JP2000055899A - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来法より短時間で、分離能が良く、しかも
ベースライン変動が少ないヘモグロビン類の測定方法を
提供する。 【解決手段】 カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、酸解離定数
（ｐＫａ）を２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．
５０の範囲に少なくとも一つずつもつ緩衝剤が含有され
る溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測
定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ
１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は糖尿病診断の指標と
して広く利用されている。ＨｂＡ１ｃとは血液中の糖が
赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆的に結合し
て生成したものであり、過去１〜２カ月間の血液中の平
均的な糖濃度を反映する。

【０００３】このＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一般
に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられてい
る。

【０００４】液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１
ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー
法により行われている（特公平８−７１９８号公報な
ど）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィ
ーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以
下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以
下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、Ｈｂ
Ｆという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並
びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などの
ピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使
用されているＨｂＡ１ｃは、最近では、上記のうちの安
定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に
対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）とし
て求められている。

【０００５】しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不
安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通
常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定するこ
とが困難であった。そこで、不安定型ＨｂＡ１ｃピーク
の影響をなくす方法が以下のように種々考えられ、実施
されているがそれぞれまだ欠点がある。例えば、特開昭
６３−２９８０６３号公報に記載の試薬を添加すること
により不安定型ＨｂＡ１ｃを除く方法があるが、この方
法は前処理操作が煩雑となる点が問題となる。また、特
公平８−７１９７号公報に記載のような充填剤を用いる
ことにより、クロマトグラム上でピークとして分離する
方法も考えられるが、測定時間が長くなる点が問題とな
る。

【０００６】また、液体クロマトグラフィー法でのヘモ
グロビン類の測定においては、アセチル化ヘモグロビン
（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン
（以下、ＣＨｂという）などの修飾ヘモグロビンの影響
を受けるといわれ、ＡＨｂやＣＨｂのピークも安定型Ｈ
ｂＡ１ｃピーク付近に溶出するため、従来法によって
は、短時間での分離が困難であった。

【０００７】さらに、カチオン交換液体クロマトグラフ
ィーによりＨｂＡ１ｃ測定を行う場合、一般に、ＨｂＡ
１ｃを溶出させたあとに、ＨｂＡ０を溶出させるが、Ｈ
ｂＡ０成分の一部等が溶出されないでカラム内に残る
と、カラム劣化の原因になるため、従来、溶離液中の塩
濃度を高めることが行われてきたが、ＨｂＡ０の溶出に
要する時間が長いという欠点があった。そこで、ｐＨの
低い溶離液でＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、ＨｂＡ
１ｃ等を溶出させたあと、ＨｂＡ０を短時間で溶出させ
るため、ｐＨの高い溶離液を用いることが考えられる
が、異なる緩衝剤からなる溶離液を用いると、溶離液を
切り替える際に、ベースラインが変動し、正確な測定の
妨げとなる場合がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
に鑑み、従来法より短時間で、分離能が良く、しかも、
ベースライン変動が少ないヘモグロビン類の測定方法を
提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビ
ン類の測定方法において、酸解離定数（ｐＫａ）を２．
１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少な
くとも一つずつもつ緩衝剤が含有される溶離液を用いる
ことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。請
求項２記載の発明は、溶離液が、カオトロピックイオン
を含有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビ
ン類の測定方法である。請求項３記載の発明は、測定目
的のピークを分離するのに際し、ｐＨの異なる少なくと
も２種以上の溶離液を用い、該ｐＨの異なる少なくとも
２種以上の溶離液が、同一の緩衝剤を含むものであるこ
とを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の
測定方法である。請求項４記載の発明は、ヘモグロビン
Ａ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出するため
に用いる溶離液のｐＨが４．０〜６．８の範囲にあり、
ヘモグロビンＡ０の溶出に、カラムに流入する際のｐＨ
がヘモグロビンの等電点よりアルカリ側になるようにｐ
Ｈを設定した溶離液を用いることを特徴とする請求項
１、２又は３記載のヘモグロビン類の測定方法である。

【００１０】上記緩衝剤としては、酸解離定数（ｐＫ
ａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０
の範囲に少なくとも一つずつ存在するものを用いる。す
なわち、単一の物質でｐＫａを、２．１５〜６．３９及
び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つずつも
つ物質を用いるか、あるいは、２．１５〜６．３９の範
囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１
０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と
を組み合わせて用いる。また、上記緩衝剤を複数組み合
わせて用いてもよい。上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測
定目的のピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近
において、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．
６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲が好ま
しく、より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８
０〜１０．００の範囲である。さらに好ましくは、３．
５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の範囲である。

【００１１】上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホ
ウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン
酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリ
ン又はアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾ
ール類、アルコール類などの有機物が挙げられる。ま
た、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、
カコジル酸、グリセロールリン酸、ヒ酸、２，４，６−
コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−ア
ミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシ
プロリン、ピペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でもよい。上
記カルボン酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオ
ン酸、安息香酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸とし
ては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタ
ル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等
が挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例え
ば、β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、
５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピ
ルビン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等
が挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例
えば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられ
る。上記アニリン又はアニリン誘導体としては、例え
ば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられる。上記
アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラ
ギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチ
ジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。上記アミン類
としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−
ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、
トリメチルアミン、トリエチルアミン、ヘキサメチルア
ミン、ジメチルアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエ
タノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類と
しては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシ
イミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５
（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。上記ア
ルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル
−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル
−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル
−１−プロパノール、ｎ−プロピルアルコール等が挙げ
られる。

【００１２】また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モ
リホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）
メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）
イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビ
ス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロ
パン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセト
アミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、
３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸
（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリ
シルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシ
ン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰ
Ｓ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれる
ものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫ
ａを表１・２に示す。（引用文献：堀尾武一・山下仁平
蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂）

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】上記緩衝剤の溶離液中の濃度は、緩衝作用
がある範囲であればよく、好ましくは１〜１０００ｍ
Ｍ、より好ましくは１５〜５００ｍＭである。また、上
記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いてもよく、例え
ば、有機物と無機物を混合して用いても良い。

【００１６】上記カオトロピックイオンとは、水溶液に
溶けると解離して生じたイオンにより、水の構造が破壊
され、疎水性物質と水が接触したときに起こる、水のエ
ントロピー減少を抑制するもので、具体的には、陰イオ
ンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオ
ン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イ
オン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオ
ン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、
陽イオンとしては、マグネシウムイオン、バリウムイオ
ン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオ
ン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジン
イオン等が挙げられる。ヘモグロビン類の分離能を良く
するためには、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオ
ン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ
化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝
酸イオン、臭化物イオン等を、陽イオンとして、バリウ
ムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウ
ムイオン等を用いるのが好ましい。さらに、より好まし
くは、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、
チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオ
ン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン等を用いる。

【００１７】上記カオトロピックイオンの溶離液中の濃
度は、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定にお
いて、分離効果が低下し、また、３０００ｍＭよりも高
くてもヘモグロビン類の分離効果は向上しないので、
０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１００
０ｍＭがより好ましい。また、カオトロピックイオンは
複数種混合して用いてもよい。上記カオトロピックイオ
ンは、測定サンプルと接触する液、例えば、溶血液、サ
ンプル希釈液などに添加してもよい。

【００１８】上記溶離液には、防腐剤やヘモグロビンの
安定化剤を添加してもよい。上記防腐剤としては、例え
ば、アジ化ナトリウム等が挙げられる。上記ヘモグロビ
ンの安定剤としては、公知の安定剤を用いることがで
き、例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオ
ン、アジ化ナトリウムなどの還元剤・酸化防止剤などが
挙げられる。

【００１９】上記溶離液は、ｐＨの異なる少なくとも２
種類以上を用いるのが好ましい。また、ｐＨの異なる少
なくとも２種類以上の溶離液を用いる場合、測定目的の
ピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩
衝剤を含むものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り
替える際の、ベースライン変動が、測定値に悪影響を与
えなければ、その必要はない。さらに、ベースライン変
動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分
離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一
であるものを用いるのがより好ましい。なお、溶離液の
ｐＨは、例えば、後述のｐＨ調節剤の添加量により調節
できる。

【００２０】上記ｐＨの異なる２種類以上の溶離液は、
測定途中で切り替えてもよいし、グラディエント溶出、
ステップグラディエント溶出を行ってもよい。

【００２１】上記測定目的のピークとは、例えば、修飾
ヘモグロビン（ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、安定型ＨｂＡ
１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＡＨｂ、ＣＨｂ）、異常ヘ
モグロビン（ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＡ₂ ）、ＨｂＦ、Ｈ
ｂＡ０等が挙げられる。

【００２２】ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン
類を分離するための溶離液のｐＨは、４．０未満である
と、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、６．８を
超えると、ヘモグロビンのプラス電荷が減少し、カチオ
ン交換樹脂に保持されにくくなり、分離能が低下するの
で４．０〜６．８が好ましく、４．５〜５．８がより好
ましい。

【００２３】ＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液は、
カラム劣化の防止と測定時間短縮のため、カラムに流入
する際のｐＨをヘモグロビンの等電点（ｐＨ６．８）よ
りアルカリ側になるように設定した溶離液を用いるのが
好ましい。上記溶離液のｐＨは、７．０〜１０が好まし
く、８．０〜９．５がより好ましい。溶離液のｐＨが
６．８以下になるとＨｂＡ０溶出が不十分となり、ｐＨ
が１０より高いと充填剤の分解が起こるものと考えられ
る。また、ＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液には、
例えば、硫酸イオン、フッ化物イオンといったアンチカ
オトロピックイオンを添加してもよい。上記ヘモグロビ
ンの等電点については、理化学辞典（第４版、１９８７
年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記
載あるように、ｐＨ６．８〜７．０である。

【００２４】上記溶離液には、以下の物質を添加しても
よい。 （１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなど）を
添加してもよい。これらの塩類の濃度は、特に限定され
ないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。 （２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えてもよ
い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等
が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリ
ウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化
ストロンチウム、水酸化セシウム、水酸化ニッケル、水
酸化アルミニウム、水酸化カドニウ等が挙げられる。こ
れらの酸・塩基の濃度は、特に限定されないが、好まし
くは、０．００１〜５００ｍＭである。 （３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセ
トンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの
有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０
〜８０％（ｖ／ｖ）であり、緩衝剤が析出しない程度で
用いるのが好ましい。

【００２５】上記カチオン交換液体クロマトグラフィー
において、充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交
換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高
分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。

【００２６】該カチオン交換基は、公知のものでよく特
に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。

【００２７】上記粒子の直径は、好ましくは0.5 〜20μ
m 、より好ましくは1 〜10μm である。また、粒度分布
は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径
×100 ）として、好ましくは20％以下、より好ましくは
15％以下である。

【００２８】上記高分子粒子としては、例えば、シリ
カ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。上記高分子粒子は、導入されるイオン交
換基以外の構成成分は、より親水性であることが好まし
い。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが
好ましい。

【００２９】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応
でイオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこと
ができる。また、カチオン交換基を有する単量体を重合
して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換
充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量
体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に
重合する方法などが挙げられる。また、（メタ）アクリ
ル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カ
チオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合
し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加
水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させて
もよい。更に、特公平08-7197 号公報に記載のように、
架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する
単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体
を重合させても良い。

【００３０】上記充填剤はカラムに充填されて液体クロ
マトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知の
ステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されな
い。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長
さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０
ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填
剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用で
きるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例
えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたス
ラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することに
より行う。

【００３１】上記測定に使用される液体クロマトグラフ
は、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入
装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成され
る。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気
装置など）が適宜付属されてもよい。

【００３２】上記測定方法における、他の測定条件とし
ては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは
０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．２〜３ｍｌ
／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可
視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶血活性
を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈
したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料注入量
は、希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１０
０μｌ程度である。

【００３３】

【発明の実施の形態】次に、実施例、比較例を挙げて本
発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にの
み限定されるものではない。 実施例１ （Ｈｂ類の測定） （測定条件）得られたカラムを用いて、以下の測定を行
った。 ・システム ：送液ポンプ ：LC-9A （島津製作所製） オートサンプラ：ASU-420 （積水化学製） 検出器 ：SPD-6AV （島津製作所製） ・溶 離 液：溶離液Ａ：50mMの過塩素酸を含有する50mMリン酸緩衝液（和 光純薬製）（pH5.3 ） 溶離液Ｂ：200mM の過塩素酸を含有する50mMリン酸緩衝液（ pH8.0 ） 0 〜3 分= 溶離液Ａ；3 〜3.2 分= 溶離液Ｂ；3.2 〜5 分= 溶 離液Ａを用いた。 ・流 速：2.0mL/分 ・検出波長 ：415nm ・試料注入量：10μL

【００３４】（充填剤の調製）テトラエチレングリコー
ルジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５
０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．
５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール
（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、
攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重
合した。重合後、洗浄・乾燥し、分級して、平均粒径６
μｍの粒子を得た。 （カラムの充填）得られた上記粒子を、以下のようにし
て充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ5.8 ）３０ｍｌに分級し、５分間超音波処理した
後、よく攪拌した。全量をステンレス製の空カラム
（４．６φ×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機
社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業
社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ² で定圧充填し
た。 （測定試料）健常人血をNaF 採血し、以下の試料を調製
した。 ａ）糖負荷血：健常人血に、500mg/dLとなるようグルコ
ース水溶液を添加し、37℃で３時間反応させたもの。 ｂ）ＣＨｂ含有試料：健常人血10mLに、0.3%のシアン酸
ナトリウムの生理食塩水溶液1mL を添加し、37℃で３時
間反応させたもの。 ｃ）ＡＨｂ含有試料：健常人血10mLに、0.3%のアセトア
ルデヒドの生理食塩水溶液1.0mL を添加し、室温で3 時
間反応させたもの。 ・試料ａ、ｂおよびｃは溶血希釈液（0.1%ポリエチレン
グリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリ
トンＸ-100）（東京化成）のリン酸緩衝液(pH7.0) ）で
溶血し、150 倍に希釈して測定試料とした。 （測定結果）上記測定条件により、試料を測定して得ら
れたクロマトグラムを図１〜３に示す。図１は試料ａを
測定した結果、図２は試料ｂ、図３は試料ｃを測定した
結果を示す。ピーク１はHbA1a およびb 、ピーク２はHb
F 、ピーク３は不安定型HbA1c、ピーク４は安定型HbA1c
、ピーク５はHbA0、ピーク６はＣHb、ピーク７はＡHb
を示す。図１では、ピーク３および４が良好に分離され
ている。また、図２ではピーク６：CHb 、図3 ではピー
ク７：ＡHbがピーク４から良好に分離されている。 （ベースラインの安定性）試料として、溶血希釈液を測
定した。図７に示したように、ベースラインは、非常に
安定していた。

【００３５】実施例２ （Ｈｂ類の測定）溶離液Ａとして55mMの過塩素酸を含有
する20mMコハク酸-20mM リン酸緩衝液(pH5.3) 、溶離液
Ｂとして250mM の過塩素酸を含有する20mMコハク酸-20m
M リン酸緩衝液（pH8.0)を用い実施例１に準じて測定を
行ったところ、得られたクロマトグラムは図１〜図３と
同様に良好であった。

【００３６】実施例３ （Ｈｂ類の測定）溶離液Ａとして55mMの硝酸ナトリウム
を含有する20mMマレイン酸-20mM リン酸緩衝液(pH5.3)
、溶離液Ｂとして200mM の硝酸ナトリウムを含有する2
0mMマレイン酸-20mM リン酸緩衝液(pH8.3) を用い実施
例１に準じて測定を行ったところ、得られたクロマトグ
ラムは図１〜図３と同様に良好であった。

【００３７】実施例４ （Ｈｂ類の測定）溶離液Ａとして50mMの過塩素酸を含有
する10mMマレイン酸-50mM リン酸緩衝液(pH5.3) 、溶離
液Ｂとして200mM の過塩素酸を含有する8mM マレイン酸
-50mM リン酸緩衝液（pH8.3)を用い実施例１に準じて測
定を行ったところ、得られたクロマトグラムは図１〜図
３と同様に良好であった。

【００３８】比較例１ （Ｈｂ類の測定）溶離液Ａとして45mMの硝酸ナトリウム
を含有する30mMコハク酸緩衝液（pH5.3）、溶離液Ｂと
して,250mMの硝酸ナトリウムを含有する30mMコハク酸緩
衝液（pH5.7 ）を用いて、実施例１に準じて測定を行っ
た。図４は試料ａを測定した結果、図５は試料ｂ、図６
は試料ｃを測定した結果を示す。図４〜図６に示したよ
うに、HbAoピーク幅が実施例に比べて大きく、その結果
測定時間が長くなった。

【００３９】比較例２ （Ｈｂ類の測定）溶離液Ａとして45mMの硝酸ナトリウム
を含有する30mMコハク酸緩衝液（pH5.3）、溶離液Ｂと
して250mM の硝酸ナトリウムを含有する30mMコハク酸緩
衝液（pH8.0 ）を用いて、実施例１に準じて測定を行っ
た。得られたクロマトグラムは図４〜６と同様であり、
HbAoピーク幅が実施例に比べて大きい結果となった。こ
の原因は、溶離液ＢのpHを8.0 に調製したが、pH8付近
では、緩衝能が弱いためと考えられる。

【００４０】比較例３ （Ｈｂ類の測定）溶離液Ａとして45mMの硝酸ナトリウム
を含有する30mMコハク酸緩衝液（pH5.3）、溶離液Ｂと
して300mM の硝酸ナトリウムを含有する30mMグアニジン
緩衝液（pH8.6 ）を用いて、実施例１に準じて測定を行
った。得られたクロマトグラムは図１〜図３とほぼ同様
であった。 （ベースラインの安定性）試料として、溶血希釈液を測
定した。図８に示したように、溶離液A から溶離液Ｂに
切り換えた際、ベースライン変動が確認された。これに
より測定値への悪影響が考えられる。

【００４１】比較例４ （Ｈｂ類の測定）溶離液Ａとして 50mM の過塩素酸ナト
リウムを含有する30mMマロン酸緩衝液(pH5.3) 、溶離液
Ｂとして250mM の過塩素酸ナトリウムを含有する50mMグ
アニジン緩衝液(pH8.3) を用いて、実施例１に準じて測
定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜図３とほ
ぼ同様であったが、ベースラインの安定性を試験する
と、溶離液A から溶離液Ｂに切り換えた際、ベースライ
ン変動が確認された。

【００４２】

【発明の効果】本発明のヘモグロビン類の測定方法は、
以上の構成からなるので、分離能が良く、しかも、短時
間で、かつベースライン変動が少ないヘモグロビン類の
測定方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図

【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図

【図３】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図

【図４】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図

【図５】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図

【図６】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図

【図７】実施例１の測定条件により、溶血希釈液の測定
を行った際に得られたクロマトグラムを示す図

【図８】比較例３の測定条件により、溶血希釈液の測定
を行った際に得られたクロマトグラムを示す図

【符号の説明】

ピーク１・・・HbA1a およびb ピーク２・・・HbF ピーク３・・・不安定型HbA1c ピーク４・・・安定型HbA1c ピーク５・・・HbA0 ピーク６・・・CHb ピーク７・・・AHb

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カチオン交換液体クロマトグラフィーに
   よるヘモグロビン類の測定方法において、酸解離定数
   （ｐＫａ）を２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．
   ５０の範囲に少なくとも一つずつもつ緩衝剤が含有され
   る溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測
   定方法。
2. 【請求項２】 溶離液が、カオトロピックイオンを含有
   することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の
   測定方法。
3. 【請求項３】 測定目的のピークを分離するのに際し、
   ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液を用い、該ｐ
   Ｈの異なる少なくとも２種以上の溶離液が、同一の緩衝
   剤を含むものであることを特徴とする請求項１又は２記
   載のヘモグロビン類の測定方法。
4. 【請求項４】 ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘ
   モグロビン類を溶出するために用いる溶離液のｐＨが
   ４．０〜６．８の範囲にあり、ヘモグロビンＡ０の溶出
   に、カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点
   よりアルカリ側になるようにｐＨを設定した溶離液を用
   いることを特徴とする請求項１、２又は３記載のヘモグ
   ロビン類の測定方法。