JP5002659B2 - 液体クロマトグラフ装置、および分析用プログラム - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフ分析法に関する。

液体クロマトグラフ装置の一例として、高速アミノ酸分析計を用いて説明する。アミノ酸分析計は大別して、タンパク質加水分解物アミノ酸約２０成分を対象とした標準分析法と、生体液アミノ酸類縁物質約４０成分またはそれ以上の成分を対象とした生体液分析法を行うものに分類できる。

生体液分析法の例としては、特開昭５３−６０２９１号公報，特開昭５９−１０８４９号公報，特開平４−１９４５７０号公報，特開平９−８００３７号公報，特開２００２−７１６６０号公報がある。また、報告文として、Journal of Chromatography, 224; 315-321(1981)“Resolution of 52 ninhydrin-positive compounds with a High-speed amino acid analyzer”，Clinical Chemistry 43; 8, 1421-1428(1997)“Amino Acid determination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography: performance of Hitachi L-8500A”がある。

特開昭５３−６０２９１号公報 特開昭５９−１０８４９号公報 特開平４−１９４５７０号公報 特開平９−８００３７号公報 特開２００２−７１６６０号公報

Journal of Chromatography, 224; 315-321(1981)"Resolution of 52 ninhydrin-positive compounds with a High-speed amino acid analyzer" Clinical Chemistry 43; 8, 1421- 1428(1997)"Amino Acid determination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography:performance of Hitachi L-8500A"

液体クロマトグラフ分析法では、高速に分析することがひとつの重要課題である。一般に液体クロマトグラフィーでは、第一溶離液によりカラムを十分に平衡化してからサンプルを注入しクロマトグラムを得る。これは、カラムが十分に平衡化していない場合、各成分の保持時間が不安定になり、結果的には良好な定量再現性が得られないことになってしまうからである。

本発明は、分析サイクル時間を短縮化と、２種の異なる分析法プログラムを速く接続すること等に関する。

本発明は、液体クロマトグラフ分析において、試料注入から次の試料注入までのサイクル時間を一定とし、カラムが溶離液により平衡化する前に試料を注入することに関する。各注入分析サイクルにおける溶離液の切り替えタイミングおよびサンプル注入のタイミングを同期させることにより、カラムが必ずしも平衡状態に至らなくとも、各成分ピークの保持時間が比較的再現性良く溶出される性質を応用したものである。

好ましくは、保持時間が不安定になることを防止するために、ステップワイズ溶出法またはグラジエント溶出法の溶離液切り替えタイミングを一定間隔とし、なおかつサンプル注入の間隔を溶出法の溶離液切り替えタイミングに同期させる。

また、好ましくは、２種の異なる分析法プログラムの接続において、前に実行するプログラムの末尾と、後に実行するプログラムの先端の要素を取り上げ、最速接続用中間プログラムを作成する。最速接続用中間プログラムは、前の実行プログラムが分析対象となる最終ピークを溶出した時点で、前の実行プログラムを終了する。即、後方プログラムの末尾部分を切り出し送液する。最速接続用中間プログラムは、この前方プログラムの中断終了から後方プログラムの末尾の切り出しプログラムとの間に挿入される。

分析サイクル時間の短縮化について、カラムが第一溶離液に十分置き換わらなくとも、切り替え時間を一定にすることにより、溶離液の置き換わりの程度は一定に繰り返されることで、各成分の保持時間再現性が良好に得られる。良好な保持時間再現性が得られれば、結果として溶離液切り替えおよび注入タイミングの同期は良好な定量再現性も得られる効果がある。

２種の異なる分析法プログラムの接続については、効率よく、前方プログラムを終了し、後方プログラムの末尾を立ち上げることにより、最速な分析法の遷移を実現することができる。

装置構成図。 ＰＦＳ−９４法によって得られるクロマトグラム。 ＰＦＳ−７５法によって得られるクロマトグラム。 分析プログラムＡ。 分析プログラムＢ。 最速接続中間プログラム使用例。 最速接続中間プログラム。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。

図１は、本実施例のアミノ酸分析計の装置構成及び流路説明図である。１〜４はそれぞれ第１〜第４緩衝液、５はカラム再生液である。この中から電磁弁シリーズ６によって何れかの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ７によってアンモニアフィルタカラム８，オートサンプラ９によって導入されたアミノ酸試料は分離カラム１０で分離される。ここで分離したアミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試薬１１とミキサ１３で混合し、加熱された反応カラム１４で反応する。反応によって発色したアミノ酸（ルーエマン パープル）は検出器１５で連続的に検知され、データ処理装置１６によってクロマトグラム及びデータとして出力され、記録、保存される。

（分析サイクル時間の短縮化に関して）
従来からイオン交換クロマトグラフィーを用いるアミノ酸分析法では、イオン交換カラムを約０.１mol／Ｌの水酸化ナトリウムもしくは水酸化リチウムの再生液で洗浄した後、クエン酸ナトリウムか、またはクエン酸リチウム溶離液を十分な時間を送液して、カラムを平衡化していた。再生液から溶離液に切り替えてサンプルを注入するまでの、所謂、カラム平衡化液量は、表１に示すように従来例ＰＦ−９４法では９.５ml（流量：０.５６ml／min、送時間：１７分間）であった。カラムは、内径５.４mm長さ５０mm相当であり、容積は１.１mlとなる。平衡化液量は、カラム容積で規格化すると、カラム容積の８.４倍量を送液している換算になる。イオン交換樹脂の場合、充填剤内部まで溶離液が浸透するため、カラム内の空隙率は考慮しないものとする。カラム容器中の再生液を溶離液の送液により置き換えていく場合、送り込んだ溶離液が速やかにカラム容器内で一様になるモデルでは、自然対数の底ｅの累乗に反比例した比率で再生液が残る。即ち、前述の例では、カラム容積の８.４倍量を送液すれば、ｅ^-8.4＝０.０００２２５＝０.０２２５％の再生液しかカラム内に残っていない計算になる。

本実施例では、カラム平衡化液量を従来のカラム容積７倍量に比べ、保持時間やピーク面積の変動・ばらつきを極限まで許容して、何倍量まで低減することできるかが重要になる。

本実施例のアミノ酸分析方法であるＰＦＳ−７５法と従来技術を備えたアミノ酸分析法であるＰＦＳ−９４法を比較する。ＰＦＳ−９４法及びＰＦＳ−７５法は、分析サイクル時間がそれぞれ９４分間と７５分間であり、カラム再生液の送液時間と第１緩衝液による平衡化時間のみが異なる。以上の分析法及び従来のタンパク質加水分解物分析法（以下ＰＨ）と生体液分析法（以下ＰＦ）について、カラム内の液体を再生液から第１緩衝液に置き換えたときの、再生液残存率を表１に示す。尚、カラム内体積をＶ（ｍＬ）、カラム再生後次の試料注入までに送液される第１緩衝液の送液体積をＶＲＩ（ｍＬ）とあらわすとき、カラム内の再生液残存率Ｒ（％）は数式１で示される。また、ＰＦＳ−７５法、及びＰＦＳ−９４法で使用する緩衝液のリチウムイオン濃度及びｐＨ等を表２に示す。

表１から、本実施例の分析法における再生液残存率Ｒは従来技術のＰＦ法における再生液残存率Ｒの６００倍であり、本実施例である分析法の再生液残存率Ｒはこれまでのどの分析法と比較しても遥かに大きい値である。換言すれば、従来はカラム内の液体を第１緩衝液に十分置換し、カラムを平衡化した後に試料を注入していた。一方、本実施例では、液体置換が不十分であり、１％オーダーの再生液がカラム内に残存している状態で試料を注入する方法を採用している。つまり、従来法では十分なカラム平衡化の後に試料注入することで、良好な保持時間の再現性を得ていたと考えられる。しかし、本実施例では、再現性を若干低下させてでも高速に分析することを優先し、カラム平衡化がやや不十分な状態にもかかわらず試料注入する方法をとったといえる。なお、数式１よりＲが１％のときは、ＶＲＩ／Ｖ比は４.６であることがわかる。

ＰＦＳ−９４は第１緩衝液から第４緩衝液までの分析プログラムは共通しているが、カラム再生液と平衡化のための第１緩衝液を送液する部分のプログラムが異なる。ＰＦＳ−９４，ＰＦＳ−７５はそれぞれ１分析あたりの所要時間が９４分，７５分の分析法である。

図２，図３はそれぞれＰＦＳ−９４法、及びＰＦＳ−７５法について、各分析法を用いてＲＧスタートなしで分析を開始したときの第１注入分析と第２注入分析でのクロマトグラムを比較したものである。図３のＰＦＳ−７５法では第１注入分析と第２注入分析のクロマトグラムにおいて、成分の保持時間が一致していないが、図２のＰＦＳ−９４法では保持時間が一致している。

従来から、同一のタイムウィンドウでピーク同定できるようにするため、即ち第１注入分析と第２注入分析において各成分の保持時間が極力一致するように、カラムを十分に平衡化してきた。ＰＦＳ−９４法では、サイクル中のピーク同定に関して、ＶＲＩ／Ｖ比で８.４、再生液残存率０.０２２５％で、従来の通り十分、平衡化し、保持時間を一致させている。今回、第１注入分析の後にカラムを第１緩衝液で十分平衡化するという従来の手法にとらわれず、保持時間を一致させる別の方法を検討した。

今回、カラム平衡化時間にとらわれることなく、再生液残存率がたとえ１％以上であっても、すなわち、ＶＲＩ／Ｖ比が４.６以下であっても、注入間隔サイクルを一定にすることにより保持時間を一致させることができる方法を見つけた。第１緩衝液を十分送液しなくとも、注入間隔を時間短縮することができるため、分析を高速化することが可能となった。必ず先にカラム再生（ＲＧ）工程から分析を開始するＲＧスタートの場合のデータを用いることとすれば、図３の第２注入クロマトグラムの保持時間が得られる。ＲＧスタートを用いるかあるいは第２以降の注入分析からのデータを用いることにより、分析サイクルの高速化は可能である。本実施例として、ＰＦＳ−７５法はＶＲＩ／Ｖ比が２.５（表１参照）であるにもかかわらず、第１注入分析と第２注入分析での保持時間を一致させることができた。

また、タンパク質加水分解物（ＰＨ）法においても、従来の通り、ＶＲＩ／Ｖ比は、６.８と大きい（表１参照）。

（２種の異なる分析法プログラムの接続に関して）
分析プログラムはカラムに吸着した成分を分離する溶出工程，強アルカリの再生液によってカラムを再生するカラム再生工程，引き続き行われる分析に備えるための第１緩衝液でカラムを平衡化するカラム平衡化工程から構成される。また、分析プログラムはポンプの流速，カラムオーブンの温度等も時間軸に沿って指定するものである。

ここで、２種類の分析プログラムを用いて連続分析する場合を考える。２種類の分析プログラムの例として分析プログラムＡ（図４）と分析プログラムＢ（図５）を例に挙げる。同一の分析プログラムを用いた試料中の連続成分分析を効率よく行うにはＲＧスタートが有効である。ＲＧスタートとは第１分析によって得られるクロマトグラムにおける成分ピークの保持時間と、第２分析以降に得られるクロマトグラムにおける成分ピークの保持時間のずれを解消する方法である。

ところが、分析プログラムＡの後に分析プログラムＢを用いて試料中の成分を分析する場合、分析プログラムＡに引き続き連続して分析プログラムＢを実行すると、分析プログラムＢの第１分析で得られるクロマトグラムにおける成分ピークの保持時間と第２分析以降で得られるクロマトグラムにおける成分ピークの保持時間の再現性が低下する。分析プログラムＡの最終成分であるアルギニン（Ａｒｇ）の溶出直後にプログラムを途中で中断し、分析プログラムＡによる再生液送液工程を実施することなく、分析プログラムＢ専用のＲＧスタートを挿入することによってこの現象を回避することができる。しかし、分析プログラムＡと分析プログラムＢ用のＲＧスタートの繋ぎ目で以下の不具合が生じる。

（１）２つの分析プログラム間でポンプ流速の設定値が等しくない場合、分析プログラムの繋ぎ目で圧力変動が起こる。これはカラム寿命に対して負の方向に作用する。（２）分析プログラムの繋ぎ目でカラムオーブンの温度設定値が一致しない場合、カラムがカラム外から受け取るエンタルピー量の再現性が低下するため、成分ピークの保持時間再現性が低下する。

これらの問題を解決するため、図６に示すようにプログラムの繋ぎ目に両プログラムを円滑に繋ぐような接続プログラムを挿入する。また、図７に、図２及び図３に示した分析プログラムＡ及び分析プログラムＢに対応させた最速接続中間プログラムを示す。図７に示した最速接続用中間プログラムでは、カラムオーブン温度値に関しては分析プログラムＢのＲＧ工程における、最初のカラムオーブン温度となるように設定した。ポンプの流速設定値に関しては、分析プログラムＡの最下段の設定値と分析プログラムＢのＲＧ工程の初段の設定とを滑らかに繋げるよう、つまり、ポンプ１の流速設定値を０.５００ｍＬ／minから０.４００ｍＬ／minへ、ポンプ２の流速設定値を０.４００ｍＬ／minから０.３５０ｍＬ／minへリニアグラジエントによって繋いだ。この接続プログラムを挿入することによって、分析プログラムＢのＲＧが実行される前に、ポンプの流速及びカラムオーブン温度が分析プログラムＢのＲＧ工程初段のポンプ流速設定値、及びカラムオーブン温度設定値へとリニアグラジエントプログラムを用いて直線的に接続され、正常な状態で分析プログラムＢをＲＧスタートすることによって、再現性よく連続分析することが可能となる。

１…第１緩衝液、２…第２緩衝液、３…第３緩衝液、４…第４緩衝液、５…カラム再生液、６…電磁弁シリーズ、７…緩衝液ポンプ、８…アンモニアフィルタカラム、９…オートサンプラ、１０…アミノ酸試料は分離カラム、１１…ニンヒドリン試薬、１２…ニンヒドリンポンプ、１３…ミキサ、１４…反応カラム、１５…検出器、１６…データ処理装置。

Claims (2)

1. 液体クロマトグラフ装置であって、分析プログラムを実行する演算部を備え、
   当該演算部は、第一の条件で液体クロマトグラフ分析を行う第一分析プログラムの実行後第二の条件で液体クロマトグラフ分析を行う第二分析プログラムの実行前に、前記第一分析プログラムの終了時の前記第一の条件から前記第二分析プログラムの開始時の前記第二の条件までを直線的に変化させる接続プログラムを実行する液体クロマトグラフ装置であって、
   前記演算部は、前記第一分析プログラムのカラムオーブン温度値及びポンプの流速設定値の終了時の条件から前記第二分析プログラムのカラムオーブン温度値及びポンプの流速設定値の開始時の条件まで直線的に変化させる接続プログラムを実行することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
2. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置であって、
   前記各分析プログラムによる分析開始前に、カラム再生工程を行うことを特徴とする液体クロマトグラフ装置。

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