JP3429709B2 - 安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビン類の
測定方法に関し、より詳細には安定型ヘモグロビンＡ１
ｃの測定を目的とした、陽イオン交換液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃ
と略す）は、すべてのヘモグロビンに対するその構成比
率が、過去１〜２カ月間の平均的な血糖値（血液中のグ
ルコース濃度）を反映しているため、糖尿病のスクリー
ニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握する検査
項目として繁用されている。

【０００３】ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモ
グロビンＡ（以下、ＨｂＡと略す）とが反応して生成さ
れた糖化ヘモグロビン( 以下、ＧＨｂと略す) であり、
可逆的に反応したものを不安定型ＨｂＡ１ｃ（unstable
HbA1c）と呼び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に
反応したものを安定型ＨｂＡ１ｃ(stable HbA1c)と呼ん
でいる。

【０００４】普通、ヘモグロビンは２種類のサブユニッ
ト２つずつから構成される４量体のタンパク質である。
ＨｂＡのサブユニットはα鎖とβ鎖であり、このβ鎖の
Ｎ末端アミノ酸にグルコースが結合したものがＨｂＡ１
ｃである。過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を良く反
映するのは安定型ＨｂＡ１ｃであり、臨床検査分野で
は、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）を得ることがで
きる測定法の開発が望まれている。

【０００５】従来、ＨｂＡ１ｃの主な測定法としては、
血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン
類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異
なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロ
マトグラフィー（以下、ＬＣと略す）が用いられてき
た。（例えば、日本国・特公平８−７１９８号公報
等）。

【０００６】陽イオン交換ＬＣにより、十分な時間を掛
けて溶血試料中のヘモグロビン類を分離すると、通常は
ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａと略す）及びヘ
モグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂと略す）、ヘモグ
ロビンＦ（以下、ＨｂＦと略す）、不安定型ＨｂＡ１
ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０（以下、Ｈ
ｂＡ０と略す）の順に溶離されてくる。ＨｂＡ１ａ、Ｈ
ｂＡ１ｂ及びＨｂＡ１ｃはＨｂＡが糖化されたＧＨｂ、
ＨｂＦはα鎖とγ鎖から成る胎児性ヘモグロビン、Ｈｂ
Ａ０はＨｂＡを主成分とする一群のヘモグロビン成分で
あって、ＨｂＡ１ｃより強くカラムに保持されたもので
ある。

【０００７】従来の技術では、安定型ＨｂＡ１ｃから不
安定型ＨｂＡ１ｃを十分に分離することができないばか
りでなく、時にアセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂ
と略す）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂと
略す）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型ＨｂＡ１ｃと
重なって溶離してくるという問題があった。

【０００８】すなわち、陽イオン交換ＬＣによる安定型
ＨｂＡ１ｃ値（％）の測定を目的として、血液検体のヘ
モグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値
に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動
が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂ
ピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが
困難であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高精
度に安定型ＨｂＡ１ｃを測定するために、上述した従来
技術の欠点を解消し、短時間でしかも分離能に優れたヘ
モグロビン類の測定方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明（以
下、 本発明１という）は、ホウ酸交換基を有する充填剤
を併用しない陽イオン交換液体クロマトグラフィーによ
る安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法において、トリ
ブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン
酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ
酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、バリウムイオ
ン、セシウムイオン及びグアニジンイオンからなる群よ
り選ばれる少なくとも１種であるカオトロピックイオン
を含有し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機
酸、有機酸及び／またはこれらの塩を含む溶離液を用い
ることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方
法である。

【００１１】

【００１２】請求項２記載の発明は、請求項１に記載の
安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、測定目
的のピークを分離するのに際し、ｐＨの異なる少なくと
も２種以上の溶離液を用い、該ｐＨの異なる少なくとも
２種以上の溶離液が、同一の緩衝剤を含むものであるこ
とを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法で
ある。

【００１３】請求項３記載の発明は、請求項１または２
に記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であっ
て、ＨｂＡ０を溶出するために、カラムに流入する際の
ｐＨがヘモグロビンの等電点と等しいか、または等電点
よりアルカリ側になる溶離液を用いることを特徴とする
安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。

【００１４】

【００１５】

【００１６】請求項４記載の発明は、請求項３に記載の
安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、前記溶
離液のｐＨが６．８以上であることを特徴とする安定型
ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。

【００１７】請求項５記載の発明は、請求項１〜４のい
ずれか１項に記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方
法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモ
グロビン類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を用
いることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定
方法である。

【００１８】請求項６記載の発明は、請求項５に記載の
安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、ヘモグ
ロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出
に、少なくとも溶出力の異なる２種以上の溶離液を用
い、 溶出力の弱い溶離液から順に送液することを特徴と
する安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。

【００１９】請求項７記載の発明は、請求項１〜６のい
ずれか１項に記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方
法であって、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を
用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前
に、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を
送液することを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの
測定方法である。

【００２０】請求項８記載の発明は、請求項１〜７のい
ずれか１項に記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方
法であって、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によ
って送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下さ
せることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定
方法である。

【００２１】以下、本発明１の詳細を説明する。本発明
１で用いられる溶離液は、カオトロピックイオンを含有
し、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、
有機酸及び／またはこれらの塩を含む。

【００２２】上記カオトロピックイオンとは、化合物が
水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであ
り、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したとき
に起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。

【００２３】上記カオトロピックイオンとしては、トリ
ブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン
酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ
酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、バリウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオ
ンのうちの少なくとも１種が用いられる。

【００２４】上記カオトロピックイオンの中でも、より
好ましくは、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝
酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。

【００２５】上記溶離液中のカオトロピックイオンの濃
度が、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定にお
いて、分離効果が低下するおそれがあり、また、３００
０ｍＭよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ
以上向上しないので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ま
しく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、更に、１
０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。

【００２６】また、カオトロピックイオンは複数種混合
して用いても良い。上記カオトロピックイオンは、測定
試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に
添加しても良い。

【００２７】本発明１においては、溶離液に用いる緩衝
能を有する物質として、無機酸、有機酸またはこれらの
塩が含まれる。上記無機酸としては、例えば、炭酸、リ
ン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カ
ルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキ
シカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が
挙げられる。

【００２８】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸として
は、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられ
る。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−
ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が
挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミ
ノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン
等が挙げられる。

【００２９】上記無機酸または有機酸の塩としては、公
知のもので良く、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等
が挙げられる。

【００３０】上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、
複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合し
て用いても良い。

【００３１】上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの
塩の溶離液中の濃度、複数種用いる場合には複数種の合
計の濃度は、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝
作用があれば良く、１〜１０００ｍＭが好ましく、１０
〜５００ｍＭが特に好ましい。

【００３２】本発明１においては、上記溶離液のｐＨ
は、４．０〜６．８に限定され、好ましくは４．５〜
５．８である。溶離液のｐＨが４未満であると、ヘモグ
ロビン類が変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超え
ると、ヘモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン
交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が
悪くなる。

【００３３】上記溶離液には、以下の物質を添加しても
良い。

【００３４】（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特
に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭであ
る。

【００３５】（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基
を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、
硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、
水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。こ
れらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好まし
くは、０．００１〜５００ｍＭである。

【００３６】（３）メタノール、エタノール、アセトニ
トリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良
い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、
好ましくは０〜８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピッ
クイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない
程度で用いるのが好ましい。

【００３７】（４）アジ化ナトリウム、チモール等の防
腐剤を添加しても良い。

【００３８】（５）ヘモグロビンの安定剤として、公知
の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム
等の還元剤・酸化防止剤等を添加しても良い。

【００３９】以下、本発明２の詳細を説明する。本発明
２では、上記カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解
離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９の範囲及び
６．４０〜１０．５０の範囲にある緩衝剤を含有する溶
離液が用いられる。

【００４０】本発明２において用いられるカオトロピッ
クイオンとその濃度等については、本発明１の場合と同
様であるため、上述した本発明１におけるカオトロピッ
クイオンについての説明を援用することにより省略す
る。

【００４１】本発明２において、上記緩衝剤としては、
酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９及び６．
４０〜１０．５０の範囲に存在するものが用いられる。
すなわち、緩衝剤として、ｐＫａを、２．１５〜６．３
９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つず
つもつ単一の物質を用いても良く、あるいは、２．１５
〜６．３９の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質
と６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫ
ａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いても良
い。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良
い。

【００４２】上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的の
ピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近におい
て、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜
６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲が好ましく、
より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１
０．００の範囲である。さらに好ましくは、３．５０〜
６．２５及び７．００〜９．５０の範囲である。

【００４３】上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホ
ウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン
酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリ
ンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダ
ゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。ま
た、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、
カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジ
ン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピ
リジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリ
ン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。

【００４４】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。

【００４５】上記ジカルボン酸としては、例えば、マロ
ン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン
酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。

【００４６】上記カルボン酸誘導体としては、例えば、
β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，
５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビ
ン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙
げられる。

【００４７】上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられ
る。

【００４８】上記アニリンまたはアニリン誘導体として
は、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられ
る。

【００４９】上記アミノ酸としては、例えば、アスパラ
ギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−
アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられ
る。

【００５０】上記アミン類としては、例えば、エチレン
ジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエ
タノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類と
しては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシ
イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５
（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。

【００５１】上記アルコール類としては、例えば、２−
アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−
アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−
アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられ
る。

【００５２】また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モ
リホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）
メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）
イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビ
ス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロ
パン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセト
アミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、
３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸
（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリ
シルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシ
ン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰ
Ｓ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれる
ものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫ
ａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平
蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂 １９８５年）。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用が
ある範囲であれば良く、好ましくは１〜１０００ｍＭ、
より好ましくは１０〜５００ｍＭである。また、上記緩
衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、
有機物と無機物を混合して用いても良い。

【００５６】本発明２においても、溶離液には、本発明
１と同様に、無機塩類、ｐＨ調節剤、水溶性有機溶媒、
防腐剤、ヘモグロビン安定剤等を添加しても良い。

【００５７】本発明１または２においては、ｐＨの異な
る少なくとも２種類以上の上記溶離液を用いるのが好ま
しい。また、その場合、測定目的のピークを分離するに
あたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用
いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、（検出
器出力の）ベースライン変動が、測定値に悪影響を与え
なければ、その必要はない。

【００５８】さらに、ベースライン変動をより小さくす
るために、上記測定目的のピークを分離するにあたって
用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用い
るのがより好ましい。なお、溶離液のｐＨは、例えば、
前述のｐＨ調節剤の添加量により調節できる。

【００５９】上記ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を、
勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良
い。

【００６０】上記測定目的のピークとは、ＨｂＡ１ａ、
ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ、ＡＨｂ、ＣＨｂ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ2 、Ｈｂ
Ｓ、ＨｂＣ等が挙げられる。

【００６１】ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン
類を分離するための溶離液のｐＨは、４．０未満である
と、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、６．８を
超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、陽イオン
交換基に保持されにくくなり、分離能が低下するので
４．０〜６．８が好ましく、４．５〜５．８がより好ま
しい。

【００６２】本発明３は、ＨｂＡ０を溶出するために、
カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点と等
しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶離液を用
いる。上記溶離液は、 カオトロピックイオンを含有する
ことがより好ましい。 このカオトロピックイオンとして
は、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チ
オシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、
ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化
物イオン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイ
オン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオ
ン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げら
れ、その濃度等については、本発明１の場合と同様であ
る。また、溶離液には、本発明１と同様に、無機塩類、
ｐＨ調節剤、水溶性有機溶媒、防腐剤、ヘモグロビン安
定剤等を添加しても良い。

【００６３】また、本発明１または２においても、Ｈｂ
Ａ０の溶出に際し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填
剤に保持されたＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶
出するためには、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロ
ビンの等電点よりアルカリ側になるように設定した溶離
液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、ｐ
Ｈがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側であるひとつ
の溶離液を送液する方法や、ｐＨの異なる２種以上の溶
離液を用いる方法がある。

【００６４】ヘモグロビンはｐＨが等電点より酸性側か
らアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに
変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発
力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることができる。

【００６５】なお、理化学辞典（第４版、１９８７年９
月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載さ
れているように、ヘモグロビンの等電点はｐＨ６．８〜
７．０である。そのため、ＨｂＡ０成分を溶出するため
に、カラムに流入する際の溶離液のｐＨを６．８以上に
することがより好ましい。

【００６６】この条件を満たすため、測定に用いる溶離
液の内、少なくともひとつの溶離液のｐＨが６．８以上
であることが必要である。本溶離液のｐＨは望ましくは
７．０〜１２．０であり、７．５〜１１．０がより好ま
しく、更には８．０〜９．５が好ましい。溶離液のｐＨ
が６．８未満になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分とな
る。溶離液のｐＨは、用いる充填剤の分解が起こらない
範囲に設定すれば良い。

【００６７】ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられる、
ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例え
ば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；
クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチル
グルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカ
ルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩から
なる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリ
ノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−
（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒ
ｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａ
ｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥ
Ｓ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリ
シルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド
（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。ま
た、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴ
Ａ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダ
ゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルア
ミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエ
タノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等
の有機物も使用できる。

【００６８】また、無機酸；有機酸；無機酸または有機
酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、
有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。

【００６９】より効果的にＨｂＡ０成分を溶出するため
には、上記溶離液にカオトロピックイオンを添加するの
が好ましい。添加するカオトロピックイオンとしては、
トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシ
アン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジク
ロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イ
オン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオ
ン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げら
れる。

【００７０】添加するカオトロピックイオン濃度は、１
〜３０００ｍＭで、好ましくは、１０〜１０００ｍＭ、
更には、５０〜５００ｍＭが好ましい。

【００７１】本発明１〜３においては、少なくとも溶出
力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するた
めの溶離液を送液する前に、該ＨｂＡ０を溶出するため
の溶離液以外の溶離液を送液しても良い。

【００７２】すなわち、ＨｂＡ０成分を溶出するための
溶離液が（送液ポンプで）送液されてカラムに通液され
るとＨｂＡ０成分が溶出されてくる。このＨｂＡ０成分
を溶出するための溶離液を送液する前、すなわち、Ｈｂ
Ａ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分を分離
するために、ＨｂＡ０成分を溶出する溶離液以外の溶離
液を送液する。

【００７３】ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン
類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも
２種類以上用い、塩濃度勾配法やｐＨ勾配法またはこの
２つの組み合わせにより、安定型ＨｂＡ１ｃ等の測定対
象ピークをシャープに溶出させることが可能になる。

【００７４】本発明１〜３においては、ＨｂＡ０よりも
前に溶出するヘモグロビン類（ＨｂＡ１ａ及びｂ、Ｈｂ
Ｆ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ）の溶出に
は、少なくとも２種類以上の溶離液を用い、かつ、溶出
力の最も弱い溶離液を先に流すこともできる。

【００７５】本発明１〜３に係るヘモグロビン類の測定
方法では、好ましくは、溶離液を勾配溶出法または段階
溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出
力を低下させることが望ましい。

【００７６】従来のＬＣでは、分離対象成分のピークを
シャープにしたり、隣り合って溶出する２つ以上のピー
クの分離度を向上させたりするために、複数の溶離液を
用いた勾配溶出法や段階溶出法が利用されている。

【００７７】勾配溶出法は「グラジエント溶出」と呼ば
れている。すなわち、複数台の送液ポンプを用い、溶出
力が異なる複数の溶離液の送液比率を連続的に変化させ
て送液する。それによって、図２０に示すように、時間
と共に溶出力が連続的に上昇するように溶出が行われ
る。

【００７８】また、段階溶出法は「ステップワイズ溶
出」と称されている。この方法では、１台の送液ポンプ
を、電磁弁等を介して複数の溶離液に連結する。そし
て、電磁弁を切り換えることにより、溶出力の低い溶離
液から、溶出力の高い溶離液に切り換えて送液する。従
って、図２１に示すように、溶出力は段階的に上昇いて
いく。

【００７９】しかしながら、溶出される各成分の性質が
類似していたり、短時間で溶出することが要求されてい
る場合、従来の勾配溶出法や段階溶出法では、類似した
性質の成分間でピークが重なり、分離度が低下するおそ
れがあった。

【００８０】これに対して、本発明では、勾配溶出法ま
たは段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、その
途中、すなわち勾配溶出法または段階溶出法により複数
の溶離液を順に切り替えて送液していく途中において、
分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミングを考
慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状態が良
くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させることも
できる。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い
溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した
後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから
溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する。

【００８１】陽イオン交換ＬＣにおいて、溶離液の溶出
力を低下させるには、溶離液の塩濃度を下げる方法やｐ
Ｈを下げる方法、またはこの２つを組み合わせる方法が
挙げられる。

【００８２】陰イオン交換ＬＣでは溶離液の塩濃度を下
げる方法やｐＨを上げる方法、逆相クロマトグラフィー
では溶離液の有機溶媒の極性を上げる方法、順相クロマ
トグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を下げる方法
が挙げられる。

【００８３】上記のように勾配溶出法または段階溶出法
によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低
下させる方法により、ヘモグロビンを分離する場合をよ
り具体的に説明する。

【００８４】ヘモグロビン類の分離には、陽イオン交換
充填剤が充填されたカラムを用い、溶離液を塩濃度２０
〜１０００ｍＭ、ｐＨ４〜９の範囲で勾配溶出法または
段階溶出法によって送液させ、その途中において溶離液
の塩濃度を５〜５００ｍＭ、ｐＨを０．１〜３の範囲で
下げることによって溶離液の溶出力を低下させて分離を
行う。

【００８５】本発明の方法を段階溶出法によって行う場
合の、装置の構成例を図１７に示した。溶離液Ａ，Ｂ，
Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、ｐ
Ｈ、極性等において異なる）ものであり、電磁弁１によ
って設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成さ
れている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部
３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成
分が検出器５により検出される。各ピークの面積、高さ
等はインテグレータ６により算出される。

【００８６】安定型ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える
可能性のあるＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等のヘモグロビ
ン成分を含む血液検体を測定する場合、ＨｂＡ０成分
（ピーク）として主にＨｂＡを溶出させ、それより後に
ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる測定方法を設
定することがある。これにより、ＨｂＡ０ピークからＨ
ｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けるため、より正確な
安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。

【００８７】ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる
測定方法を設定する場合、前述した少なくとも溶出力の
異なる３種の溶離液を用いる方法における「ＨｂＡ０を
溶出するための溶離液」は、ＨｂＡを主成分とするＨｂ
Ａ０ピークを溶出する溶離液を意味している。このと
き、「ＨｂＡ０を溶出するための溶離液」の後に、Ｈｂ
Ａ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために、より溶出力
の強い溶離液を送液することが必要となる。

【００８８】本発明のヘモグロビン類の測定方法におけ
るカチオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少
なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よ
りなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換
基を導入することで得られる。

【００８９】該カチオン交換基は、公知のものでよく特
に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。

【００９０】上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２
０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。また、粒
度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平
均直径×１００）として、好ましくは４０％以下、より
好ましくは３０％以下である。

【００９１】上記高分子粒子としては、例えば、シリ
カ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。上記高分子粒子は、導入されるイオン交
換基以外の構成成分は、より親水性であることが好まし
い。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが
好ましい。

【００９２】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応
でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこ
とができる。

【００９３】また、カチオン交換基を有する単量体を重
合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交
換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単
量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下
に重合する方法などが挙げられる。

【００９４】また、（メタ）アクリル酸メチル、（メ
タ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有
エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在
下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エス
テルをカチオン交換基に変換させてもよい。

【００９５】更に、特公平８−７１９７号公報に記載の
ように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基
を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、
該単量体を重合させても良い。

【００９６】上記充填剤はカラムに充填されて液体クロ
マトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知の
ステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されな
い。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長
さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０
ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填
剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用で
きるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例
えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたス
ラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することに
より行う。

【００９７】本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のも
ので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプ
ラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付
属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付
加されても良い。

【００９８】上記測定法における、他の測定条件として
は、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは
０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ
／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可
視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけでは
ない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有す
る物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したも
のを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により
異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。

【００９９】

【実施例】以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定
されるものではない。

【０１００】（実施例１） 充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイ
ル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量
％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２
５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７
５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥し
た後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。

【０１０１】充填剤のカラムへの充填 得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒
子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３
０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌し
た。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０
ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入し
た。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続
し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ² で定圧充填した。

【０１０２】ヘモグロビン類の測定 得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビ
ン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０） なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りである。測定
開始より０〜３分の間は溶離液Ａを送液し、３〜３．２
分の間は溶離液Ｂを送液し、３．２〜５分の間は溶離液
Ａを送液した。 流速：２．０ｍＬ／分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：１０μＬ

【０１０３】（測定試料）健常人血をフッ化ナトリウム
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモ
ノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１０
０）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液
（ｐＨ７．０）を用いた。 ａ）糖負荷血：全血検体に５００ｍｇ／ｄＬのグルコー
ス水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上
記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ａと
した。 ｂ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量
％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加
し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。 ｃ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量
％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加
し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。

【０１０４】（測定結果）上記測定条件により、試料を
測定して得られたクロマトグラムを図１〜３に示す。図
１は試料ａ、図２は試料ｂ、図３は試料ｃを測定した結
果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピー
ク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク
４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６
はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。図１では、ピーク
３および４が良好に分離されている。また、図２ではピ
ーク６（ＣＨｂ）、図３ではピーク７（ＡＨｂ）がピー
ク４から良好に分離されている。

【０１０５】（実施例２）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同
様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：５５ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸 −２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭ コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０） なお、コハク酸のｐＫａは、表１に記載の通りである。

【０１０６】（実施例３）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同
様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：５５ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する１０ｍＭ マレイン酸−４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２００ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する１０ｍＭ マレイン酸−４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３） なお、マレイン酸のｐＫａは、表１に記載の通りであ
る。

【０１０７】（実施例４）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同
様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する１０ｍＭマレイン 酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する８ｍＭマレイン 酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）

【０１０８】（比較例１）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．４） 溶離液Ｂ：３３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０） 得られたクロマトグラムを図４〜６に示す。図４は試料
ａ、図５は試料ｂ、図６は試料ｃを測定した結果であ
る。図１〜３に比較して、測定時間が長いにもかかわら
ず、分離状態が悪いことが分かる。

【０１０９】（実施例５）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩 衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸 緩衝液（ｐＨ８．０） 測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを送液し、３〜
３．２分の間は溶離液Ｂを送液し、３．２〜５分の間は
溶離液Ａを送液した。

【０１１０】（測定結果）得られたクロマトグラムを図
７〜９に示す。図７は試料ａ、図８は試料ｂ、図９は試
料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及び
ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１
ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ
０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。図７
では、ピーク３および４が良好に分離されている。ま
た、図８ではピーク６（ＣＨｂ）、図９ではピーク７
（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。

【０１１１】（実施例６）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同
様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：４８ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する２５ｍＭ コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２００ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する２５ｍＭ コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）

【０１１２】（実施例７）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同
様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：５３ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク酸 −２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク 酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）

【０１１３】（実施例８）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同
様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：４８ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する２５ｍＭコ ハク酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２００ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する３０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．３）

【０１１４】（比較例２）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：１７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：３３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７） 得られたクロマトグラムを図１０〜１２に示す。図１０
は試料ａ、図１１は試料ｂ、図１２は試料ｃを測定した
結果である。図７〜９に比較して、測定時間が長いにも
かかわらず、分離状態が悪いことが分かる。

【０１１５】（比較例３）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。得られたクロマトグラムは図１０〜１２
と同様であった。 溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．６） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ６．５） 実施例５〜８及び比較例２、３のクロマトグラムにおい
て、ＨｂＡ０のピーク幅及び分離能を比較した結果、実
施例５〜８は、比較例２、３に比べて、ＨｂＡ０のピー
ク幅は、狭く、しかも、分離能も良かった。

【０１１６】（実施例９）充填剤の調製において２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の代わり
に、 メタクリル酸（和光純薬）を用い、 溶離液を以下の
組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモ
グロビン類の測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：７０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する ７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する ７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【０１１７】（実施例１０）溶離液を以下の組成とした
ことの他は、実施例９と同様に操作してヘモグロビン類
の測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：７０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する ７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する ７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１２．０）

【０１１８】（実施例１１）溶離液を以下の組成とした
ことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類
の測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する ２０ｍＭコハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する ５ｍＭコハク酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【０１１９】（実施例１２）溶離液を以下の組成とした
ことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類
の測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する ２０ｍＭコハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する ５ｍＭコハク酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１２．５）

【０１２０】（比較例４）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例９と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：７０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する ７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する ７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）

【０１２１】（比較例５）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する ２０ｍＭコハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する ５ｍＭコハク酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）

【０１２２】実施例９〜１２及び比較例４、５のクロマ
トグラムにおいて、ＨｂＡ０のピーク幅及び分離能を比
較した結果、実施例９〜１２は、比較例４、５に比べ
て、ＨｂＡ０のピーク幅は、狭く、しかも、分離能も良
かった。また、実施例９〜１２及び比較例４、５におい
て、試料を連続測定した場合のＨｂＡ１ｃの保持時間の
変化を図１３に示した。 図１３より、実施例９〜１２で
は、比較例４、５に比べて保持時間の変化が少ないこと
が分かる。

【０１２３】（実施例１３）溶離液の数と組成およびそ
の送液条件を以下のように変更した以外は、実施例１と
同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。 溶離液：溶離液Ａ：５５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩 衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：６８ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸緩 衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭリン酸 緩衝液（ｐＨ８．０） 測定開始より０〜０．７分の間は溶離液Ａを送液し、
０．７〜１．４分の間は溶離液Ｂを送液し、１．４〜
１．５分の間は溶離液Ｃを送液し、１．５〜１．９分の
間は溶離液Ａを送液した。

【０１２４】（測定結果）得られたクロマトグラムを図
１４〜１６に示す。図１４は試料ａ、図１５は試料ｂ、
図１６は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂ
Ａ１ａ及びｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型
ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５は
ＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示
す。図１４では、ピーク３および４が良好に分離されて
いる。また、図１５ではピーク６（ＣＨｂ）、図１６で
はピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されて
いる。

【０１２５】（実施例１４）溶離液を以下の組成とした
ことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン
類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜
１６と同様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：４８ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク酸 −２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：６７ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク酸 −２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する２５ｍＭコハク 酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）

【０１２６】（実施例１５）溶離液を以下の組成とした
ことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン
類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜
１６と同様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：５３ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭマレイン 酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：６８ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭマレイン 酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する２０ｍＭマレイ ン酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【０１２７】（実施例１６）溶離液を以下の組成とした
ことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン
類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜
１６と同様に良好であった。 溶離液：溶離液Ａ：４８ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する２５ｍＭ コハク酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：７１ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する２５ｍＭ コハク酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｃ：２００ｍＭの硝酸ナトリウムを含有する３０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．３）

【０１２８】（実施例１７）図１７に示した装置を用い
て、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行った。カラ
ムには陽イオン交換樹脂（ミクロネックスＡ１ｃ ＨＳ
−IV、積水化学工業社製）を充填したものを用いた。溶
離液Ａとして１７０ｍＭ、溶離液Ｂとして１９０ｍＭ、
溶離液Ｃとして１５０ｍＭ、溶離液Ｄとして３３０ｍＭ
の、それぞれリン酸緩衝液で、溶離液Ａ〜ＣはｐＨ６の
ものを、溶離液ＤはｐＨ７．２のものを用いた。試料と
しては、実施例１で用いた全血検体を溶血試薬を用いて
１００倍に溶血、希釈したものを用いた。２分間でＨｂ
Ａ１ｃ（後述のピークＰ５）を各ヘモグロビン類のピー
クから分離するように溶離液を段階溶出法を用いて切り
替えた。溶離液の切り替え条件および得られたクロマト
グラムを図１８に示した。すなわち、溶離液は０〜３８
秒は溶離液Ａを、３８〜５８秒は溶出力のより高い溶離
液Ｂを、５８〜７８秒はより溶出力の低い溶離液Ｃを、
７８〜１００秒は溶出力の最も高い溶離液Ｄを、１００
〜１２０秒は溶離液Ａを再び送液した。ピークの検出に
は４１５ｎｍの吸収強度を用いた。図１８のクロマトグ
ラムにおいて、ピークＰ１〜Ｐ３は、ＨｂＡ１ａ及びＨ
ｂＡ１ｂ類であり、ピークＰ４はＨｂＦであり、ピーク
Ｐ５はＨｂＡ１ｃであり、ピークＰ６はＨｂＡ０であ
る。

【０１２９】上記の方法では、溶離液Ａから溶離液Ｂへ
の切り替えにより溶出力を上昇させたことによりピーク
Ｐ６が早く溶出して、ＨｂＡ１ｃのピークであるピーク
Ｐ５の正確な検出を妨害するのを防ぐため、溶離液Ｂか
ら溶出力のより低い溶離液Ｃへの切り替えを行ってい
る。

【０１３０】再現性を評価するために、この方法で同一
試料について１０回繰り返し測定し、次式によりＨｂＡ
１ｃ値を算出した。１０回の各測定値、その平均値およ
びＣＶ値（％）を表３に示した。 ＨｂＡ１ｃ値（％）＝ピークＰ５の面積÷（ピークＰ１
の面積＋ピークＰ２の面積＋ピークＰ３の面積＋ピーク
Ｐ４の面積＋ピークＰ５の面積＋ピークＰ６の面積）×
１００

【０１３１】

【表３】

【０１３２】（比較例６）実施例１７における溶離液Ｃ
を用いなかったこと、および溶離液Ｂの代わりに溶離液
Ｂ１（１８０ｍＭ、ｐＨ６のリン酸緩衝液）を用いた他
は、実施例１７に準じて実施例１７と同一の試料中のヘ
モグロビン類の測定を行った。溶離液の切り替え条件お
よび得られたクロマトグラムを図１９に示した。すなわ
ち、溶離液は０〜３８秒は溶離液Ａを、３８〜７８秒は
溶離液Ｂ１を、７８〜１００秒は溶出力の最も高い溶離
液Ｄを、１００〜１２０秒は溶離液Ａを再び送液した。
溶離液Ａから溶離液Ｂよりも溶出力の低い溶離液Ｂ１へ
切り替えたため、ピークＰ６の一部が早く溶出すること
はないが、ピークＰ５はシャープにならず、図１９に○
で囲んだように、ピークＰ５にピークＰ４およびピーク
Ｐ６が一部重なっていることが分かる。

【０１３３】再現性をみるために、この方法で同一試料
について１０回繰り返し測定し、実施例１と同様にして
ＨｂＡ１ｃ値を算出した。１０回の各測定値、その平均
値およびＣＶ値（％）を表３に示した。

【０１３４】

【発明の効果】本願発明に係る測定方法によれば、従来
のヘモグロビン類の測定方法における問題点であったヘ
モグロビン類の分離性能が改善され、特に安定型ＨｂＡ
１ｃを高い再現性で精密に分離できる。また、短時間
で、ベースライン変動が少ないと共に、 カラム耐久性も
向上されたヘモグロビン類の測定方法を提供することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図２】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図３】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図４】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図５】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図６】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図７】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図８】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図９】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図である。

【図１０】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン
類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。

【図１１】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン
類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。

【図１２】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン
類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図である。

【図１３】 実施例９〜１２及び比較例４、５におい
て、試料を連続測定した場合のＨｂＡ１ｃの保持時間の
変化を示した図である。

【図１４】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビ
ン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグ
ラムを示す図である。

【図１５】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビ
ン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグ
ラムを示す図である。

【図１６】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビ
ン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグ
ラムを示す図である。

【図１７】 段階溶出法によって行う場合の、装置の構
成例を示す図である。

【図１８】 実施例１７の溶離液の切り替え条件および
得られたクロマトグラムを示す図である。

【図１９】 比較例６の溶離液の切り替え条件および得
られたクロマトグラムを示す図である。

【図２０】 勾配溶出法を説明するための説明図であ
る。

【図２１】 段階溶出法を説明するための説明図であ
る。

【符号の説明】

１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク ２ ＨｂＦのピーク ３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク ４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク ５ ＨｂＡ０のピーク ６ ＣＨｂのピーク ７ ＡＨｂのピーク

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−113440（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−297554（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−239301（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−319003（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/00 - 30/96

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ホウ酸交換基を有する充填剤を併用しな
   い陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる安定型ヘ
   モグロビンＡ１ｃの測定方法において、トリブロモ酢酸
   イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、
   ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオ
   ン、硝酸イオン、臭化物イオン、バリウムイオン、セシ
   ウムイオン及びグアニジンイオンからなる群より選ばれ
   る少なくとも１種であるカオトロピックイオンを含有
   し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有
   機酸及び／またはこれらの塩を含む溶離液を用いること
   を特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の安定型ヘモグロビンＡ
   １ｃの測定方法であって、測定目的のピークを分離する
   のに際し、ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液を
   用い、該ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液が、
   同一の緩衝剤を含むものであることを特徴とする安定型
   ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の安定型ヘモグ
   ロビンＡ１ｃの測定方法であって、ＨｂＡ０を溶出する
   ために、カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等
   電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶
   離液を用いることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１
   ｃの測定方法。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の安定型ヘモグロビンＡ
   １ｃの測定方法であって、前記溶離液のｐＨが６．８以
   上であることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの
   測定方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の安
   定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、ヘモグロ
   ビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、
   ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を用いることを特徴とする
   安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の安定型ヘモグロビンＡ
   １ｃの測定方法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に
   溶出するヘモグロビン類の溶出に、少なくとも溶出力の
   異なる２種以上の溶離液を用い、 溶出力の弱い溶離液か
   ら順に送液することを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ
   １ｃの測定方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の安
   定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、少なくと
   も溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出
   するための溶離液を送液する前に、該ＨｂＡ０を溶出す
   るための溶離液以外の溶離液を送液することを特徴とす
   る安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の安
   定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、溶離液を
   勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中
   において溶離液の溶出力を低下させることを特徴とする
   安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。