JPH11295286A

JPH11295286A - ヘモグロビン類の測定方法

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Publication number: JPH11295286A
Application number: JP10099471A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Oishi; 和之大石; Yuji Setoguchi; 雄二瀬戸口; Kazuhiko Shimada; 一彦嶋田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 1999-10-29
Anticipated expiration: 2018-04-10
Also published as: JP3848459B2

Abstract

(57)【要約】【課題】従来より短時間で、精度良く、ヘモグロビン
類を測定する方法を提供する。【解決手段】充填剤のイオン交換基と同種のイオン種
を含む緩衝液を溶離液として用いることを特徴とする液
体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類（特に、安
定型ヘモグロビンＡ１ｃ）の測定方法。充填剤がカチオ
ン交換樹脂であり、溶離液がグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝
液である上記の液体クロマトグラフィーによるヘモグロ
ビン類の測定方法。充填剤がカチオン交換樹脂であり、
溶離液が有機酸又はその塩を含む緩衝液であることを特
徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類
の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖化ヘモグロビン、特に糖化ヘモグロビ
ンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指
標として広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血
液中の糖がその濃度に比例して赤血球に入った後に、ヘ
モグロビンと結合して生成したものである。溶血血液試
料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中
の平均的な糖濃度を反映するので溶血血液中の糖化ヘモ
グロビンは、糖尿病の診断の指標とされ、通常、糖化ヘ
モグロビンのうち、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、Ｈ
ｂＡ１ｃという）を用いたＨｂＡ１ｃ値〔糖化ヘモグロ
ビンと非糖化ヘモグロビンの合計に対するＨｂＡ１ｃの
割合（％）〕が、糖尿病の診断の最適な指標として広く
使用されている。

【０００３】このＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一般
に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられている
が、液体クロマトグラフィー法はその高精度性により最
も汎用されている。

【０００４】このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー
法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフ
ィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報
など）。溶血血液試料をカチオン交換液体クロマトグラ
フィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ
（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ
（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、
ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１
ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という。な
お、ＨｂＡ０は非糖化ヘモグロビンなどである）などの
ピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使
用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ
１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定
型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められ
ている。

【０００５】しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不
安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通
常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定するこ
とが困難であった。そこで、不安定型ＨｂＡ１ｃピーク
の影響をなくす方法が以下のように種々考えられ、実施
されているがそれぞれまだ欠点がある。すなわち、例え
ば、特開昭６３−２９８０６３号公報に記載の試薬を添
加することにより不安定型ＨｂＡ１ｃを除く方法がある
が、この方法は除去のための前処理操作が煩雑となる点
が問題となる。また、例えば、特公平８−７１９７号公
報に記載のような充填剤を用いることにより、比較的長
時間を要してクロマトグラム上でピークとして分離する
方法も考えられるが測定時間が長くなる点が問題とな
る。

【０００６】この液体クロマトグラフィー法には、上記
のように、充填剤としてはカチオン交換樹脂が一般的に
用いられており、そのイオン交換基としてはカルボキシ
ル基及びスルホン酸基が用いられている。また、溶離液
としては、殆どがリン酸緩衝液が用いられている。

【０００７】この液体クロマトグラフィー法は測定時間
の短縮化が進み、１検体あたり数分間で測定が可能とな
っているが、各ピークの分離は未だ不十分である。

【０００８】また、液体クロマトグラフィー法での測定
においては、アセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂと
いう）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂとい
う）などの修飾ヘモグロビンの影響を受けるといわれ
る。更に、ＡＨｂやＣＨｂのピークも安定型ＨｂＡ１ｃ
ピーク付近に溶出するため、短時間での分離が困難であ
る。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来法の欠点がなく、従来より短時間で、精度良く、ヘ
モグロビン類を測定する方法を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明（以
下、本発明１という）は、液体クロマトグラフィーによ
るヘモグロビン類の測定方法であって、充填剤のイオン
交換基と同種のイオン種を含む緩衝液を溶離液として用
いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法であ
る。

【００１１】請求項２記載の発明（以下、本発明２とい
う）は、充填剤がカチオン交換樹脂であり、溶離液がグ
ッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液であることを特徴とする請求
項１記載のヘモグロビン類の測定方法である。

【００１２】請求項３記載の発明（以下、本発明３とい
う）は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類
の測定方法であって、充填剤がカチオン交換樹脂であ
り、溶離液が有機酸又はその塩を含む緩衝液であること
を特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。

【００１３】以下、本発明１の詳細を説明する。本発明
１で用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のイオン
交換基を有している粒子よりなる充填剤である。上記の
イオン交換基含有充填剤は、後に詳細に説明するよう
に、高分子粒子にイオン交換基を導入することなどによ
り製造される。上記イオン交換基は、例えば、カルボキ
シル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン性官能
基及び第３級アミンや第４級アンモニウム基などのアニ
オン性官能基である。また、複数の官能基が混在されて
いても良い。上記混在とは、一つの粒子が複数の官能基
を有している場合だけでなく、一つの官能基を有する粒
子を複数混合して用いる場合も含むものとする。これら
のイオン交換基の導入量は特に制限されないが、好まし
くは、充填剤の乾燥重量１ｇ当たり０．１μｅｑ〜１０
０ｍｅｑである。充填剤粒子の直径は、好ましくは０．
５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。充
填剤の粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準
偏差÷平均粒径×１００）として、好ましくは２０％以
下、より好ましくは１５％以下である。

【００１４】本発明１で用いられる充填剤を製造する方
法は、特に限定されないが、例えば、（ａ）高分子粒子
にイオン交換基を導入する方法、（ｂ）イオン交換基を
有する単量体を重合して高分子粒子とする方法、（ｃ）
重合性のイオン交換基含有エステル（（メタ）アクリル
酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなど）を架橋性単
量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得
られた粒子を加水分解処理し、エステルをイオン交換基
に変換させる方法などが挙げられる。

【００１５】上記（ａ）高分子粒子にイオン交換基を導
入する方法、について以下説明する。上記高分子粒子と
しては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒
子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高
分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなど
の合成高分子粒子などが挙げられる。

【００１６】上記高分子粒子としては、導入されるイオ
ン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好
ましく、また、耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高い
ものが好ましい。

【００１７】高分子粒子がシリカ粒子の場合、該シリカ
粒子は、例えばアルコキシラン誘導体をアルコール／水
の混合溶媒に添加し、触媒存在下に重合することにより
得ることができる。さらに必要に応じて、官能基含有シ
ランカップリング剤を反応させることにより、適当な官
能基を導入することもできる。

【００１８】高分子粒子がセルロース粒子の場合、該セ
ルロース粒子は、例えば、三酢酸セルロースを有機溶媒
に溶解し、さらにゼラチン水溶液を添加して有機溶媒を
除去後、アルカリ性下で加水分解することにより得るこ
とができる。

【００１９】高分子粒子がポリアミノ酸粒子の場合、該
ポリアミノ酸粒子は、例えば、Ｎ−カルボン酸無水物を
重合することにより得ることができる。

【００２０】高分子粒子が合成高分子粒子の場合、該合
成高分子粒子は、例えば、スチレン、ジビルベンゼン、
ジビニルトルエン；メチル（メタ）アクリレート、エチ
ル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリ
レート；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート
などの単量体を、重合開始剤存在下で重合することによ
り得ることができる。

【００２１】高分子粒子にイオン交換基を導入する方法
は、該高分子粒子が反応性の官能基（例えば、水酸基、
アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など。以下、反
応性基という）を有する場合であれば、該反応性基に反
応性を有する官能基及びイオン交換基の両者を有する化
合物と上記高分子粒子とを化学結合させればよい。上記
反応性基を有する高分子粒子を調製するには、例えば、
水酸基含有単量体（２−ヒドロキシエチル（メタ）アク
リレート、２−ヒドロキシメチル（メタ）アクリレー
ト、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、（ポ
リ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グ
リセロールモノ（メタ）アクリレートなど）；アミノ基
含有単量体（（メタ）アクリルアミド、２−アミノエチ
ル（メタ）アクリレート、２−アミノメチル（メタ）ア
クリレート、アミノプロピル（メタ）アクリレート、ジ
メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルア
ミノエチル（メタ）アクリレート、アリルアミンな
ど）；カルボキシル基含有単量体（（メタ）アクリル
酸、イタコン酸など）；又はエポキシ基含有単量体（グ
リシジル（メタ）アクリレートなど）を、架橋性単量体
などと混合し、重合開始剤の存在下に重合すればよい。

【００２２】上記反応性基を有さない高分子粒子の場合
であれば、種々の公知の化学反応を用いて、高分子粒子
に反応性基を導入すればよい。

【００２３】高分子粒子に導入されるイオン交換基は、
公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシ
ル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基；
第３級アミノ基、第４級アンモニウム基などのアニオン
交換基が挙げられる。

【００２４】上記（ｂ）イオン交換基を有する単量体を
重合して高分子粒子とする方法、について以下説明す
る。上記イオン交換基を有する単量体としては、イオン
交換基がカルボキシル基の場合であれば、例えば、（メ
タ）アクリル酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸な
どが挙げられ、スルホン酸基の場合であれば、例えば、
スチレンスルホン酸、３−スルホプロピル（メタ）アク
リル酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリレート、３
−スルホプロピルイタコレート、Ｎ−（３−スルホプロ
ピル）−Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，
Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、２−アクリルアミ
ド−２−メチルプロパンスルホン酸、アリルスルホン酸
などが挙げられ、リン酸基の場合であれば、例えば、
（（メタ）アクリロイルオキシメチル）アシッドホスフ
ェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）ア
シッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキ
シプロピル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）ア
クリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェートなど
が挙げられ、例えば、第３級アミノ基、第４級アンモニ
ウム基の場合であれば、ジメチルアミノエチル（メタ）
アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレ
ート、（メタ）アクリレートヒドロキシプロピルトリメ
チルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリレートジ
メチルアミノエチルトリメチルアンモニウムクロライド
などが挙げられる。

【００２５】上記の重合方法は、上記単量体と架橋性単
量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法
などが挙げられる。

【００２６】本発明１の測定方法の実施に際して、充填
剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に
用いられる。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス
製、樹脂製など、特に限定されない。カラムサイズとし
ては、内径０．５〜１０ｍｍ、長さ５〜３００ｍｍのも
のが好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の
任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好まし
い。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩
衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラ
ムに圧入することにより行う。

【００２７】上記測定に使用される液体クロマトグラフ
は、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入
装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成され
る。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気
装置など）が適宜付属されてもよい。

【００２８】本発明１の測定方法に用いる溶離液は、使
用する充填剤が有するイオン交換基と同種のイオン種
（以下、同種イオンという）を含む緩衝液からなる。例
えば、充填剤としてカルボキシル基を有する充填剤を用
いる場合には、カルボキシル基を有する化合物〔具体的
には、例えば、グリシン等のアミノ酸；酢酸、クエン
酸、フタル酸等の酸類；Ｎ−（アセトアミド）−２−イ
ミノ２酢酸（以下、ＡＤＡという）、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチルグリシン（以下、ＴＲＩＣＩＮＥ
という）等のＧｏｏｄの緩衝液組成物など〕を含む緩衝
液；充填剤としてスルホン酸基を有する充填剤を用いる
場合には、スルホン酸基を有する化合物〔具体的には、
例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−
２−エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという）、２
−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（以下、ＭＥＳ
という）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
（以下、ＭＯＰＳという）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以下、
ＴＥＳという）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）−２−アミノエタンスルホン酸（以下、ＢＥＳとい
う）など〕を含む緩衝液；充填剤としてリン酸基を有す
る充填剤を用いる場合には、リン酸基を有する化合物
〔具体的には、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリ
ウム、リン酸リチウム、リン酸マグネシウムなど〕を含
む緩衝液を用いる。

【００２９】溶離液の濃度は、充填剤や測定対象試料、
その他の測定条件により異なるが、好ましくは１〜１０
００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。ま
た、上記の同種イオン緩衝液同士を、複数混合して用い
てもよい。

【００３０】本発明１の測定方法では、上記同種イオン
緩衝液は、ヘモグロビン類の分析時における糖化ヘモグ
ロビン類の溶出時の溶離液に必ず含有される。しかしな
がら同種イオンのみで構成される必要はなく、異種イオ
ン（充填剤のイオン交換基と異種のイオン種）が混合さ
れていてもよい。この場合も同種イオンは、好ましくは
１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭ含ま
れている必要がある。

【００３１】また充填剤として２種以上の異なるイオン
交換基を有する充填剤を使用した場合には、溶離液とし
てどちらか一方のイオン交換基種との同種イオンを用い
ればよい。例えば、カルボキシル基及びスルホン酸基の
両者を有する充填剤を使用した場合、カルボキシル基を
有する緩衝液でもよいし、スルホン酸基を有する緩衝液
でもよいし、両者の混合緩衝液でもよい。

【００３２】また以下の化合物を同種イオン緩衝液に添
加してもよい。（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウムなど）を添加してもよい。これらの塩類の濃
度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍ
Ｍである。（２）塩酸などの無機酸類、酢酸などの有機酸類を添加
してもよい。これらの無機酸類、有機酸類の濃度は、特
に限定されないが、好ましくは０．００１〜１００ｍＭ
である。（３）水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基類
を添加してもよい。これらの塩基類の濃度は、特に限定
されないが、好ましくは０．００１〜１００ｍＭであ
る。（４）メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの
水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの有機溶媒の
濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％
（Ｖ／Ｖ）である。

【００３３】また溶離液を測定途中で切り替えたり、グ
ラディエント溶出を行ってもよい。この場合、上記のよ
うに、糖化ヘモグロビン類の溶出時には上記同種イオン
緩衝液を含む溶離液で分離を行う必要があるが、他の分
画（例えば、ＨｂＡ０分画）の溶出時には、必ずしも同
種イオン緩衝液成分を含む必要はない。上記の「糖化ヘ
モグロビン類の溶出時」とは、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１
ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃの
分画を、この順序に含む、いわゆるｆｉｒｓｔｆｒａｃ
ｔｉｏｎの溶出時のことを指す。ただし、この場合、他
の物質がピークとして混在している場合も含む。

【００３４】本発明１の測定方法において、他の測定条
件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ま
しくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．１〜
３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎ
ｍの可視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶
血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液
を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料
注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは１〜５
０μｌ程度である。

【００３５】以下、本発明２の詳細を説明する。本発明
２で用いられる充填剤は、本発明１で用いられる充填剤
のうちのカチオン交換樹脂に相当するものであることの
他は本発明１で用いられる充填剤と同様であり、その製
造方法も本発明１の説明と同様である。

【００３６】本発明２の測定方法の実施に際して、上記
充填剤がカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測
定に用いられること、及び上記測定に使用される液体ク
ロマトグラフなどは本発明１と同様である。

【００３７】本発明２の測定方法に用いる溶離液は、一
般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものの中か
ら選択される。具体的には、例えば、ビス（２−ヒドロ
キシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタ
ン（以下、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓという）、ＨＥＰＥＳ、Ｍ
ＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳなどが挙げられる。

【００３８】溶離液の濃度は、他の測定条件により異な
るが、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５
〜８００ｍＭである。また、上記の緩衝液を複数混合し
て用いてもよい。また他の緩衝液（リン酸塩、ホウ酸塩
などを含む無機系緩衝液、クエン酸、コハク酸などを含
む有機酸系緩衝液など）；塩類（塩化ナトリウム、塩化
カリウム、硫酸ナトリウムなど）；塩酸などの無機酸；
酢酸などの有機酸；水酸化ナトリウムや水酸化カリウム
などの塩基；メタノール、エタノール、アセトニトリル
などの水溶性有機溶媒と混合して用いても良い。

【００３９】また溶離液を測定途中で切り替えたり、グ
ラディエント溶出を行ってもよい。この際、糖化ヘモグ
ロビン類の溶出は、上記Ｇｏｏｄの緩衝液を含む溶離液
で行う必要があるが、他の分画（例えばＨｂＡ０分画）
の溶出時には、必ずしもＧｏｏｄの緩衝液成分を含む必
要はない。

【００４０】本発明２の測定方法において、他の測定条
件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ま
しくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．１〜
３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎ
ｍの可視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶
血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液
を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料
注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは１〜５
０μｌ程度である。

【００４１】以下、本発明３の詳細を説明する。本発明
３で用いられる充填剤は、本発明１で用いられる充填剤
のうちのカチオン交換樹脂に相当するものであることの
他は本発明１で用いられる充填剤と同様であり、その製
造方法も本発明１の説明と同様である。

【００４２】本発明３の測定方法の実施に際して、上記
充填剤がカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測
定に用いられること、及び上記測定に使用される液体ク
ロマトグラフなどは本発明１と同様である。

【００４３】本発明３の測定方法に用いる溶離液は、有
機酸又はその塩を含む緩衝液である。上記有機酸とは、
分子内にカチオン性のイオン交換基、例えば、カルボキ
シル基、スルホン酸基、リン酸基の少なくとも一つ以上
を有するものが挙げられる。

【００４４】上記カルボキシル基を有する有機酸として
は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ジカルボン酸、ヒドロ
キシカルボン酸及びその誘導体などがあるが、これらに
限定されず、分子内に少なくとも一つ以上カルボキシル
基を有するものであれば特に限定されない。

【００４５】上記飽和脂肪酸としては、例えば、ギ酸、
酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプ
リル酸、カプリン酸などが挙げられる。

【００４６】上記不飽和脂肪酸としては、例えば、アク
リル酸、メタクリル酸などが挙げられる。

【００４７】上記ジカルボン酸としては、例えば、シュ
ウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、
マレイン酸、フマル酸などの脂肪族ジカルボン酸；安息
香酸、フタル酸、サリチル酸などの芳香族ジカルボン酸
などがある。

【００４８】上記ヒドロキシカルボン酸としては、分子
内に水酸基及びカルボキシル基をそれぞれ少なくとも一
つ以上有するものであれば特に限定されず、例えば、乳
酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸などがある。

【００４９】上記スルホン酸基を有する有機酸として
は、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳな
どが挙げられる。

【００５０】上記リン酸基を有する有機酸としては、例
えば、ホスホエノールピルビン酸三ナトリウム、６−ホ
スホグルコン酸三ナトリウムなどが挙げられる。

【００５１】有機酸としては、その他に、アゼライン
酸、アニス酸、アニリン、アニリンスルホン酸、アミノ
安息香酸、イソ吉草酸、イソキノリン、イソニコチン
酸、イソ酪酸、２−インドールカルボン酸、オキサロ酢
酸、オクタン酸、２−キノリンカルボン酸、グリオキシ
ル酸、グリコール酸、グルタミン酸、クロロ安息香酸な
どが挙げられる。

【００５２】本発明３の測定方法に用いる溶離液は、有
機酸の塩を含む緩衝液であってよい。塩としてはナトリ
ウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩などが挙げられる。

【００５３】本発明３の測定方法に用いる溶離液とし
て、上記で例示しなかったものについては、有機酸又は
その塩で、酸解離定数ｐＫａ値（２５℃）の少なくとも
一つが１．０〜９．０にあるものが挙げられる。

【００５４】本発明３の測定方法に用いる溶離液の濃度
は、他の測定条件により異なるが、好ましくは０．１〜
２０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。
また、上記の緩衝液を複数混合して用いてもよい。また
他の緩衝液（リン酸塩、ホウ酸塩などを含む無機系緩衝
液など）；塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウムなど）；塩酸などの無機酸；水酸化ナトリウ
ムや水酸化カリウムなどの塩基；メタノール、エタノー
ル、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒と混合して用
いても良い。また、更に分離をよくするために、他の添
加剤を加えてもよい。また、複数の溶離液を用いて測定
途中で切り替えたり、グラディエント溶出、ステップグ
ラディエント溶出を行ってもよい。

【００５５】測定に用いる溶離液の種類及び数は、特に
限定されず、用いられる複数の溶離液の全てが、上記有
機酸又はその塩を含む必要はない。好ましくは、糖化ヘ
モグロビン溶出時に、上記有機酸又はその塩を含む溶離
液を用いる。

【００５６】本発明３の測定方法において、他の測定条
件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ま
しくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．１〜
３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎ
ｍの可視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶
血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液
を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料
注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは１〜５
０μｌ程度である。

【００５７】（作用）本発明１の測定方法は、充填剤の
イオン交換基と同種のイオン種を含む緩衝液を溶離液と
して用いるので、従来のヘモグロビン類の測定法におけ
る問題点であった測定時間の延長や、分離性能が解決さ
れ、短時間内に、かつ高精度にヘモグロビン類を分離で
きる。

【００５８】本発明２の測定方法は、充填剤がカチオン
交換樹脂であり、溶離液がＧｏｏｄの緩衝液であること
を特徴とする本発明１のヘモグロビン類の測定方法であ
るので、従来分離が困難であった安定型ＨｂＡ１ｃの短
時間での高精度測定、及びＡＨｂ、ＣＨｂの分離定量が
可能となった。

【００５９】本発明３の測定方法は、充填剤がカチオン
交換樹脂であり、溶離液が有機酸又はその塩を含む緩衝
液を用いるので、従来分離が困難であった不安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ及び安定型ＨｂＡ１ｃの短時間での高精度測定が
可能となった。

【００６０】

【実施例】以下、本発明の非限定的な実施例を挙げるこ
とにより、本発明を更に明らかにする。

【００６１】（実施例１）カルボキシル基を有する充填
剤を用いるもの充填剤の調製テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４００ｇ及びメタクリル酸（和光純薬社製）１
５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）
１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコ
ール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散さ
せ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時
間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均
粒径６μｍの粒子（以下、充填剤１という）を得た。

【００６２】カラムの充填得られた充填剤１をカラムに以下のようにして充填し
た。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく
撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×
３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入
した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続
し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ² で定圧充填した。

【００６３】ヘモグロビン類の測定得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビ
ン類の測定を行った。測定条件システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭフタル酸水素ナトリウム（和光純薬社製）緩衝液（ｐＨ５．７）溶離液Ｂ：３００ｍＭフタル酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）測定開始より０〜１分の間は溶離液Ａを流し、１〜１．１分の間は溶離液Ｂを流し、１．１〜２分の間は溶離液Ａを流した。流速：２．０ｍｌ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μｌ

【００６４】測定試料健常人血をフッ化ナトリウム採血し、以下の試料を調製
した。試料ａ（糖負荷血）：健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌと
なるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反
応させたもの。試料ｂ（カルバミル化ヘモグロビン（ＣＨｂ）含有試
料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナ
トリウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で１
時間反応させたもの。試料ｃ（アセチル化ヘモグロビン（ＡＨｂ）含有試
料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアル
デヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間
反応させたもの。試料ｄ：上記試料ｂと試料ｃを等量混合したもの。

【００６５】次いで、上記試料ａと試料ｄをそれぞれ以
下のように処理して試料Ａと試料Ｄを作製し測定試料と
した。試料Ａ：上記試料ａを、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％ト
リトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））
で溶血し、１５０倍に希釈して試料Ａとした。試料Ｄ：上記試料ｄを、溶血希釈液Ｙ（溶血希釈液Ｘに
ポリリン酸ナトリウム（太平化学社製）を０．０５重量
％となるよう添加したもの）で１５０倍に溶血希釈し、
３５℃で２分間加温して試料Ｄとした。

【００６６】測定結果上記測定条件により、試料Ａを測定して得られたクロマ
トグラムを図１に、試料Ｄを測定して得られたクロマト
グラムを図２に示す。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ
１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１
ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ
０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。図１
では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、
図２ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良
好に分離されていることがわかる。

【００６７】（実施例２）リン酸基を有する充填剤を用
いるものテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４００ｇ及び（２−メタクリロイルオキシエチ
ル）アシッドホスフェート（共栄社化学社製）１００ｇ
の混合物に、過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５
ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール水
溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気
下で８０℃に昇温し、８０℃で８時間重合した。重合
後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子
（以下、充填剤２という）を得た。実施例１と同様にし
て、充填剤２をカラムに充填し、ヘモグロビン類の測定
を行った。溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．８）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を用い実施例１に準じて測定を行ったと
ころ、得られたクロマトグラムは図１及び図２と同様、
良好であった。

【００６８】（実施例３）スルホン酸基を有する充填剤
を用いるもの特公平８−７１９７号公報に記載の方法により、充填剤
を調製した。テトラエチレングリコールジメタクリレー
ト３００ｇ、グリセロールジメタクリレート（新中村化
学社製）１００ｇに過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解
し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌ
に分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０
℃で１時間重合した。１時間後、２−アクリルアミド−
２−メチルプロパンスルホン酸１００ｇを添加し、さら
に６５℃で３時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した
後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤３と
いう）を得た。イオン交換容量を測定したところ、乾燥
粒子１ｇ当たり１１．３μｅｑであった。実施例１と同
様にして充填剤３をカラムに充填し、ヘモグロビン類の
測定を行った。溶離液ＡとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度
で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．
７）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を用い実施例１に準じて測定を行ったところ、
得られたクロマトグラムは図１及び図２と同様、良好で
あった。

【００６９】（比較例１）実施例１と同様にして充填剤
１をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例１に準じて
（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範
囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変え
た）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマ
トグラムを図３（試料Ａ）及び図４（試料Ｄ）に示す。
図１及び図２に比較して、測定時間が長いにもかかわら
ず、分離能が悪いことが分かる。

【００７０】（比較例２）実施例１と同様にして充填剤
２をカラムに充填し、溶離液ＡとしてＭＥＳを１００ｍ
Ｍ濃度で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ
５．９）、溶離液ＢとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度で、
食塩を５００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．９）を用
いて、実施例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間
は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分
離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行
ったところ、得られたクロマトグラムは図３及び図４と
同様であった。

【００７１】（比較例３）実施例１と同様にして充填剤
３をカラムに充填し、溶離液Ａとして２０ｍＭクエン酸
ナトリウム（和光純薬社製）水溶液（ｐＨ６．０）及び
溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を用いて、実施例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時
間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な
分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を
行った。得られたクロマトグラムは、図３及び図４と同
様であった。

【００７２】（実施例４）テトラエチレングリコールジ
メタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化
成社製）１００ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純
薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニ
ルアルコール（日本合成化学製）水溶液２５００ｍｌに
分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温
し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した
後、分級して平均粒径６μｍ（以下、充填剤４という）
の粒子を得た。

【００７３】実施例１と同様にして充填剤４をカラムに
充填し、溶離液ＡとしてＭＥＳを１０ｍＭ濃度で、食塩
を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．７）、溶離液
Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用い
て、実施例１に準じて（但し、流速は１．５ｍｌ／分と
した）ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用いて
得られたクロマトグラムを図５に、試料Ｄを用いて得ら
れたクロマトグラムを図６に示した。図５では、ピーク
３及び４が良好に分離されている。また、図６ではＡＨ
ｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離され
ていることがわかる。

【００７４】（実施例５）特公平８−７１９７号公報に
記載の方法により、充填剤を調製した。トリエチレング
リコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ
に過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビ
ニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌し
ながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で１時間重合し
た。１時間後メタクリル酸１５０ｇを添加し、さらに１
時間８０℃で重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分
級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤５という）
を得た。実施例１と同様にして充填剤５をカラムに充填
し、溶離液Ａとして２０ｍＭ濃度でＢｉｓ−Ｔｒｉｓ
（和光純薬社製）を含む１１０ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ
６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じてヘモグロビ
ン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図５
及び図６と同様であった。

【００７５】（比較例４）実施例４と同様にして充填剤
４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ５．５）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じて
（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範
囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変え
た）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマ
トグラムを図７（試料Ａ）及び図８（試料Ｄ）に示す。
図５及び図６に比較して、測定時間が長いにもかかわら
ず、分離能が悪いことが分かる。

【００７６】（比較例５）実施例５と同様にして充填剤
５をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ５．９）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じて
（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範
囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変え
た）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマ
トグラムは図７及び図８と同様であった。

【００７７】（実施例６）実施例４と同様にして充填剤
４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１０ｍＭの濃度で
コハク酸を含む１００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．３）、
溶離液Ｂとして１０ｍＭの濃度でコハク酸を含む２００
ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｃとして１０ｍ
Ｍの濃度でコハク酸を含む４００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ
５．８）を用いて、測定開始より０〜０．３分の間は溶
離液Ａを流し、０．３〜１．０分の間は溶離液Ｂを流
し、１．０〜１．２分の間は溶離液Ｃを流し、１．２〜
２．０分の間は溶離液Ａを再び流したことの他は、実施
例４に準じて（但し、試料注入量は１０μｌ）ヘモグロ
ビン類の測定を行った。試料Ａを用いて得られたクロマ
トグラムを図９に、試料Ｄを用いて得られたクロマトグ
ラムを図１０に示した。図９では、ピーク３及び４が良
好に分離されている。また、図１０ではＡＨｂやＣＨｂ
のような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていること
がわかる。

【００７８】（比較例６）実施例６と同様にして充填剤
４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｂとして１２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ５．３）及び溶離液Ｃとして４００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ５．９）を用いて、実施例６に準じ
て（溶離液Ａ、Ｂ及びＣの通流時間は、実用的な測定時
間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変
えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用い
て得られたクロマトグラムを図１１に、試料Ｄを用いて
得られたクロマトグラムを図１２に示した。図９及び図
１０に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離
能が悪いことが分かる。

【００７９】

【発明の効果】本発明１の測定方法によれば、従来のヘ
モグロビン類の測定法における問題点であった測定時間
の延長や、分離性能が解決され、短時間内に、かつ高精
度にヘモグロビン類を分離できる。

【００８０】本発明２の測定方法によれば、従来短時間
では分離が困難であった不安定型ＨｂＡ１ｃを安定型Ｈ
ｂＡ１ｃから分離できるため、従来より短時間で、精度
良く、ヘモグロビン類を測定できる。また、ＡＨｂ、Ｃ
Ｈｂのような修飾ヘモグロビンも安定型ＨｂＡ１ｃより
分離でき、またＡＨｂとＣＨｂも分離できるため、それ
ぞれを定量することが可能となった。

【００８１】本発明３の測定方法によれば、従来短時間
では分離が困難であった不安定型ＨｂＡ１ｃを安定型Ｈ
ｂＡ１ｃから分離できるため、従来より短時間で、精度
良く、ヘモグロビン類を測定できる。また、ＡＨｂ、Ｃ
Ｈｂのような修飾ヘモグロビンも安定型ＨｂＡ１ｃより
分離でき、またＡＨｂとＣＨｂも分離できるため、それ
ぞれを定量することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の測定条件により、試料Ａのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図２】実施例１の測定条件により、試料Ｄのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図３】比較例１の測定条件により、試料Ａのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図４】比較例１の測定条件により、試料Ｄのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図５】実施例４の測定条件により、試料Ａのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図６】実施例４の測定条件により、試料Ｄのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図７】比較例４の測定条件により、試料Ａのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図８】比較例４の測定条件により、試料Ｄのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図９】実施例６の測定条件により、試料Ａのヘモグロ
ビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示
す図。

【図１０】実施例６の測定条件により、試料Ｄのヘモグ
ロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図１１】比較例６の測定条件により、試料Ａのヘモグ
ロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図１２】比較例６の測定条件により、試料Ｄのヘモグ
ロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【符号の説明】

１ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂのピーク２ＨｂＦのピーク３不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク４安定型ＨｂＡ１ｃのピーク５ＨｂＡ０のピーク６ＡＨｂのピーク７ＣＨｂのピーク

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体クロマトグラフィーによるヘモグロ
ビン類の測定方法であって、充填剤のイオン交換基と同
種のイオン種を含む緩衝液を溶離液として用いることを
特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】充填剤がカチオン交換樹脂であり、溶離
液がグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液であることを特徴とす
る請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項３】液体クロマトグラフィーによるヘモグロ
ビン類の測定方法であって、充填剤がカチオン交換樹脂
であり、溶離液が有機酸又はその塩を含む緩衝液である
ことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。