JPH09127088A - 生体試料の分析方法 - Google Patents
生体試料の分析方法Info
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- JPH09127088A JPH09127088A JP7285971A JP28597195A JPH09127088A JP H09127088 A JPH09127088 A JP H09127088A JP 7285971 A JP7285971 A JP 7285971A JP 28597195 A JP28597195 A JP 28597195A JP H09127088 A JPH09127088 A JP H09127088A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liquid chromatography
- packing material
- filler
- column
- biological sample
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- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体試料を短時間で分離性良く分析し得る液
体クロマトグラフィー法による生体試料の分析方法を提
供する。 【解決手段】 生体試料を、逆相分配液体クロマトグラ
フィー用充填剤（Ａ）（例、フェニル基をもつスチレン
系ポリマー）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上
記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対するクロマトグラム
を改良し得る充填剤（Ｂ）（例、オクタデシル基をもつ
シリカからなる逆相分配液体クロマトグラフィー用充填
剤、ＣＯＯＨ基をもつアクリル系ポリマーからなるカチ
オン交換系充填剤など）とが一本のカラムに充填されて
なる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体ク
ロマトグラフィー分析を行うことを特徴とする。
体クロマトグラフィー法による生体試料の分析方法を提
供する。 【解決手段】 生体試料を、逆相分配液体クロマトグラ
フィー用充填剤（Ａ）（例、フェニル基をもつスチレン
系ポリマー）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上
記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対するクロマトグラム
を改良し得る充填剤（Ｂ）（例、オクタデシル基をもつ
シリカからなる逆相分配液体クロマトグラフィー用充填
剤、ＣＯＯＨ基をもつアクリル系ポリマーからなるカチ
オン交換系充填剤など）とが一本のカラムに充填されて
なる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体ク
ロマトグラフィー分析を行うことを特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は液体クロマトグラフ
ィー法による生体試料の分析方法に関する。
ィー法による生体試料の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料の分析において液体クロマトグ
ラフィー分析は汎用されている分析手法の一つである。
この液体クロマトグラフィー分析、例えば、ＨＰＬＣ
（高性能液体クロマトグラフィー）分析は、一般に逆相
分配系液体クロマトグラフィーがよく用いられている。
逆相分配系液体クロマトグラフィーとは、極性の低い液
体を固定相とし、これと自由に混ざらない、例えば、水
やメタノールなどのように極性の高い液体を移動相とす
る液体クロマトグラフィーのことであり、固定相用の充
填剤としては逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤
が使用され、例えば、官能基として、オクチル基、オク
タデシル基のような直鎖アルキル基をもつものや、フェ
ニル基などをもつ充填剤が使用される。
ラフィー分析は汎用されている分析手法の一つである。
この液体クロマトグラフィー分析、例えば、ＨＰＬＣ
（高性能液体クロマトグラフィー）分析は、一般に逆相
分配系液体クロマトグラフィーがよく用いられている。
逆相分配系液体クロマトグラフィーとは、極性の低い液
体を固定相とし、これと自由に混ざらない、例えば、水
やメタノールなどのように極性の高い液体を移動相とす
る液体クロマトグラフィーのことであり、固定相用の充
填剤としては逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤
が使用され、例えば、官能基として、オクチル基、オク
タデシル基のような直鎖アルキル基をもつものや、フェ
ニル基などをもつ充填剤が使用される。
【０００３】この生体試料の分析で得られるクロマトグ
ラムにおいて、分析時間を短くすると分離が悪くなると
いう問題があった。生体試料の分析において各ピークの
保持時間の短縮、各ピークの分離性等のクロマトグラム
を改良したい場合、その方法としては、溶離液種類、測
定温度またはカラムサイズの変更など種々あるが、特に
充填剤の改良が最も効果的である。しかし、目的にあっ
た充填剤を新たに製造し、それを用いてクロマトグラム
を改良することは、他の方法に比べると煩雑であり容易
なことではない。
ラムにおいて、分析時間を短くすると分離が悪くなると
いう問題があった。生体試料の分析において各ピークの
保持時間の短縮、各ピークの分離性等のクロマトグラム
を改良したい場合、その方法としては、溶離液種類、測
定温度またはカラムサイズの変更など種々あるが、特に
充填剤の改良が最も効果的である。しかし、目的にあっ
た充填剤を新たに製造し、それを用いてクロマトグラム
を改良することは、他の方法に比べると煩雑であり容易
なことではない。
【０００４】また、液体クロマトグラフィーの分析手法
を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本
のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示さ
れている。例えば、特開平６−２７３４０１号公報に
は、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を
備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてア
ルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切
り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出
させて分析を行う、イオン交換液体クロマトグラフィー
による陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されて
いるが、これは、カラムを交換することなく両方のイオ
ン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対
象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。ま
た、これは、イオン交換系液体クロマトグラフィーに関
するものであり、逆相分配系液体クロマトグラフィーで
はなく、生体試料の分析には適用され得ない。
を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本
のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示さ
れている。例えば、特開平６−２７３４０１号公報に
は、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を
備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてア
ルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切
り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出
させて分析を行う、イオン交換液体クロマトグラフィー
による陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されて
いるが、これは、カラムを交換することなく両方のイオ
ン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対
象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。ま
た、これは、イオン交換系液体クロマトグラフィーに関
するものであり、逆相分配系液体クロマトグラフィーで
はなく、生体試料の分析には適用され得ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料を
短時間で分離性良く分析し得る液体クロマトグラフィー
法による分析方法を提供することにある。
に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料を
短時間で分離性良く分析し得る液体クロマトグラフィー
法による分析方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】請求項１記載の生体試料
の分析方法（以下、請求項１記載の発明を本発明１とい
う）は、生体試料を含有する試料を、逆相分配液体クロ
マトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）と
は異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対す
るクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが一本の
カラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラ
ムに導入し、液体クロマトグラフィー分析を行うことを
特徴とする。
の分析方法（以下、請求項１記載の発明を本発明１とい
う）は、生体試料を含有する試料を、逆相分配液体クロ
マトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）と
は異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対す
るクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが一本の
カラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラ
ムに導入し、液体クロマトグラフィー分析を行うことを
特徴とする。
【０００７】本発明１でいうクロマトグラムの改良と
は、例えば、各ピークの保持時間の短縮、各ピークの分
離性、ピークのシャープさなどを言う。
は、例えば、各ピークの保持時間の短縮、各ピークの分
離性、ピークのシャープさなどを言う。
【０００８】本発明１で使用される充填剤（Ａ）は、生
体試料の分離に主に作用する充填剤であり、逆相分配液
体クロマトグラフィー用充填剤に限定される。
体試料の分離に主に作用する充填剤であり、逆相分配液
体クロマトグラフィー用充填剤に限定される。
【０００９】上記充填剤（Ａ）としては、逆相分配液体
クロマトグラフィー用充填剤であれば特に制限はなく、
公知のいずれもが使用可能である。逆相分配液体クロマ
トグラフィー用充填剤とは、前述の逆相分配系液体クロ
マトグラフィーに使用される充填剤のことであり、例え
ば、官能基として、オクチル基、オクタデシル基のよう
な直鎖アルキル基をもつものや、フェニル基などをもつ
充填剤である。上記充填剤（Ａ）の骨格の素材として
も、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可
能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のい
ずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、ア
クリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系
の素材としては、例えば、セルロース系、キトサン系、
ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとして
は、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
クロマトグラフィー用充填剤であれば特に制限はなく、
公知のいずれもが使用可能である。逆相分配液体クロマ
トグラフィー用充填剤とは、前述の逆相分配系液体クロ
マトグラフィーに使用される充填剤のことであり、例え
ば、官能基として、オクチル基、オクタデシル基のよう
な直鎖アルキル基をもつものや、フェニル基などをもつ
充填剤である。上記充填剤（Ａ）の骨格の素材として
も、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可
能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のい
ずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、ア
クリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系
の素材としては、例えば、セルロース系、キトサン系、
ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとして
は、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００１０】本発明１で使用される充填剤（Ｂ）は、上
記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の生
体試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤に限
定される。上記充填剤（Ｂ）の選択範囲としては、上記
のように限定された範囲内のものであれば、従来から液
体クロマトグラフィー用充填剤として使用されてきたい
ずれの充填剤も使用可能であり、具体的には、逆相分配
液体クロマトグラフィー用充填剤、イオン交換液体クロ
マトグラフィー用充填剤、順相分配液体クロマトグラフ
ィー用充填剤、その他（アパタイトや官能基なしなど）
が挙げられる。また、上記充填剤（Ｂ）の骨格の素材と
しても、特に限定されず、例えば、前述の充填剤（Ａ）
の骨格の素材として例示したものが例示される。また、
充填剤（Ｂ）は、２種以上混合されて使用されてもよ
い。
記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の生
体試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤に限
定される。上記充填剤（Ｂ）の選択範囲としては、上記
のように限定された範囲内のものであれば、従来から液
体クロマトグラフィー用充填剤として使用されてきたい
ずれの充填剤も使用可能であり、具体的には、逆相分配
液体クロマトグラフィー用充填剤、イオン交換液体クロ
マトグラフィー用充填剤、順相分配液体クロマトグラフ
ィー用充填剤、その他（アパタイトや官能基なしなど）
が挙げられる。また、上記充填剤（Ｂ）の骨格の素材と
しても、特に限定されず、例えば、前述の充填剤（Ａ）
の骨格の素材として例示したものが例示される。また、
充填剤（Ｂ）は、２種以上混合されて使用されてもよ
い。
【００１１】充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとし
ては、上記充填剤（Ｂ）が逆相分配液体クロマトグラフ
ィー用充填剤である場合としては、充填剤（Ａ）と充填
剤（Ｂ）の官能基同士が異なる例としては、例えば、オ
クタデシル基をもつ充填剤とフェニル基をもつ充填剤の
組合せ、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の骨格素材が異な
る例としては、オクタデシル基をもつポリマー系充填剤
とオクタデシル基をもつシリカ系充填剤の組合せが挙げ
られる。また、さらに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の生
体試料の分離に関与する官能基が同じであり、骨格素材
も同じであり、ただ充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）が同一
物でない場合も含まれる。このような場合としては、例
えば、用いる素材が同一のものでも、その使用量が異な
る場合、或いはポリマー系の素材の場合であって重合条
件（重合温度、時間など）が異なる場合など、処方が異
なれば同一物でなく、このようなものを組み合わせて充
填剤（Ａ）のクロマトグラムを充填剤（Ｂ）によって改
良し得る場合である。
ては、上記充填剤（Ｂ）が逆相分配液体クロマトグラフ
ィー用充填剤である場合としては、充填剤（Ａ）と充填
剤（Ｂ）の官能基同士が異なる例としては、例えば、オ
クタデシル基をもつ充填剤とフェニル基をもつ充填剤の
組合せ、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の骨格素材が異な
る例としては、オクタデシル基をもつポリマー系充填剤
とオクタデシル基をもつシリカ系充填剤の組合せが挙げ
られる。また、さらに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の生
体試料の分離に関与する官能基が同じであり、骨格素材
も同じであり、ただ充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）が同一
物でない場合も含まれる。このような場合としては、例
えば、用いる素材が同一のものでも、その使用量が異な
る場合、或いはポリマー系の素材の場合であって重合条
件（重合温度、時間など）が異なる場合など、処方が異
なれば同一物でなく、このようなものを組み合わせて充
填剤（Ａ）のクロマトグラムを充填剤（Ｂ）によって改
良し得る場合である。
【００１２】充填剤（Ｂ）が逆相分配液体クロマトグラ
フィー用充填剤以外である場合としては、イオン交換液
体クロマトグラフィー用充填剤、順相分配液体クロマト
グラフィー用充填剤又はアパタイトが好ましい。上記イ
オン交換液体クロマトグラフィー用充填剤としては、カ
チオン交換基又はアニオン交換基をもつ充填剤が選ば
れ、カチオン交換基をもつものとしては、例えば、官能
基として−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3 Ｈなどをもつ充填剤が挙
げられ、アニオン交換基をもつものとしては、例えば、
官能基として−ＮＲ2 、−ＮＲ3 （Ｒは水素原子又はア
ルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。また、上記
順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤としては、例
えば、官能基として−ＮＨ2 、−ＣＮ、−ＯＨなどをも
つ充填剤が挙げられる。
フィー用充填剤以外である場合としては、イオン交換液
体クロマトグラフィー用充填剤、順相分配液体クロマト
グラフィー用充填剤又はアパタイトが好ましい。上記イ
オン交換液体クロマトグラフィー用充填剤としては、カ
チオン交換基又はアニオン交換基をもつ充填剤が選ば
れ、カチオン交換基をもつものとしては、例えば、官能
基として−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3 Ｈなどをもつ充填剤が挙
げられ、アニオン交換基をもつものとしては、例えば、
官能基として−ＮＲ2 、−ＮＲ3 （Ｒは水素原子又はア
ルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。また、上記
順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤としては、例
えば、官能基として−ＮＨ2 、−ＣＮ、−ＯＨなどをも
つ充填剤が挙げられる。
【００１３】充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比
率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填
剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含
有量は、５０重量％以下が好ましい。
率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填
剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含
有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００１４】本発明１で用いられるカラムは、従来から
液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられている
ものであれば、特に制限されないが、直径１〜２０ｍ
ｍ、長さ２０〜５００ｍｍのステンレス管が好ましい。
液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられている
ものであれば、特に制限されないが、直径１〜２０ｍ
ｍ、長さ２０〜５００ｍｍのステンレス管が好ましい。
【００１５】本発明１で用いられる液体クロマトグラフ
ィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤
（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序とし
ては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充
填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層
状態でカラム内に存在することになる）してもよい。ま
た、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的に
は、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合っ
た量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの
入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は
定圧送液して充填する方法が挙げられる。
ィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤
（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序とし
ては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充
填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層
状態でカラム内に存在することになる）してもよい。ま
た、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的に
は、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合っ
た量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの
入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は
定圧送液して充填する方法が挙げられる。
【００１６】本発明１で分析される生体試料としては、
動物や植物などの生体に含まれる試料であれば、特に限
定されず、例えば、ヒト又は動物の血液、尿などの体
液；植物も含む生物一般の組織中の物質やその代謝物な
どが挙げられる。また、その生体試料中の具体的に測定
される物質としては、例えば、蛋白質、ペプチド、核
酸、酵素、脂質、色素などが挙げられる。
動物や植物などの生体に含まれる試料であれば、特に限
定されず、例えば、ヒト又は動物の血液、尿などの体
液；植物も含む生物一般の組織中の物質やその代謝物な
どが挙げられる。また、その生体試料中の具体的に測定
される物質としては、例えば、蛋白質、ペプチド、核
酸、酵素、脂質、色素などが挙げられる。
【００１７】本発明１の生体試料の分析方法は、分析に
使用するカラムとして、上述の液体クロマトグラフィー
用カラムを使用することの他は、従来の液体クロマトグ
ラフィー法による生体試料の分析方法と同様である。以
下、本発明１の生体試料の分析方法について詳述する。
使用するカラムとして、上述の液体クロマトグラフィー
用カラムを使用することの他は、従来の液体クロマトグ
ラフィー法による生体試料の分析方法と同様である。以
下、本発明１の生体試料の分析方法について詳述する。
【００１８】図１は、上述の液体クロマトグラフィー用
カラムを使用して生体試料の分析をする際の装置の構成
の一例である。液体クロマトグラフィー用カラム１に移
動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サンプラー
４から生体試料を導入する。液体クロマトグラフィー用
カラム１によって分離された試料は、検出器５よって検
出され、その結果が記録計６に記録される。なお、生体
試料に必要に応じて公知の前処理が施されてもよい。
カラムを使用して生体試料の分析をする際の装置の構成
の一例である。液体クロマトグラフィー用カラム１に移
動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サンプラー
４から生体試料を導入する。液体クロマトグラフィー用
カラム１によって分離された試料は、検出器５よって検
出され、その結果が記録計６に記録される。なお、生体
試料に必要に応じて公知の前処理が施されてもよい。
【００１９】上記移動相としては、逆相分配モードにお
ける公知の溶離液が用いられる。例えば、水系では、無
機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸など）および／
またはこれらの塩よりなる緩衝液などが用いられる。ま
た、有機溶媒系では、例えば、メタノール、エタノー
ル、アセトニトリルなどが用いられる。また、水と有機
溶媒の混合系も用いられる。移動相の通液する速度（流
速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ程度が選ばれ
る。
ける公知の溶離液が用いられる。例えば、水系では、無
機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸など）および／
またはこれらの塩よりなる緩衝液などが用いられる。ま
た、有機溶媒系では、例えば、メタノール、エタノー
ル、アセトニトリルなどが用いられる。また、水と有機
溶媒の混合系も用いられる。移動相の通液する速度（流
速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ程度が選ばれ
る。
【００２０】上記の分離については、公知の方法が採用
され、適当濃度の移動相により試料が分離溶出される。
また、クロマトグラムの改良ため、分析途中で溶離液濃
度や流速等を変えることもできる。また、液体クロマト
グラフィー用カラム等を恒温槽内に設置することもでき
る。
され、適当濃度の移動相により試料が分離溶出される。
また、クロマトグラムの改良ため、分析途中で溶離液濃
度や流速等を変えることもできる。また、液体クロマト
グラフィー用カラム等を恒温槽内に設置することもでき
る。
【００２１】上記の検出についても公知の技術が用いら
れ、例えば、紫外可視分光光度計などが好適に使用され
る。
れ、例えば、紫外可視分光光度計などが好適に使用され
る。
【００２２】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を説明す
る。実施例における分析装置は、前記図１のように構成
して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。 送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。 サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、
ＡＳＵ−４２０。 検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰ
Ｄ−６ＡＶ。
る。実施例における分析装置は、前記図１のように構成
して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。 送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。 サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、
ＡＳＵ−４２０。 検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰ
Ｄ−６ＡＶ。
【００２３】実施例において使用した充填剤は、以下の
通りである。 充填剤 逆相−１ 市販の逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｍｉ
ｃｒｏｎｅｘ ＲＰ−３０、積水化学工業社製）。骨格
の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基
としてフェニル基を有している。
通りである。 充填剤 逆相−１ 市販の逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｍｉ
ｃｒｏｎｅｘ ＲＰ−３０、積水化学工業社製）。骨格
の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基
としてフェニル基を有している。
【００２４】充填剤 逆相−２ 市販の逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（ＴＳ
Ｋｇｅｌ ＯＤＳ、東ソ−社製）。骨格の素材として、
シリカが使用され、官能基としてオクタデシル基を有し
ている。
Ｋｇｅｌ ＯＤＳ、東ソ−社製）。骨格の素材として、
シリカが使用され、官能基としてオクタデシル基を有し
ている。
【００２５】充填剤 カチオン−１ 以下のように、特開平３−７３８４８号公報の方法によ
りカチオン交換充填剤を製造した。ジエチレングリコー
ルジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベン
ゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１
ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成
社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入し、
８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、アクリ
ル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間重合
した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗浄
し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級し
て６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−１
とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯＯ
Ｈを有する。
りカチオン交換充填剤を製造した。ジエチレングリコー
ルジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベン
ゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１
ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成
社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入し、
８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、アクリ
ル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間重合
した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗浄
し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級し
て６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−１
とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯＯ
Ｈを有する。
【００２６】（実施例１、２、比較例１） 液体クロマトグラフィー用カラムの製造 表１に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表１に示
した使用量（ｇ）で３０ｍｌの５０重量％エタノール水
溶液に分散した（比較例１は、充填剤（Ａ）のみ使
用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラム
を接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に
上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ
−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカ
ラムを製造した。
した使用量（ｇ）で３０ｍｌの５０重量％エタノール水
溶液に分散した（比較例１は、充填剤（Ａ）のみ使
用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラム
を接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に
上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ
−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカ
ラムを製造した。
【００２７】
【表１】
【００２８】生体試料の分離 上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取り
つけた装置で、生体試料として蛋白質標品（リボヌクレ
アーゼ、チトクロームＣ、リゾチーム、牛血清アルブミ
ン、ミオグロビン及びオブアルブミンを含有）を水に溶
解したものを分析した。溶出は、５容量％アセトニトリ
ル水溶液（ｐＨ２．３）に、８０容量％アセトニトリル
水溶液（ｐＨ２．０）を混合するリニアグラジエント法
にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。検出は
２２０ｎｍの吸光度測定にて行った。実施例１で得られ
たクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたクロマ
トグラムを図３に示した。なお、実施例２のクロマトグ
ラムも実施例１のクロマトグラムとほぼ同様であった。
なお、図２及び３における各ピークは、１１リボヌクレ
アーゼ、１２チトクロームＣ、１３リゾチーム、１４牛
血清アルブミン、１５ミオグロビン、１６オブアルブミ
ンである。
つけた装置で、生体試料として蛋白質標品（リボヌクレ
アーゼ、チトクロームＣ、リゾチーム、牛血清アルブミ
ン、ミオグロビン及びオブアルブミンを含有）を水に溶
解したものを分析した。溶出は、５容量％アセトニトリ
ル水溶液（ｐＨ２．３）に、８０容量％アセトニトリル
水溶液（ｐＨ２．０）を混合するリニアグラジエント法
にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。検出は
２２０ｎｍの吸光度測定にて行った。実施例１で得られ
たクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたクロマ
トグラムを図３に示した。なお、実施例２のクロマトグ
ラムも実施例１のクロマトグラムとほぼ同様であった。
なお、図２及び３における各ピークは、１１リボヌクレ
アーゼ、１２チトクロームＣ、１３リゾチーム、１４牛
血清アルブミン、１５ミオグロビン、１６オブアルブミ
ンである。
【００２９】
【発明の効果】本発明１〜３の生体試料の分析方法の構
成は上記の通りであり、生体試料のクロマトグラムの改
良がなされ得、生体試料を短時間で分離性良く分析し得
る。また、本発明１〜３の生体試料の分析方法に使用さ
れる液体クロマトグラフィー用カラムは、逆相分配液体
クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤
（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試
料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）と
が一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィ
ー用カラムであり、その製造が容易である。従って、本
発明１〜３の生体試料の分析方法は、簡便な方法でより
正確に生体試料を分析できる方法である。
成は上記の通りであり、生体試料のクロマトグラムの改
良がなされ得、生体試料を短時間で分離性良く分析し得
る。また、本発明１〜３の生体試料の分析方法に使用さ
れる液体クロマトグラフィー用カラムは、逆相分配液体
クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤
（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試
料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）と
が一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィ
ー用カラムであり、その製造が容易である。従って、本
発明１〜３の生体試料の分析方法は、簡便な方法でより
正確に生体試料を分析できる方法である。
【００３０】
【図１】本発明の生体試料の分析を行う際の装置の構成
の一例である。
の一例である。
【図２】実施例１のクロマトグラムである。
【図３】比較例１のクロマトグラムである。
１ 液体クロマトグラフィー用カラム ２ 移動相 ３ 送液ポンプ ４ サンプラー ５ 検出器 ６ 記録計
Claims (3)
- 【請求項１】 生体試料を含有する試料を、逆相分配液
体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤
（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試
料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）と
が一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィ
ー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィー分析を行
うことを特徴とする生体試料の分析方法。 - 【請求項２】 前記充填剤（Ｂ）が逆相分配液体クロマ
トグラフィー用充填剤である請求項１記載の生体試料の
分析方法。 - 【請求項３】 前記充填剤（Ｂ）がイオン交換液体クロ
マトグラフィー用充填剤、順相分配液体クロマトグラフ
ィー用充填剤又はアパタイトである請求項１記載の生体
試料の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28597195A JP3561352B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 生体試料の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28597195A JP3561352B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 生体試料の分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09127088A true JPH09127088A (ja) | 1997-05-16 |
| JP3561352B2 JP3561352B2 (ja) | 2004-09-02 |
Family
ID=17698345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28597195A Expired - Fee Related JP3561352B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 生体試料の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3561352B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004177180A (ja) * | 2002-11-25 | 2004-06-24 | Chemicals Evaluation & Research Institute | 液体クロマトグラフ用カラム |
| JP2006159148A (ja) * | 2004-12-10 | 2006-06-22 | Nagoya Institute Of Technology | クロマトグラフィー用カラムおよび電気クロマトグラフィー用カラム |
| JP2007205871A (ja) * | 2006-02-01 | 2007-08-16 | Shiseido Co Ltd | 高速液体クロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた分析方法 |
| WO2008023534A1 (en) * | 2006-08-23 | 2008-02-28 | Ngk Insulators, Ltd. | Porous silica column, analysis method using the same and method of diagnosing diabetes |
| CN110849992A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-28 | 北京彤程创展科技有限公司 | 苯乙烯含量的测定方法及其应用 |
-
1995
- 1995-11-02 JP JP28597195A patent/JP3561352B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004177180A (ja) * | 2002-11-25 | 2004-06-24 | Chemicals Evaluation & Research Institute | 液体クロマトグラフ用カラム |
| JP2006159148A (ja) * | 2004-12-10 | 2006-06-22 | Nagoya Institute Of Technology | クロマトグラフィー用カラムおよび電気クロマトグラフィー用カラム |
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| WO2008023534A1 (en) * | 2006-08-23 | 2008-02-28 | Ngk Insulators, Ltd. | Porous silica column, analysis method using the same and method of diagnosing diabetes |
| CN110849992A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-28 | 北京彤程创展科技有限公司 | 苯乙烯含量的测定方法及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3561352B2 (ja) | 2004-09-02 |
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