JP2006234804A - 標的化合物と結合する反応化合物を特定するスクリーニング方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 スクリーニングに必要な複数の作業をオンラインで行なうことができるようにする。
【解決手段】 試料を、タンパク質に反応化合物が結合した反応生成物を含むタンパク質と未反応の反応化合物とに分離するための一次元目分析流路Ａと、分離した試料成分のうち反応生成物を含むタンパク質のみを分画するための分画流路Ｂと、反応生成物をタンパク質と反応化合物に解離する濃縮用移動相を送液するための濃縮移動相送液流路Ｃと、濃縮移動相によって移送される液をトラップカラム２４に導くための反応化合物濃縮流路Ｄと、トラップカラム２４にトラップされた反応化合物を移送するための二次元目分析用移動相を送液するための二次元目分析用移動相送液流路Ｅと、二次元目分析用移動相によって移送される反応化合物を二次元目分析カラム２６で分析するための二次元目分析流路Ｆとを備えている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、標的化合物と結合する反応化合物を特定するスクリーニング方法及びスクリーニング装置に関するものである。

例えば、タンパク質と結合する物質の結合活性を測定するためのスクリーニングに、以下に挙げられる実験作業をオフラインで行なっていた。
（１）タンパク質と結合する化合物をスクリーニングするために、タンパク質と反応化合物を混和する。
（２）その混和物からタンパク質のみを回収する。
（３）回収したタンパク質と結合した反応化合物をタンパク質から解離させる。
（４）次に、カラムに通してタンパク質と反応化合物を分離し、反応化合物のみを回収する。
（５）回収した反応化合物を質量分析計で測定する。

また、上記の他に、反応化合物を放射性同位体で標識し、タンパク質と結合反応させた後にタンパク質から測定される放射線量を測定することによって反応化合物とタンパク質の結合を確認する方法も挙げられる。

従来では、上記した（１）〜（５）の作業はすべてオフラインで行なわれていたために、分析結果を得るまでには手間がかかってしまうという問題があった。さらに、人の手で行なう作業では、作業に失敗する可能性もある上、分析者によってその作業に対する熟練度が異なるために異なった結果が出る可能性があるという問題もある。また、これら複数の作業をオフラインで行なうと、分析者が長時間、その作業に携わる必要がある。

そこで本発明は、スクリーニングに必要な複数の作業をオンラインで行なうことができるようにすることを目的としている。

本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に含んで標的化合物と結合する反応化合物を特定するものである。
（Ａ）試料として標的化合物と反応化合物を試料注入部に注入し、試料注入部から注入されたその試料を一次元目分析用移動相で一次元目分析カラムに導いて試料成分に分離する一次元目分析工程、
（Ｂ）分離された試料成分のうち標的化合物と反応化合物とが結合した反応生成物を含む部分をループ流路に分画する分画工程、
（Ｃ）上記反応生成物から上記反応化合物を解離させる溶媒を濃縮用移動相として、上記分画工程により分画された反応生成物から反応化合物を解離させながら該反応化合物を選択的に捕捉するトラップカラムへ導く反応化合物濃縮工程、及び
（Ｄ）上記トラップカラムに捕捉された試料を二次元目分析用移動相により二次元目分析力ラムに導いて分析する二次元目分析工程。

本発明では標的化合物と反応化合物との反応溶液を調製して試料注入部から注入した後は、スクリーニングのための複数の作業（Ａ）から（Ｄ）がオンラインで行なわれる。
本発明でスクリーニングの対象とするのは、標的化合物と結合して反応生成物を形成する反応化合物であるが、この場合の「結合」は共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合などの化学的結合のほか、内包（タンパク質の内部にある空隙に他の化合物が入り込むこと。）やファンデルワールス力による物理的な結合も含まれる。
また、反応生成物から反応化合物の「解離」は、化学的又は物理的な結合状態が解かれることを意味する。

試料注入部への試料注入方法としては、標的化合物と反応化合物を予め反応させた反応溶液として注入する場合と、標的化合物自体と反応化合物自体を順次注入する場合の２つの方法を含んでいる。
一般的に、タンパク質と結合する物質、特に生体内で起こる相互作用による結合状態というのは平衡状態であり、結合と解離が高速で繰り返されている状態である。そのため、例えば、試料として反応化合物を標的化合物であるタンパク質と結合させた状態で用意して液体クロマトグラフの試料注入部に注入すると、その試料を一次元目分析カラムに移送するための移動相によって希釈されて平衡状態がくずれ、移動相によっては平衡状態になった試料が解離してしまい、二度と結合できなくなってしまうことがある。例えば、反応化合物がｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドであり、タンパク質がＷＧＡ（小麦胚芽レクチン）である場合は、これらは相互作用によって結合することは明らかであるが、これらを反応させた状態で液体クロマトグラフの試料注入部に注入すると、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドとＷＧＡが解離した状態で検出されることがわかった。そのため、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドのような成分が反応化合物である場合、タンパク質に結合する反応化合物を正確に分析することは困難であることがわかった。

標的化合物と反応化合物との反応生成物が移動相に希釈されて解離するような場合にも本発明を適用できるようにするための本発明のスクリーニング方法の形態では、試料注入部に注入する試料を標的化合物自体とそれより分子量の小さい反応化合物自体とし、試料注入部への注入は反応化合物を先に注入し、次いで標的化合物を注入する順序で行ない、一次元目分析カラムとして反応化合物よりも標的化合物の方が先に溶出するように分子量により溶出速度が異なるように選択されたサイズ排除カラムを用い、それにより一次元目分析カラムでは後で注入された標的化合物が反応化合物より先に流出することにより一次元目分析カラム中で標的化合物と反応化合物とを反応させるようにする。

「サイズ排除カラム」とは、一定の分子サイズ（分子量）よりも大きい成分とそれよりも小さい分子とを分離することができるカラムを意味する。一般に、サイズ排除カラムでは、分子量の大きい成分の溶出速度は速く、分子量の小さい成分の溶出速度は遅い。サイズ排除カラムは、分離する分子量（排除限界分子量）を所望の大きさにすることができ、例えばあるタンパク質の分子量を基準として、そのタンパク質やそれよりも大きな分子量をもつ成分とそのタンパク質よりも小さな分子量をもつ成分とを分離することができる。本発明において用いるサイズ排除カラムは、標的化合物のサイズ以下の排除限界分子量をもつものである。このようなサイズ排除カラムを用いることで、標的化合物と排除限界分子量より分子量の小さい反応化合物が結合した反応生成物は標的化合物と同じく早く溶出され、標的化合物と結合しない反応化合物は分子量が排除限界分子量よりも小さいために標的化合物及び反応生成物よりも遅く溶出される。これにより、標的化合物に結合した反応化合物と結合しない反応化合物とを分離することができる。

反応化合物濃縮工程では、分画された反応生成物を濃縮用移動相によりトラップカラムへ導く際にさらに濃縮用移動相を混合するようにするのが好ましい。
標的化合物は特に限定されるものではないが、一例としてタンパク質を挙げることができる。

本発明のスクリーニング装置は、試料注入部から注入された試料を一次元目分析用移動相で一次元目分析カラムに導いて試料成分に分離する一次元目分析流路と、試料注入部に試料を注入する試料供給装置と、分離された試料成分のうち標的化合物と反応化合物とが結合した反応生成物を含む部分をループ流路に分画する分画流路と、上記反応生成物から上記反応化合物を解離させる溶媒を濃縮用移動相として、上記分画流路で分画された反応生成物から反応化合物を解離させながら該反応化合物を選択的に捕捉するトラップカラムへ導く反応化合物濃縮流路と、上記トラップカラムに捕捉された試料を二次元目分析用移動相により二次元目分析力ラムに導いて分析する二次元目分析流路とを備えて標的化合物と結合する反応化合物を特定するものである。
これにより、スクリーニングに必要な複数の動作をオンラインで行なうことができるようになる。

標的化合物と反応化合物との反応生成物が移動相により希釈されても容易に解離しないものである場合には、試料供給装置は試料として標的化合物と反応化合物の反応溶液を注入するように制御されるものとすることができる。

一方、標的化合物と反応化合物との反応生成物が移動相により希釈されて解離するものである場合には、試料供給装置は試料として標的化合物自体とそれより分子量の小さい反応化合物自体を別個に、かつ反応化合物を先に注入し、その後に標的化合物を注入するように制御され、一次元目分析カラムは反応化合物よりも標的化合物の方が先に溶出するように分子量により溶出速度が異なるように選択されたサイズ排除カラムであり、それにより一次元目分析カラムでは後で注入された標的化合物が反応化合物より先に流出することにより一次元目分析カラム中で標的化合物と反応化合物とが反応するようにすることができる。
反応化合物濃縮流路が、分画された反応生成物を濃縮用移動相により移送する流路にさらに濃縮用移動相を混合する流路を備えているのが好ましい。

本発明のスクリーニング方法においては、（Ａ）一次元目分析工程、（Ｂ）分画工程、（Ｃ）反応化合物濃縮工程、及び（Ｄ）二次元目分析工程をこの順で含むようにしたので、スクリーニングのための複数の作業をオンラインで行なうことができる。

工程（Ａ）の一次元目分析工程では、標的化合物と反応化合物との反応生成物が移動相によって希釈されても解離しないものである場合には、試料として標的化合物と反応化合物を予め混合して反応溶液としてものを注入できるので、試料注入動作が簡便になる。

一方、標的化合物と反応化合物との反応生成物が移動相によって希釈されても解離するものである場合は、反応化合物を先に注入し、その後に標的化合物を注入するようにして、一次元目分析カラムとしてサイズ排除カラムを用いることにより一次元目分析カラム中で標的化合物と反応化合物とを反応させるようにすれば、その反応生成物が移動相によって希釈されることがなく、解離するのを防ぐことができる。これにより、反応生成物を解離させることなく分画することができるので、標的化合物に結合する反応化合物の分析を正確に行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法における標的化合物としてタンパク質を用いれば、タンパク質と結合する反応化合物を特定することができる。

本発明のスクリーニング装置は、試料供給装置に試料注入部に試料を注入するようにし、一次元目分析流路と、分画流路と、反応化合物濃縮流路と、二次元目分析流路と、を備え、これらが互いに接続されているようにしたので、スクリーニングのための複数の作業をオンラインで行なうことができる。

試料供給装置により試料として標的化合物と反応化合物との反応生成物の反応溶液を注入するようにすれば、試料注入機構が簡単になる。
また、試料供給装置により試料として標的化合物自体とそれより分子量の小さい反応化合物自体を別個に、かつ反応化合物を先に注入し、その後に標的化合物を注入するようにすれば、標的化合物と反応化合物との反応生成物が移動相により希釈されると解離する場合にも、標的化合物と反応する反応化合物と反応しない反応化合物とを分離することができるようになる。

分画された反応生成物を濃縮用移動相によりトラップカラムへ導く際にさらに濃縮用移動相を混合するようにすれば、反応生成物を濃縮用移動相で希釈して反応化合物が標的化合物から解離するのを促すことができる。

以下に本発明のスクリーニング方法及びその実施に使用されるスクリーニング用二次元液体クロマトグラフの実施例を図面を参照しながら説明する。図１は、本発明の二次元液体クロマトグラフの一実施例を概略的に示す流路図である。
ここでは標的化合物をタンパク質とし、スクリーニングによりタンパク質に結合する反応化合物を特定するものとする。

この実施例における試料として、タンパク質と幾つかの反応化合物とを混和させたものを用いる。したがって、試料中にはタンパク質と所定の反応化合物とが結合して生成した反応生成物のほかに、タンパク質とは結合しなかった化合物が含まれており、さらに未反応のタンパク質も含まれうる。

この実施例のスクリーニング装置は、試料をタンパク質（反応化合物が結合した反応生成物を含む。）と未反応の反応化合物とに分離するための一次元目分析流路Ａと、分離した試料成分のうち反応生成物のみを分画するための分画流路Ｂと、濃縮用移動相を送液するための濃縮移動相送液流路Ｃと、反応生成物となったタンパク質から濃縮移動相によって反応化合物を解離させながらトラップカラム２４に導くための反応化合物濃縮流路Ｄと、トラップカラム２４にトラップされた反応化合物を移送するための二次元目分析用移動相を送液するための二次元目分析用移動相送液流路Ｅと、二次元目分析用移動相によって移送される反応化合物を二次元目分析カラム２６で分析するための二次元目分析流路Ｆとからなる二次元液体クロマトグラフを備えている。さらにこのスクリーニング装置は、一次元目分析流路Ａ上の試料注入部８に試料を注入するために、試料注入ノズル３２を含む試料供給装置も備えている。流路Ａ〜Ｆは選択的に流路を接続することができる６ポートバルブ１２,２２の各ポートに接続されている。

一次元目分析流路Ａの上流端はタンク２ａに接続されており、タンク２ａには一次元目分析用移動相が収容されている。一次元目分析流路Ａ上には、上流側から、デガッサ４、送液ポンプ６、試料注入部８及び一次元目分析カラム１０が設けられている。デガッサ４は送液ポンプ６によって送液される一次元目分析用移動相から気泡などを除去するために設けられている。試料は試料注入ノズル３２によって試料注入部８から注入されるようになっており、注入された試料は一次元目分析用移動相によって一次元目分析カラム１０に導かれて成分ごとに分離される。
ここで、一次元目分析用移動相として、例えば０.８%塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を挙げることができる。

分画流路Ｂ上には分画用のループ流路１４が形成されており、分画流路Ｂに導かれた成分を貯留できるようになっている。
濃縮用移動相送液流路Ｃの上流端はタンク２ｂに接続されており、タンク２ｂには濃縮用移動相が貯蔵されている。濃縮用移動相は送液ポンプ１６によってデガッサ４を介して送液される。濃縮用移動相として、例えば０.１％ＦＴＡ（トリフルオロ酢酸）を挙げることができる。

反応化合物濃縮流路Ｄ上にはトラップカラム２４が設けられており、反応化合物のみを捕捉することができるようになっている。
トラップカラム２４としては、タンパク質などの巨大分子は捕捉されず、反応化合物のみが選択的に捕捉されるもので、ここでは内面逆相カラムを用いる。

二次元目分析用移動相送液流路Ｅの上流端はタンク２ｃ及び２ｄに接続されている。例えば、タンク２ｃには０.１％ＴＦＡを含む純水、タンク２ｄには０.１％ＴＦＡを含むアセトニトリルがそれぞれ収容されており、これらは送液ポンプ１８ａと１８ｂによって所定の送液速度でミキサ２０に送液され、ミキサで所定の混合比に混合されて二次元目分析用移動相となって送液されるようになっている。これら送液ポンプ１８ａ，１８ｂ及びミキサ２０はグラジエント送液機構２１を構成している。

二次元目分析流路Ｆは、上流側から、二次元目分析カラム２６、検出器２８及び質量分析計３０を備えている。検出器２８は、例えば紫外線検出器又は示差屈折計である。
流路Ｆでは、二次元目分析カラム２６で試料を成分ごとに分離し、検出器２８で検出し、さらに質量分析計３０で各成分を特定することができるようになっている。

６ポートバルブ１２はａ〜ｆのポートを備えており、６ポートバルブ２２はｇ〜ｌのポートを備えている。一次元目分析流路Ａの下流端は６ポートバルブ１２のポートａに接続されている。分画流路Ｂの上流端は６ポートバルブ１２のポートｃ,ｆ間に接続されている。濃縮用移動相送液流路Ｃは６ポートバルブ１２のポートｄ及びｅに接続されており、ポートｅに濃縮液を送液し、さらにポートｄからの液体と濃縮用移動相とを混合させることができるようになっている。また、濃縮用移動相送液流路Ｃは混合流路Ｃ’を介して６ポートバルブ２２のポートｇに接続されており、ポートｄからの液体と濃縮用移動相とを混合した液体をポートｇに送液することができるようになっている。反応化合物濃縮流路Ｄは６ポートバルブ２２のポートｉ,ｌ間に接続されている。二次元目分析用移動相送液流路Ｅの下流端は６ポートバルブ２２のポートｋに接続されている。二次元目分析流路Ｆの上流端は６ポートバルブ２２のポートｊに接続されている。なお、６ポートバルブ１２のポートｂ及び６ポートバルブのポートｈはそれぞれドレイン１５，２５に開放されている。

６ポートバルブ１２は、ポートａ−ｂ間，ｃ−ｄ間及びｅ−ｆ間を接続するときには、ポートａ−ｆ間，ｂ−ｃ間及びｄ−ｅ間を遮断し、ポートａ−ｆ間，ｂ−ｃ間及びｄ−ｅ間を接続するときには、ポートａ−ｂ間，ｃ−ｄ間及びｅ−ｆ間を遮断するようになっている。

６ポートバルブ２２は、ポートｇ−ｈ間，ｉ−ｊ間及びｋ−ｌ間を接続するときには、ポートｇ−ｌ間，ｈ−ｉ間及びｊ−ｋ間を遮断し、ポートｇ−ｌ間，ｈ−ｉ間及びｊ−ｋ間を接続するときには、ポートｇ−ｈ間，ｉ−ｊ間及びｋ−ｌ間を遮断するようになっている。

６ポートバルブ１２をポートａ−ｆ間，ｂ−ｃ間及びｄ−ｅ間が接続されるように切り替えた場合には、一次元目分析流路Ａが分画流路Ｂに接続され、一次元目分析カラム１０を経た試料成分がループ流路１４に移送される。
６ポートバルブ１２をポートａ−ｂ間，ｃ−ｄ間及びｅ−ｆ間が接続されるように切り替えた場合には、一次元目分析流路Ａの下流端はドレイン１５に接続され、一次元目分析カラムを経た試料は排出される。

これにより、特定のタイミングで６ポートバルブ１２を切り替えてポートａ−ｆ間，ｂ−ｃ間及びｄ−ｅ間を接続することで、一次元目分析カラム１０で分離された試料成分のうち反応生成物を含むタンパク質のみをループ流路１４に送って分画し、残りの不要な成分はドレイン１５へ排出することができる。

６ポートバルブ１２をポートａ−ｂ間，ｃ−ｄ間及びｅ−ｆ間が接続されるように切り替え、６ポートバルブ２２をポートｇ−ｌ間，ｈ−ｉ間及びｊ−ｋ間が接続されるように切り替えた場合には、濃縮用移動相送液流路Ｃにより濃縮用移動相を送液することで、送液ポンプ１６によって送液された濃縮用移動相の一部はポートｅ及びｆを経てループ流路１４に導かれ、ループ流路１４に分画された反応生成物を含むタンパク質とともにポートｃ,ｄを経て混合流路Ｃ’を通り、ポートｇ及びポートｌを経てトラップカラム２４に導かれる。このとき、送液ポンプ１６によって送液された濃縮用移動相のうちポートｅに導入されなかった濃縮用移動相はポートｄからの移動相と混合流路Ｃ’の上流端で混合され、反応生成物を含むタンパク質を含む移動相が希釈される。反応生成物は濃縮用移動相と接触することにより、タンパク質と反応化合物とに解離する。トラップカラム２４では反応化合物だけが捕捉され、タンパク質を含む残りの成分はポートｉ及びｈを経てドレイン１５に排出されるようになっている。

さらに、６ポートバルブ２２をポートｇ−ｈ間，ｉ−ｊ間及びｋ−ｌ間が接続されるように切り替えた場合、二次元目分析用移動相送液流路Ｅに二次元目分析用移動相を送液すると、二次元目分析用移動相は６ポートバルブ２２のポートｋ，ｌを経て反応化合物濃縮流路Ｄに導かれる。反応化合物濃縮流路Ｄに導かれた二次元目分析用移動相はトラップカラム２４に捕捉された反応化合物を溶出させて、６ポートバルブ２２のポートｉ，ｊを介して二次元目分析流路Ｆに導入される。二次元目分析流路Ｆでは、二次元目分析用移動相によって導かれた反応化合物が二次元目分析カラム２６で分離され、検出器２８で検出され、さらに質量分析計３０でその成分が特定される。

次に、上記の二次元液体クロマトグラフを用いてスクリーニングを行なう際の動作の一例を説明する。この実施例のスクリーニング方法は、以下に示す工程からなる。図２，図３及び図４は試料分析時の移動相の流路を概略的に示す流路図であり、図２は一次元目分析工程、図３は反応化合物の濃縮工程、図４は二次元目分析工程をそれぞれ示している。

［一次元目分析工程］
試料としてタンパク質と反応化合物とを混和させた溶液を用いる。試料は分析者が予め調製しておく。
図２に示されるように、一次元目分析時には、一次元目分析流路Ａに一次元目分析用移動相を送液する。（Ａ）に示されるように、試料が試料注入ノズル３２によって試料注入部８に注入されると、試料は一次元目分析用移動相によって一次元目分析カラム１０に移送され、タンパク質と特定の反応化合物とが反応して生成した反応生成物を含むタンパク質部分と、未反応の反応化合物とに分離される。このうち反応生成物を含むタンパク質部分は、６ポートバルブ１２がポートａ−ｆ間，ｂ−ｃ間及びｄ−ｅ間が接続された状態となるように切り替えられてループ流路１４に送られる。反応生成物を含むタンパク質以外の試料成分は、（Ｂ）に示されるように、６ポートバルブ１２がポートａ−ｂ間，ｃ−ｄ間及びｅ−ｆ間が接続された状態に切り替えられてドレイン１５に排出される。

ここでは、一次元目分析用移動相の流量は一定速度であるので、一次元目分析用移動相の流量と一次元目分析カラム１０と６ポートバルブ１２との間の距離から、一次元目分析カラム１０で分離された反応生成物を含むタンパク質が６ポートバルブ１２に到達するまでの時間を算出することができ、算出した時間に基づいて６ポートバルブ１２の切替えを行なうことにより、反応生成物を含むタンパク質だけを選択的にループ流路１４に送って貯留することができる。

また、この実施例では示されていないが、一次元目分析カラム１０と６ポートバルブ１２との間に検出器を設け、検出器の検出信号に基づいて６ポートバルブ１２の切替えを行なうようにしてもよい。

［濃縮］
次に、濃縮用移動相を図３の太線で示された流路に送液する。６ポートバルブ１２はポートａ−ｂ間，ｃ−ｄ間及びｅ−ｆ間が接続されるように切り替えられ、６ポートバルブ２２は、ポートｇ−ｌ間，ｈ−ｉ間及びｊ−ｋ間が接続された状態に切り替えられる。送液ポンプ１６によって濃縮用移動相が６ポートバルブ１２のポートｅ，ｆを経てループ流路１４に送液される。このとき濃縮用移動相送液流路Ｃを流れる濃縮用移動相のうちの一部はポートｅには送液されず、ポートｄからの溶液と混合されて混合流路Ｃ’に流入する。ループ流路１４中に貯留されていた反応生成物を含むタンパク質は濃縮用移動相とともにポートｄを経て混合流路Ｃ’を通り、６ポートバルブ２２のポートｇに流入する。このとき反応性生物が濃縮移動相と接触してタンパク質と結合していた反応化合物が解離する。ポートｇに導入された試料はポートｌを経て濃縮流路Ｄに流入し、トラップカラム２４にて反応化合物のみが捕捉され、残りの成分はポートｉ及びｈを経てドレイン２５に排出される。

［二次元目分析］
６ポートバルブ２２がポートｇ−ｈ間，ｉ−ｊ間及びｋ−ｌ間が接続された状態に切り替えられ、図４の太線で示された流路を二次元目分析用移動相が流れるように、グラジエント送液機構２１によって二次元目分析用移動相が６ポートバルブ２２のポートｋ，ｌを介してトラップカラム２４に導入される。トラップカラム２４に捕捉されている反応化合物は二次元目分析用移動相によって溶出し、二次元目分析用移動相とともに６ポートバルブ２２のポートｉ，ｊを経て二次元目分析カラム２６に導入されて成分ごとに分離される。分離された各成分は検出器２８で検出されて質量分析計３０で特定される。

この実施例における二次元液体クロマトグラフによれば、タンパク質と反応化合物とを混和させた試料を分析者が調製した後は、オンラインで、試料を、反応生成物を含むタンパク質と未反応の反応化合物とに分離して反応生成物を含むタンパク質のみを分画し、その後反応生成物を解離させて反応化合物のみを濃縮して捕捉し、反応化合物を分析することができるので、スクリーニングにかかる複数の作業を同一分析系内でオンラインで行なうことが可能である。また、オンラインでの操作は自動化も容易である。
さらに、試料の調製以外の作業を自動的に行なうようにすれば、人為的なミスや熟練度の差による結果の相違が生じることなく、大量の分析を一定条件の下で行なうことができる。

標的化合物、反応化合物及び一次元目分析用移動相の組合せによっては、標的化合物と反応化合物を予め混合して反応溶液として試料注入部に注入する上の実施例の方法では、試料注入部８から一次元目分析カラム１０までの間で反応溶液が移動相によって大量希釈されて、既に結合していた標的化合物と反応化合物が解離してしまうことがある。そのような場合においても本発明のスクリーニングを実行できるようにした実施例を図５に示す。

この実施例では、試料注入ノズル３２ａを含む試料供給装置は、試料注入部８に対し、試料として標的化合物であるタンパク質自体とそれより分子量の小さい反応化合物自体とを別個に、かつ反応化合物を先に注入し、その後に標的化合物であるタンパク質を注入するように制御されるものである。

また、一次元目分析カラム１０ａは反応化合物よりも標的化合物であるタンパク質の方が先に溶出するように分子量により溶出速度が異なるように選択されたサイズ排除カラムである。ここでは一次元目分析カラム１０ａのサイズ排除カラムとしては、ＧＰＣ（Gel Permeation Chromatography）カラム又はＧＦＣ（Gel Filtration Chromatography）カラムを用いる。この実施例で用いるサイズ排除カラムの排除限界分子量は標的化合物とするタンパク質の分子量程度であり、その分子量以上の分子量をもつタンパク質とそれよりも分子量の小さい分析対象の反応化合物とを分離することができるものである。

試料注入ノズル３２ａは、図５（Ｂ）に示されるように、先にタンパク質３４を吸入し、その後反応化合物３６を吸入する。これにより、試料注入ノズル３２ａ内では、先端側に反応化合物３６の層、基端側に標的化合物３４の層が形成される。この状態で試料注入部８に試料注入を行なうと、先に反応化合物３６が注入され、その後に標的化合物であるタンパク質３４が注入される。試料注入部８に注入された試料は、注入された順に従い、反応化合物３６、タンパク質３４の順に一次元目分析カラム１０ａに移送される。
この実施の液体クロマトグラフを用いた分析動作は、図２〜図４を参照して示した第１の実施例と同じであるので、説明は割愛する。

図６（Ａ）〜（Ｃ）は一次元目分析カラム１０ａにおける試料の動きを示す図である。（Ａ）は一次元目分析カラム１０ａに試料が導入された直後の状態であるが、注入された順に従い、反応化合物３６が前方にあり、その後方にタンパク質３４がある。しかし、一次元目分析カラム１０ａ内では、排除限界分子量を超える分子量をもつ成分、即ちタンパク質３４は早い速度で移動し、排除限界分子量より小さい分子量をもつ反応化合物３６は遅い速度で移動するため、移動速度の差によって、一次元目分析カラム１０ａ内では（Ｂ）に示されるように、タンパク質３４の領域が反応化合物３６の領域を追い越していく。このとき、タンパク質３４と結合する反応化合物はタンパク質と結合して反応生成物３６ｂとなり、タンパク質３４とともに早い移動速度で移動していくが、タンパク質と結合しなかった反応化合物３６ａは遅い移動速度のまま移動していく。やがて、（Ｃ）に示されるように、タンパク質と結合して反応生成物３６ｂとなった領域は、タンパク質と結合しなかった未反応の反応化合物３６ａから分離されて一次元目分析カラム１０ａから溶出する。

その結果、図７に示されるように、タンパク質と結合した反応化合物の反応生成物３６ｂを含むタンパク質のピークと、それから分離された、反応しなかった反応化合物のピークとからなるクロマトグラムを得ることができる。

この実施例のスクリーニング装置では、反応生成物を含むタンパク質部分が溶出されて６ポートバルブ１２に到達するタイミングで、６ポートバルブ１２がポートａ−ｆ間，ｂ−ｃ間及びｄ−ｅ間が接続された状態（図２（Ａ）を参照）となるように切り替えられ、反応生成物を含むタンパク質部分がループ流路１４に送られて貯留される。反応生成物を含むタンパク質部分より遅れて溶出した未反応の反応化合物部分３６ａは、６ポートバルブ１２がポートａ−ｂ間，ｃ−ｄ間及びｅ−ｆ間が接続された状態（図２（Ｂ）を参照）に切り替えられることによりドレイン１５に排出される。

図８は図５の実施例において、一次元目分析カラムから溶出した成分を分析した結果を示す図であり、（Ａ）は予め標的化合物と反応化合物を混和して反応させた反応溶液を試料注入部８に注入した場合、（Ｂ）は同実施例にしたがい標的化合物と反応化合物を別々に試料注入部８に注入した場合である。

試料は、標的化合物のタンパク質としてＷＧＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を用い、反応化合物としてｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシド（０.１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。一次元目分析用移動相として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）／０.８％ＮａＣｌ溶液を用い、０.０５ｍＬ／分の流速で流した。また、一次元目分析カラム１０ａとして、長さが１５０ｍｍ、内径が２ｍｍのサイズ排除カラムであるシリカベースのＤＩＯＬカラム（株式会社島津製作所の製品）を用い、カラムオーブンの温度を２５℃とした。

また、（Ｂ）のクロマトグラムを得た測定では、試料としてタンパク質のＷＧＡを試料注入ノズル３２ａに３０μＬ吸入した後、続いてｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドを５μＬ吸入し、その後、試料注入部８に試料注入ノズル３２ａから試料を注入した。

図８（Ａ），（Ｂ）において、破線で示したピークはｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドのみを試料注入部に注入したときのピークを示している。図８（Ａ），（Ｂ）は横軸の縮尺が異なっているので、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドのピークが異なった位置に示されているが、両図においてそれらの保持時間は等しい。

図８（Ａ）に示すように、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドの溶出時間は、ＷＧＡの影響を受けつつも、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドのみを注入した場合に比べて、大きな変化は見られず、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドはタンパク質のＷＧＡから解離していることを示している。これに対して、（Ｂ）に示すように、この実施例により試料を注入した場合には、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドの溶出時間の位置にはピークがなく、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドはタンパク質のＷＧＡと反応してＷＧＡの溶出時間の位置にシフトしていることがわかる。

この結果から、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドとタンパク質のＷＧＡを試料とする場合には、予め両者を混和して反応溶液を調製した後に試料注入部８に注入すると、移動相により希釈されて解離してしまい、その反応生成物を分取することができないが、ｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドを先に注入し、その後からタンパク質のＷＧＡを注入するようにすれば、タンパク質のＷＧＡと反応するｐ‐ニトロフェニル‐ジ‐Ｎ‐アセチル‐β‐キトビオシドをスクリーニングできることがわかる。

以上の実施例では、検出器２８の下流側に質量分析計３０が設けられているものが示されているが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば検出器２８の下流側に試料を滴下するためのプローブを備え、プレートなどの試料容器に成分ごとに分画捕集するものであってもよい。

スクリーニング装置の一実施例を概略的に示す流路図である。 同実施例のスクリーニング装置における二次元液体クロマトグラフの一次元目分析工程の流路を示す図であり、（Ａ）は反応生成物を含むタンパク質を分画する場合、（Ｂ）は不要成分を排出する場合、をそれぞれ示す図である。 同実施例における反応化合物の濃縮工程を示す流路図である。 同実施例における二次元目分析工程の流路を示す図である。 スクリーニング装置の他の実施例を概略的に示す流路図である。 同実施例におけるサイズ排除カラムにおける試料の動きを示す図である。 同実施例におけるサイズ排除カラムからの溶出液から得られるクロマトグラムの一例を示す波形図である。 同実施例のスクリーニング装置において、一次元目分析カラムから溶出した成分を分析した結果を示す図であり、（Ａ）は予め標的化合物と反応化合物を混和して反応させた反応溶液を試料注入部に注入した場合、（Ｂ）は実施例により標的化合物と反応化合物を別々に試料注入部に注入した場合である。

符号の説明

２ａ，２ｂ，２ｃ，２ｄ 移動相用タンク
４ デガッサ
６，１６，１８ａ，１８ｂ 送液ポンプ
８ 試料注入部
１０，１０ａ 一次元目分析カラム
１２，２２ ６ポートバルブ
１４ 分画ループ
１５，２５ ドレイン
２０ ミキサ
２１ グラジエント送液機構
２４ トラップカラム
２６ 二次元目分析カラム
２８ 検出器
３０ 質量分析計
３２，３２ａ 試料注入ノズル
３４ 標的化合物
３６ 反応化合物
３６ｂ 反応生成物

Claims (9)

1. 工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に含んで標的化合物と結合する反応化合物を特定するスクリーニング方法。
   （Ａ）試料として標的化合物と反応化合物を試料注入部に注入し、試料注入部に注入されたその試料を一次元目分析用移動相で一次元目分析カラムに導いて試料成分に分離する一次元目分析工程、
   （Ｂ）分離された試料成分のうち標的化合物と反応化合物とが結合した反応生成物を含む部分をループ流路に分画する分画工程、
   （Ｃ）前記反応生成物から前記反応化合物を解離させる溶媒を濃縮用移動相として、前記分画工程により分画された反応生成物から反応化合物を解離させながら該反応化合物を選択的に捕捉するトラップカラムへ導く反応化合物濃縮工程、及び
   （Ｄ）前記トラップカラムに捕捉された試料を二次元目分析用移動相により二次元目分析力ラムに導いて分析する二次元目分析工程。
2. 前記試料注入部に注入する試料は、標的化合物と反応化合物を予め反応させた反応溶液である請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. 前記試料注入部に注入する試料は標的化合物自体とそれより分子量の小さい反応化合物自体であり、
   前記試料注入部への注入は反応化合物を先に注入し、次いで標的化合物を注入する順序で行ない、
   前記一次元目分析カラムとして前記反応化合物よりも前記標的化合物の方が先に溶出するように分子量により溶出速度が異なるように選択されたサイズ排除カラムを用い、
   それにより前記一次元目分析カラムでは後で注入された標的化合物が反応化合物より先に流出することにより前記一次元目分析カラム中で標的化合物と反応化合物とを反応させるようにした請求項１に記載のスクリーニング方法。
4. 前記反応化合物濃縮工程では、分画された反応生成物を濃縮用移動相により前記トラップカラムへ導く際にさらに前記濃縮用移動相を混合する請求項１から３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
5. 前記標的化合物はタンパク質である請求項１から４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
6. 試料注入部から注入された試料を一次元目分析用移動相で一次元目分析カラムに導いて試料成分に分離する一次元目分析流路と、
   前記試料注入部に試料を注入する試料供給装置と、
   分離された試料成分のうち標的化合物と反応化合物とが結合した反応生成物を含む部分をループ流路に分画する分画流路と、
   前記反応生成物から前記反応化合物を解離させる溶媒を濃縮用移動相として、前記分画流路で分画された反応生成物から反応化合物を解離させながら該反応化合物を選択的に捕捉するトラップカラムへ導く反応化合物濃縮流路と、
   前記トラップカラムに捕捉された試料を二次元目分析用移動相により二次元目分析力ラムに導いて分析する二次元目分析流路と、を備えた二次元液体クロマトグラフを備えて標的化合物と結合する反応化合物を特定するスクリーニング装置。
7. 前記試料供給装置は試料として標的化合物と反応化合物の反応溶液を注入するように制御される請求項６に記載のスクリーニング装置。
8. 前記試料供給装置は試料として標的化合物自体とそれより分子量の小さい反応化合物自体を別個に、かつ反応化合物を先に注入し、その後に標的化合物を注入するように制御され、
   前記一次元目分析カラムは前記反応化合物よりも前記標的化合物の方が先に溶出するように分子量により溶出速度が異なるように選択されたサイズ排除カラムであり、
   それにより前記一次元目分析カラムでは後で注入された標的化合物が反応化合物より先に流出することにより前記一次元目分析カラム中で標的化合物と反応化合物とが反応する請求項６に記載のスクリーニング装置。
9. 前記反応化合物濃縮流路は、分画された反応生成物を濃縮用移動相により移送する流路にさらに前記濃縮用移動相を混合する流路を備えた請求項６から８のいずれかに記載のスクリーニング装置。
   

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