JP2014095637A - 安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供する。
【解決手段】カチオン交換クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、下記（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有する溶離液と、カチオン交換基を有するカラム充填剤とを用い、測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
（１）カオトロピックイオン
（２）酸解離定数を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩
（３）酸解離定数を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩
【選択図】なし

Description

本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。

液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、他の測定方法と比較して精度が良く、短時間で測定できるため、特に糖尿病患者の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定値（ヘモグロビンＡ１ｃ値）の管理に用いられている。この用途では、同時再現性試験時におけるヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）が１．０％以下程度の精度が要求される。

安定型ヘモグロビンＡ１ｃの高精度測定のためには、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン類との良好な分離性が必要である。高い分離性能を得るための一般的な手段は、カラム充填剤粒子の粒径を小さくし、より均一にすることである。例えば、特許文献１には、平均粒径値が３〜４μｍの微小な充填剤を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定する方法が開示されている。しかし、その結果、測定系にかかる圧力は５０×１０^５Ｐａ以上と大きくなる。そのため、使用する液体クロマトグラフは高い耐圧性能が必要になり、高価で複雑な構造になる。また、測定系に常時高圧がかかるため、長期間使用した場合の配管系の詰まりや劣化、カラム寿命の短縮等の弊害をもたらす。安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定のような多数の検体を測定する項目においては、カラム寿命はコストに直接影響を及ぼすため、短期間で測定精度が低下するカラムは実用上使用できない。従来の方法で高精度測定を行う場合は、特許文献１に示された圧力値と同等か、それ以上の圧力値が生じる。

高圧測定での問題を回避するために測定系に生じる圧力値を低くする方法として、粒径値が大きいカラム充填剤を用いる方法がある。しかしこの方法では、カラム内の空隙率の増加によって分離性能が低下し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度の低下、及び、カラム寿命の短縮という問題が生じる。また、測定時の流速を小さくする方法もある。しかしこの方法では、流量が不安定になり分離性能の低下によるヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度の低下、及び、測定時間の延長等の問題が生じる。

一方、安定型ヘモグロビンＡ１ｃをより精度よく分離するための溶離液に関する技術も開示されている。溶離液の変更は、充填剤の変更に比べて容易にできるため、クロマトグラフィーの改良手段として有益である。安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定する際の溶離液の成分は、通常の液体クロマトグラフィーに用いる緩衝液の成分が適宜用いられている。例えば、リン酸やホウ酸等の無機オキソ酸を含む緩衝液を用いる方法（特許文献２〜５）、有機酸やアミノ酸を含む緩衝液を用いる方法（特許文献６、７）等が開示されている。また、溶離液に界面活性剤を添加する方法（特許文献８、９）、カオトロピックイオンを添加する方法（特許文献２、４、１０）等、各種添加剤を付与することで分離性能の向上等が図られている。

しかし、上記の溶離液に関する従来技術では、短時間測定で分離性能を高くすることが困難なため、結局小粒径のカラム充填剤を用いることになり、高圧下での測定における上記問題が生じる。特に、長期間測定を行った場合には、使用初期には良好であった測定再現性が低下する問題が生じる。

特開平０５−００５７３０号公報 特開平３−１０２２５９号公報 特開平３−２５５３６０号公報 特開昭６３−７５５５８号公報 特開昭５８−２１００２４号公報 特開平５−６０７４２号公報 特開平１１−２９５２８６号公報 特開平５−５７３０号公報 特開平１０−１０１０８号公報 特開２０００−５５８９９号公報

本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供する。

本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、下記（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有する溶離液と、カチオン交換基を有するカラム充填剤とを用い、測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
（１）カオトロピックイオン
（２）酸解離定数を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩
（３）酸解離定数を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩
以下に本発明を詳述する。

本発明者は、カチオン交換基を有するカラム充填剤を用いるカチオン交換クロマトグラフィーにおいて、特定の成分を含有する溶離液を用い、かつ、測定系に生じる圧力値を特定の範囲に設定することにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できることを見出した。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いる溶離液は、カオトロピックイオン（以下、成分（１）ともいう）を含有する。

成分（１）のカオトロピックイオンとしては、例えば、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等の陰イオン性カオトロピックイオン類や、カルシウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、グアニジウムイオン等の陽イオン性カオトロピックイオン類等が挙げられる。なかでも、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、グアニジウムイオンが好ましく、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジウムイオンがより好ましい。溶離液は、二種類以上の成分（１）を含有してもよい。

溶離液中の成分（１）の濃度の好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は４０００ｍｍｏｌ／Ｌである。成分（１）の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合及び４０００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が低下することがある。成分（１）の濃度のより好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は３００ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いる溶離液は、酸解離定数（ｐＫａ値）を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩（以下、成分（２）ともいう）を含有する。
なお、本明細書において、「ｐＫａ値を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩」とは、「ｐＫａ値を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸」又は「ｐＫａ値を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸」の塩を意味する。

溶離液が成分（２）を含まない場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が悪くなる。また、溶離液のｐＨが変動しやすくなり、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が低下する。成分（２）のｐＫａ値の範囲は、３．８以上６．５未満であることが好ましい。
なお、二つ以上のｐＫａ値を有する酸の場合、そのうちの少なくとも１つのｐＫａ値が３．５以上６．５未満であれば、この酸又はその塩は成分（２）のｐＫａ値の条件を満たすものとする。

成分（２）は、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、又は、これらの塩である。これらの酸又は塩から生ずるカルボキシル基により安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が向上する。
成分（２）のモノカルボン酸としては、例えば、乳酸、グリコール酸、ギ酸、酢酸等が挙げられる。
成分（２）のジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、マロン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、グルタル酸、アジピン酸等が挙げられる。
成分（２）のトリカルボン酸としては、例えば、クエン酸、イソクエン酸等が挙げられる。
成分（２）のアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、β−アラニン、ヒスチジン、グルタミン酸等が挙げられる。
なかでも、ジカルボン酸又はその塩、トリカルボン酸又はその塩が好ましく、コハク酸又はその塩、クエン酸又はその塩がより好ましい。
溶離液は、二種類以上の成分（２）を含有してもよい。

溶離液中の成分（２）の濃度の好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は４００ｍｍｏｌ／Ｌである。成分（２）の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、溶離液のｐＨが変動しやすくなり、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が低下することがある。成分（２）の濃度が４００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、クロマトグラムのベースラインが不安定になることがある。成分（２）の濃度のより好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は３００ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いる溶離液は、ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩（以下、成分（３）ともいう）を含有する。
なお、本明細書において、「ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩」とは、「ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸」又は「ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸」の塩を意味する。

溶離液が成分（３）を含まない場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が悪くなる。成分（３）のｐＫａ値は、６．５以上９．２以下であることが好ましい。
なお、二つ以上のｐＫａ値を有する酸の場合、そのうちの少なくとも１つのｐＫａ値が６．５以上９．５以下であれば、この酸又はその塩は成分（３）のｐＫａ値の条件を満たすものとする。

成分（３）は、無機オキソ酸、アミノ酸、又は、これらの塩である。これらの酸又は塩から生じるオキソ酸イオン又はカルボキシル基により安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が向上する。
成分（３）の無機オキソ酸としては、例えば、リン酸、ピロリン酸、ホウ酸等が挙げられる。
成分（３）のアミノ酸としては、例えば、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、チロシン、アルギニン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、システイン、グルタミン等が挙げられる。
なかでも、無機オキソ酸又はその塩が好ましく、リン酸又はその塩がより好ましい。溶離液は、二種類以上の成分（３）を含有してもよい。

溶離液中の成分（３）の濃度の好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は４００ｍｍｏｌ／Ｌである。成分（３）の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、溶離液のｐＨが変動しやすくなり、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が低下することがある。成分（３）の濃度が４００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、クロマトグラムのベースラインが不安定になることがある。成分（３）の濃度のより好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は３００ｍｍｏｌ／Ｌである。

表１に主要な酸のｐＫａ値を示した（ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ８７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００７）。本明細書では、ｐＫａ値として、表１に示した値を採用する。なお、表１に示していない酸のｐＫａ値については、電位差滴定法、吸光度法、電気泳動法等の公知の方法によって測定される値を用いる。表１の「○」は成分（２）の条件又は成分（３）の条件を満たすもの、「×」は成分（２）の条件又は成分（３）の条件を満たさないものを示す。
また、溶離液が成分（２）の条件及び成分（３）の条件の両方を満たす一種類以上の酸又はその塩を含有する場合は、当該溶離液は成分（２）及び成分（３）の両方を含有することとする。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、少なくとも二種類の溶離液を用いることが好ましい。安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む成分を溶出させるために用いる溶離液（溶離液Ａ）と、ヘモグロビンＡ０を含む成分を溶出させるために用いる溶離液（溶離液Ｂ）とを用いることがより好ましい。
この場合、少なくとも溶離液Ａは、（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有する。また、溶離液Ａに加えて、溶離液Ｂも（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有することが好ましい。溶離液Ｂにも（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分又は（１）、（２）、及び、（３）の一部の成分を含有させる場合、該当する成分の種類は、溶離液Ａに含まれる成分と同一の種類であることが好ましい。

溶離液ＡのｐＨの好ましい下限は４．０、好ましい上限は６．０である。溶離液ＡのｐＨが４．０未満であると、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの溶出が遅くなり、測定時間が延長することがある。また、ヘモグロビン類が変性して分離性能が悪くなり、測定精度が低下する。溶離液ＡのｐＨが６．０を超える場合、カチオン交換反応が充分行われなくなり、分離性能が低下することがある。溶離液ＡのｐＨのより好ましい下限は４．２、より好ましい上限は５．８である。

溶離液ＢのｐＨの好ましい下限は７．０、好ましい上限は１０．０である。溶離液ＢのｐＨが７．０未満であると、ヘモグロビンＡ０の溶出が遅くなり、測定時間が延長することがある。溶離液ＢのｐＨが１０．０を超える場合、カチオン交換反応が充分行われなくなり、分離性能が低下することがある。溶離液ＢのｐＨのより好ましい下限は７．２、より好ましい上限は９．３である。

上記の少なくとも二種類の溶離液の切り替え方法は、ステップワイズグラディエント法でもよいし、リニアグラディエント法でもよい。
ステップワイズグラディエント法では、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む、ヘモグロビンＡ０よりも早い保持時間を有する成分を溶離液Ａで溶出した後、溶離液Ｂに切り替えてヘモグロビンＡ０を含む成分を溶出することが好ましい。
リニアグラディエント法では、溶離液Ａを主成分とする溶離液により安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む、ヘモグロビンＡ０よりも早い保持時間を有する成分を溶離液Ａで溶出した後、溶離液Ｂを主成分とする溶離液によりヘモグロビンＡ０を含む成分を溶出することが好ましい。

溶離液Ａとして、成分（１）〜（３）の種類及び濃度が異なる複数種の溶離液Ａを用いてもよい。同様に溶離液Ｂとして、複数種の溶離液Ｂを用いてもよい。また、溶離液Ａ及び溶離液Ｂ以外の溶離液を用いてもよい。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いる溶離液は、（１）、（２）、及び、（３）の成分以外の無機酸又はその塩類、有機酸又はその塩類、酸性化合物、塩基性化合物、水溶性有機溶媒等の公知の溶離液組成物を含有してもよい。また、界面活性剤、親水性ポリマー類、親水性低分子化合物、防腐剤、安定化剤等の公知の添加剤成分を含有してもよい。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いるカラム充填剤は、カチオン交換基を有する。
カチオン交換基としては、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基が好ましい。
なお、本発明の測定方法でいうカチオン交換基には、該カチオン交換基に付随する構造は問わないため、カチオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、本発明の測定方法でいう「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む。
また、上記架橋重合体粒子は、表面に複数種のカチオン交換基を有していてもよい。

上記カラム充填剤は、架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基含有重合体を有するカラム充填剤であることが好ましい。

架橋重合体粒子を構成する架橋重合体は、アクリル系重合体（アクリル系架橋重合体）であることが好ましい。
なお、本明細書において、「アクリル系架橋重合体」とは、アクリル基又はメタクリル基を有する架橋性単量体（以下、「アクリル系架橋性単量体」ともいう）の重合物を意味する。また、後述する「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート又はメタクリレート」であることを示し、「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」を示す。

アクリル系架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。

ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらのアクリル系架橋性単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アクリル系架橋重合体の原料として、アクリル系架橋性単量体以外に、必要に応じて非架橋性単量体も原料として用いてもよい。
非架橋性単量体は、アクリル系単量体（以下、「アクリル系非架橋性単量体」ともいう）であることが好ましい。
アクリル系非架橋性単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、水酸基を有するアクリル系非架橋性単量体等が挙げられる。

（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。

水酸基を有するアクリル系非架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。

ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２、３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２、３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらのアクリル系非架橋性単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アクリル系非架橋性単量体を用いる場合、アクリル系非架橋性単量体の添加量は、アクリル系架橋性単量体量１００重量部に対して、１００重量部以下であることが好ましい。アクリル系非架橋性単量体の添加量が１００重量部を超えると、得られる架橋重合体粒子の架橋度が低下することにより耐圧性が小さくなり、膨潤や収縮が起きて分離精度が低下しやすくなる。

カチオン交換基含有重合体は、カチオン交換基含有単量体を重合して得られる重合体であることが好ましい。
カチオン交換基含有単量体は、アクリル系のカチオン交換基含有単量体であることがより好ましい。

カルボキシル基を有するアクリル系のカチオン交換基含有単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類や、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。
リン酸基を有するアクリル系のカチオン交換基含有単量体としては、例えば、（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート及びこれらの誘導体等が挙げられる。
スルホン酸基を有するアクリル系のカチオン交換基含有単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類等、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、及び、これらの誘導体等が挙げられる。
これらのアクリル系のカチオン交換基含有単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

また、カチオン交換基含有重合体は、カチオン交換基を有する化合物（以下、「カチオン交換性化合物」ともいう）と反応可能な官能基（以下、「反応性基」ともいう）を有する親水性重合体にカチオン交換性化合物を反応させて得られるものでもよい。

反応性基は、非イオン性の親水性基であることが好ましい。
非イオン性の親水性基としては、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。なかでも、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基が好ましく、水酸基、エポキシ基、グリシジル基がより好ましい。

反応性基を有する親水性重合体は、反応性基を有する単量体（以下、「反応性単量体」ともいう）の重合物であることが好ましい。
反応性単量体としては、（メタ）アクリル酸エステル類が好ましい。
（メタ）アクリル酸エステル類としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類や、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類や、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類や、エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類や、アミノ化（メタ）アクリレート類や、アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。

ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２、３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２、３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン、シアノ（メタ）アクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、ブチルシアノアクリレート、（メタ）アクリロニトリル等が挙げられる。
これらの反応性単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

カチオン交換性化合物としては、反応性基が水酸基の場合は、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類や、クロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類や、イオン交換基を有するアルデヒド化合物類や、トリカルバニル酸やブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物類や、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等のスルトン化合物類等が挙げられる。また、反応性基がエポキシ基、グリシジル基、アミノ基の場合は、例えば、硫酸ナトリウム、タウリン、グリコール酸、亜硫酸ナトリウム等のイオン交換性化合物類が挙げられる。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いるカラム充填剤は、架橋重合体粒子の存在下でカチオン交換性単量体を重合させて得られる重合物であることが好ましい。または、架橋重合体粒子の存在下で反応性基を有する親水性単量体を重合させ、カチオン交換性化合物を反応させて得られる重合物であることが好ましい。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、上記の溶離液及び上記のカラム充填剤を用いた上で、測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下となるように設定する。
なお、本明細書において「測定系に生じる圧力値（以下、単に「圧力値」ともいう）」とは、クロマトグラフィーの流路系において、カラムを含む、送液ポンプ以降の配管系流路全体により発生する圧力値を意味する。例えば、送液ポンプとカラムとの間に接続した圧力計により測定できる値である。

圧力値が９．８×１０^３Ｐａ未満であると、ヘモグロビン類の測定値の精度が低下し、測定時間が延長する。また、圧力値が非常に小さいため、圧力値の制御が困難となる。圧力値が１９．６×１０^５Ｐａを超えると、測定精度及び測定安定性が低下する。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法におけるカチオン交換クロマトグラフィーは、溶離液送液用のポンプ、検出器、試料導入装置等を備えた公知の液体クロマトグラフに、上述したカラム充填剤を充填したカラムを接続し、かつ、測定系に生じる圧力値を上述した設定範囲にすることにより行うことができる。

本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法によれば、糖尿病診断の指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間に高精度に測定することができる。
また、本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法では、安定型ヘモグロビンＡ１ｃとともに、健常人血に含まれるヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）を短時間内に高精度に測定できる。

本発明によれば、カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる。

実施例１の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 比較例１の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 比較例２の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例１、２、３及び６の測定条件による、測定回数とＨｂＡ１ｃ値との関係を示すグラフである。 比較例２、３、６及び８の測定条件による、測定回数とＨｂＡ１ｃ値との関係を示すグラフである。 製造例２、５及び６で得られたカラム充填剤を用いた場合の設定圧力値と同時再現性試験時のＣＶ値との関係を示すグラフである。 測定時の設定圧力値の異なる測定系における測定回数とＨｂＡ１ｃ値との関係を示すグラフである。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

（製造例１）
製造例１では、カチオン交換基を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１７０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇ、及び、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換基含有単量体、東亞合成社製）１００ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。
反応系を３００ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１０時間重合反応を行い、カチオン交換基を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、粒度分布測定装置（ＰＳＳ社製、「アキュサイザーＳ７８８／ＳＩＳ」）により測定したところ、６．７μｍであった。

（製造例２）
製造例２では、架橋重合体の表面でカチオン交換基含有単量体を重合し、カチオン交換基を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。

（１）架橋重合体粒子の調製
ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。反応系を３５０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行い、架橋重合体粒子を得た。

（２）カチオン交換基含有重合体の調製
上記「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系に２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを添加した後、８０℃で２時間重合反応を行い、表面にカチオン交換基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、６．７μｍであった。

（製造例３）
製造例３では、架橋重合体の表面に反応性基を有する親水性重合体を調製して、カチオン交換性化合物を反応させることにより、表面にカチオン交換基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。
上記製造例２の「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系に２，３−ジヒドロキシルプロピルメタクリレート（反応性単量体、日油社製）１００ｇを添加した後、８０℃で２．５時間重合反応を行い、架橋重合体の表面に反応性基含有親水性重合体を有する重合物を得た。この重合物１０ｇを、１，３−プロパンスルトン１０ｇを溶解した２％水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬ中に添加して６０℃で撹拌し、表面にカチオン交換基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、６．６μｍであった

（製造例４）
製造例４では、カチオン交換基を有さない架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。
ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。反応系を３００ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して８時間重合反応を行い、カチオン交換基を有さない架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、６．８μｍであった。

（実施例１）
実施例１では、製造例１で得られたカラム充填剤を充填したカラムを用いて、健常人血中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を測定した。

（１）カラム充填剤の充填
製造例１で得られたカラム充填剤０．８ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散して撹拌しスラリー化した。５分間超音波処理した後、スラリー全量を、ステンレス製エンプティカラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（アズワン社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（ＧＬサイエンス社製、「ＰＵ−６１４」）を接続し、圧力２０ＭＰａで送液して定圧充填した。

（２）測定試料の調製
フッ化ナトリウム採血した健常人血を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１００倍に溶血希釈した。

（３）測定条件
カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表２に、それ以外の条件を表３に示す。
溶離液Ａは、成分（１）として３０ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含み、成分（２）として８ｍｍｏｌ／Ｌのコハク酸（ｐＫａ値４．２及び５．６）を含み、成分（３）として１０５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（リン酸のｐＫａ値７．２）を含む。溶離液ＡのｐＨは５．３に調整した。
また、溶離液Ｂは２５０ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウム、及び、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウムを含む。溶離液ＢのｐＨは７．９に調整した。
なお、圧力値は、以下の方法により測定した。即ち、各カラムを液体クロマトグラフに接続し、送液ポンプとカラムとの間に、デジタル圧力計（長野計器社製、「ＧＣ６１」）を接続し、溶離液Ａを送液した時の圧力表示値を読み取った。

（４）測定結果
得られたクロマトグラムを図１に示す。各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。

（実施例２）
実施例２では、製造例２で得られたカラム充填剤を充填したカラムを用いて、健常人血中のＨｂＡ１ｃを測定した。
製造例２で得られたカラム充填剤を、実施例１と同様にしてステンレス製エンプティカラムに充填し、実施例１と同様の方法で健常人血試料を測定した。カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表２に示す。
得られたクロマトグラムは図１と同様、各ピークが短時間で良好に分離できた。

（実施例３）
実施例３では、製造例３のカラム充填剤を充填したカラムを用いて、健常人血中のＨｂＡ１ｃを測定した。
製造例３で得られたカラム充填剤を、実施例１と同様にしてステンレス製エンプティカラムに充填し、実施例１と同様の方法で健常人血試料を測定した。カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表２に示す。
得られたクロマトグラムは図１と同様、各ピークが短時間で良好に分離できた。

（実施例４〜７）
実施例４〜７では、実施例２における溶離液Ａ及び溶離液Ｂに含まれる成分を変更して実施例１と同様の測定を行った。カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表２に示す。
実施例４及び実施例５は溶離液Ａの成分（１）の種類を変更した場合、実施例６は溶離液Ａの成分（２）の種類を変更した場合、実施例７は溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分（３）の種類を変更した場合を示す。
得られたクロマトグラムはいずれも図１と同様、各ピークが短時間で良好に分離できた。

（比較例１）
比較例１では、製造例４で得られたカラム充填剤を充填したカラムを用いて、健常人血中のＨｂＡ１ｃを測定した。
製造例４で得られたカラム充填剤を、実施例１と同様にしてステンレス製エンプティカラムに充填し、実施例１と同様の方法で健常人血試料を測定した。カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表４に示す。
得られたクロマトグラムを図２に示す。カチオン交換基を有するカラム充填剤を用いない場合は、（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有する溶離液を用い、本発明で規定する設定圧力値の範囲内で測定を行ってもＨｂＡ１ｃは分離できなかった。

（比較例２〜８）
比較例２〜８では、製造例２で得られたカラム充填剤を用い、（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有する溶離液を用いずに、健常人血中のＨｂＡ１ｃを測定した。
カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表４に示す。
比較例２は、溶離液Ａとして、成分（１）を含まない溶離液を用いた例を示す。
比較例３は、溶離液Ａとして、成分（２）を含まない溶離液を用いた例を示す。
比較例４は、溶離液Ａとして、成分（２）に代えて、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸以外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。
比較例５は、溶離液Ａとして、成分（２）に代えて、ｐＫａ値が成分（２）の規定範囲外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。
比較例６は、溶離液Ａとして、成分（３）を含まない溶離液を用いた例を示す。
比較例７は、溶離液Ａとして、成分（３）に代えて、無機オキソ酸及びアミノ酸以外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。なお、表４中、「ＨＥＰＥＳ」は、「２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸」を示す。
比較例８は、溶離液Ａとして、成分（３）に代えて、ｐＫａ値が成分（３）の規定範囲外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。

比較例２により得られたクロマトグラムを図３に示す。ＨｂＡ１ｃの分離は、実施例に比べて悪かった。比較例３〜８により得られたクロマトグラムも図３と同様であった。
以上の実施例４〜７及び比較例２〜８の結果から、本発明の規定範囲内の溶離液を用いることにより、ＨｂＡ１ｃを良好に分離できることがわかった。また、本発明の規定範囲内の溶離液を用いなかった場合、設定圧力値が本発明の規定範囲内であっても、ＨｂＡ１ｃの分離が悪いことがわかった。

（評価）
製造例１〜３のカラム充填剤を用い、実施例１〜７及び比較例２〜８の溶離液を用いて以下の評価を行った。

（評価１）同時再現性試験
実施例１「（２）測定試料の調製」の健常人血から得られた試料を、２０回連続測定して得られたＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値（以下、単に「ＣＶ値」ともいう）を表２及び表４に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ａを用いた実施例１〜７では、ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値はいずれも１．０％以下と良好であった。
カラム充填剤の異なる実施例１〜３では、特に製造例２及び製造例３のカラム充填剤を用いた場合にＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値が良好であり、その中でも製造例２で得られたカラム充填剤を用いた実施例２において良好であった。
また、溶離液Ａの成分を本発明の規定範囲内で変更した実施例４〜７においてもＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値は良好であり、特に実施例６において良好であった。
本発明の規定範囲内の溶離液を用いなかった比較例２〜８のＣＶ値は３．０％以上と悪く、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値の精度管理を行えるレベルではなかった。

（評価２）修飾ヘモグロビン類の測定
人為的に調製した修飾ヘモグロビン類を多く含む試料の測定を行った。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、以下の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血に、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血に、アセトアルデヒドを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血に、シアン酸ナトリウムを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のＨｂＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血試料（非修飾品）のＨｂＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表２及び表４に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ａを用いた実施例１〜７では、Δ値がいずれも０．１５以下と良好であった。特に製造例２、製造例３で得られたカラム充填剤を用いた実施例２、実施例３が良好であり、その中でも製造例２のカラム充填剤を用いた実施例２が良好であった。
溶離液Ａの成分を本発明の規定範囲内で変更した実施例４〜７においてもΔ値は良好であり、特に実施例６において良好であった。
本発明の規定範囲内の溶離液を用いなかった比較例２〜８のΔ値は０．４以上と悪く、ＨｂＡ１ｃ値が修飾ヘモグロビンの影響を受けた。

（評価３）測定安定性の評価
実施例１、２、３、６及び比較例２、３、６、８のカラム充填剤及び溶離液を用いて、実施例１「（２）測定試料の調製」の健常人血から得られた試料を３０００回繰り返し測定し、ＨｂＡ１ｃ値の推移を確認した。測定回数とＨｂＡ１ｃ値との関係を図４及び図５に示す。
図４に示した実施例の結果において、実施例１〜３ではＨｂＡ１ｃ値は安定であった。特に製造例２、製造例３で得られたカラム充填剤を用いた実施例２、実施例３が良好であった。また溶離液Ａの成分を変更した実施例６においてもＨｂＡ１ｃ値は安定であった。
一方、図５に示した比較例の結果においては、ＨｂＡ１ｃ値がいずれも低下した。
本発明の規定範囲内の溶離液を用いなかった場合は、カラム耐久性が悪くなることを確認した。

（製造例５）
製造例５及び製造例６では、本発明に規定する設定圧力値の検討を行うため、製造例２と同様の組成及び同様の方法によるが、平均粒子径が異なるカラム充填剤を調製した。
まず製造例５では、製造例２より平均粒子径が小さいカラム充填剤を調製した。

（１）架橋重合体粒子の調製
ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。反応系を４００ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行い、架橋重合体粒子を得た。

（２）カチオン交換基含有重合体の調製
上記「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系に２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを添加した後、８０℃で２時間重合反応を行い、表面にスルホン酸基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、４．２μｍであった。

（製造例６）
製造例６では、製造例２よりも平均粒子径が大きいカラム充填剤を調製した。
製造例５「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系の撹拌速度を４００ｒｐｍから２５０ｒｐｍに変更した以外は製造例５と同様に操作してカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、９．５μｍであった。

（評価４）設定圧力値の同時再現性及び測定安定性への影響評価
設定圧力値を変更した場合の同時再現性及び測定安定性への影響を確認した。
設定圧力値は、平均粒径値が異なるカラム充填剤を用いること、及び、測定時の流速を変更することにより行った。
平均粒径値が異なるカラム充填剤は、製造例２、製造例５及び製造例６で得られた各カラム充填剤を用いた。各カラム充填剤を、実施例１「（１）カラム充填剤の充填」と同様にしてステンレス製エンプティカラム充填して得られたカラムを用いた。溶離液としては実施例２の溶離液を用いた。また、測定時の流速は、０．１〜３．３ｍＬ／分の間で変更した。
同時再現性試験は評価１、測定安定性試験は評価３の方法に準じて行った。
各測定時の設定圧力値と同時再現性試験時のＣＶ値との関係を図６に示す。ＣＶ値は、本発明で規定する設定圧力値の範囲（９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下）において良好であった。しかしながら、本発明で規定する設定圧力値の範囲を外れた場合、本発明の規定範囲内のカラム充填剤及び溶離液を用いた場合でも再現性が低下した。
また、製造例２で得られたカラム充填剤を用いて流速を変更し、測定時の設定圧力値の異なる測定系における測定安定性試験を実施した。測定回数とＨｂＡ１ｃ値との関係を図７に示す。実施例２と同様の測定条件の場合は設定圧力値が８６０×１０^３Ｐａ（図７中には「８６０」と表示）であり３０００回測定まで安定していた。一方、設定圧力値が９×１０^３Ｐａの場合（図７中には「９」と表示）は、約５００回でＨｂＡ１ｃ値が低下し、設定圧力値が２１０８×１０^３Ｐａの場合（図７中には「２１０８」と表示）は、約１５００回でＨｂＡ１ｃ値が低下した。これらの挙動は、製造例５、製造例６で得られたカラム充填剤を用いた場合でも同様であった。
本発明で規定する設定圧力値の範囲を外れた場合、本発明の規定範囲内のカラム充填剤及び溶離液を用いた場合でもカラム耐久性が悪くなることを確認できた。
設定圧力値による同時再現性及び測定安定性への影響は、カラム充填剤の平均粒径値を変更した場合でも、測定時の溶離液の流速を変更した場合でも同様であった。従って、カラム耐久性への影響は、充填剤の平均粒径値や流速の影響ではなく、設定圧力値の影響である。

以上からカチオン交換基を有するカラム充填剤を用いること、（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有する溶離液を用いること、及び、本発明で規定する設定圧力値を用いること、の全ての条件を満たす場合のみにおいて、ＨｂＡ１ｃの高精度測定が行えることを確認した。
特に、カラム充填剤としてカチオン交換基含有重合体を有する架橋重合体を用いた場合、成分（２）としてジカルボン酸又はその塩か、トリカルボン酸又はその塩を用いた場合、成分（３）として無機オキソ酸又はその塩を用いた場合に性能が良好であった。

本発明によれば、カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる。

１１ ヘモグロビンＦ
１２ ヘモグロビンＡ１ｃ
１３ ヘモグロビンＡ０

Claims (5)

1. カチオン交換クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、
   下記（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有する溶離液と、カチオン交換基を有するカラム充填剤とを用い、
   測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する
   ことを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
   （１）カオトロピックイオン
   （２）酸解離定数を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩
   （３）酸解離定数を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩
2. 成分（２）は、ジカルボン酸又はその塩か、トリカルボン酸又はその塩の少なくともいずれかであり、成分（３）は、無機オキソ酸又はその塩であることを特徴とする請求項１記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
3. カチオン交換基を有するカラム充填剤、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む成分を溶出させる溶離液Ａと、ヘモグロビンＡ０を含む成分を溶出させる溶離液Ｂとの少なくとも２種類の溶離液を用い、
   前記溶離液Ａは、（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含有し、かつ、ｐＨが４．０〜６．０であり、
   前記溶離液Ｂは、ｐＨが７．０〜１０．０であり、
   測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定することを特徴とする請求項１又は２記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
4. カチオン交換基を有するカラム充填剤は、架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基含有重合体を有するカラム充填剤であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
5. 架橋重合体粒子を構成する架橋重合体、及び、カチオン交換基含有重合体は、アクリル系重合体であることを特徴とする請求項４記載の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。

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