JP3975017B2 - 液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィーを用いてヘモグロビン類を測定する場合、一般的に、カチオン交換カラムを用い、溶離液の溶出力を変化させながらヘモグロビン(Hb)類の分離を行う(特公平8−7198号公報等参照)。通常、溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーで分離すると、ヘモグロビンA1a(以下HbA1aという)及びヘモグロビンA1b(以下HbA1bという)、ヘモグロビンF(以下HbFという)、不安定型ヘモグロビンA1c(以下、不安定型HbA1cという)、安定型ヘモグロビンA1c(以下、安定型HbA1cという)、ヘモグロビンA0(以下HbA0という)の順に溶出する。
【0003】
一般に、HbA1a及びHbA1bから安定型HbA1cの溶出までは溶出力の比較的弱い溶離液(第1液)が用いられ、HbA0の溶出には、測定時間の短縮とカラムの劣化防止のために、第1液と比較して極端に溶出力の強い液(第2液)が用いられる。従来、複数検体を連続測定する場合においては、HbA0を全て溶出させ1検体の測定が完了した後、第1液によってカラム内が平衡に達するのを待って、次の検体の測定に入ることが行われてきた。これは第1液によってカラム内が完全に平衡に達しないまま次の検体の測定に入ると、溶出順序が早い成分(HbA1aやHbA1b)だけでなく、安定型HbA1cの分離も悪くなると考えられていたためである。しかしながら、カラム内が第1液で完全に平衡に達するのを待ってから次の検体の測定に入ると、1検体の測定に長時間を要し迅速な連続測定の妨げとなるという問題があった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記に鑑み、複数検体を連続測定する場合において測定時間を短縮することが可能な、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
請求項1記載の発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーにより、ヘモグロビン類を含有する複数の検体を連続的に測定する方法において、1検体の測定に溶出力の異なる2種以上の溶離液を用い、N番目(Nは1以上の整数)の検体の測定後、N+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達する前に、N+1番目の検体をインジェクションすることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【0006】
請求項2記載の発明は、N+1番目の検体中のヘモグロビンA1a及びA1bを分離する際に、N+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類の測定方法である。
【0007】
本発明においては、1検体の測定に溶出力の異なる2種以上の溶離液を用いる。溶出力の異なる溶離液としては、例えば、pHまたは塩濃度のうち少なくとも一方が異なる緩衝液を用いることができる。溶出法としては、勾配溶出法、段階溶出法のどちらを用いてもよい。
【0008】
1検体の測定に溶出力の異なる2種の溶離液を用いる場合においては、例えば次のような第1液および第2液を用いることができる。但し、溶離液の種類は、2種に限定されるわけではない。
【0009】
HbA0より前に溶出する成分を分離するための溶離液(第1液)のpHは、4.0〜6.0が好ましい。溶離液のpHが4未満であると、ヘモグロビンが変成する可能性があり、pHが6.0を超えるとヘモグロビンの陽電荷が減少し、カチオン交換樹脂に保持されにくく、分離能が低下するために好ましくない。また、第1液として、pHが上記範囲内にあり、pHが異なる2種以上の溶離液を用いてもよい。
【0010】
HbA0成分を溶出するための溶離液(第2液)は、カラムの耐久性の向上と測定時間短縮のために、実際にカラムを通過するときのpHがヘモグロビンの等電点(pH6.8)よりアルカリ性側になるように設定する。第2液のpHは、7.0〜10が好ましく、より好ましくは7.5〜10である。pHが7.0より低いと、カラムを通過する時のpHが6.8以上に到達せず、10よりも高いと充填剤が分解する恐れがあるためである。また、第2液として、pHが上記範囲内にあり、pHが異なる2種以上の溶離液を用いてもよい。
【0011】
上記溶離液としては、例えば、リン酸系、ホウ酸系、炭酸系等の無機酸またはその塩の他、クエン酸系、β,β−ジメチルグルタル酸系、酢酸系、コハク酸系、フタル酸系、カコジル酸系、マレイン酸系等の有機酸またはその塩よりなる緩衝液を用いることができる。その他、MES、HEPES、Bis−Tris等のGood’sの緩衝液も使用できる。
【0012】
上記緩衝液の濃度は、緩衝作用がある範囲であればよく、0.1mM〜1000mMが好ましく、より好ましくは1mM〜500mMである。
【0013】
上記緩衝液には、適宜、無機塩類、カオトロピックイオン、pH調節剤、水溶性有機溶媒等を添加してもよい。
【0014】
上記無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、1〜1500mMである。
【0015】
上記カオトロピックイオンとは、水溶液に溶けると解離して生じたイオンにより、水の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するもので、具体的には、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等がある。また、陽イオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン等がある。
【0016】
上記pH調節剤としては、公知の酸または塩基を用いることができ、酸としては、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等がある。また、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化ストロンチウム、水酸化セシウム、水酸化ニッケル、水酸化アルミニウム、水酸化カドミウム等がある。これらの酸、塩類の濃度は特に限定されないが、好ましくは0.001〜500mMである。
【0017】
上記水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等を用いることができる。緩衝液中の濃度としては、特に限定されないが、好ましくは10〜80%(v/v)である。
【0018】
本発明はヘモグロビン類を含有する複数の検体を連続的に測定する方法に関するものであり、N番目(Nは1以上の整数)の検体の測定後、N+1番目検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達する前に、N+1番目の検体のインジェクションを行う。
【0019】
上記N番目の検体の測定とは、N番目の検体のインジェクションを行った後、N番目の検体中のHbA0が完全に溶出するまでを意味する。また、上記のN+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液とは、溶出力の異なる2種以上の溶離液のうち、1検体の測定の一番目に用いる溶離液である。
【0020】
本発明において、N+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していないことは、例えば、カラムから流出する溶離液のpHあるいは電気伝導度を測定することにより確認することができる。
【0021】
本発明においては、N+1番目の検体中のヘモグロビンA1a及びA1bを分離する際にのみ、N+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることがより好ましい。これは、N+1番目の検体中のヘモグロビンA1a及びA1bを分離する際にN+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることにより、HbA1aとHbA1bが充分に分離されずに溶出してしまうが、これらの成分の分離定量は臨床的に意義が認められておらず、分離されずにまとめて溶出しても特に問題はないためである。このことにより、安定型HbA1cを分析する場合においても、より迅速に連続測定を行うことができる。
【0022】
本発明で用いる液体クロマトグラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置(サンプラ)、カラム、検出器などから構成され、他の付属装置(カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など)を適宜付属してもよい。
【0023】
本発明で用いる液体クロマトグラフにおいて、溶離液の流速は、好ましくは0.05〜5ml/分、より好ましくは0.2〜3ml/分である。
【0024】
本発明で用いる液体クロマトグラフにおいて、測定試料の検出は、415nmの可視光を用いるのが好ましいが、特に限定されるわけではない。
【0025】
上記測定試料としては、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いるのが好ましいが、特に限定されるわけではない。
【0026】
上記試料試料の注入量としては、希釈倍率によって異なるが、好ましくは0.1〜100μl程度である。
【0027】
本発明におけるカラムの充填剤としては、カチオン交換基をもち、粒径が0.1〜10μmのものを用いるのが好ましい。粒径が0.1μmよりも小さいものは、圧力が高くなり、また、粒径が10μmよりも大きくなると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり、分離能が悪くなるためである。
【0028】
上記カチオン交換液体グロマトグラフィーにおいて、充填剤は、少なくとも1種以上のカチオン交換基を有している粒子より成るものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【0029】
上記カチオン交換基は、公知のものでよく、特に制限はなく、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸機等のカチオン交換基が挙げられる。また、カチオン交換基は、複数種導入してもよい。
【0030】
上記粒子の直径は、好ましくは、0.1〜10μm、より好ましくは、0.2〜8μmである。粒度分布は、変動係数値(CV値)(粒径の標準偏差/平均直径×100)として、好ましくは、20%以下、より好ましくは、15%以下である。
【0031】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子;セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子;ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子等が挙げられる。高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また、耐圧性、耐湿潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【0032】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する交換基(水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など)に、化学反応でイオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によっても本発明のカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
また、(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合したあと、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に交換させてもよい。
【0033】
更に、特公平8−7197号公報記載のように、架橋性重合体粒子を調製したあと、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合性粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【0034】
上記カラムの素材は、ステンレスなどの金属、PEEKなどのプラスチック、ガラスを用いることができる。また、カラムの充填剤と接する部分をイナートな素材、例えば、PEEK、ポリエチレン、テフロン、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜で被覆してもよい。
【0035】
上記充填剤の充填は、公知の任意の方法、例えば、スラリー充填法を用いるのが好ましい。充填剤粒子を溶離液などの緩衝剤に分散させ、スラリーとして、送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行うことができる。
【0036】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【0037】
(測定試料)
健常人血をNaF採血し、溶血希釈液(0.1%トリトンX−100のリン酸緩衝液溶液(pH7.0))で溶血し、150倍に希釈して測定試料とした。
【0038】
(実施例1)
以下の条件で、上記試料の測定を行った。
【0039】
(比較例1)
測定条件を以下の通りにしたこと以外は、実施例1と同様に測定を行った。
・測定条件:測定開始より0〜3分の間は溶離液Aを、3〜3.2分の間は溶離液Bを、3.2〜5分の間は溶離液Aを流した。
【0040】
(測定結果)
実施例1により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図1に、比較例1により試料を測定して得られたクロマトグラムを図2に示した。
図1と図2を比較すると、比較例1では、測定時間が5分であるのに対し、実施例1では、測定時間は3.5分と短いにもかかわらず、両者は同等の分離能をもつことが分かる。
【0041】
【発明の効果】
本発明により、HbA1a及びHbA1bの成分を完全に分離せずまとめて溶出させることができるので、検体の連続測定において測定時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1の測定条件により、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図
【図2】 比較例1の測定条件により、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図
【符号の説明】
1…HbA1aおよびHbA1bのピーク
2…HbFのピーク
3…不安定型HbA1cのピーク
4…安定型HbA1cのピーク
5…HbA0のピーク
Claims (2)
- カチオン交換液体クロマトグラフィーにより、ヘモグロビン類を含有する複数の検体を連続的に測定する方法において、1検体の測定に溶出力の異なる2種以上の溶離液を用い、N番目(Nは1以上の整数)の検体の測定後、N+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達する前に、N+1番目の検体をインジェクションすることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- N+1番目の検体中のヘモグロビンA1a及びA1bを分離する際に、N+1番目の検体の測定の最初に用いる溶離液によってカラム内が平衡に達していない状態とすることを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類の測定方法。
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