JP2001221788A - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 勾配溶出法または段階溶出法を用いたカチオ
ン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の
測定方法において、ヘモグロビン類の分離を短時間で、
高分離能で行うことができ、さらに測定再現性の優れた
ヘモグロビン類の測定方法を提供する。 【解決手段】 カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、溶出力の異な
る少なくとも２種の溶離液（溶離液Ａ及び溶離液Ｂ）を
用い、溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きく、
溶離液Ａによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの溶出力が、
溶離液Ｂによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの溶出力より
も小さいヘモグロビン類の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関し、より詳
細には、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる安
定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、液体クロマトグラフィー（以
下、ＬＣという）を用いて試料を分離する場合、溶離液
として、一定の溶出力のものを１種類用いる方法や、２
種以上の溶離液を用いた勾配溶出法または段階溶出法に
より、各成分のピークを鋭くし、分離度を改善したり、
測定時間を短縮する方法が行われている。

【０００３】上記勾配溶出法（グラジエント溶離法）と
は、溶離液の溶出力を弱いものからから強いものへと時
間的に直線的に上昇させる方法（図１３）であり、送液
ポンプを複数台用いて、溶出力の異なる液を送液し、そ
の比率を連続的に変化させることにより、全体的な溶出
力を変化させる方法である。

【０００４】また、上記段階溶出法（ステップワイズ溶
離法）とは、溶離液の溶出力を段階的に上昇させる方法
（図１４）であり、送液ポンプ１台を用い、送液ポンプ
の上流側で電磁弁等により溶出力の異なる液を切り替
え、段階的に溶出力を変化させる方法である。

【０００５】これらの方法において、溶離液の溶出力を
変化させるには、例えば、溶離液の極性、イオン強度、
ｐＨなどが挙げられる。（以上の従来の技術について
は、日本分析化学会関東支部編、高速液体クロマトグラ
フィーハンドブック、３９〜４０頁、１１７〜１１９
頁、１９８５年）。

【０００６】しかしながら、各成分の性質が類似してい
たり、短時間で溶出することが要求されていたりする場
合、勾配溶出法で勾配が大きすぎたり、段階溶出法で溶
出力を上げすぎたりすると、類似した性質の成分間でピ
ークが重なり、分離に悪影響を及ぼす恐れがある。そこ
で、このような場合、ピークが重なるポイントで勾配を
緩めたり、全くなくしたり、溶出力の上昇の程度を低く
したりしている。しかしながら、このような対策ではピ
ークの鋭さがなくなったり、また、測定時間が延びたり
するなど、勾配溶出法または段階溶出法の利点が発揮さ
れない場合があった。

【０００７】一方、上記液体クロマトグラフィーは、最
近臨床検査分野で広く用いられており、特に、血液試料
中に含まれている夾雑成分の中から測定対象成分を分離
したり、性質の似た複数の成分を相互に分離分析した
り、特定の成分を分取するために用いられている。

【０００８】その中でも、糖化ヘモグロビン、特にヘモ
グロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は糖尿病診
断の指標として広く利用されている。ＨｂＡ１ｃとは血
液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆
的に結合して生成したものであり、過去１〜２カ月間の
血液中の平均的な糖濃度を反映する。

【０００９】液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１
ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー
法により行われている（特公平８−７１９８号公報な
ど）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィ
ーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以
下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以
下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、Ｈｂ
Ｆという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並
びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などの
ピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使
用されているＨｂＡ１ｃは、最近では、上記のうちの安
定型ＨｂＡ１ｃであり、その割合は、全ヘモグロビンピ
ークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比
率（％）として求められている。

【００１０】しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不
安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通
常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定するこ
とが困難であった。

【００１１】また、時に、アセチル化ヘモグロビン（以
下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン（以
下、ＣＨｂという）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型
ＨｂＡ１ｃと重なって溶離してくるという問題があっ
た。すなわち、カチオン交換ＬＣによる安定型ＨｂＡ１
ｃ値の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を
測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えな
いように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している
不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂピークを、安定
型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。

【００１２】さらに、「異常ヘモグロビン」としてヘモ
グロビンＳ（以下、ＨｂＳという）ヘモグロビンＣ（以
下、ＨｂＣという）が知られている。ＨｂＳはヘモグロ
ビンＡ（以下、ＨｂＡという）のβ鎖のＮ末端から６番
目のグルタミン酸がバリンに置換されたものであり、Ｈ
ｂＣは同じ部位がリジンに置換されたものである。これ
らＨｂＳ、ＨｂＣ、及び下記するＨｂＡ２は、ＨｂＡ０
より後に順に溶出される。そして、これらＨｂＳ、Ｈｂ
Ｃを含む検体の安定型ＨｂＡ１ｃを測定するときには、
これらのピーク面積を除いた他のヘモグロビン成分の合
計ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピーク面積の比
率（％）を算出して求める必要がある。

【００１３】また、ヘモグロビンＡ２（以下、ＨｂＡ２
と略す）は、α鎖とδ鎖から成るヘモグロビンであり、
ＨｂＦと共に地中海性貧血症（tha lassemia）において
その構成比率が正常者より高い。そして、上記地中海性
貧血症を同時に検査したい場合には、ＨｂＡ２をＨｂＡ
０から分離できるような溶離条件を設定する。この場合
は、全ヘモグロビンに対するＨｂＦとＨｂＡ２の構成比
率が測定結果として算出される。

【００１４】しかしながら、ＨｂＡ０とＨｂＳ、ＨｂＣ
及びＨｂＡ２とのカラムに対する保持能力が近いため、
これらのピークを完全に分離するためには、時間を要し
ていただけでなく、精度良く測定することが困難であっ
た。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来のヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑み、ヘモ
グロビン類の分離を短時間で、高分離能で行うことがで
き、さらに測定再現性の優れたヘモグロビン類の測定方
法を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の本発明
（以下、本発明１という）では、カチオン交換液体クロ
マトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法におい
て、溶出力の異なる少なくとも２種の溶離液（溶離液Ａ
及び溶離液Ｂ）を用い、溶離液ＡのｐＨが、溶離液Ｂの
ｐＨより大きく、溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ
溶出力が、溶離液Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力
よりも小さいことを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法を提供する。また、請求項２記載の本発明（以下、本
発明２という）では、上記溶離液Ａの浸透圧が、上記溶
離液Ｂの浸透圧よりも小さいことを特徴とする請求項１
記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。また、請
求項３記載の本発明（以下、本発明３という）では、ア
ルカリ性水溶液添加に対する上記溶離液Ａの緩衝能が、
上記溶離液Ｂのそれよりも小さいか、あるいは、それと
等しいことを特徴とする請求項１または２記載のヘモグ
ロビン類の測定方法を提供する。また、請求項４記載の
本発明（以下、本発明４という）では、ヘモグロビン類
の測定中の溶離液送液工程において、少なくとも、上記
溶離液Ａを送液した後上記溶離液Ｂを送液する工程、あ
るいは、上記溶離液Ｂを送液した後上記溶離液Ａを送液
する工程が含まれることを特徴とする請求項１〜３いず
れか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供す
る。また、請求項５記載の本発明（以下、本発明５とい
う）では、上記溶離液Ａ及び／又は溶離液Ｂにカオトロ
ピックイオンが含有されており、かつ、ｐＨ４．０〜
６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれら
の塩が含有されていることを特徴とする請求項１〜４い
ずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供す
る。また、請求項６記載の本発明（以下、本発明６とい
う）では、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂとは溶出力が異な
る溶離液Ｃを用い、該溶離液Ｃは、ヘモグロビンＡ０を
溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨが、ヘ
モグロビン類の等電点と等しいか、または、等電点より
アルカリ側になるように設定されていることを特徴とす
る請求項１〜５いずれか一項に記載のヘモグロビン類の
測定方法を提供する。また、請求項７記載の本発明（以
下、本発明７という）では、上記溶離液Ｃにカオトロピ
ックイオンが含有されていることを特徴とする請求項６
記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。以下に、
本発明を詳細に説明する。

【００１７】本発明１は、溶出力の異なる少なくとも２
種の溶離液（本明細書中では、溶離液Ａ及び溶離液Ｂと
いう）を用い、溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより
大きく、溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力
が、溶離液Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力よりも
小さいことを特徴とする。

【００１８】本発明でいう溶離液の安定型ヘモグロビン
Ａ１ｃ溶出力は、カチオン交換液体クロマトグラフィー
による測定において、同一ロットの安定型ヘモグロビン
Ａ１ｃ試料を、同一カラム、同一分析条件（溶離液を除
いて分析に影響する全ての条件が同じ）で、溶出力を評
価する溶離液のみを用い、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの
保持時間を測定して、これを比較することにより求める
ことができる。すなわち、溶離液Ａと溶離液Ｂの場合
で、安定型ＨｂＡ１ｃの保持時間を測定したとき、保持
時間がそれぞれＴ_A 、Ｔ_B であったとすると、Ｔ_A ＞Ｔ
_B （つまり溶離液Ｂの場合より溶離液Ａの場合の方が安
定型ＨｂＡ１ｃの溶出に時間がかかる）である場合、安
定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力は、溶離液Ａのほうが溶
離液Ｂよりも小さいということになる。上記溶離液の溶
出力を変える方法としては、ｐＨや塩濃度、イオン強
度、溶液の極性を変える方法が挙げられる。

【００１９】本発明において上記溶離液ＡのｐＨが、溶
離液ＢのｐＨより大きいとは、市販のｐＨ測定装置（例
えば、カスタニーＬＡＢ ｐＨメーター（Ｆ２３）、堀
場製作所社製）で溶離液Ａ及び溶離液Ｂを測定した場
合、溶離液ＡのｐＨが溶離液ＢのｐＨより大きいという
ことである。具体的には、液温２０℃の場合、溶離液Ａ
のｐＨは溶離液Ｂに比べて、０．００１〜３．０００大
きいことが好ましく、さらに好ましくは、０．０１０〜
２．５００大きく、またさらには、０．０２０〜２．０
００大きいものが好ましい。

【００２０】上記溶離液Ａ及びＢは、ヘモグロビン類測
定中の溶離液送液工程において、上記ＨｂＡ１ａ、Ｈｂ
Ａ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１
ｃ、ＨｂＡ０、異常ヘモグロビン（ＨｂＳ、ＨｂＣ）、
ＨｂＡ２、及び修飾ヘモグロビン（ＡＨｂ、ＣＨｂ）を
最適に分離できるように送液する。

【００２１】測定に用いられる溶離液としては、上記溶
離液Ａ、Ｂ以外にも近接したピークを分離するために他
の溶離液を用いても良い。また、測定終了後は、カラム
洗浄液、または、溶離液Ａ、Ｂより溶出力の強い溶離液
でカラム洗浄を行うことが好ましい。

【００２２】本発明２は、溶離液Ａの浸透圧が、溶離液
Ｂの浸透圧よりも小さいことを特徴とする。上記溶離液
Ａの浸透圧が、溶離液Ｂの浸透圧よりも小さいとは、市
販の浸透圧測定装置（例えば、オズモスタット（OM-602
0)、京都第一科学社製）において、溶離液Ａ、Ｂの浸透
圧を測定した場合、溶離液Ｂの浸透圧より溶離液Ａの浸
透圧が小さいということである。具体的には、上記装置
において溶離液を測定した場合、溶離液Ｂの浸透圧は、
溶離液Ａに比べて２４．４５〜２４４５０ｈＰａ（上記
OM-6020 で測定した場合は、１〜１０００ｍＯｓｍ、１
ｍＯｓｍ＝２４．４５ｈＰａ）大きく、より好ましく
は、４８．９０〜１２２２５ｈＰａ（２〜５００ｍＯｓ
ｍ）大きく、更には、１２２．２５〜７３３５ｈＰａ
（５〜３００ｍＯｓｍ）大きいのが好ましい。上記溶離
液の浸透圧を変える方法としては、溶離液に酸、アルカ
リ、塩等を添加する方法が挙げられる。

【００２３】本発明３は、アルカリ性水溶液添加に対す
る溶離液Ａの緩衝能が、溶離液Ｂのそれよりも小さい
か、あるいは、それと等しいことを特徴とする。

【００２４】上記アルカリ性水溶液添加に対する溶離液
Ａの緩衝能が、溶離液Ｂのそれよりも小さいとは、例え
ば、溶離液Ａ及びＢ各１００ｍｌに０．１モル／Ｌの水
酸化ナトリウム１ｍｌを添加した時、溶離液ＡのｐＨ増
加分（Ｘ）が、溶離液ＢのｐＨ増加分（Ｙ）と比べて同
等以上であることを意味する。本発明においては、緩衝
能の差（Ｋ）を以下のように定義する。緩衝能の差Ｋ＝
（溶離液ＡのｐＨ増加分Ｘ）−（溶離液ＢのｐＨ増加分
Ｙ）上記、溶離液の緩衝能の差（Ｋ）は、液温２０℃に
おいて、０．００１〜３．０００であることが好まし
く、さらに好ましくは、０．００２〜１．０００であ
る。

【００２５】上記溶離液には、通常、緩衝能を有する物
質として、無機酸、有機酸またはこれらの塩が含まれ
る。上記無機酸としては、例えば、炭酸、リン酸等が挙
げられる。上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、
ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン
酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が挙げられ
る。上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオ
ン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例え
ば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マ
レイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。上記カ
ルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグ
ルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられ
る。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエ
ン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミノ酸とし
ては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン等が挙げ
られる。上記無機酸または有機酸の塩としては、公知の
もので良く、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙
げられる。上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、複
数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して
用いても良い。上記無機酸、有機酸及び／またはこれら
の塩の溶離液中の濃度、複数種用いる場合には複数種の
合計の濃度は、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩
衝作用があれば良く、１〜１０００ｍＭが好ましく、１
０〜５００ｍＭが特に好ましい。

【００２６】本発明４においては、ヘモグロビン類測定
中の溶離液送液工程は、少なくとも、上記溶離液Ａを送
液した後上記溶離液Ｂを送液する工程、あるいは、上記
溶離液Ｂを送液した後上記溶離液Ａを送液する工程を含
むものである。

【００２７】すなわち、上記送液方法とは、溶離液Ａ、
ＢをＡ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ
−Ｂ−Ａ・・・、または、Ｂ−Ａ、Ｂ−Ａ−Ｂ、Ｂ−Ａ
−Ｂ−Ａ、Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ・・・・のように交互に
流すことで、交互に流す回数、Ａ及びＢの順番は、近接
したピークを分離溶離するために適宜最適なものにする
ことが好ましい。また、測定に用いる溶離液としては、
上記Ａ、Ｂ以外の溶離液を組み合わせても良い。

【００２８】上記溶離液は、例えば、溶出力のより弱い
溶離液ＡによりＨｂＡ１ａからＨｂＦ付近まで溶離し、
次に溶出力の強い溶離液Ｂに切り替えてＨｂＡ１ｃまで
を溶離し、再び、溶離液Ａを流し、その後溶出力の最も
強い溶離液に切り替えてＨｂＡ０以降に溶出するヘモグ
ロビン成分を溶出させる。このように、ＨｂＡ１ｃ溶離
後、溶離液Ａを再び流すことにより、ＨｂＡ１ｃピーク
近傍に、妨害ピークが出現せず、ＨｂＡ１ｃを正確にし
かも再現性良く分離溶離できる。

【００２９】本発明５では、溶離液Ａ及び／又は溶離液
Ｂには、カオトロピックイオン、かつ、ｐＨ４．０〜
６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれら
の塩が含有されていることを特徴とする。

【００３０】上記カオトロピックイオンとは、化合物が
水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであ
り、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したとき
に起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ
酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオ
ン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イ
オン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸
イオン等が挙げられる。また、陽イオンのカオトロピッ
クイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオ
ン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げら
れる。これらのカオトロピックイオンの中で第５の発明
に用いられるものは、陰イオンとして、トリブロモ酢酸
イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、
ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオ
ン、硝酸イオン、臭化物イオン等を、陽イオンとして、
バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオ
ン等を用いるのが好ましい。さらに、より好ましくは、
トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、ヨウ化
物イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸
イオン、グアニジンイオン等が用いられる。上記溶離液
中のカオトロピックイオンの濃度が、０．１ｍＭより低
いとヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下す
るおそれがあり、また、３０００ｍＭよりも高いと、ヘ
モグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないので、
０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１００
０ｍＭがより好ましく、更に、１０ｍＭ〜５００ｍＭが
好ましい。また、カオトロピックイオンは複数種混合し
て用いても良い。上記カオトロピックイオンは、測定試
料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に添
加しても良い。

【００３１】また、上記溶離液のｐＨは、４．０〜６．
８であることが好ましく、さらに好ましくは４．５〜
５．８である。溶離液のｐＨが４未満であると、ヘモグ
ロビン類が変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超え
ると、ヘモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン
交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が
悪くなる。

【００３２】尚、上記溶離液のｐＨは、例えば、後述の
ｐＨ調節剤の添加量により調節できる。上記ｐＨの異な
る２種類以上の溶離液を、勾配溶出法、あるいは段階溶
出法によって送液しても良い。

【００３３】本発明６では、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂ
とは溶出力が異なる溶離液Ｃを用い、該溶離液ＣはＨｂ
Ａ０を溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨ
が、ヘモグロビン類の等電点と等しいか、または、等電
点よりアルカリ側になるように設定されているものを用
いる。また上記溶離液Ｃは、ＨｂＡ０以外の成分の溶
出、例えば、ＨｂＳやＨｂＣの溶出に用いることもで
き、また、測定終了時におけるカラム洗浄液としても用
いることができる。

【００３４】本発明６において、ＨｂＡ０の溶出に際
し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填剤に保持された
ＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶出するために
は、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点
よりアルカリ側になるように設定した溶離液を用いるの
が好ましい。この条件を実現するには、ｐＨがヘモグロ
ビンの等電点よりアルカリ側であるひとつの溶離液を送
液する方法や、ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用いる
方法がある。ヘモグロビンはｐＨが等電点より酸性側か
らアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに
変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発
力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることができる。
なお、理化学辞典（第４版、１９８７年９月、岩波書
店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載されているよ
うに、ヘモグロビンの等電点はｐＨ６．８〜７．０であ
る。そのため、ＨｂＡ０成分を溶出するために、カラム
に流入する際の溶離液のｐＨを６．８以上にすることが
より好ましい。この条件を満たすため、測定に用いる溶
離液の内、少なくともひとつの溶離液のｐＨが６．８以
上であることが必要である。本溶離液のｐＨは望ましく
は７．０〜１２．０であり、７．５〜１１．０がより好
ましく、更には８．０〜９．５が好ましい。溶離液のｐ
Ｈが６．８未満になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分と
なる。溶離液のｐＨは、用いる充填剤の分解が起こらな
い範囲に設定すれば良い。ＨｂＡ０成分の溶出に好適に
用いられるｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液とし
ては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸また
は、その塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、
β−ジメチルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイ
ン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸また
は、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−
（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホ
ン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イ
ミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒ
ｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉ
ｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥ
Ｓ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃ
ｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一
般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用
できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩
衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール
等のイミダゾール類；エチレンジアミン、メチルアミ
ン、エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールア
ミン、トリエタノールアミン等のアミン類；グリシン、
β−アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミ
ノ酸類；等の有機物も使用できる。また、無機酸；有機
酸；無機酸または有機酸の塩；有機物は、複数混合して
用いても良く、また、有機酸、無機酸及び有機物を混合
しても良い。

【００３５】本発明７の溶離液Ｃには、カオトロピック
イオンが含有されている。すなわち、より効果的にＨｂ
Ａ０成分を溶出するためには、上記溶離液にカオトロピ
ックイオンを添加するのが好ましい。添加するカオトロ
ピックイオンの種類は、上述の発明５におけるものと同
様のものがあげられる。また、その濃度は、１〜３００
０ｍＭが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍＭ
であり、特に好ましくは５０〜５００ｍＭの範囲であ
る。。

【００３６】さらに本発明における上記溶離液群には、
以下の物質を添加しても良い。 （１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等）を添
加しても良い。これらの塩類の濃度は、特に限定されな
いが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。 （２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えても良
い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等
が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリ
ウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、
塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．
００１〜５００ｍＭである。 （３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセ
トン等の水溶性有機溶媒を混合しても良い。これらの有
機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜
８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピックイオン、無機
酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度で用いるの
が好ましい。 （４）アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を添加し
ても良い。 （５）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例
えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレー
ト剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸
化防止剤等を添加しても良い。

【００３７】本発明における上記溶離液Ａ・Ｂ・Ｃで
は、緩衝能を持つ物質としては、酸解離定数（ｐＫａ）
が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範
囲に存在するものが用いるのが好ましい。すなわち、緩
衝剤として、ｐＫａを、２．１５〜６．３９及び６．４
０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つずつもつ単一の
物質を用いても良く、あるいは、２．１５〜６．３９の
範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜
１０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質
とを組み合わせて緩衝剤として用いても良い。また、上
記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良い。上記緩衝剤
のｐＫａの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適
切な溶離液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発
揮できるように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１
０．５０の範囲が好ましく、より好ましくは、２．８０
〜６．３５及び６．８０〜１０．００の範囲である。さ
らに好ましくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜
９．５０の範囲である。上記緩衝剤としては、例えば、
リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、
ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン
酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン
類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げら
れる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピ
リジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６
−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−
アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキ
シプロリン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。上
記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、
安息香酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、
例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン
酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジ
メチルグルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチル
バルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フラン
カルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。上
記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、ク
エン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。上記アニリン
またはアニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジ
メチルアニリン等が挙げられる。上記アミノ酸として
は、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシ
ン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリ
ン、ロイシン等が挙げられる。上記アミン類としては、
例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメ
チルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記
イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５
（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイ
ミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が
挙げられる。上記アルコール類としては、例えば、２−
アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−
アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−
アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられ
る。また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリ
ノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキ
シエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン
（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミド
ジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−
エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（ト
リス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン
（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミ
ド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−
（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸
（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリ
シルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシ
ン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰ
Ｓ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれる
ものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫ
ａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平
蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂 １９８５年）。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【表２】

【００４０】溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用が
ある範囲であれば良く、好ましくは１〜１０００ｍＭ、
より好ましくは１０〜５００ｍＭである。また、上記緩
衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、
有機物と無機物を混合して用いても良い。また、その場
合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離
液は、同一の緩衝剤を含むものを用いるのが好ましい
が、溶離液を切り替える際の、（検出器出力の）ベース
ライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、その必
要はない。さらに、ベースライン変動をより小さくする
ために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用
いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いる
のがより好ましい。

【００４１】（溶出方法）本発明の溶離液は、ヘモグロ
ビン類の分離能、特にＨｂＡｃ１の分離のために特定の
溶出方法を用いることができる。すなわち、本発明の特
定の局面では、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビ
ン類の溶出にｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも
２種類（溶離液Ａ、Ｂ）以上用い、ＨｂＡ０の溶出に溶
離液Ｃを用いる方法、或いは、ＨｂＡ０よりも前に溶出
するヘモグロビン類の溶出に少なくとも２種類（溶離液
Ａ、Ｂ）以上用い、かつ、溶出力の最も弱い溶離液を先
に流し、目的のピークが最適に分離溶離されるように溶
離液Ａ、Ｂを交互に流す方法を用いる。これにより、Ｈ
ｂ類特に安定型ＨｂＡ１ｃをシャープに溶出することが
できる。

【００４２】さらに、本発明の特定の局面では、安定型
ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える可能性のあるのヘモ
グロビン成分（ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等）を含む血
液検体を測定する場合、上記ＨｂＡ０成分を、ＨｂＡと
測定に悪影響を与えるＨｂ類（ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨ
ｂＣ）とに分離し、ＨｂＡを溶出させた後に、測定に悪
影響を与える上記Ｈｂ類（ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂ
Ｃ）を溶離させる測定方法であるので、ＨｂＡ０ピーク
からＨｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けることがで
き、より正確な安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
ここで、上記ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる
場合におけるＨｂＡ０を溶出するための溶離液とは、Ｈ
ｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を含みＨｂＡを主成分とする
ＨｂＡ０ピークを溶出するために用いる溶離液を意味す
る。この場合では、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液の
後に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために、
より溶出力の強い溶離液を送液することが必要となる場
合がある。

【００４３】またさらに、本発明の特定の局面では、勾
配溶出法または段階溶出法によって溶離液を送液するに
際し、分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミン
グを考慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状
態が良くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させ
る。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離
液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶
出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力
の強い溶離液に切り替えて送液する。本発明の方法を段
階溶出法によって行う場合の装置の構成例を図１に示し
た。溶離液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる（例
えば、塩濃度、ｐＨ、極性等において異なる）ものであ
り、電磁弁１によって設定時間に各溶離液に切り替えら
れるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ２に
より、試料注入部３から導入された試料とともにカラム
４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピ
ークの面積、高さ等はインテグレータ６により算出され
る。

【００４４】（充填剤）本発明のヘモグロビン類の測定
方法における陽イオン交換液体クロマトグラフィーの充
填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有して
いる粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカ
チオン交換基を導入することで得られる。

【００４５】該カチオン交換基は、公知のものでよく特
に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸
基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。ま
た、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。

【００４６】上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２
０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。また、粒
度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平
均直径×１００）として、好ましくは４０％以下、より
好ましくは３０％以下である。

【００４７】上記高分子粒子としては、例えば、シリ
カ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリア
ミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子など
が挙げられる。上記高分子粒子は、導入されるイオン交
換基以外の構成成分は、より親水性であることが好まし
い。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが
好ましい。

【００４８】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応
でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うこ
とができる。

【００４９】また、カチオン交換基を有する単量体を重
合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交
換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単
量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下
に重合する方法などが挙げられる。

【００５０】また、（メタ）アクリル酸メチル、（メ
タ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有
エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在
下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エス
テルをカチオン交換基に変換させてもよい。

【００５１】更に、特公平８−７１９７号公報に記載の
ように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基
を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、
該単量体を重合させても良い。

【００５２】上記充填剤はカラムに充填されて液体クロ
マトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知の
ステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されな
い。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長
さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０
ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填
剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用で
きるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例
えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたス
ラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することに
より行う。

【００５３】本発明方法で用いるカラムのフィルターま
たはプレフィルターとしては、イナートな素材からなる
フィルター、または、そのフィルターの表面がイナート
な素材で覆われているフィルターを用いるのが好まし
い。

【００５４】本発明でカラムのフィルターまたはプレフ
ィルターの表面素材として用いるフィルターのイナート
な素材としては、セルロースエステル、セルロースアセ
テート、セルローストリアセテート、セルロース、セル
ロースナイトレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポ
リビニリデンジフロライド、ポリスルフォン、ポリエチ
レン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスル
ホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデ
ン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化物セラミッ
ク、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラ
ミック、硼化物セラミック、チタンから成る群の中から
少なくとも一つ、または、複数組み合わせてなることを
特徴とする。

【００５５】上記フィルターの形状は、メンブレンフィ
ルター、繊維を積層し焼結したもの、微粒子を焼結成型
したものなどがある。

【００５６】本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のも
ので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプ
ラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付
属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付
加されても良い。

【００５７】上記測定法における、他の測定条件として
は、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは
０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ
／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可
視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけでは
ない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有す
る物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したも
のを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により
異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。

【００５８】

【実施例】以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定
されるものではない。

【００５９】（実施例１） 充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学製）４５０ｇにベンゾイルパーオキサイド２．０ｇを
混合して溶解させ、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアル
コール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で攪拌
しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合させた。反応
系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メ
チルプロパンスルホン酸（東京化成製）２００ｇを添加
して１時間攪拌し、再び８０℃で１．３時間重合させ
た。重合後、洗浄し、分級して平均粒径６．５μｍの充
填剤を得た。

【００６０】充填剤のカラムへの充填 得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒
子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３
０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌し
た。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５
ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入し
た。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続
し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ² で定圧充填した。

【００６１】ヘモグロビン類の測定 得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビ
ン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 溶離液：溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：５３ｍＭの過塩素酸を含有する ５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２） 溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５） 測定開始より０〜２．５分の間は溶離液Ｂを送液し、
２．５〜３．０分の間は溶離液Ａを送液し、３．０〜
３．１分の間は溶離液Ｃを送液し、３．１〜４．０分の
間は溶離液Ｂを送液した。 流速：２．０ｍＬ／分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：１０μＬ

【００６２】（測定試料）健常人血をフッ化ナトリウム
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモ
ノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１０
０）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液
（ｐＨ７．０）を用いた。

【００６３】（測定結果）図２に示すように、不安定型
HbA1c と安定型HbA1c が良好に分離した。ピーク１はＨ
ｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３
は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、
ピーク５はＨｂＡ０を示す。また、安定型HbA1c の後ろ
に、妨害ピークが出ず、表３に示すように、安定型HbA1
c の測定再現性は、良好であった。

【００６４】

【表３】

【００６５】（溶離液A,B の溶出力の評価）測定試料
は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベ
ル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。測定条件
は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶
離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を
長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。そ
の結果、溶離液A ：3.0 分、溶離液Ｂ：2.2 分であっ
た。

【００６６】（実施例２） 充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学製）４５０ｇにベンゾイルパーオキサイド２．０ｇを
混合して溶解させ、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアル
コール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で攪拌
しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合させた。反応
系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メ
チルプロパンスルホン酸（東京化成製）２００ｇを添加
して１時間攪拌し、再び８０℃で１．３時間重合させ
た。重合後、洗浄し、分級して平均粒径６．５μｍの充
填剤を得た。

【００６７】充填剤のカラムへの充填 得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒
子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３
０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌し
た。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５
ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入し
た。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続
し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ² で定圧充填した。

【００６８】ヘモグロビン類の測定 得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビ
ン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 溶離液：溶離液Ａ：５３ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：７０ｍＭの過塩素酸を含有する ５５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２） 溶離液Ｃ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【００６９】測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａ
を送液し、０．６〜０．９分の間は溶離液Ｂを送液し、
０．９〜１．２分の間は溶離液Ａを送液し、１．２〜
１．３分の間は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．８分の
間は溶離液Ａを送液した。 流速：２．０ｍＬ／分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：１０μＬ

【００７０】（測定試料）健常人血をフッ化ナトリウム
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモ
ノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１０
０）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液
（ｐＨ７．０）を用いた。 ａ）糖負荷血：全血検体に５００ｍｇ／ｄＬのグルコー
ス水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上
記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ａと
した。 ｂ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量
％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加
し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。 ｃ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量
％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加
し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬によ
り溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。

【００７１】（測定結果）上記測定条件により、試料を
測定して得られたクロマトグラムを図３〜５に示す。図
３は試料ａ、図４は試料ｂ、図５は試料ｃを測定した結
果である。ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示
す。図３では、ピーク３および４が良好に分離されてい
る。また、図４ではピーク６（ＣＨｂ）、図５ではピー
ク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。

【００７２】（溶離液A,B の溶出力の評価）測定試料
は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベ
ル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。測定条件
は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶
離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を
長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。そ
の結果、溶離液A ：2.5 分、溶離液Ｂ：1.7 分であっ
た。

【００７３】（浸透圧の測定）溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を
浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第
一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：163mOs
m(3985.35hpa) 、溶離液Ｂ：220mOsm(5379hpa)であっ
た。

【００７４】（緩衝能の差の評価）溶離液Ａ、Ｂそれぞ
れ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純
薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタ
ニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定し
た。その結果、緩衝能の差は、0.002 であった。

【００７５】（実施例３）溶離液を以下の組成としたこ
ととカラムのフィルターにポリエチレン製のフィルター
（直径５ｍｍ×厚さ１．５ｍｍ）を用いたことの他は、
実施例２と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行っ
た。得られたクロマトグラムは図２〜４と同様に良好で
あった。 溶離液：溶離液Ａ：５３ｍＭの過塩素酸を含有する ４０ｍＭリン酸- ５ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｂ：７０ｍＭの過塩素酸を含有する ４０ｍＭリン酸- １０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．
２） 溶離液Ｃ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する ４０ｍＭリン酸- ５ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【００７６】（溶離液A,B の溶出力の評価）測定試料
は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベ
ル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。測定条件
は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶
離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を
長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。そ
の結果、溶離液A ：2.6 分、溶離液Ｂ：1.8 分であっ
た。

【００７７】（浸透圧の測定）溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を
浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第
一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：162mOs
m(3960.9hpa)、溶離液Ｂ：218mOsm(5330.1hpa)であっ
た。

【００７８】（緩衝能の差の評価）溶離液Ａ、Ｂそれぞ
れ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純
薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタ
ニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定し
た。その結果、緩衝能の差は、0.050 であった。

【００７９】（比較例１）溶離液を以下の組成としたこ
とと送液方法を以下のようにした他は、実施例２と同様
に操作してヘモグロビン類の測定を行った。 溶離液：溶離液Ｄ：５３ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３） 溶離液Ｅ：７０ｍＭの過塩素酸を含有する ４５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４） 溶離液Ｆ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５） 測定開始より０〜０．８分の間は溶離液Ｄを送液し、
０．８〜１．２分の間は溶離液Ｅを送液し、１．２〜
１．３分の間は溶離液Ｆを送液し、１．３〜１．８分の
間は溶離液Ｄを送液した。

【００８０】得られたクロマトグラムを図６〜８に示
す。図６は試料ａ、図７は試料ｂ、図８は試料ｃを測定
した結果である。 図３〜５に比較して、いずれもHbA1
c ピークの後ろに妨害ピークが出現して、測定試料ａを
測定した場合、表３に示すようにHbA1c 測定再現性が実
施例１〜３比べて比較例１が悪いことが明らかである。

【００８１】（溶離液A,B の溶出力の評価）測定試料
は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベ
ル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。測定条件
は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶
離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を
長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。そ
の結果、溶離液A ：2.5 分、溶離液Ｂ：1.7 分であっ
た。

【００８２】（浸透圧の測定）溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を
浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第
一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：163mOs
m(3985.35hpa) 、溶離液Ｂ：220mOsm(5379hpa)であっ
た。

【００８３】（緩衝能の差の評価）溶離液Ａ、Ｂそれぞ
れ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純
薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタ
ニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定し
た。その結果、緩衝能の差は、-0.002であった。

【００８４】（比較例２）溶離液を以下の組成としたこ
との他は、比較例１と同様に操作してヘモグロビン類の
測定を行った。 溶離液：溶離液Ｈ：210 ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．
３） 溶離液Ｉ：270 ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４） 溶離液Ｊ：400 ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５） 測定開始より０〜０．８分の間は溶離液Ｈを送液し、
０．８〜１．２分の間は溶離液Ｉを送液し、１．２〜
１．３分の間は溶離液Ｊを送液し、１．３〜１．８分の
間は溶離液Ｈを送液した。

【００８５】得られたクロマトグラムを図９〜１１に示
す。図９は試料ａ、図１０は試料ｂ、図１１は試料ｃを
測定した結果である。 実施例１〜３及び比較例１より
も、不安定型HbA1c 、CHb 及びAHb の分離が悪くなっ
た。

【００８６】（溶離液A,B の溶出力の評価）測定試料
は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベ
ル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。測定条件
は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶
離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を
長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。そ
の結果、溶離液A ：2.5 分、溶離液Ｂ：1.7 分であっ
た。

【００８７】（浸透圧の測定）溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を
浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第
一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：163mOs
m(3985.35hpa) 、溶離液Ｂ：220mOsm(5379hpa)であっ
た。

【００８８】（緩衝能の差の評価）溶離液Ａ、Ｂそれぞ
れ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純
薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタ
ニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定し
た。その結果、緩衝能の差は、0.050 であった。

【００８９】（カラム耐久性の評価）実施例１〜３及び
比較例１の溶離条件で、上記測定サンプルａを１００検
体づつ連続測定し、カラム耐久性を評価した。図１２に
示すように、実施例１〜３では、ＨｂＡ１ｃ測定値は、
１０００検体まで一定であったが、比較例１では連続測
定するに従って、ＨｂＡ１ｃピークに妨害ピークが重な
り、測定値が次第に大きくなった。

【００９０】

【発明の効果】本発明のヘモグロビン類の測定方法は、
上述の通り構成され、勾配溶出法または段階溶出法を用
いたカチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグ
ロビン類の測定方法において、ヘモグロビン類の分離を
短時間で、高分離能で行うことができ、さらに測定再現
性の優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】カチオン交換液体クロマトグラフィー装置の構
成例を示す図。

【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。

【図３】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図４】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図５】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図６】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図７】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図８】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図９】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図１０】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図。

【図１１】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類
の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラム
を示す図。

【図１２】実施例１〜３及び比較例１における測定回数
の増加にともなう安定型ＨｂＡ１ｃ値の変動を示す図。

【図１３】勾配溶出法による溶離液の送液方法を示す
図。

【図１４】段階溶出法による溶離液の送液方法を示す
図。

【符号の説明】

１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク ２ ＨｂＦのピーク ３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク ４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク ５ ＨｂＡ０のピーク ６ ＣＨｂのピーク ７ ＡＨｂのピーク ８ 妨害ピーク

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA01 AA25 BA13 BB40 BB41 BB52 CA25 DA48 FA26 FA29 FB06 GC10

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カチオン交換液体クロマトグラフィーに
   よるヘモグロビン類の測定方法において、 溶出力の異なる少なくとも２種の溶離液（溶離液Ａ及び
   溶離液Ｂ）を用い、 溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きく、 溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力が、溶離液
   Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力よりも小さいこと
   を特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
2. 【請求項２】 上記溶離液Ａの浸透圧が、上記溶離液Ｂ
   の浸透圧よりも小さいことを特徴とする請求項１記載の
   ヘモグロビン類の測定方法。
3. 【請求項３】 アルカリ性水溶液添加に対する上記溶離
   液Ａの緩衝能が、上記溶離液Ｂのそれよりも小さいか、
   あるいは、それと等しいことを特徴とする請求項１また
   は２記載のヘモグロビン類の測定方法。
4. 【請求項４】 ヘモグロビン類測定中の溶離液送液工程
   において、 少なくとも、上記溶離液Ａを送液した後上記溶離液Ｂを
   送液する工程、 あるいは、上記溶離液Ｂを送液した後上記溶離液Ａを送
   液する工程が含まれることを特徴とする請求項１〜３い
   ずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法。
5. 【請求項５】 上記溶離液Ａ及び／又は溶離液Ｂにカオ
   トロピックイオンが含有されており、かつ、ｐＨ４．０
   〜６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれ
   らの塩が含有されていることを特徴とする請求項１〜４
   いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法。
6. 【請求項６】 上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂとは溶出力が
   異なる溶離液Ｃを用い、該溶離液Ｃは、ヘモグロビンＡ
   ０を溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨ
   が、ヘモグロビン類の等電点と等しいか、または、等電
   点よりアルカリ側になるように設定されていることを特
   徴とする請求項１〜５いずれか一項に記載のヘモグロビ
   ン類の測定方法。
7. 【請求項７】 上記溶離液Ｃにカオトロピックイオンが
   含有されていることを特徴とする請求項６記載のヘモグ
   ロビン類の測定方法。