃピー
クとＨｂＡ０ピークとの分離度が、それぞれ０．９以上
となるように溶離条件を設定する請求項１または２記載
のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項４】カチオン交換液体クロマトグラフィーによ
るヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１
ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）、不安定
型ヘモグロビンＡ１ｃ（Ｌ−ＨｂＡ１ｃ）、安定型ヘモ
グロビンＡ１ｃ（Ｓ−ＨｂＡ１ｃ）及びヘモグロビンＡ
０（ＨｂＡ０）の順序でヘモグロビン類を溶出させ、ＨｂＡ１ａの溶出開始時からＬ−ＨｂＡ１ｃの溶出終了
時までの時間が、１検体測定時間の６０％以下となるよ
うに溶離条件を設定することを特徴とするヘモグロビン
類の測定方法。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項記載のヘモグ
ロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつｐＨ４．０〜６．
８で緩衝能を有する無機酸、有機酸及び／またはこれら
の塩を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビ
ン類の測定方法。