JP2014142258A - アミノ酸分析法およびアミノ酸分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】アミノ酸分析において、少なくともハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及び所定のたん白質構成アミノ酸１８成分を含む試料中のアミノ酸成分の分解能を改善して分析精度を向上させるとともに、分析時間を短縮して高速化できる方法を提供する。
【解決手段】緩衝液中のｐＨ値を、少なくともハイドロキシプロリンからアスパラギン酸が溶出される時間までは第一のｐＨ値を維持し、スレオニンからセリンが溶出される時間以降に、第一のｐＨ値よりも高い第二のｐＨ値に上昇させる段階と、試料中の成分を分離するカラムの温度を、少なくともハイドロキシプロリンからメチオニンスルホンの溶出が完了するまでの時間は第一の温度を維持し、アスパラギン酸からスレオニンが溶出される時間以降に、第一の温度よりも高い第二の温度に上昇させる段階を含む。
【選択図】図５（Ｂ）

Description

本発明は、アミノ酸分析装置およびアミノ酸分析法に関し、特に、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、アスパラギン酸を含む試料の分析に好適な装置、および方法に関する

アミノ酸分析法は大別して、たん白質加水分解物アミノ酸約２０成分を対象としたたん白質加水分解法と、生体液アミノ酸類縁化合物４０成分またはそれ以上の成分を対象とした生体液分析法とに大別される。

また、分析を行う手段として、イオン交換カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーによる方法がある。本方法においては、アミノ酸成分は緩衝液の流量、カラム温度、緩衝液組成等の分離パラメータを変更することで、溶出時間が変化する。ここで、分離パラメータの変更が溶出時間に与える影響は各アミノ酸成分で異なるため、この差異を利用してアミノ酸分析の高分離、高速化が図られてきた。

特許文献１には、アスパラギン酸とグルタミン酸とグルタミンを分離する場合に、緩衝液のリチウムイオン濃度を低濃度に設定することが開示されている。

特許文献２には、複数の緩衝液を切り替えて供給する場合に、各段階における緩衝液のｐＨ値を最適化することが開示されている。

特許文献３では、緩衝液の流量の変更と、アンモニアの溶出時間への影響が少ないその他の分離パラメータ（カラム温度、緩衝液のｐＨ）の変更とを組み合わせることで、アンモニアおよび任意のアミノ酸を含む試料の分析精度を向上させることが説明されている。

特開昭５９−１０８４９号公報 特開昭５３−６０２９１号公報 特開２００９−８５７４７号公報

日本薬局方 第１６改正 ｐ.１９８９−１９９１

以下の説明において、分析対象となるたん白質加水分解物アミノ酸１８成分、及びその他のアミノ酸の名称及びその略号は表１の表記に従った。

たん白質加水分解法では、上記のうち、たん白構成アミノ酸１８成分の分析を一斉に行うことができる。また、本方法は生体液分析法と比較して、安価な試薬（ナトリウム）を緩衝液に採用していることから、コスト面において優れている。

しかし、例えばコラーゲンのように、前処理として過ギ酸酸化処理、及び加水分解処理（処理方法については非特許文献１参照）を施した分解後の試料中に、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、アスパラギン酸が含まれている場合には、たん白質加水分解法を用いた分析ではこれらの成分が重なり合い、同時に定量することは困難であった。

したがって、このような試料に対してはたん白質加水分解法ではなく、生体液分析法により分析する場合があった。

ここで、生体液分析法はたん白質加水分解法と比較して多成分を分析できる反面、分析に長時間を要すること、及び緩衝液中にリチウムを用いているためコストの面で課題がある。上記の試料についても、生体液分析法によっては分析が完了するまでには１時間以上を要することとなる。すなわち、従来の分析法によってはユーザのニーズを十分に満たすことはできないことがある。

本発明の目的は、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及び所定のたん白質構成アミノ酸１８成分を含む試料を安価な方法で、高速かつ高精度に分析することである。

特に、当該試料中のアミノ酸を３２分以内に一斉分析し、かつ、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及びアスパラギン酸の３成分のピークが重ならないクロマトグラムを得ることである。

本発明者は鋭意研究を重ねた結果、緩衝液中のカウンターイオンとしてナトリウムイオンを用いたたん白質加水分解法により、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及び所定のたん白質構成アミノ酸１８成分を含む試料を高速かつ高精度に分析可能な方法を見出した。

すなわち、上記課題を解決するための一態様として、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及び所定のたん白質構成アミノ酸１８成分を含む試料を対象としたアミノ酸分析において、前記試料を溶離させる緩衝液中にナトリウムイオンを含み、前記緩衝液中のｐＨ値を、少なくともハイドロキシプロリンからアスパラギン酸が溶出される時間までは第一のｐＨ値を維持し、チロシンからスレオニンが溶出される時間以降に、第一のｐＨ値よりも高い第二のｐＨ値に上昇させる段階と、試料中の成分を分離するカラムの温度を、少なくともハイドロキシプロリンからメチオニンスルホンの溶出が完了するまでの時間は第一の温度を維持し、アスパラギン酸からスレオニンが溶出される時間以降に、第一の温度よりも高い第二の温度に上昇させる段階とを含むことを特徴とする。

本発明によれば、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン及び所定のたん白質構成アミノ酸１８成分を含む試料を対象としたアミノ酸分析を、安価な方法で、高速かつ高精度に分析することができる。

本発明で使用するアミノ酸分析装置の流路を示す図 本発明の分析プログラムを示す図 従来の分析プログラムを示す図 生体液分析法によって得られるクロマトグラムを示す図 本発明の分析プログラムによって得られるクロマトグラムを示す図 従来の分析プログラムによって得られるクロマトグラムを示す図 本発明の分析プログラムによって得られるクロマトグラムを示す図 緩衝液のｐＨおよび分離カラム温度と各成分の分離度との関係を示す図 生体液分析法の分析プログラムを示す図

以下、従来例と比較しながら本発明の実施形態についての詳細を述べる。

本発明の実施の形態として、たん白質構成アミノ酸は所定の１８種類であって、その他、少なくともハイドロキシプロリンとメチオニンスルホンを含むものとし、前記アミノ酸分析を３２分以内で完了する。これは、生体液分析法により定量した場合における分析時間の約１/３以下である。

図１は本発明の実施形態におけるアミノ酸分析装置の流路を説明する図である。１Ｂ〜４Ｂはそれぞれ第１〜第４緩衝液、１Ａ〜４Ａは緩衝液容器である。また、５Ｂはカラム再生液、５Ａはカラム再生液容器である。この中から電磁弁シリーズ６Ａ〜６Ｅによって何れかの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ7によって送液される。該緩衝液中にアンモニアフィルタカラム８、オートサンプラ９によって導入されたアミノ酸試料は、分離カラムオーブン１１内に設置された分離カラム１０で分離される。ここで分離したアミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１３によって送られてきたニンヒドリン試薬１２Ｂとミキサ１４で混合し、反応カラムオーブン内１６で加熱された反応カラム１５で反応する。反応によって発色したアミノ酸は検出器１７で連続的に検知され、制御装置１９に出力される。

制御装置１９は、流路全体の制御を担っており、緩衝溶液の電磁弁６Ａ〜６Ｄ、カラム再生液容器の電磁弁６Ｅ、ニンヒドリンポンプ１３、分離カラムオーブン１１、反応カラムオーブン１６、オートサンプラ９等の各ユニットとの指令及びデータのやり取りを実行するデータ処理装置１８と、各種データや、オペレータからの分析条件の指示等が入力される入力装置２０と、検出器１７によるクロマトグラム及びデータ等の検出結果や、各種操作に係るグラフィカルユーザーインターフェース(ＧＵＩ)等が表示される出力装置２１を備えている。検出器１７によって検出された各成分の測定値はデータ処理装置１８に取り込まれ、試料の分析結果が出力装置２１に送信・表示される。また、各ユニットの制御は主としてデータ処理装置１８の記憶部(図示せず)に格納されたプログラムによって実行される。

従来の分析プログラムでは、第１〜第４緩衝液、およびカラム再生液としては、表２に示す緩衝液を用いた。また、本発明の分析法では第１緩衝液として、表２に示す緩衝液に代えて、表３に示す緩衝液を用いた。ニンヒドリン試薬は市販のニンヒドリン試薬(和光純薬工業(株))を用いた。さらに、生体液分析法では、表４に示す第１〜第４緩衝液、およびカラム再生液を用いた。分離カラムにはパックドカラム４．６ｍｍＩ．Ｄ．×６０mm、充填剤としてはイオン交換樹脂♯２６２２を用いた。

なお、当然のことながら本実施の形態は一例であり、これと同一性を失わない範囲内において適宜変更できることはいうまでもない。

次に本発明の分析プログラムを図２に示す。ここで、図２の分析プログラムについて説明する。「％Ｂ１−％Ｂ５」欄は、それぞれ第１緩衝液１Ｂ〜カラム再生液５Ｂに相当する(図1参照)。

例えば、時間０．０（ｍｉｎ）で％Ｂ１−％Ｂ５の欄に１００とあるのは、緩衝液１〜緩衝液４および再生液のうち、相当する電磁弁が１００％開くという意味である。５０と５０と示される場合には、これらのうち、相当する２つの電磁弁が時間比で５０％ずつ開く、すなわち５０％ずつ溶液が混合されるという意味である。さらに時間とともに混合比を変えるとグラジエント混合が可能となる。図１の構成であれば、最大で５液までグラジエントができる。

「温度(℃)」は、分離カラムの温度プログラムを示す。例えば５２とあるのは次の指定時間まで５２℃で一定温度を保つという意味である。

「流量１（ｍＬ/ｍｉｎ）」は、緩衝液ポンプの流量、「流量２（ｍＬ/ｍｉｎ）」は、ニンヒドリンポンプの流量である。「％Ｒ１−％Ｒ３」欄は、ニンヒドリン試薬の混合比である。通常ニンヒドリン試薬は２液に分かれており、使用時にＲ１とＲ２は５０％ずつ混合されるようになっている。Ｒ３は５％エタノール溶液が設置してあり、分析終了時の洗浄などに使用する。

ここで、図３に従来行われていたたん白質加水分解物分析法の分析プログラムを示す。なお、この場合には表１に示す第一緩衝液を使用している。図示されるように、従来の分析プログラムにおいては、分析中の温度は５７℃で一定に保たれている。

また、図７には生体液分析法の分析プログラムを示す。本図より、本方法ではプログラムの完了までに１５０分もの時間を要することがわかる。

図４（Ａ）に、生体液分析法を使用して得られたクロマトグラムを示す。ここで、図３のたん白質加水分解物分析法における従来の分析プログラムを使用した場合には、全成分の成分分離ができないため、本発明による分析プログラムとの比較例としては生体液分析法による結果を示すこととした。また、図４（Ｂ）に、図２の本発明の実施の形態における分析プログラムを使用して得られたクロマトグラムを示す。本図の左上には、アミノ酸２５成分までを一斉分析した分析クロマトグラムのうち、Ｈｙｐｒｏ〜Ｐｒｏについて異なる波長（５７０ｎｍ）にて検出した結果を示している。

また、上記のアミノ酸２５成分のうち、Ｈｙｐｒｏ〜Ｐｒｏのピークのみを選択した結果については、図３の従来の分析プログラムにより得られたクロマトグラムを図５（Ａ）に示し、本発明に係る実施の形態により得られたクロマトグラムを図５（Ｂ）に示す。

図５（Ａ）に示されるように、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、アスパラギン酸の３成分のピークが集中しており、完全に分離できていない。従って、これらの３成分についてはピークの特定が困難であり、測定データの信頼性が低い。

次に図４（Ａ）、図５（Ｂ）に示すように、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及び所定のたん白質構成アミノ酸１８成分を含んだ計２５成分の一斉分析を可能にした本発明の実施の形態に係る分析プログラムの作成過程について述べる。

分離カラムを固定した場合に、ピーク位置を移動させるパラメータとしては、（ａ）緩衝液中のイオン濃度の強さ、（ｂ）ｐＨ強度、（c）カラム温度、及び（ｄ）緩衝液ポンプの流速等が挙げられる。

本実施例では、上記のパラメータのうち、（ｂ）ｐＨ強度の変更と（ｃ）カラム温度の変更とを組み合わせることにより、ハイドロキシプロリンを含んだ過ギ酸酸化処理後の試料における最適な分析プログラムを実施している。

なお、分析プログラムの時間（緩衝液切り替え時間、分離カラム温度切り替え時間等）は図１の電磁弁シリーズ６ならびに分離カラムオーブン１１における時間を基準としているため、クロマトグラムの示された各成分が溶出した時間（保持時間）とは異なっている。

分析プログラムの時間と、保持時間とは、緩衝液が電磁弁シリーズ６から検出器に至るまでに相当する程度のタイムラグを有しており、具体的には５分程度のずれがある。

また、分析プログラムの時間と、分離カラムの温度の切り替え時間とは、分離カラムから検出器に至るまでに相当する程度のタイムラグを有しており、具体的には３分程度のずれがある。

したがって、以下の説明においては上記のような分析プログラムと保持時間とのずれを考慮して分析条件を切り替えているものとする。

分離能の指標としては、例えば特開２００８−２４９４４７号公報に開示されるように、(数１)に示す分離度Ｒｓが知られている。本実施例においても分離度を指標として使用する。

〔数１〕
分離度Ｒｓ（アミノ酸１／アミノ酸２）＝１．１８（Ｒｔ₂−Ｒｔ₁）／Ｗ_1(1/2)＋Ｗ_2(1/2)・・・式（１）
（Ｗ_1(1/2)、Ｗ_2(1/2)・・・ピーク高さの半分の高さで時間軸に並行に走る線と交わる２点間の距離を計算することによって得られるピーク幅）

図６は分析開始時のカラム温度と緩衝液のｐＨによる２種類の成分間の分離度を示したものである。カラム温度については分析プログラムによって制御し、緩衝液のｐＨについてはクエン酸量を変えることで調製した。また、Ｎ．Ａ．はピーク間が近接し、データ解析による分離が不可能であることを示す。

ここで、本図に示された結果から、以下の新規な知見が得られた。すなわち、（１）ＨｙＰｒｏ−ＭｅｔＳＯＮ間の分離については、ｐＨに依存せず、温度が低いほど分離能が向上する点、（２）Ａｓｐ−Ｔｈｒ間、およびＧｌｕ−Ｐｒｏ間の分離については、温度が高いほど分離能が向上する点、（３）ＭｅｔＳＯＮ−Ａｓｐ間の分離については、緩衝液ｐＨが低いほど分離能が向上する点、（４）Ａｓｐ−Ｔｈｒ間の分離については、緩衝液ｐＨが低いほど分離能が向上する点が見出された。

上記の知見を踏まえて、本発明に係る実施の形態においては、緩衝液へのクエン酸添加により、第一緩衝液のｐＨを表３に示した通り３．１４とし、ＭｅｔＳＯＮ−Ａｓｐ間の分離能を改善した。また、ＨｙＰｒｏ〜Ａｓｐの溶出が終わるまでの間は第一緩衝液のｐＨを維持し、その後Ｔｈｒの溶出からは第二緩衝液のｐＨとなるように切り替えた。本発明の分析プログラムでは、第一緩衝液から第二緩衝液に切り替えてから、第二緩衝液によって成分が溶出されるようになるまでには約５分を要することを考慮し、分析プログラム１．５分で緩衝液を第一緩衝液から第二緩衝液に切り替えるようにしている。

また、温度の初期設定を従来の５７℃よりも低い５２℃と設定し、ＭｅｔＳＯＮの溶出が終わるまで維持することにより、Ｈｙｐｒｏ−ＭｅｔＳＯＮ間の分離能を改善した。
さらに、Ａｓｐの溶出からは５７℃以上６２℃以下となるように切り替えた。本発明の分析プログラムでは、カラムの温度を切り替えてから成分の溶出に影響が出るまでは約３分を要することを考慮し、分析プログラム２．０分で温度を５７℃とし、２．５分でさらに６２℃に切り替えるようにしている。

これらを組み合わせることにより、図２に示す分析プログラムが求められ、図４（Ｂ）の分離結果が実現する
本発明の分析プログラムを採用したことによる効果を纏めると以下のようになる。
１）緩衝液ｐＨならびにカラム温度の設定によって、ハイドロキシプロリン、メチオニンスルホンおよび所定のたん白質構成成分１８成分に加えて、ハイドロキシリシン、オルニチン、ノルバリンを含めた２５成分を分析した場合でも、各成分がバランスよく分離でき、且つ、分析時間も３２分以内に抑えることができる。
２）分析装置のハードウエアや分離カラムを変更することなく、アプリケーションの改善により上記の分析結果が実現した。
３）カウンターイオンに高価なリチウムを使用した生体液分析法ではなく、安価なナトリウムを使用したたん白質加水分解物分析法による分析を実現できた。

１Ａ〜４Ａ・・・緩衝液容器
１Ｂ〜４Ｂ・・・緩衝液
５Ａ・・・カラム再生液容器
５Ｂ・・・カラム再生液
６Ａ〜６ＥE・・・電磁弁シリーズ
７・・・緩衝液ポンプ
８・・・アンモニアフィルタカラム
９・・・オートサンプラ
１０・・・分離カラム
１１・・・分離カラムオーブン
１２Ａ・・・ニンヒドリン試薬容器
１２Ｂ・・・ニンヒドリン試薬
１３・・・ニンヒドリンポンプ
１４・・・ミキサ
１５・・・反応カラム
１６・・・反応カラムオーブン
１７・・・検出器
１８・・・データ処理装置
１９・・・制御装置
２０・・・入力装置
２１・・・出力装置

Claims (8)

1. 液体試料を緩衝液とともに分離カラムに送液して前記液体試料に含まれる各種アミノ酸を分離し、当該分離結果を検出器によって検出するアミノ酸分析方法において、
   前記液体試料中に、少なくともハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及びアスパラギン酸を含み、
   前記緩衝液中のｐＨ値を、少なくともハイドロキシプロリンからアスパラギン酸が溶出される時間までは第一のｐＨ値を維持し、スレオニンからセリンが溶出される時間以降に、第一のｐＨ値よりも高い第二のｐＨ値に上昇させる工程と、
   試料中の成分を分離するカラムの温度を、少なくともハイドロキシプロリンからメチオニンスルホンの溶出が完了するまでの時間は第一の温度を維持し、アスパラギン酸からスレオニンが溶出される時間以降に、第一の温度よりも高い第二の温度に上昇させる工程とを含むことを特徴とするアミノ酸分析方法。
2. 請求項１に記載されたアミノ酸分析方法において、
   前記第一のｐＨ値を３．１４以下とし、第二のｐＨ値を３．３以下とし、かつ、前記第一の温度を５２℃以下とし、第二の温度を５７℃以上６２℃以下としたことを特徴とするアミノ酸分析方法。
3. 請求項１に記載されたアミノ酸分析方法において、
   前記液体試料中には、さらに、スレオニン、セリン、グルタミン、プロリンを含むことを特徴とするアミノ酸分析方法。
4. 液体試料を緩衝液とともに分離カラムに送液して前記液体試料に含まれる各種アミノ酸を分離し、当該分離結果を検出器によって検出するアミノ酸分析システムにおいて、
   前記液体試料中に、少なくともハイドロキシプロリン、メチオニンスルホン、及びアスパラギン酸を含み、
   前記緩衝液中のｐＨ値を、少なくともハイドロキシプロリンからアスパラギン酸が溶出される時間までは第一のｐＨ値を維持し、スレオニンからセリンが溶出される時間以降に、第一のｐＨ値よりも高い第二のｐＨ値に上昇させ、かつ、
   試料中の成分を分離するカラムの温度を、少なくともハイドロキシプロリンからメチオニンスルホンの溶出が完了するまでの時間は第一の温度を維持し、アスパラギン酸からスレオニンが溶出される時間以降に、第一の温度よりも高い第二の温度に上昇させることを特徴とするアミノ酸分析システム。
5. 請求項１に記載されたアミノ酸分析方法において、
   前記第一のｐＨ値を３．１４以下とし、第二のｐＨ値を３．３以下とし、かつ、前記第一の温度を５２℃以下とし、第二の温度を５７℃以上６２℃以下としたことを特徴とするアミノ酸分析システム。
6. 請求項４に記載されたアミノ酸分析システムにおいて、
   前記液体試料中には、さらに、スレオニン、セリン、グルタミン、プロリンを含むことを特徴とするアミノ酸分析システム。
7. 緩衝液を送液する送液部と、
   前記送液部により送液された緩衝液中に試料を注入する試料注入部と、
   前記試料中の成分を分離するカラムを備えた分離部と、
   当該分離されや試料中の成分を検出する検出器と、
   前記緩衝液中のｐＨ値および前記カラムの温度を予め定めた物質が溶出されるまでは維持し、その後予め定めた他の成分が溶出された時間以降は、前記ｐＨ値および前記温度を上昇させる段階を実行する分析プログラムに従って前記送液部および前記分離部を制御する制御部と、を有するアミノ酸分析装置において、
   前記制御部は、
   前記緩衝液中のｐＨ値を、少なくともハイドロキシプロリンからアスパラギン酸が溶出される時間までは第一のｐＨ値を維持し、スレオニンからセリンが溶出される時間以降に、第一のｐＨ値よりも高い第二のｐＨ値に上昇させ、かつ、
   前記カラムの温度を、少なくともハイドロキシプロリンからメチオニンスルホンの溶出が完了するまでの時間は第一の温度を維持し、アスパラギン酸からスレオニンが溶出される時間以降に、第一の温度よりも高い第二の温度に上昇させるように前記送液部及び前記分離部および前記分離部を制御することを特徴とするアミノ酸分析装置。
8. 請求項７に記載されたアミノ酸分析装置において、
   前記第一のｐＨ値を３．１４以下とし、第二のｐＨ値を３．３以下とし、かつ、前記第一の温度を５２℃以下とし、第二の温度を５７℃以上６２℃以下となるように前記送液部および前記分離部を制御することを特徴とするアミノ酸分析装置。