JP2007040857A - 液体クロマトグラフ分析方法,液体クロマトグラフ装置、及び分析用プログラム - Google Patents
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Abstract
本発明は、分析サイクル時間を短縮化等に関する。
【解決手段】
本発明は、液体クロマトグラフ分析において、試料注入から次の試料注入までのサイクル時間を一定とし、カラムが溶離液により平衡化する前に試料を注入することに関する。各注入分析サイクルにおける溶離液の切り替えタイミングおよびサンプル注入のタイミングを同期させることにより、カラムが必ずしも平衡状態に至らなくとも、各成分ピークの保持時間が比較的再現性良く溶出される性質を応用したものである。
【選択図】図1
Description
71660号公報がある。また、報告文として、Journal of Chromatography, 224; 315-321(1981) “Resolution of 52 ninhydrin-positive compounds with a High-speed
amino acid analyzer”,Clinical Chemistry 43; 8, 1421- 1428 (1997) “Amino Acid
determination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography:
performance of Hitachi L-8500A”がある。
従来からイオン交換クロマトグラフィーを用いるアミノ酸分析法では、イオン交換カラムを約0.1mol/Lの水酸化ナトリウムもしくは水酸化リチウムの再生液で洗浄した後、クエン酸ナトリウムか、またはクエン酸リチウム溶離液を十分な時間を送液して、カラムを平衡化していた。再生液から溶離液に切り替えてサンプルを注入するまでの、所謂、カラム平衡化液量は、表1に示すように従来例PF−94法では9.5ml(流量:0.56ml/min、送時間:17分間)であった。カラムは、内径5.4mm長さ50mm相当であり、容積は1.1mlとなる。平衡化液量は、カラム容積で規格化すると、カラム容積の8.4倍量を送液している換算になる。イオン交換樹脂の場合、充填剤内部まで溶離液が浸透するため、カラム内の空隙率は考慮しないものとする。カラム容器中の再生液を溶離液の送液により置き換えていく場合、送り込んだ溶離液が速やかにカラム容器内で一様になるモデルでは、自然対数の底eの累乗に反比例した比率で再生液が残る。即ち、前述の例では、カラム容積の8.4倍量を送液すれば、e−8.4=0.000225=0.0225%の再生液しかカラム内に残っていない計算になる。
PH)と生体液分析法(以下PF)について、カラム内の液体を再生液から第1緩衝液に置き換えたときの、再生液残存率を表1に示す。尚、カラム内体積をV(mL)、カラム再生後次の試料注入までに送液される第1緩衝液の送液体積をVRI(mL)とあらわすとき、カラム内の再生液残存率R(%)は数式1で示される。また、PFS−75法、及びPFS−94法で使用する緩衝液のリチウムイオン濃度及びpH等を表2に示す。
(表1参照)であるにもかかわらず、第1注入分析と第2注入分析での保持時間を一致させることができた。
6.8と大きい(表1参照)。
分析プログラムはカラムに吸着した成分を分離する溶出工程,強アルカリの再生液によってカラムを再生するカラム再生工程,引き続き行われる分析に備えるための第1緩衝液でカラムを平衡化するカラム平衡化工程から構成される。また、分析プログラムはポンプの流速,カラムオーブンの温度等も時間軸に沿って指定するものである。
(1)2つの分析プログラム間でポンプ流速の設定値が等しくない場合、分析プログラムの繋ぎ目で圧力変動が起こる。これはカラム寿命に対して負の方向に作用する。(2)分析プログラムの繋ぎ目でカラムオーブンの温度設定値が一致しない場合、カラムがカラム外から受け取るエンタルピー量の再現性が低下するため、成分ピークの保持時間再現性が低下する。
minから0.400mL/minへ、ポンプ2の流速設定値を0.400mL/minから0.350
mL/minへリニアグラジエントによって繋いだ。この接続プログラムを挿入することによって、分析プログラムBのRGが実行される前に、ポンプの流速及びカラムオーブン温度が分析プログラムBのRG工程初段のポンプ流速設定値、及びカラムオーブン温度設定値へとリニアグラジエントプログラムを用いて直線的に接続され、正常な状態で分析プログラムBをRGスタートすることによって、再現性よく連続分析することが可能となる。
Claims (6)
- 注入から次の注入までのサイクル時間を一定とし、カラムが溶離液により平衡化する前に試料を注入することを特徴とする液体クロマトグラフ分析方法。
- 再生液を用いるイオン交換クロマトグラフ分析方法であり、
サンプルを溶離分析する工程と、再生液を送液する工程と、再生液送液後に再度、溶離液を送液する工程と、送液を再生液から溶離液に切り替えてからカラム内容積の4.6 倍以下の体積の溶離液を送液する工程を備え、不十分なカラム平衡化状態で次のサンプルを注入することを特徴とする請求項1記載の液体クロマトグラフ分析方法。 - 液体クロマトグラフ装置であって、
注入から次の注入までのサイクル時間を一定とし、カラムが溶離液により平衡化する前に試料を注入することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 - 請求項3記載の液体クロマトグラフ装置であって、
再生液を用いるイオン交換クロマトグラフ装置であり、
サンプルを溶離分析する工程と、再生液を送液する工程と、再生液送液後に再度、溶離液を送液する工程と、送液を再生液から溶離液に切り替えてからカラム内容積の4.6 倍以下の体積の溶離液を送液する工程を備え、不十分なカラム平衡化状態で次のサンプルを注入することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 - 液体クロマトグラフ装置であって、
第一グラジエント溶出プログラムから第二グラジエント溶出プログラムに移行する間に挿入する接続用グラジエント溶出プログラムに、第一グラジエント溶出プログラムおよび第二グラジエント溶出プログラムそれぞれの構成要素を含めた接続用グラジエント溶出プログラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 - 液体クロマトグラフ装置に用いる分析用プログラムであって、
第一グラジエント溶出プログラムから第二グラジエント溶出プログラムに移行する間に挿入する接続用グラジエント溶出プログラムと、
第一グラジエント溶出プログラムおよび第二グラジエント溶出プログラムそれぞれの構成要素を含めた接続用グラジエント溶出プログラムとを含む分析用プログラム。
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