JP2000171454A

JP2000171454A - ヘモグロビン類の測定方法

Info

Publication number: JP2000171454A
Application number: JP10345497A
Authority: JP
Inventors: Yuji Setoguchi; 雄二瀬戸口; Kazuyuki Oishi; 和之大石; Kazuhiko Shimada; 一彦嶋田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2000-06-23

Abstract

(57)【要約】【課題】液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン
類の測定方法において、従来法より、より分離能が高い
方法を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフィーによるヘモグロ
ビン類の測定方法であって、カチオン交換基を有する平
均粒径０．１〜１０μｍの充填剤を内径０．１〜４ｍ
ｍ、長さ５〜２００ｍｍのカラム（例、内径１．５ｍ
ｍ、長さ５０ｍｍのカラム。内径２．０ｍｍ、長さ５０
ｍｍのカラム。内径３．０ｍｍ、長さ５０ｍｍのカラ
ム）に充填した液体クロマトグラフィー用カラムを用
い、移動相の流速が０．００１〜２ｍｌ／ｍｉｎで測定
することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】有機化学、生化学、医学などの分野にお
ける試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフが
汎用されている。この液体クロマトグラフは、通常、図
７のようなシステムに構成されている。溶離液などの移
動相１１が電磁弁１２を通り、送液ポンプ１３により試
料導入装置１４を経由して、フィルタ−装置１５を通り
分離カラム１６に入り、この分離カラム１６により試料
中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器１
７によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出
され、その結果がデーター処理装置１８により処理され
てクロマトグラム１９として表される。

【０００３】液体クロマトグラフィーによる測定の一つ
として、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビン
Ａ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標
となるため広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは
血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものであ
る。溶血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ
月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血液中
の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標となる。

【０００４】このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー
法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフ
ィー法により行われている（特公平８−７１９７号公報
など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフ
ィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以
下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以
下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、Ｈｂ
Ｆという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並
びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などの
ピークに分画できる。なお、糖尿病の診断の指標として
使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型Ｈｂ
Ａ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安
定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求めら
れている。

【０００５】このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー
法による測定は、具体的には、カラムとしてカチオン交
換液体クロマトグラフィー用充填剤（例えば、カルボキ
シル基やスルホン酸基を官能基として有する充填剤）が
充填されたものを用い、ｐＨ５．０〜９．０の溶離液を
用いて行われている。

【０００６】このカチオン交換液体クロマトグラフィー
によるヘモグロビン類の測定は測定時間の短縮化が図ら
れてきたが、分離能が悪いという問題があるため、更な
る短縮化ができないという問題点がある。

【０００７】そこで、ヘモグロビン分析において分離能
を上げるために以下の技術が提案されている。無機多孔性物質又は有機多孔性物質のいずれかに官能
基を導入した充填剤を充填した分離カラムと、分離カラ
ムに試料を注入する手段と、分離カラムからの溶離液の
吸光度を検出する手段とを具備し、液体クロマトグラフ
ィーにより、血液中のヘモグロビン、ヘモグロビン誘導
体又はグリコヘモグロビンを測定する液体クロマトグラ
フ装置において、分離能を上げるために、充填剤の乾燥
状態での平均粒径を４μｍ以下にする必要があることが
記載されている（特開平３−１０２２５９号公報）。また、特開平３−２５５３６０号公報には、非多孔性
カチオン交換体を用いた高速液体クロマトグラフィーに
よるグリコヘモグロビンの分離定量法であって、非多孔
性カチオン交換体の平均粒子径が１〜１０μｍである方
法が記載され、非多孔性充填剤を用いることにより短時
間でグリコヘモグロビン、特に不安定型ＨｂＡ１ｃと安
定型ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＦの精密分析を可能にしたとの
記載がある。

【０００８】このように、分離能を上げるために、充填
剤の粒子径やその種類などが検討されているが、分離に
用いるカラムの形状に関する検討は格別にはされていな
かった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
に鑑みてなされたものであり、その目的は、液体クロマ
トグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法におい
て、従来法より、より分離能が高い方法を提供すること
にある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、ヘモグロビン類の測定
方法において、カラムの形状を工夫することにより、従
来に比し分離が飛躍的に向上することを見出し、本発明
を完成させた。すなわち、本発明のヘモグロビン類の測
定方法は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン
類の測定方法であって、カチオン交換基を有する平均粒
径０．１〜１０μｍの充填剤を内径０．１〜４ｍｍ、長
さ５〜２００ｍｍのカラムに充填した液体クロマトグラ
フィー用カラムを用い、移動相の流速が０．００１〜２
ｍｌ／ｍｉｎで測定することを特徴とする。以下、本発
明の詳細を説明する。

【００１１】本発明のヘモグロビン類の測定方法に用い
られる液体クロマトグラフは、公知のものでよく、例え
ば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、
検出器などから構成されるものであり、他の付属装置
（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属さ
れていてよい。装置の接液部〔ポンプ、ポンプヘッド、
サンプラ、特に、試料が接する部位（配管、プレフィル
ター（ホルダー、フィルター）、カラム、カラム内のフ
ィルター、検出器セル、サンプルバイアルなど）〕は、
イナートな素材（ポリエーテルエーテルケトン、ポリテ
トラフロロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンな
どのプラスチックやチタンなど）を用いることが好まし
い。

【００１２】また、装置の接液部であるポンプ、ミキシ
ングカラム、サンプラ、配管、プレフィルター（ホルダ
ー、フィルター）、カラム及び検出器（セル）などのデ
ッドボリュームを可及的に小さくする方が好ましい。例
えば、ミキシングカラムは５００μｌ以下が好ましく、
２５０μｌ以下が特に好ましい。また、サンプラのイン
ジェクションバルブ容量は１０μｌ以下が好ましく、５
μｌ以下がより好ましく、２μｌ以下が特に好ましい。
また、配管は、内径０．２５ｍｍ以下が好ましく、０．
１３ｍｍ以下がより好ましく、０．０６５ｍｍ以下が特
に好ましい。また、サンプラ、プレフィルタ、カラム、
検出器などを配管で連結する場合、配管の長さは、可及
的短い方が好ましい。また、検出器（セル）の容量は、
２０μｌ以下が好ましく、１０μｌ以下がより好まし
く、５μｌ以下が特に好ましい。送液ポンプは、脈流が
極めて少なく安定した送液が可能なものが好ましい。

【００１３】本発明のヘモグロビン類の測定方法に用い
られる移動相の流速は、０．００１ｍｌ／ｍｉｎ未満に
なると流速の精度が悪くなり、２ｍｌ／ｍｉｎを超える
と分離が悪くなるので、０．００１〜２ｍｌ／ｍｉｎに
限定され、０．０１〜１ｍｌ／ｍｉｎが好ましい。

【００１４】本発明のヘモグロビン類の測定方法におい
て、他の測定条件としては、公知の条件でよく、検出は
４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれに限定され
るわけではない。測定試料は、界面活性剤など溶血活性
を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈
したものを用いるのが好ましいが、特にこれに限定され
るわけではない。試料注入量は、希釈倍率により異なる
が、好ましくは０．１〜１００μｌ程度であり、更に好
ましくは０．２〜５０μｌであり、特に好ましくは０．
３〜２０μｌである。

【００１５】本発明のヘモグロビン類の測定方法に用い
られる充填剤は、カチオン交換基を有する平均粒径０．
１〜１０μｍのものに限定される。平均粒径が０．１μ
ｍより小さくなると、粒度分布が悪くなり分離能の向上
が望めなくなる。また、平均粒径が１０μｍより大きく
なると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり、分
離能が悪くなる。上記平均粒径は０．２〜８μｍが好ま
しく、０．５〜５μｍが更に好ましい。

【００１６】本発明のヘモグロビン類の測定方法に用い
られる充填剤は、上記のように、少なくとも１種以上の
カチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、
例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで
得られる。

【００１７】該カチオン交換基は、公知のものでよく特
に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入されていても良
い。

【００１８】また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）
（粒径の標準偏差÷平均直径×１００）として、好まし
くは２０％以下、より好ましくは１５％以下である。

【００１９】上記高分子粒子としては、例えば、シリ
カ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。上記高分子粒子は、導入されるイオン交
換基以外の構成成分は、より親水性であることが好まし
い。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが
好ましい。

【００２０】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応
でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこ
とができる。また、カチオン交換基を有する単量体を重
合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交
換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単
量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下
に重合する方法などが挙げられる。また、（メタ）アク
リル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性
カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合
し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加
水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させて
もよい。更に、特公平８−７１９７号公報に記載のよう
に、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有
する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単
量体を重合させても良い。

【００２１】以下、本発明のヘモグロビン類の測定方法
に用いられるカラムについて説明する。本発明で用いら
れるカラムの内径は、０．１〜４ｍｍに限定される。内
径０．１ｍｍ未満になると、作業性が悪くなると共に、
分離能が悪くなり、内径４ｍｍを超えると、充填剤量が
多くなるだけでなく、分離能も悪くなる。好ましくは内
径０．２〜３．５ｍｍ、更に好ましくは内径０．５〜３
ｍｍである。本発明で用いられるカラムの長さは、５〜
２００ｍｍに限定される。長さ５ｍｍ未満になると、作
業性が悪くなると共に、分離能が悪くなり、長さ２００
ｍｍを超えると、充填剤量が多くなるだけでなく、分離
能も悪くなる。好ましくは長さ１０〜１００ｍｍであ
る。

【００２２】本発明で用いられるカラムの内径と長さの
組み合わせとしては、内径０．１〜４ｍｍ、長さ５〜２
００ｍｍに限定され、好ましくは、内径０．２〜３．５
ｍｍ、長さ１０〜１００ｍｍであり、更に好ましくは、
内径０．５〜３ｍｍ、長さ１０〜１００ｍｍである。

【００２３】カラムの素材は、例えば、ステンレスなど
の金属、ポリエーテルエーテルケトンなどのプラスチッ
ク、ガラスを用いることができる。また、カラムの充填
剤と接する部位を、イナートな素材（例えば、ポリエー
テルエーテルケトン、ポリエチレン、ポリテトラフロロ
エチレン、チタン化合物、珪素化合物、シリコーン樹
脂）を用いて製造したり、イナートな素材で被覆しても
良い。

【００２４】充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任
意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好まし
い。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩
衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラ
ムに圧入することにより行う。

【００２５】カラムフィルターについては、フィルター
の材質としては、例えば、ステンレス、銅、チタン、セ
ラミック、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属やナイ
ロン、ポリテトラフロロエチレン、セルロース、ポリス
ルホン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリ
エチレン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポ
リカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル、ポリエー
テルエーテルケトン、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、
ノリル樹脂などのプラスチックやガラスなどがある。フ
ィルターの形状は、メンブレンフィルター、繊維を積層
し焼結したもの、濾紙状のものなど特に限定されない。

【００２６】本発明のヘモグロビン類の測定方法に用い
られる溶離液について以下説明する。溶離液として用い
る緩衝液に用いられる試薬としては、例えば、リン酸、
ホウ酸、炭酸などの無機酸又はその塩；カルボン酸、ジ
カルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン
酸、カコジル酸、ピロリン酸などの有機酸又はその塩；
アニリン、アニリン誘導体、アミノ酸、アミン、イミダ
ゾール、ピリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン、グリシルグリシン、などの有機物が挙げられ
る。

【００２７】上記カルボン酸としては、酢酸、プロピオ
ン酸又はその塩などが挙げられる。上記ジカルボン酸と
しては、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン
酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸などが挙げられ
る。上記カルボン酸誘導体としては、β、β−ジメチル
グルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸などが挙げら
れる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、クエン酸、
酒石酸、乳酸などが挙げられる。上記アニリン誘導体と
しては、ジメチルアニリンが挙げられる。上記アミノ酸
としては、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシンな
どが挙げられる。上記アミンとしては、エチレンジアミ
ン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリ
エタノールアミンなどが挙げられる。上記イミダゾール
としては、イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾー
ル、２，５（４）−ジメチルイミダゾールなどが挙げら
れる。その他に、MES,HEPES,Bistris,TrisなどのGoodの
緩衝液なども挙げられる。

【００２８】本発明において、ＨｂＡ０より前の成分を
分離するための溶離液のｐＨは、４．０〜５．８が好ま
しい。溶離液のｐＨが４以下であると、ヘモグロビンが
変性する可能性があるので、好ましくない。また、ｐＨ
が５．８をこえると、ヘモグロビンのプラス荷電が減少
し、カチオン交換樹脂に保持されにくくなり、ヘモグロ
ビン類の分離が悪くなる。

【００２９】本発明において、ＨｂＡ０成分を溶出する
ための溶離液は、耐久性の向上と測定時間短縮のため、
ｐＨをヘモグロビンの等電点（ｐＨ＝６．８）よりアル
カリ側に設定するのが好ましい。

【００３０】本発明において、溶離液を測定途中で切り
替えたり、グラディエント溶出、ステップアップグラデ
ィエント溶出を行ってもよい。

【００３１】本発明において、溶離液として用いる緩衝
液の濃度は、水溶液状態で緩衝作用があれば良く、１〜
１０００ｍＭが好ましく、１〜５００ｍＭがより好まし
い。

【００３２】また、本発明において、溶離液として有機
酸、無機酸、又は、その塩は、複数混合して用いても良
い。例えば、有機酸と無機酸を混合しても良い。また、
緩衝液中の物質として、pKa 値が２．１５〜６．３９と
６．４０〜１３．００の両方にあるものを用いるのが好
ましい。より好ましくは２．８０〜６．２５と６．８０
〜１２．００、更に好ましくは３．５０〜６．１０と
７．００〜１１．００の両方にあるものである。この場
合、緩衝液組成として、複数の物質を含有している場合
でも、それぞれの物質のpKa 値が２．１５〜６．３９と
６．４０〜１３．００の両方にあれば良い。また、１種
類の物質で、pKa 値が２．１５〜６．３９と６．４０〜
１３．００の両方にある緩衝液でも良い。

【００３３】上記溶離液には、以下の物質を添加しても
よい。（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなど）を
添加してもよい。これらの塩類の濃度は、特に限定され
ないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。

【００３４】（２）カオトロピックイオンを添加しても
よい。カオトロピックイオンとは、水溶液に溶けると解
離して生じたイオンにより、水の構造が破壊され、疎水
性物質と水が接触したときに起こる、水のエントロピー
減少を抑制するもので、具体的には、陰イオンとして、
トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシ
アン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジク
ロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イ
オン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオンとし
ては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイ
オン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウム
イオン等が挙げられる。より好ましくは、陰イオンとし
て、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チ
オシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、
ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオンである。

【００３５】上記カオトロピックイオンの溶離液中の濃
度は、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定にお
いて、分離効果が低下し、また、３０００ｍＭよりも高
くてもヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しない
ので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜
１０００ｍＭがより好ましい。また、カオトロピックイ
オンは複数種混合して用いてもよい。

【００３６】（３）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基
を加えてもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、
硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、
水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウ
ム、水酸化ストロンチウム、水酸化セシウム、水酸化ニ
ッケル、水酸化アルミニウム、水酸化カドミウム等が挙
げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されな
いが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。（４）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセ
トンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの
有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０
〜８０％（ｖ／ｖ）であり、無機酸、有機酸、これらの
塩、無機塩類、カオトロピックイオン、ｐＨ調節剤など
が析出しない程度で用いるのが好ましい。（５）その他尿素、界面活性剤などを添加してもよい。

【００３７】（作用）本発明は、液体クロマトグラフィ
ーによるヘモグロビン類の測定方法であって、カチオン
交換基を有する平均粒径０．１〜１０μｍの充填剤を内
径０．１〜４ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのカラムに充填
した液体クロマトグラフィー用カラムを用い、移動相の
流速が０．００１〜２ｍｌ／ｍｉｎで測定することを特
徴とするヘモグロビン類の測定方法であり、特に、充填
剤を内径０．１〜４ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのカラム
に充填した液体クロマトグラフィー用カラムを用いてい
るので、本発明の方法を用いると、従来に比し分離が飛
躍的に向上する。

【００３８】

【発明の実施の形態】次に、実施例、比較例を挙げて本
発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にの
み限定されるものではない。実施例１（液体クロマトグラフィー用カラムの作製）充填剤の調製テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチル
スルホン酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物にベンゾ
イルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１．
５ｇを溶解した。これを、４重量％ポリビニルアルコー
ル（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散さ
せ、攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時
間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平
均粒径３μｍの粒子を得た。カラムの作製カラム１本あたり、上記充填剤１．０ｇを、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超
音波処理した後、よく攪拌した。これをステンレス製カ
ラム本体（内径１．５ｍｍ×長さ５０ｍｍ）を接続した
パッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー（梅谷
精機社製）に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、
上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体４０に圧力３
００ｋｇ／ｃｍ²で定圧充填した後、エンドフィッティ
ングとカラム本体を螺合して液体クロマトグラフィー用
カラムを製造した。

【００３９】（ヘモグロビン類の測定）得られたカラム
を用いて、ヘモグロビン類の測定を以下のようにして行
った。測定条件・システム：送液ポンプ：イナートポンプ2001：NANOSPACE SI-1（資
生堂社製）オートサンプラ：オートサンプラー2003（資生堂社製）検出器：UV-VIS検出器2002（資生堂社製）・溶離液：溶離液Ａ：７０ｍＭの濃度で過塩素酸を含有する５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）溶離液Ｂ：２００ｍＭの濃度で過塩素酸を含有する５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）測定開始より０〜１．５分の間は溶離液Ａを流し、１．
５〜２分の間は溶離液Ｂを流し、２〜３分の間は溶離液
Ａを流した。・流速：０．２５ｍｌ／分・検出波長：４１５ｎｍ・試料注入量：３μｌ

【００４０】測定試料健常人から、フッ化ナトリウム採血し以下の試料を調製
した。ａ）糖負荷血：上記の健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌと
なるようにグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間
反応させた後、溶血希釈液（０．１重量％の濃度でポリ
エチレングリコール−モノ−４−オクチルフェニルエー
テル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含む１
０ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）。以下、溶血希
釈液Ｘという）を、全血に対して１５０倍希釈となるよ
うに添加して溶血希釈して試料ａとした。ｂ）カルバミル化ヘモグロビン（ＣＨｂ）含有試料：上
記の健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナト
リウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で３時
間反応させた後、溶血希釈液Ｘを全血に対して１５０倍
希釈となるように添加して溶血希釈して試料ｂとした。ｃ）アセチル化ヘモグロビン（ＡＨｂ）含有試料：上記
の健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒ
ドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間反応
させた後、溶血希釈液Ｘを全血に対して１５０倍希釈と
なるように添加して溶血希釈して試料ｃとした。

【００４１】測定結果図１は試料ａを測定して得られたクロマトグラム、図２
は試料ｂを測定して得られたクロマトグラム、図３は試
料ｃを測定して得られたクロマトグラムを示す。図１〜
３（及び後述の図４〜６）において、ピーク１はＨｂＡ
１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不
安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピー
ク５はＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂ
を示す。図１では、ピーク３及び４が良好に分離されて
おり、また、図２ではピーク６（ＣＨｂ）が、図３では
ピーク７（ＡＨｂ）が、それぞれピーク４から良好に分
離されていることがわかる。

【００４２】実施例２、３充填剤種類としては実施例１と同様のものを用い、充填
剤の平均粒径、カラム内径、カラム長さ、流速を表１に
示したように変えたことの他は、実施例１と同様に行っ
た。

【００４３】

【表１】

【００４４】（測定結果）実施例２、３のいずれにおい
ても、試料ａを測定して得られたクロマトグラムは図１
と、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムは図２
と、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムは図３と
同様であった。

【００４５】比較例１〜３充填剤種類としては実施例１と同様のものを用い、充
填剤の平均粒径、カラム内径、カラム長さを表２に示し
たように変えたこと、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの通流時
間を、実用的な時間内において、各ピークの分離ができ
るだけシャープになるように変えたこと、並びに、流
速を、実用的な流速において、各ピークの分離ができる
だけシャープになるように変えたこと、の他は、実施例
１と同様に行った。

【００４６】

【表２】

【００４７】（測定結果）図４は比較例１〜３の方法に
て試料ａを測定して得られたクロマトグラム、図５は比
較例１〜３の方法にて試料ｂを測定して得られたクロマ
トグラム、図６は比較例１〜３の方法にて試料ｃを測定
して得られたクロマトグラムを示す。図４〜６より、比
較例１〜３の方法にて測定すると、実施例１〜３の方法
にて測定した場合に比べて、ピーク１〜７の分離が悪い
ことがわかる。

【００４８】

【発明の効果】本発明のヘモグロビン類の測定方法の構
成は、上記の通りであり、本発明によると、従来法より
ヘモグロビン類の分離能が良好になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】試料ａを測定して得られたクロマトグラムを示
す図。

【図２】試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを示
す図。

【図３】試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを示
す図。

【図４】試料ａを測定して得られたクロマトグラムを示
す図。

【図５】試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを示
す図。

【図６】試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを示
す図。

【図７】液体クロマトグラフのシステムの構成を示す説
明図。

【符号の説明】

１ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂのピーク２ＨｂＦのピーク３不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク４安定型ＨｂＡ１ｃのピーク５ＨｂＡ０のピーク６ＣＨｂのピーク７ＡＨｂのピーク１１移動相１２電磁弁１３送液ポンプ１４試料導入装置１５フィルタ−装置１６分離カラム１７検出器１８データー処理装置１９クロマトグラム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 AA01 AA13 BB01 BB14 BB39 BB41 BB48 BB50 BB51 CA25 DA46 DA47 DA48 DA49 FA26 FA29 FB06 GC10 HA09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体クロマトグラフィーによるヘモグロ
ビン類の測定方法であって、カチオン交換基を有する平
均粒径０．１〜１０μｍの充填剤を内径０．１〜４ｍ
ｍ、長さ５〜２００ｍｍのカラムに充填した液体クロマ
トグラフィー用カラムを用い、移動相の流速が０．００
１〜２ｍｌ／ｍｉｎで測定することを特徴とするヘモグ
ロビン類の測定方法。