WO2021182599A1 - ヘモグロビン分析方法 - Google Patents

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美奈 梅津
有理子 根本
博暁 太平
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積水メディカル株式会社
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    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing hemoglobin.
  • liquid chromatography is widely used for analysis of components in samples.
  • liquid chromatography is used for the analysis of hemoglobin (Hb).
  • HbA hemoglobin
  • HbA1c is a glycated hemoglobin in which sugar in blood and hemoglobin are bound, and is used as a marker for diabetes and the like.
  • the blood HbA1c concentration (%), that is, the ratio of HbA1c in the total blood Hb reflects the average blood glucose level in the past 1 to 2 months, and is widely used as an index for diagnosing diabetes.
  • Patent Documents 1 and 2 describe a method for separating the HbA1c fraction and the HbA0 fraction by cation exchange chromatography, and the method describes the following eluent A and eluent B: Eluent A: pH is 4.0 to 6.0, (1) chaotropic ion, (2) acid dissociation constant is in the range of 3.5 or more and less than 6.5, and monocarboxylic acid and dicarboxylic acid.
  • Eluent B Elution having a pH 0.5 to 3.0 higher than eluent A and a concentration 20 to 200 mmol / L lower than eluent A, or a pH of 7.0 to 10.0. liquid, Is used in this order, and the pressure value generated in the measurement system is set to 9.8 ⁇ 10 3 Pa or more and 19.6 ⁇ 10 5 Pa or less.
  • Patent Document 3 describes a method for separating various hemoglobins containing abnormal hemoglobin and thalassemia markers from a blood sample by cation exchange chromatography using an eluent having a pH of 8.1 or more and an osmotic pressure of 40 mOsm / kg or less. ..
  • HbA1c hemoglobin A1c concentration
  • the elution time and separation ability of HbA0 may differ even under the same measurement conditions using the same sample.
  • this variation in elution time and separability is caused by variations in the structure of the chromatography analyzer (for example, component dimensions and assembly), and eluent delivery conditions due to slight differences in operation. It was presumed that it was caused by the fluctuation of.
  • the present invention provides a hemoglobin analysis method capable of separating the HbA0 fraction with high accuracy without being affected by structural variations of the analyzer and differences in operation.
  • the present invention provides the following.
  • Hemoglobin analysis method Including eluting the fraction containing hemoglobin A0 by ion exchange chromatography using an eluent containing a buffer at a concentration of less than 25 mM.
  • the buffer is a good buffer,
  • the pH of the eluent is within ⁇ 0.1 of the pKa of the buffer.
  • Method. [2] The method according to [1], wherein the good buffer is TES.
  • the eluent containing the buffer at a concentration of less than 25 mM is further included to be passed through the eluent B, and the eluate B is a buffer having a pH of 6.0 to 10.0.
  • the chromatography is high performance liquid chromatography.
  • the eluent according to any one of [10] to [12], which is used after the eluate A in ion exchange chromatography and the eluate A is a buffer solution having a pH of 4.0 to 6.8. ..
  • the elution according to any one of [10] to [13], which is used before the eluate B in ion exchange chromatography and the eluate B is a buffer solution having a pH of 6.0 to 10.0. liquid.
  • HbA0 can be separated from a sample with high accuracy without being affected by structural variations of the analyzer and differences in operation.
  • the present invention is useful for highly sensitive detection of various hemoglobin species and accurate measurement of HbA1c concentration.
  • the present invention relates to a hemoglobin analysis method by ion exchange chromatography.
  • a blood sample containing hemoglobin which is used for ordinary hemoglobin analysis, can be used.
  • a blood sample obtained by hemolyzing or diluting blood collected from a human can be used.
  • the chromatography performed by the method of the present invention is preferably liquid chromatography, more preferably high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the ion exchange chromatography in the present invention can be performed using a known liquid chromatography system, that is, an ion exchange column connected to a system equipped with a pump for eluent delivery, a sampler, a detector, and the like.
  • the ion exchange chromatography performed by the method of the present invention is a cation exchange chromatography using a stationary phase having a cation exchange group.
  • a cation exchange column packed with a stationary phase having the cation exchange group is used for the cation exchange chromatography.
  • the cation exchange group include a carboxyl group, a phosphoric acid group, a sulfonic acid group, and the like, of which a sulfonic acid group is preferable.
  • Examples of the stationary phase include filler particles, a porous body, and the like, and filler particles are preferable.
  • the filler particles include inorganic particles and organic particles.
  • Examples of the inorganic particles include particles composed of silica, zirconia and the like.
  • Examples of the organic particles include natural polymer particles such as cellulose, polyamino acid and chitosan, and synthetic polymer particles such as polystyrene and polyacrylic acid ester.
  • the stationary phase having the cation exchange group it is obtained by polymerizing a mixture of a non-crosslinkable hydrophilic acrylic monomer and polyglycidyl ethers disclosed in JP-A-2011-0475858. Examples thereof include a filler containing the crosslinked polymer particles to be obtained and a layer of an acrylic monomer having a cation exchange group polymerized on the surface of the crosslinked polymer particles.
  • the eluent used in the method of the present invention is the eluent used for hemoglobin separation by ion exchange chromatography. More preferably, the eluent is the eluent used for elution of hemoglobin from the stationary phase in cation exchange chromatography.
  • a buffer solution containing a low-concentration Good buffer is used as the eluent for separating HbA0 used for elution of HbA0 from the stationary phase.
  • Preferred examples of good buffers are Bicine (N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine), Tricine (N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine), and TES (N-tris (hydroxymethyl)). Methyl-2-aminoethanesulfonic acid), of which TES is preferred.
  • the concentration of the above-mentioned buffer in the HbA0 separation eluate is preferably less than 25 mM, more preferably 20 mM or less, still more preferably 17.5 mM or less, still more preferably 15 mM or less, while preferably 2 mM or more. It is preferably 2.5 mM or more, more preferably 5 mM or more, still more preferably 10 mM or more.
  • concentration range of the buffer in the HbA0 separation eluate are preferably 2 mM or more and less than 25 mM, more preferably 2.5 mM or more and 20 mM or less, still more preferably 5 mM or more and 17.5 mM or less, still more preferably 10 mM. More than 15 mM and less.
  • the pH of the HbA0 separation eluate can be adjusted based on the pKa of the buffer contained in the eluent.
  • the pH of the HbA0 separation eluent is preferably within ⁇ 0.1 of the buffer pKa, more preferably within ⁇ 0.08 of the buffer pKa, and even more preferably within ⁇ 0 of the buffer pKa. It can be within 0.05, more preferably within ⁇ 0.03 of the pKa of the buffer.
  • pH and pKa shall indicate the values of pH and pKa at 25 ° C., respectively.
  • the pKa of the buffer can be calculated from its composition, for example, the pKa of TES at 25 ° C is 7.55 (J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol.31, No.2: 231-370, 2002).
  • the HbA0 separation eluate may further contain an organic acid, an inorganic acid, or a salt thereof.
  • the organic acid include citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid and the like
  • the inorganic acid include hydrochloric acid, nitrate, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid, acetic acid, perchloric acid and the like.
  • salts include sodium salts, potassium salts and the like.
  • the eluent for separating HbA0 can contain any one or a combination of two or more of these organic acids, inorganic acids or salts thereof.
  • the osmotic pressure of the HbA0 separation eluate is preferably 45 mOsm / kg or less, more preferably 40 mOsm / kg or less, and on the other hand, preferably 20 mOsm / kg or more, more preferably 25 mOsm / kg or more.
  • Examples of the osmotic pressure range of the HbA0 separation eluate are preferably 20 to 45 mOsm / kg, and more preferably 25 to 40 mOsm / kg.
  • the value of osmotic pressure in the present specification means the value of osmotic pressure measured by the freezing point depression method.
  • the osmotic pressure can be measured using a commercially available osmotic pressure gauge, for example, an osmometer 3250 (manufactured by Advanced Instruments). Further, in the present specification, the unit of osmotic pressure, mOsm / kg, means mOsm / kgH 2 O, which may also be expressed as mOsm / L or mOsm.
  • the fraction containing HbA0 is separated from the sample by ion exchange chromatography using the above-mentioned eluent for separating HbA0.
  • the fraction containing hemoglobin A1c is first separated before separating the fraction containing HbA0, as in the conventional hemoglobin analysis by ion exchange chromatography.
  • the fraction containing HbA1c is eluted with an eluent A different from the above-mentioned eluent for HbA0 separation.
  • the eluent A may be a buffer solution containing a buffer.
  • the buffer is an acid or a salt thereof having a buffering capacity at pH 4.0 to 6.8.
  • acids include organic acids and inorganic acids.
  • organic acids include citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid and the like, and salts thereof
  • examples of inorganic acids include hydrochloric acid, nitrate, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid, acetic acid and perchlorine. Acids and the like, and salts thereof.
  • the buffer solution used for the eluent A can contain any one or a combination of two or more of these organic acids, inorganic acids and salts thereof. Of these, a buffer solution containing a phosphate, a succinate, or a perchlorate salt is preferable, and a succinate buffer solution is more preferable.
  • the phosphate include sodium salts and potassium salts, and monosodium phosphate and disodium phosphate are preferable.
  • the succinate include sodium salts and potassium salts, and monosodium succinate and disodium succinate are preferable.
  • perchlorates include sodium perchlorate. These phosphates, succinates and perchlorates may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the buffer in the eluent A may be 0.1 mM or more and 400 mM or less, preferably 1 mM or more and 300 mM or less.
  • the pH of the eluent A is preferably pH 4.0 or higher, more preferably pH 5.0 or higher, still more preferably pH 5.2 or higher, preferably pH 6.8 or lower, more preferably pH 6.0 or lower, still more preferably pH 6.0 or lower.
  • the pH is 5.8 or less.
  • the pH range of the eluent A is preferably pH 4.0 to 6.8, more preferably pH 5.0 to 6.0, and even more preferably pH 5.2 to 5.8.
  • the osmotic pressure of the eluent A is preferably 160 mOsm / kg or more, more preferably 180 mOsm / kg or more, preferably 240 mOsm / kg or less, and more preferably 220 mOsm / kg or less.
  • the osmotic pressure range of the eluent A is preferably 160 to 240 mOsm / kg, more preferably 180 to 220 mOsm / kg.
  • the eluent A has a pH of 5.0 to 6.0 and an osmotic pressure of 160 to 240 mOsm / kg, more preferably 180 to 220 mOsm / kg.
  • the eluent A has a pH of 5.2 to 5.8 and an osmotic pressure of 160 to 240 mOsm / kg, more preferably 180 to 220 mOsm / kg.
  • the eluent B may be further passed after the above-mentioned eluent for separating HbA0 is passed.
  • the eluent B is an eluent having a composition different from that of the above-mentioned eluent for separating HbA0 and eluent A.
  • the eluent B can elute a fraction containing components such as HbA2, HbS, HbC, etc., which are eluted later than the fraction containing HbA0.
  • the eluent B may be an eluent conventionally used for elution of HbA0, HbA2, HbS, HbC, etc. in hemoglobin analysis by conventional ion exchange chromatography.
  • the eluent B is a buffer solution
  • examples of the buffer solution used for the eluent B include the same as those exemplified for the eluent A, among which phosphates, succinates, and the like.
  • a buffer solution containing perchlorate is preferable, and a phosphate buffer solution is more preferable.
  • the concentration of the buffer in the eluent B may be 0.1 mM or more and 400 mM or less, preferably 1 mM or more and 300 mM or less.
  • the pH of the eluent B is preferably pH 6.0 or higher, more preferably pH 7.0 or higher, still more preferably pH 7.5 or higher, preferably pH 10.0 or lower, more preferably pH 9.0 or lower, still more preferably.
  • the pH is 8.5 or less.
  • the pH range of the eluent B is preferably pH 6.0 to 10.0, more preferably pH 7.0 to 9.0, and even more preferably pH 7.5 to 8.5.
  • the osmotic pressure of the eluent B is preferably 150 mOsm / kg or more, more preferably 200 mOsm / kg or more, still more preferably 250 mOsm / kg or more, preferably 500 mOsm / kg or less, more preferably 400 mOsm / kg. It is less than or equal to, more preferably 350 mOsm / kg or less.
  • the osmotic pressure range of the eluent B is preferably 150 to 500 mOsm / kg, more preferably 200 to 400 mOsm / kg, and even more preferably 250 to 350 mOsm / kg.
  • the eluent B has a pH of 6.0 to 10.0 and an osmotic pressure of 150 to 500 mOsm / kg. In a more preferred embodiment, the eluent B has a pH of 7.0 to 9.0 and an osmotic pressure of 200 to 400 mOsm / kg. In a more preferred embodiment, the eluent B has a pH of 7.5 to 8.5 and an osmotic pressure of 250 to 350 mOsm / kg.
  • the eluent used in the present invention includes a solvent, a hemoglobin modifier, and a binder to trivalent hem iron, in addition to the above-mentioned buffer. It may contain additives such as a pH adjuster and a surfactant.
  • the eluent used in the present invention contains a hemoglobin modifier.
  • the hemoglobin denaturing agent may be any oxidizing agent capable of changing the heme iron of hemoglobin from divalent to trivalent to produce methemoglobin.
  • oxidizing agents include nitrite, potassium ferricyanide, methylene blue, hydrogen peroxide, ascorbic acid, hydrogen sulfide and the like. Of these, nitrite is preferable, and sodium nitrite or potassium nitrite is more preferable.
  • the concentration of the hemoglobin modifier in the eluate is preferably 0.05 to 15 mmol / L, more preferably 1.0 to 10 mmol / L.
  • the eluent used in the present invention contains a binder to trivalent heme iron.
  • the binder to trivalent heme iron stabilizes methemoglobin produced by the hemoglobin denaturing agent and stabilizes its elution behavior.
  • the binder to the trivalent heme iron include azides, cyanides and the like.
  • azides include sodium azide, diphenylphosphate azide, 4-dodecylbenzene sulfonyl azide, 4-acetylaminobenzene sulfonyl azide, potassium azide, lithium azide, iron azide, hydrogen azide, lead azide. , Mercury azide, copper azide, silver azide and the like.
  • cyanide examples include potassium cyanide, hydrogen cyanide, sodium cyanide, silver cyanide, mercury cyanide, copper cyanide, lead cyanide, iron cyanide, lithium cyanide, ammonium cyanide and the like.
  • the binder to the trivalent heme iron is an azide, more preferably sodium azide.
  • the concentration of the binder to the trivalent heme iron in the eluent is preferably 0.05 to 15 mmol / L, more preferably 0.5 to 10 mmol / L.
  • Examples of the pH adjuster include known acids and bases, examples of the acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid and the like, and examples of the base include sodium hydroxide, potassium hydroxide and water. Examples thereof include lithium oxide, magnesium hydroxide, barium hydroxide and calcium hydroxide.
  • the solvent examples include water-soluble organic solvents such as methanol, ethanol, acetonitrile and acetone.
  • concentration of the solvent is preferably such that salts and the like do not precipitate, for example, 80% (v / v) or less, and a more preferable range is 0.1% (w / w) or more and 50% (w / w). ) It is as follows.
  • the fractions containing various hemoglobins are eluted while switching the above-mentioned eluents A, B, and HbA0 separation eluents.
  • gradient elution is performed by switching the eluent in the order of eluent A ⁇ HbA0 separation eluent.
  • gradient elution is performed by switching the eluent in the order of eluent A ⁇ HbA0 separation eluent ⁇ eluent B.
  • eluent A 100% of eluent A (hereinafter, A solution, or simply referred to as A) is passed through the eluate to elute the fraction containing HbA1c.
  • the eluate is gradiented to increase the proportion of the HbA0 separation eluate (hereinafter referred to as C solution or simply C), and the proportion of C solution is increased to 100%.
  • C solution or simply C
  • the fraction containing HbA0 is eluted by the solution C.
  • the gradient from the liquid A to the liquid C may be a stepwise gradient or a linear gradient, and the mixing ratio of the stepwise gradient or the gradient of the linear gradient may be changed stepwise in the middle. ..
  • the gradient from solution A to solution C is stepwise.
  • liquid C and eluent B (hereinafter, liquid B, or simply referred to as B) are switched.
  • the gradient from the liquid C to the liquid B may be a stepwise gradient or a linear gradient, and the mixing ratio of the stepwise gradient or the gradient of the linear gradient may be changed stepwise in the middle. ..
  • Liquid B elutes an Hb fraction that elutes later than HbA0 (eg, a fraction containing HbA2, HbS, HbC, etc.).
  • liquid A may be passed again after liquid B.
  • the gradient from the liquid B to the liquid A may be a stepwise gradient or a linear gradient, but is preferably a stepwise type.
  • the HbA0 fraction can be separated with high accuracy by passing the above-mentioned eluent for HbA0 separation after the eluate A. Therefore, according to the method of the present invention, the peak of HbA0 can be clearly detected by chromatographic analysis without being affected by the structural variation of the analyzer and the difference in operation, and by extension, various hemoglobin species. Highly sensitive detection and accurate measurement of HbA1c concentration are possible.
  • the obtained mixture was dispersed in 5 L of a 4 wt% polyvinyl alcohol (Nippon Synthetic Chem Industry Co., Ltd., “Gosenol GH-20”) aqueous solution, heated to 80 ° C. under a nitrogen atmosphere with stirring, and polymerized for 1 hour.
  • the reaction was carried out. After cooling the temperature to 30 ° C., 100 g of 2-methacrylamide-2-methylpropanesulfonic acid (manufactured by Toa Synthetic Co., Ltd.) was added to the reaction system as an acrylic monomer having a cation exchange group, and the temperature was adjusted to 80 ° C. again.
  • the polymerization reaction was carried out for 1 hour after warming.
  • the obtained crosslinked polymer particles were washed with ion-exchanged water and acetone to obtain crosslinked polymer particles into which a sulfonic acid group was introduced.
  • the obtained column filler for hemoglobin separation was packed in a stainless steel column having an inner diameter of 4 mm and a length of 20 mm to prepare a cation exchange column for hemoglobin separation.
  • Test 1 The sample prepared in Reference Example 2 was subjected to hemoglobin analysis by HPLC.
  • Two HPLC devices of the same type were prepared (devices A and B), and analysis was performed using each of them under the following conditions.
  • Diagonal Stepwise gradient (0-21 seconds: Eluent A ⁇ Exceeds 21 seconds 39 seconds: Eluent C ⁇ Exceeds 39 seconds 47 seconds: Eluent B ⁇ Exceeds 47 seconds 90 seconds: Eluent A)
  • the pH (25 ° C.) and osmotic pressure of the eluent were measured with a pH meter: F-52 (manufactured by HORIBA, Ltd.) and an osmometer 3250 (manufactured by Advanced Instruments).
  • Table 2 shows the elution time (top peak time) of the peak of HbA0 and the full width at half maximum when each eluent C was used.
  • eluent C having a TES concentration of less than 25 mM and a difference between pH and TES pKa of 0.1 or less was used, a clear peak of HbA0 was obtained by chromatography on all models, and further depending on the model. The difference in peak rise time and top peak time, and the difference in peak width became smaller.

Abstract

ＨｂＡ０画分を高精度に分離することができるヘモグロビン分析方法の提供。　ヘモグロビン分析方法であって、緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ヘモグロビンＡ０を含む画分を溶出させることを含み、該緩衝剤がリン酸塩又はグッド緩衝剤であり、該溶離液のｐＨが該緩衝剤のｐＫａの±０．１以内である、方法。

Description

ヘモグロビン分析方法
　本発明は、ヘモグロビンの分析方法に関する。
　有機化学、生化学、医学などの分野において、検体中の成分の分析に液体クロマトグラフィーが汎用されている。例えば、医学の分野では、ヘモグロビン（Ｈｂ）の分析に液体クロマトグラフィーが利用されている。正常ヒトＨｂの大部分はＨｂＡであり、またＨｂＡには、主にＨｂＡ０と、糖化したＨｂＡ１ｃが含まれる。ＨｂＡ１ｃは、血中の糖とヘモグロビンが結合した糖化ヘモグロビンであり、糖尿病などのマーカーとして使用される。血中ＨｂＡ１ｃ濃度（％）、すなわち血中全Ｈｂ中のＨｂＡ１ｃの割合は、過去１～２ヶ月での血糖値の平均を反映し、糖尿病診断の指標として広く用いられている。
　特許文献１及び２には、カチオン交換クロマトグラフィーによりＨｂＡ１ｃ分画とＨｂＡ０分画を分離する方法が記載されており、該方法は、下記溶離液Ａ及び溶離液Ｂ：
　溶離液Ａ：ｐＨが４．０～６．０であり、かつ（１）カオトロピックイオン、（２）酸解離定数を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩、及び、（３）酸解離定数を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩、を含む溶離液、
　溶離液Ｂ：ｐＨが溶離液Ａよりも０．５～３．０高く、かつ濃度が溶離液Ａよりも２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ小さいか、又はｐＨが７．０～１０．０である、溶離液、
をこの順に用い、かつ、測定系に生じる圧力値を９．８×１０3Ｐａ以上１９．６×１０5Ｐａ以下に設定することを含む。
　特許文献３には、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーにより、血液試料から異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーを含む各種ヘモグロビンを分離する方法が記載されている。
特開２０１４－０９５６３７号公報 特開２０１４－０９５６３８号公報 国際公開公報第２０１９／２０３３０２号
　ヘモグロビン（Ｈｂ）Ａ１ｃ濃度の正確な算出のためには、液体クロマトグラフィー分析においてＨｂＡ１ｃと、他のＨｂ類、特にＨｂＡ０をそれぞれ高精度に分離することが求められる。ＨｂＡ０の分離精度が低下すると、ＨｂＡ１ｃ濃度が正確に算出できなくなるだけでなく、ＨｂＡ０の近くにピークを有するＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣなど（これらはＨｂの形成異常を示す指標として使用される）が検出できなくなる。
　しかし、実際のクロマトグラフィー分析では、同じ検体を用いた同じ測定条件下でも、ＨｂＡ０の溶出時間や分離能が異なる場合があった。本発明者の研究からは、この溶出時間や分離能のぶれは、クロマトグラフィー分析装置の構造上（例えば部品寸法や組み立て）のバラつき、また動作のわずかな違いに起因する溶離液の送液条件の変動により生じたものであると推定された。本発明は、分析装置の構造上のバラつき、また動作の違いによる影響を受けることなく、ＨｂＡ０画分を高精度に分離することができるヘモグロビン分析方法を提供する。
　したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕ヘモグロビン分析方法であって、
　緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ヘモグロビンＡ０を含む画分を溶出させることを含み、
　該緩衝剤が、グッド緩衝剤であり、
　該溶離液のｐＨが、該緩衝剤のｐＫａの±０．１以内である、
方法。
〔２〕前記グッド緩衝剤がＴＥＳである、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記溶離液の浸透圧が６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記ヘモグロビンＡ０を含む画分の溶出の前に、溶離液Ａを用いてヘモグロビンＡ１ｃを含む画分を溶出させることをさらに含み、該溶離液Ａが、ｐＨ４．０～６．８の緩衝液である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記溶離液Ａと、前記緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液との切り替えがステップワイズグラジエントにより行われる、〔４〕記載の方法。
〔６〕前記緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液に続いて、溶離液Ｂを通液することをさらに含み、該溶離液ＢがｐＨ６．０～１０．０の緩衝液である、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液と、前記溶離液Ｂとの切り替えがステップワイズグラジエントにより行われる、〔６〕記載の方法。
〔８〕前記イオン交換クロマトグラフィーがカチオン交換クロマトグラフィーである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有し、該緩衝剤のｐＫａの±０．１以内であるｐＨを有し、該緩衝剤がグッド緩衝剤である、イオン交換クロマトグラフィーにおけるヘモグロビンＡ０分離用溶離液。
〔１１〕前記グッド緩衝剤がＴＥＳである、〔１０〕記載の溶離液。
〔１２〕浸透圧が６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、〔１０〕又は〔１１〕記載の溶離液。
〔１３〕イオン交換クロマトグラフィーにおいて溶離液Ａの後に使用され、該溶離液ＡがｐＨ４．０～６．８の緩衝液である、〔１０〕～〔１２〕のいずれか１項記載の溶離液。
〔１４〕イオン交換クロマトグラフィーにおいて溶離液Ｂの前に使用され、該溶離液ＢがｐＨ６．０～１０．０の緩衝液である、〔１０〕～〔１３〕のいずれか１項記載の溶離液。
　本発明によれば、分析装置の構造上のバラつき、また動作の違いによる影響を受けることなく、試料からＨｂＡ０を高精度に分離することができる。本発明は、各種ヘモグロビン種の高感度な検出、及びＨｂＡ１ｃ濃度の正確な測定に有用である。
各種溶離液Ｃを用いたＨＰＬＣによるＨｂＡ０分離。各図は、２台のＨＰＬＣ装置（装置Ａ、Ｂ）で得られたクロマトグラムの全体像（上）及びＡ０ピークの拡大像（下）を示す。各図の上の数値は、溶離液ＣのＴＥＳ濃度及びｐＨを表す。 図１の続き。
　本発明は、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析方法に関する。本発明によるヘモグロビン分析方法（以下、本発明の方法ともいう）に用いられる試料としては、通常のヘモグロビン分析に用いられる、ヘモグロビンを含む血液試料を用いることができる。例えば、ヒトから採取した血液を溶血又は希釈した血液試料を用いることができる。
　好ましくは、本発明の方法で行われるクロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーであり、より好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。本発明におけるイオン交換クロマトグラフィーは、公知の液体クロマトグラフィーシステム、すなわち、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えたシステムに接続したイオン交換カラムなどを用いて行うことができる。
　好ましくは、本発明の方法で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換基を有する固定相を用いたカチオン交換クロマトグラフィーである。好ましくは、該カチオン交換基を有する固定相が充填されたカチオン交換カラムが、該カチオン交換クロマトグラフィーに用いられる。該カチオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などが挙げられ、このうちスルホン酸基が好ましい。
　該固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。該充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。該無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。該有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。該カチオン交換基を有する固定相の好ましい例として、特開２０１１－０４７８５８号公報に開示されている、非架橋性の親水性アクリル系単量体とポリグリシジルエーテル類との混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、該架橋重合体粒子の表面に重合されたカチオン交換基を有するアクリル系単量体の層とを含む充填剤が挙げられる。
　本発明の方法では、従来のイオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析と同様に、試料中のヘモグロビンを固定相（例えばイオン交換カラム）に吸着させた後、該固定相に溶離液を流して該固定相からヘモグロビンを溶離させることにより、試料中のヘモグロビンを分離する。したがって、本発明の方法で使用される溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離のために使用される溶離液である。より好ましくは、該溶離液は、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて、固定相からのヘモグロビンの溶離のために使用される溶離液である。
　本発明の方法では、固定相からのＨｂＡ０の溶離に用いるＨｂＡ０分離用溶離液として、低濃度のグッド緩衝剤を含有する緩衝液を用いる。グッド緩衝剤の好ましい例としては、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、及びＴＥＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸）が挙げられ、このうちＴＥＳが好ましい。
　該ＨｂＡ０分離用溶離液における上述した緩衝剤の濃度は、好ましくは２５ｍＭ未満、より好ましくは２０ｍＭ以下、さらに好ましくは１７．５ｍＭ以下、さらに好ましくは１５ｍＭ以下であり、一方、好ましくは２ｍＭ以上、より好ましくは２．５ｍＭ以上、さらに好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上である。該ＨｂＡ０分離用溶離液における該緩衝剤の濃度の範囲の例としては、好ましくは２ｍＭ以上２５ｍＭ未満、より好ましくは２．５ｍＭ以上２０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以上１７．５ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以上１５ｍＭ以下が挙げられる。
　該ＨｂＡ０分離用溶離液のｐＨは、該溶離液に含まれる緩衝剤のｐＫａに基づいて調整することができる。該ＨｂＡ０分離用溶離液のｐＨは、好ましくは該緩衝剤のｐＫａの±０．１以内、より好ましくは該緩衝剤のｐＫａの±０．０８以内、さらに好ましくは該緩衝剤のｐＫａの±０．０５以内、さらに好ましくは該緩衝剤のｐＫａの±０．０３以内であり得る。また本明細書では、特別な記載がない限り、ｐＨ及びｐＫａは、２５℃におけるｐＨ及びｐＫａの値をそれぞれ示すものとする。緩衝剤のｐＫａはその組成から計算可能であり、例えばＴＥＳの２５℃でのｐＫａは７．５５である（J. Phys. Chem .Ref. Data, Vol.31, No.2: 231-370, 2002）。
　該ＨｂＡ０分離用溶離液は、さらに有機酸、無機酸、又はその塩を含有していてもよい。該有機酸の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられ、該無機酸の例としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、過塩素酸等が挙げられる。塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。該ＨｂＡ０分離用溶離液は、これらの有機酸、無機酸又はその塩のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。
　該ＨｂＡ０分離用溶離液の浸透圧は、好ましくは４５ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であり、他方、好ましくは２０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは２５ｍＯｓｍ／ｋｇ以上である。該ＨｂＡ０分離用溶離液の浸透圧の範囲の例としては、好ましくは２０～４５ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは２５～４０ｍＯｓｍ／ｋｇが挙げられる。なお本明細書における浸透圧の値は、凝固点降下法により測定された浸透圧の値をいう。浸透圧は、市販の浸透圧計、例えばオズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）等を用いて測定することができる。また本明細書において、浸透圧の単位ｍＯｓｍ／ｋｇとは、ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2Ｏを意味し、これはｍＯｓｍ／Ｌ又はｍＯｓｍとも表記されることがある。
　本発明の方法では、上述のＨｂＡ０分離用溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、試料からＨｂＡ０を含む画分を分離する。好ましくは、本発明の方法では、従来のイオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析と同様に、ＨｂＡ０を含む画分を分離する前に、まずヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を含む画分を分離する。
　ＨｂＡ１ｃを含む画分は、上述のＨｂＡ０分離用溶離液とは異なる溶離液Ａによって溶出される。溶離液Ａは、緩衝剤を含有する緩衝液であればよい。好ましくは、該緩衝剤は、ｐＨ４．０～６．８で緩衝能を有する酸又はその塩である。当該酸の例としては、有機酸及び無機酸が挙げられる。有機酸の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等、及びこれらの塩が挙げられ、無機酸の例としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、過塩素酸等、及びこれらの塩が挙げられる。該溶離液Ａに用いられる緩衝液は、これらの有機酸、無機酸及びその塩のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。このうち、リン酸塩、コハク酸塩、又は過塩素酸塩を含む緩衝液が好ましく、コハク酸塩緩衝液がより好ましい。リン酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムが好ましい。コハク酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウムが好ましい。過塩素酸塩の例としては、過塩素酸ナトリウムが挙げられる。これらのリン酸塩、コハク酸塩及び過塩素酸塩は、単独で用いられてもよく、２種以上で併用されてもよい。溶離液Ａにおける該緩衝剤の濃度は、０．１ｍＭ以上４００ｍＭ以下であればよく、好ましくは１ｍＭ以上３００ｍＭ以下である。
　溶離液ＡのｐＨは、好ましくはｐＨ４．０以上、より好ましくはｐＨ５．０以上、さらに好ましくはｐＨ５．２以上であり、好ましくはｐＨ６．８以下、より好ましくはｐＨ６．０以下、さらに好ましくはｐＨ５．８以下である。溶離液ＡのｐＨ範囲は、好ましくはｐＨ４．０～６．８であり、より好ましくはｐＨ５．０～６．０であり、さらに好ましくはｐＨ５．２～５．８である。また、溶離液Ａの浸透圧は、好ましくは１６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であり、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である。溶離液Ａの浸透圧の範囲は、好ましくは１６０～２４０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは１８０～２２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましい実施形態において、溶離液Ａは、ｐＨ５．０～６．０であり、かつ浸透圧が１６０～２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１８０～２２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。より好ましい実施形態において、溶離液Ａは、ｐＨ５．２～５．８であり、かつ浸透圧が１６０～２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１８０～２２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
　本発明の方法においては、上述のＨｂＡ０分離用溶離液の通液に続いて、さらに溶離液Ｂを通液してもよい。該溶離液Ｂは、上述のＨｂＡ０分離用溶離液及び溶離液Ａとは組成の異なる溶離液である。該溶離液Ｂにより、ＨｂＡ０を含む画分よりも遅れて溶出される成分、例えば、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を含む画分を溶出することができる。
　溶離液Ｂは、従来のイオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析において、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等の溶出に従来使用されていた溶離液であればよい。例えば、溶離液Ｂは緩衝液であり、該溶離液Ｂに用いられる緩衝液の例としては、溶離液Ａについて例示したものと同様のものが挙げられ、このうちリン酸塩、コハク酸塩、又は過塩素酸塩を含む緩衝液が好ましく、リン酸塩緩衝液がより好ましい。溶離液Ｂにおける該緩衝剤の濃度は、０．１ｍＭ以上４００ｍＭ以下であればよく、好ましくは１ｍＭ以上３００ｍＭ以下である。溶離液ＢのｐＨは、好ましくはｐＨ６．０以上、より好ましくはｐＨ７．０以上、さらに好ましくはｐＨ７．５以上であり、好ましくはｐＨ１０．０以下、より好ましくはｐＨ９．０以下、さらに好ましくはｐＨ８．５以下である。溶離液ＢのｐＨ範囲は、好ましくはｐＨ６．０～１０．０であり、より好ましくはｐＨ７．０～９．０であり、さらに好ましくはｐＨ７．５～８．５である。また、溶離液Ｂの浸透圧は、好ましくは１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であり、さらに好ましくは２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であり、好ましくは５００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であり、さらに好ましくは３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である。溶離液Ｂの浸透圧の範囲は、好ましくは１５０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは２００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、さらに好ましくは２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましい実施形態において、溶離液Ｂは、ｐＨ６．０～１０．０であり、かつ浸透圧が１５０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇである。より好ましい実施形態において、溶離液Ｂは、ｐＨ７．０～９．０であり、かつ浸透圧が２００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。さらに好ましい実施形態において、溶離液Ｂは、ｐＨ７．５～８．５であり、かつ浸透圧が２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
　本発明で使用される溶離液（上述した溶離液Ａ、Ｂ、及びＨｂＡ０分離用溶離液）は、上述した緩衝剤以外に、溶媒、及び、ヘモグロビン変性剤、三価ヘム鉄への結合剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などの添加剤を含有していてもよい。
　好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、ヘモグロビン変性剤を含有する。ヘモグロビン変性剤は、ヘモグロビンのヘム鉄を二価から三価に変化させ、メトヘモグロビンを生成することができる酸化剤であればよい。そのような酸化剤の例としては、亜硝酸塩、フェリシアン化カリウム、メチレンブルー、過酸化水素、アスコルビン酸、硫化水素などが挙げられる。このうち、亜硝酸塩が好ましく、亜硝酸ナトリウム又は亜硝酸カリウムがより好ましい。該溶離液における該ヘモグロビン変性剤の濃度は、好ましくは０．０５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、三価ヘム鉄への結合剤を含有する。該三価ヘム鉄への結合剤は、該ヘモグロビン変性剤により生成されたメトヘモグロビンを安定化させて、その溶出挙動を安定化させる。該三価ヘム鉄への結合剤の例としては、アジ化物、シアン化物等が挙げられる。アジ化物の例としては、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４－ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４－アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。シアン化物の例としては、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。好ましくは、該三価のヘム鉄への結合剤はアジ化物であり、より好ましくはアジ化ナトリウムである。該溶離液における該三価ヘム鉄への結合剤の濃度は、好ましくは０．０５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　該ｐＨ調整剤としては、公知の酸及び塩基が挙げられ、酸の例としては、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられる。
　該溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒が挙げられる。該溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度であることが好ましく、例えば８０％（ｖ／ｖ）以下が好ましく、より好ましい範囲は０．１％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）以下である。
　好ましくは、本発明の方法では、上述した溶離液Ａ、Ｂ、及びＨｂＡ０分離用溶離液を切り替えながら、各種ヘモグロビンを含む画分を溶出させる。好ましくは、本発明の方法では、溶離液Ａ→ＨｂＡ０分離用溶離液の順で溶離液を切り替えることによりグラジエント溶離を行う。より好ましくは、本発明の方法では、溶離液Ａ→ＨｂＡ０分離用溶離液→溶離液Ｂの順で溶離液を切り替えることによりグラジエント溶離を行う。
　好ましくは、本発明の方法におけるグラジエント溶離では、まず、溶離液Ａ（以下、Ａ液、又は単にＡと称する）１００％で通液し、ＨｂＡ１ｃを含む画分を溶出させる。次いで溶離液にグラジエントをかけてＨｂＡ０分離用溶離液（以下、Ｃ液、又は単にＣと称する）の割合を増加させ、Ｃ液の割合を１００％まで上げる。Ｃ液により、ＨｂＡ０を含む画分が溶出される。Ａ液からＣ液へのグラジエントは、Ａ：Ｃ＝１００：０→０：１００となるように行われる。Ａ液からＣ液へのグラジエントは、ステップワイズグラジエントであってもリニアグラジエントであってもよく、また、途中で段階的にステップワイズグラジエントの混合比や、リニアグラジエントの勾配を変化させてもよい。好ましくは、Ａ液からＣ液へのグラジエントは、ステップワイズ式である。
　好ましくは、次いでＣ液と溶離液Ｂ（以下、Ｂ液、又は単にＢと称する）とが切り替えられる。好ましくは、Ｃ液からＢ液へのグラジエントは、Ｃ：Ｂ＝１００：０→０：１００となるように行われる。Ｃ液からＢ液へのグラジエントは、ステップワイズグラジエントであってもリニアグラジエントであってもよく、また、途中で段階的にステップワイズグラジエントの混合比や、リニアグラジエントの勾配を変化させてもよい。Ｂ液により、ＨｂＡ０よりも遅く溶出するＨｂ画分（例えば、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を含む画分）が溶出される。
　必要に応じて、Ｂ液に続いて、再度Ａ液を通液してもよい。Ａ：Ｂ＝１００：０の通液時間を設けてもよい。Ｂ液からＡ液へのグラジエントは、ステップワイズグラジエントであってもリニアグラジエントであってもよいが、好ましくはステップワイズ式である。
　本発明の方法では、溶離液Ａに続いて上述のＨｂＡ０分離用溶離液を通液することにより、ＨｂＡ０画分を高精度に分離することができる。したがって、本発明の方法によれば、分析装置の構造上のバラつきや動作の違いによる影響を受けることなく、クロマトグラフィー分析でＨｂＡ０のピークを明瞭に検出することができ、ひいては、各種ヘモグロビン種の高感度な検出、及びＨｂＡ１ｃ濃度の正確な測定が可能になる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（参考例１：ヘモグロビン分離用カラムの調製）
　非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（日油社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ－２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として２－メタクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸（東亜合成社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子を得た。得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径４ｍｍ、長さ２０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン分離用カチオン交換カラムを調製した。
（参考例２：試料の調製）
　グリコＨｂコントロール（シスメックス社製）を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜溶解希釈して試料を調製した。
（試験１）
　参考例２で調製した試料について、ＨＰＬＣによりヘモグロビン分析を行った。同型のＨＰＬＣ装置を２台用意し（装置Ａ、Ｂ）、それぞれを用いて下記条件で分析を行った。
＜分析条件＞
　ＨＰＬＣ装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
　検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）
　送液ポンプ：ＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）
　脱気ユニット：ＤＧＵ－２０Ａ５Ｒ（島津製作所社製）
　カラムオーブン：ＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
　オートサンプラー：ＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
　カラム：参考例１で作成したヘモグロビン分離用カチオン交換カラム
　流速：２．１ｍＬ／ｍｉｎ
　検出波長：４１５ｎｍ
　試料注入量：５μＬ
　溶離液
　　溶離液Ａ：４０ｍｍｏｌ／Ｌコハク酸ナトリウム、５５ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ５．３、浸透圧２００ｍＯｓｍ／ｋｇ）
　　溶離液Ｂ：４５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、９ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ７．６、浸透圧３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）
　　溶離液Ｃ：表１記載の処方
　　グラジエント：ステップワイズグラジエント（０～２１秒：溶離液Ａ→２１秒を超え３９秒：溶離液Ｃ→３９秒を超え４７秒：溶離液Ｂ→４７秒を超え９０秒：溶離液Ａ）
　溶離液のｐＨ（２５℃）及び浸透圧は、ｐＨメーター：Ｆ－５２（堀場製作所製）、及びオズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）にて測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　試料の分析結果を図１～２に示す。また表２には、各溶離液Ｃを用いた場合における、ＨｂＡ０のピークの溶出時間（トップピーク時間）及び半値全幅を示す。ＴＥＳ濃度が２５ｍＭ未満であり、ｐＨとＴＥＳのｐＫａとの差が０．１以内である溶離液Ｃを用いた場合、いずれの機種でもクロマトグラフィーでＨｂＡ０の明瞭なピークが得られ、さらに機種によるピークの立ち上がり時間やトップピーク時間の差、及びピーク幅の差が小さくなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (14)

  1. 　ヘモグロビン分析方法であって、
    　緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ヘモグロビンＡ０を含む画分を溶出させることを含み、
    　該緩衝剤が、グッド緩衝剤であり、
    　該溶離液のｐＨが、該緩衝剤のｐＫａの±０．１以内である、
    方法。
  2. 　前記グッド緩衝剤がＴＥＳである、請求項１記載の方法。
  3. 　前記溶離液の浸透圧が６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記ヘモグロビンＡ０を含む画分の溶出の前に、溶離液Ａを用いてヘモグロビンＡ１ｃを含む画分を溶出させることをさらに含み、該溶離液Ａが、ｐＨ４．０～６．８の緩衝液である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　前記溶離液Ａと、前記緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液との切り替えがステップワイズグラジエントにより行われる、請求項４記載の方法。
  6. 　前記緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液に続いて、溶離液Ｂを通液することをさらに含み、該溶離液ＢがｐＨ６．０～１０．０の緩衝液である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有する溶離液と、前記溶離液Ｂとの切り替えがステップワイズグラジエントにより行われる、請求項６記載の方法。
  8. 　前記イオン交換クロマトグラフィーがカチオン交換クロマトグラフィーである、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　緩衝剤を２５ｍＭ未満の濃度で含有し、該緩衝剤のｐＫａの±０．１以内であるｐＨを有し、該緩衝剤がグッド緩衝剤である、イオン交換クロマトグラフィーにおけるヘモグロビンＡ０分離用溶離液。
  11. 　前記グッド緩衝剤がＴＥＳである、請求項１０記載の溶離液。
  12. 　浸透圧が６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、請求項１０又は１１記載の溶離液。
  13. 　イオン交換クロマトグラフィーにおいて溶離液Ａの後に使用され、該溶離液Ａが、ｐＨ４．０～６．８の緩衝液である、請求項１０～１２のいずれか１項記載の溶離液。
  14. 　イオン交換クロマトグラフィーにおいて溶離液Ｂの前に使用され、該溶離液ＢがｐＨ６．０～１０．０の緩衝液である、請求項１０～１３のいずれか１項記載の溶離液。 
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