JPH06507978A - 蛍光消光によるグリコヘモグロビンの測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光消光によるグリコヘモグロビンの測定発明の背景 グリコヘモグロビンは種々の糖、最も一般的にはグルコースがヘモグロビン分子 に結合して形成された、一連の微量ヘモグロビン成分を意味する一般名である。

これらの微量ヘモグロビン成分のうち糖尿病に関して最も重要なものはＡｌｃで ある。これはヘモグロビンＡの一方または両方のβ鎮のＮ−末端アミノ酸残基、 バリンにグルコースが結合して形成される（Ｇｏｌｄｔｌｅｉｎ、　Ｄ、Ｅ、ｅ ｌ　ｔｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｔ　３２：８６４−８７０．　１９８６）。

中で、グリコヘモグロビンは（元の、天然型の）ヘモグロビン八から周囲のヘモ グロビン濃度に比例した速度で形成される。

この反応は自発的で、酵素の触媒作用は受けないが、非常にゆっくりと進むため 赤血球の寿命（１２０日）の間にヘモグロビンの一部が修飾されるだけで、また 非可逆的である。その結果、グリコヘモグロビンは過去の血糖値の加重「移動」 平均を提供するが、最近の血糖値がより大きく影響する（ＳｉＢｅ＋、　ｃｌｉ ｆ、、　Ａｎａ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　２６＋２１３−２１９．　 １９１１９）　。

グリコヘモグロビン濃度の上昇は真性糖尿病に伴うことが知られている。グリコ ヘモグロビンは、糖尿病ではない場合も総ヘモグロビンの約５％存在するが、糖 尿病患者ではその２〜４倍となる。グリコヘモグロビン濃度は血糖値の短期（時 間単位）変動の影１は比較的受けず、従って、糖尿病における血糖コントロール の状態を比較的正確に反映し、その結果は過去１〜３力月の時平均血糖濃度の指 標である。グリコヘモグロビンの測定値は糖尿病患者でグルコース不耐性の重症 度を評価するとき及び真性糖尿病の管理に使用する（Ｌｅｓｌｅ＋、　Ａｆｉｅ 、　Ｃｌ１ｎ。

Ｂｏｏｔｈｅｓ　２６２Ｎ−２１９，１９８９，ＫｅＩｌｓｅｄ７．　ｅｌ　ｅ Ｉ　、　Ｂ＋、　Ｍｅｄ。

Ｂａ１１．　４５：１７４−１９０．　１９８９；　ＦｌｗｃｋｉＩｅｒ、ｅｌ 　＊１．、　１．　ＣｈｒｏｍｓｌｏＩｒ。

４２９：２７９−２９２．　１９８８；　Ｇｏｌｄｓｊｅｉｎ、　ｅｌ　＊１． 、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　３２：ＢＮ−７０，１９８６；　Ｍｏｒｊｅｎｔ ｅｆｉ、　０１ｎ、　Ｍｅｄ、　Ｂｅ１１．３２：３０９−３２８．　１９８５ ；Ｇｏｌｄ＋１ｅｉｎ、ｃｌ　１１．、　ＣＲＣＣｏ１１．　Ｒｅｔ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｌｓｂ、Ｓｃｉ、　２１＋１８７−２２８．　１９８４；　Ｐｅ＊ｃｏｃ ｋ、１．　Ｃｌ１ｎ、　Ｐｓｌｈｏｌ、３７：８４１−８５１．　１９１１４； １１ｉｅｄｅ＋＋ｒ、　ｅｌ　＊１．、　Ａｎ＋、　Ｃｌ１１１．　Ｂｉｏｃｂ ｅｔ　２１＋２−１５．　１９８４；１７ｅｒ、ｅＩ　ｔｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　 Ｃｈｅｗ、　Ａｃｌ＊　１２７＋１４７−１８４．　１９８３；ＧＩｂｂＢ、　 Ｍｅｄ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、　６６：１３０９−Ｈｌｓ、１９８ ２）。

ヘモグロビンＡ　またはヘモグロビンＡ１として、または総ｅ グリコヘモグロビンとしてグリコヘモグロビンを測定するには種々の方法がある （イオン交換クロマトグラフィー、チオバルビッール酸法、等電点電気泳動、及 び親和性クロマトグラフィーア・ソセイ）　（Ｃａｆｅ、Ｒ＾、、ｅｌ　ｒｌ、 、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　２７：２８９−３０１゜１９７８；　Ｎｅ１ｈ＊ｎ、 　Ｄ、Ｍ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｔ　２７：１２６１−１２６３．　１９８１ ；Ｍｏ＋＋＋ｅ、Ｉ、Ｃ，ｅｌ　＊ｌ、、　Ａｎｎ、Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｅｈｅ ｔ　２３：８５−９１゜１９８６　）。イオン交換クロマトグラフィーでは、ヘ モグロビンＡｌｃを含むグリコヘモグロビンの多くはヘモグロビンＡＯに比べて 中性ｐＨで正の荷電が弱く、負に荷電した樹脂への結合が弱い（Ｒｏｓｅｎｌｈ ＊１．　Ｐ、に、ｅｌ　＊１．、＾ｓ、１．Ｃ１ｉ口、Ｐｓｌｈｏｌ、７５：４ ５−４９．１９！ＩＩ米国特許第４．４０７．９６１号、米国特許第４．６４９ ．１２２号）。ヘモグロビンＡ　画分からヘモグロビンｌｃを分離する１畠＋ｂ 二三の方法が報告されている（Ｇｏｌｄｓｌｅｉｎ、　Ｄ、Ｅ、ｅｌ　＊ｌ、。

Ｄｉ暑ｂｅｔｅ＋　３１＋７０−７８．　１９ｇ２：　Ｍ暑ｑｗｔｒ１．　Ｆ、 Ｘ、　ｅｌ　ｚｌ、、Ｃｌ１ｏ。

Ｃｈｉｎ、Ａｃｌ＊　１０８：３２９−３３２．　１９８０；　ＩｏＩｌｅＩＩ 　Ｍ、Ｄ、ｅｌ　ｔｌ、。

Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　２＋５３−５８．　１９７８；　Ｃ１ｔｒｋｅ、　Ｉ、 Ｔ、　ｅｌ　＊１．、Ｄｉ８ｂｅｊｅＭ＠ｔｓｂａ１．　５：２９３−２９６． 　１９７９；　Ｄ＊ｖｉ３　１．Ｅ、ｅｌ　畠１．．　Ｄｉａｂｅｔｅｓ２７： Ｉ［１２−１０７，＋９７８；　Ｃｏ１５．　Ｒ，Ａ、ｅｌ　＊Ｉ、、　１ｌｌ ｅｌ＊ｂ＋１ｉｔｓ　２７＋　２８９−３０１、１９７８；米国特許第４．３８ ９．４９１号；　Ｂｉｏ−Ｒｅｄ　Ｌｓｂｏｒ［ｏｒｉｅ＋。

Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ＾Ｉｔ　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏｌ＋＊ｎ　Ｔｅｚｊ　Ｉｎ＋ｊ ｒｓｅｌｉｏ＋＋　Ｍ■ｓ＊Ｉ、１９９０年３月）。しかし、これらの方法には いくつかの欠点がある。これらの方法の多くでは２つのバッファを使用する。

１つのバッファは特異的に結合している物質は放出させないように、イオン交換 樹脂から未結合物質を溶出するためのものである。第二のバッファは異なるｐＨ １イオン強度で使用するか、または競合阻害剤を含むことを要し、特異的に結合 していた物質を溶出する。温度、ｐＨ１イオン強度及びカラムサイズは試験結果 に影響を与える（Ｓｉｍｏａ、　Ｍ、　ｔｌ　＊１．、　Ｄｉｓｂｅｌｅｔ　２ ９：４６７−４７４、１９８０；　５ｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ、　＾、Ｐ、Ｍ、　 ｅＩ　ｓｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｂｓｓ、　２７：９４−９９．　１９８１；　 ＣｏｓｌＢｍｏｌｉ、Ｍ、ｅＩ　轟１．．　Ｉ、Ｃｂｒｏａｓｌｏｌｒ、２７２ ：５１６５、　１９８３）。さらに、これらの方法は複数の異なるステップ、複 数の容器を必要とし、それらのほとんどが自動化されていないかまたは半自動に 過ぎない。

これらの従来法の他の限定要因としては、使用する方法によって、可逆的な中間 体糖化型の「プレーヘモグロビン−ＡｌｃＪが含まれ、それをアッセイ前に除去 しなければならないことがある（Ｇｏｌｄｕｅｉａ、　Ｄ、Ｅ、ｅｌ　＊１．、 　Ｄｉｓｂｅｌｅｔ　３１＋７０−７８．　１９８２　；Ｂ■ｎ、　Ｈ，Ｆ、、 　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３Ｇ＋　６Ｎ−６１７，１９８１；　Ｎ＊ｌｈｓ＋＋、　 Ｄ、Ｍ、。

Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｗ、２７：１２６１−１２６３．　１９８１；　Ｍｓｙｅｒ、 Ｔ、に、ｅｌ　＠１．＋　Ｃｌ１ｍ。

Ｃｈｉｓ、　＾ｃｊｉ　１２７＋１４７−１８４．　１９１１３；　Ｈｅａｌｔ ｈ　＆ｆｉｄ　？ｂｌｉｃ　Ｐｏ１ｉｅ７Ｃ＠ｓｔ口ｌｅｅ、Ａｗｅτｔｃｓａ 　Ｃｏ１１Ｂｃ　ｏｌ　Ｐｋマ電１ｃｉｓａｔ　ｋａａ、１ａｔｅτａＭｔｄ、 　１Ｇ＋＋７１０−７Ｎ、　１９８４）　（Ｎｓｌｂｉｆｉ、　Ｄ、Ｍ、、　Ｃ ｌ１ｎ、　Ｃｈｅｔ　２７：１２６１−１２６３．　１９８１　’）。高濃度の 胎児ヘモグロビン、鎌型ヘモグロビン及び他の肴な条件がアッセイを妨害する可 能性もある（Ｎｉｅｉｔｄｌｉｋ、Ｄ、Ｃ，、ｅｌ　＊１．、ＩＡＭＡ　２２４ ：１７３４−１７３６．　１９７３　）。

グリコヘモグロビンを測定する他の方法では、グリコヘモグロビンと特異的に結 合する、親和性試薬または結合剤を使用する。以下の特許明細書：米国特許第４ ．２００．４３５　、４．２６０．５１６　。

４、２７４．９７１１　；　４．２５５．３８５及び４．４３８．２０４号では 、親和性法またはヘモグロビンのアロステリック特性を使用して測定する。独国 特許第１５９５６９号では、親和性試薬として糖結合蛋白質を記載している。

他の親和性結合法はグリコヘモグロビンとホウ酸誘導体の間の特異的な複合体形 成に基づいている（Ｍｉｄｄｌｅ　ｅｌ　＊ｌ、。

Ｂｉｏｃｈｚｍ、１．　２Ｇ９ニア７＋−７７９，１９８３；　Ｋｌｅｎｋ　ｃ ｌ　畠１．．　Ｃｌ１Ｉ１．　Ｃｈｅ＋＋。

２Ｌ２［１８８−２０９４，１９Ｂ２；　Ｌｉｉｆｅ　ｅｌ　ｓｌ、、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｃｔｅｓ、　３２：３５ｇ−３６０、１９８６、米国特許第４．２６９． ６０５号；米国特許第４．８６１．７２８号；英国特許出願ＧＢ　２２０６４１ １＾；　１ｚｏｌ＊Ｊ　ｌｅｅ、、τｓｃｋ＋＋ｉｃ畠ＩＰｗｂｌｉｃｓｊｉｏ ｎ：　Ｇ１７ｃｍＡ＋ｌｉｎ”　Ｇ■ｂ、１９１１６；　Ｆｏ＋ｒｅｓｌ、Ｒ， Ｄ、ｔｌＩｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｂｃ園、　３４：１４Ｓ−１４８，１９８８ ）　、親和性結合法はＨｂ　Ａ　Ｉｃの他にグリコヘモグロビン種も検出するが 、この方法はＨｂ　Ａ　ｌｃにより特異的な方法例えばイオン交換クロマトグラ フィーと直線的に相関する（Ｌｉｉｆｅ　ｅｌ　ｉｆ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｂｓ ｓ、　３！　：３５［１−Ｈｅ、１９８６　）。グリコヘモグロビンのイオン交 換及び比色アッセイと同様に、親和性法にも制約がある。その制約の１つは２つ の異なるバッファが必要なことである。最初のバッファはシス−ディオール基を 持たない非糖化画分を溶出する。グリコヘモグロビンを多く含む結合画分は、カ ラムからグリコヘモグロビンを置換する置換剤例えば糖アルコールを含む第二バ ッファで溶出する。また、流速及びカラムサイズも親和性試薬に結合するヘモグ ロビン量を限定する。

容易に実施でき、干渉がなく、実験による変動例えばｐＨ及び温度に対して比較 的感受性がないグリコへモグロビンアッセイが必要とされている。本発明の目的 はグリコヘモグロビンを正確に、精密に測定する方法及び試薬を開発することで ある。

発明の概要 本発明は蛍光消光によるグリコヘモグロビンの測定に関する。

グリコヘモグロビン及び通常のヘモグロビンは両方とも同程度に蛍光を消光する が、本発明者らは蛍光消光を使用して血液試料中のグリコヘモグロビン濃度を評 価できるという意外な事実を発見した。本発明は、２回連続して蛍光消光を測定 すること、すなわち、試料中の総ヘモグロビンによる蛍光消光を測定し、２番目 に試料中に存在するグリコヘモグロビンまたは非糖化ヘモグロビンの蛍光消光を 測定するという独自の手法を含んでいる。グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロ ビンの分離は、イオン捕獲及び固相分離を含む本明細書に記載の種々の方法で可 能である。

図面の説明 第１図：本発明の実施例６のアッセイ手順に基づき、第１表に挙げた較正溶液に よる総ヘモグロビン及びグリコヘモグロビンについての典型的な較正曲線（較正 溶液Ａに対する蛍光（％）対ヘモグロビン（ｍＭ））の典型的な較正曲線。

第２図一本発明（実施例６）及びｌ５ｏｌ＊ｂのＧ１７ｃｍＡｌ＋１１アツセイ を使用してグリコヘモグロビン百分率（％）についてテストした２０１個の患者 試料の相関曲線。

第３図一本発明の実施例８のアッセイ手順に基づき実施例４の較正溶液を使用し た、グリコヘモグロビンについての典型的な較正曲線（蛍光の逆数（カウント７ 秒）対ヘモグロビン濃度（ｍＭ））。

第４図：本発明の実施例８のアッセイ手順に基づき実施例４の較正溶液を使用し た、総ヘモグロビンについての典型的な較正曲線（蛍光の逆数（カウント７秒） 対ヘモグロビン濃度（ｍＭ））。

第５図工本発明（実施例８）及び１ｚｏｌ＊ｂのＧＩ７ｃｍ＾１１ｎアッセイを 使用してグリコヘモグロビン百分率（％）についてテストした２０人の患者試料 の相関曲線。

発明の詳細な説明 本発明は蛍光消光によるグリコヘモグロビンの測定に関する。

グリコヘモグロビン及び通常のヘモグロビンは両方とも同程度に蛍光を消光する が、本発明者らは蛍光消光を使用して血液試料中のグリコヘモグロビン濃度を評 価できるという意外な事実を発見した。本発明は、２回連続して蛍光消光を測定 すること、すなわち、試料中の総ヘモグロビンによる蛍光消光を測定し、２番目 に非糖化ヘモグロビンを除去した後に試料中に存在するグリコヘモグロビンによ る蛍光消光を測定するという独自の手法を含んでいる。グリコヘモグロビンと非 糖化ヘモグロビンの分離は、イオン捕獲及び固相分離を含む本明細書に記載の種 々の方法で可能である。

蛍光消光は、ある種の分子例えばヘモグロビンのヘム部分が、入射励起放射に曝 された隣接する蛍光化合物の励起エネルギーを吸収する能力に関する。通常、適 切な波長の入射励起放射に曝された蛍光化合物はエネルギーを吸収（励起）し、 次に蛍光放射の形でそのエネルギーを放出する。励起状態にあるときには、蛍光 化合物は別の物質、例えばヘモグロビンのヘムのような消光性化合物にそのエネ ルギーを移行させることにより、吸収したエネルギーを放出することもできる。

このエネルギー移行が通常生じるべき蛍光の量を減少させ、消光と呼ばれる。

血液試料中のグリコヘモグロビンの測定の第一段階として、赤血球を溶解する必 要がある。赤血球が溶解すると、その細胞からグリコヘモグロビンと非糖化ヘモ グロビンの両方が放出される。一般的な陽イオン（例えば臭化セチルトリメチル アンモキシコール酸ナトリウム）、及び非イオン（例えば、サポニン及びポリオ キシエチレン）の活性剤が赤血球の溶解に有用である。約０．１〜５％（Ｖ／Ｖ ）の濃度の非イオン活性剤、例えばサポニンが好ましく、より好ましい濃度範囲 は約０．５〜約２％（Ｖ／Ｖ）である。機械的な破壊、例えば超音波及び低張溶 解も赤血球からヘモグロビンを放出させる有効な方法である。

好ましくは、活性剤例えば約０．５％のＴ＋１ｌｏｎ　！−１００を加え、ピペ ットで混合物を急速に吸い上げ、吹き出すことを２回繰り返して、赤血球を溶解 させる。この方法では新鮮な全血をほぼ一瞬で溶血させる。

好ましい方法では、赤血球を溶解した後、試料を検出可能な蛍光信号を持つ指示 薬と接触させる。グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの混合物（総ヘモグ ロビン）で生じる蛍光消光により第一の測定値が得られる。グリコヘモグロビン と非糖化ヘモグロビンを分離し、グリコヘモグロビンまたは非糖化ヘモグロビン で生じる蛍光消光により第二の測定値を得る。次に、これらの２つの測定値から グリコヘモグロビンの百分率を計算できる。

別の好ましい方法では、赤血球を溶解した後、試料を検出可能な蛍光信号を有す る指示薬と接触させ、グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンを分離する。グ リコヘモグロビンまたは非糖化ヘモグロビンで生じた蛍光消光により第一の測定 値を得る。次に、グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの両方で生じた蛍光 消光により第二の測定値を得る。この二番目の測定は、総ヘモグロビンによる蛍 光消光を測定するか、非糖化ヘモグロビンによる蛍光消光を測定し、この値を第 一の測定値に加えることにより実施できる。次に、グリコヘモグロビンの百分率 を第−測定値及び第二測定値から計算できる。

もう１つ別の好ましい方法では、グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの分 離に使用する固相またはマトリックスに指示薬を直接または間接的に取り込ませ る。

指示薬はその蛍光がヘモグロビンにより測定可能な程度に消光される蛍光化合物 からなる。本発明に使用できる蛍光化合物には、メチルウンベリフェロン及び他 のクマリン類、フルオレセン、ローダミン等を含んでいる。

グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンは種々の方法で分離できる。好ましい 実施態様では、分離過程に、グリコヘモグロビンに特異的な特異結合物質を使用 する。本明細書で使用する特異結合物質とは、特異結合対の一員、すなわち、分 子の１つが化学的または物理的手段を介して第二の分子と特異的に結合するよう な２つの異なる分子の一方を意味する。特異結合物質には、ジヒドロキシボリル 部分、レクチン、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、例えば抗Ｈｂ 　Ａ　Ｉｃ抗体、及び組換え蛋白質を含む他の結合蛋白質を含んでいる。モノク ローナル抗Ｈｂ　Ａ　Ｉｃ抗体の例はに＊ｏｖｌｅｓ、　ｅｌ畠１．の米国特許 第４、７２７．０３６号明細書に記載されている。

グリコヘモグロビンに特異的な好ましい特異結合物質は、本明細書に参考として 含む米国特許第４．２６９．６０５号明細書に記載のようにジヒドロキシボリル 部分である。この部分は好ましくはフェニルまたは置換フェニルホウ素酸、ホウ 酸または他のホウ素酸例えばエタンホウ素酸及び１−プロパンホウ素酸等である 。反応が実質的に始まる前に、ホウ素酸塩は先ず正四面体隨イオン型となってい なければならない（すなわち、溶液のｐＨはホウ素酸塩のｐＫより高くなければ ならない）。反応機構は解明されていないが、正四面体ホウ素酸塩はヒドロキシ ルを１．２−シス−ジオールと交換し、水２分子を放出し、五員環共有複合体を 形成する。

好ましくは、ホウ素酸塩／ジオール複合体はこれを強化する作用を持つバッファ の存在下で形成する。このテスト系に適合するバッファはｐＫａが約７．５〜１ １．０の範囲のノ（ツファである。この域のバッファは当業界で公知である。ア ッセイ中、３７℃で、ｐＨを約７．８〜９．６、より好ましくは約８．５〜９． ２、最も好ましくは９〜９．２の範囲に維持するためには、バッファのｐＫａが 約８．５〜９．２であるのが好ましい。アミン類は複合体を強化でき、グリシン 、モルホリン、ＨＥＰＥＳまたは付加物例えばアンモニウム塩またはピペラジン のようなバッファがホウ素酸塩／ジオール複合体形成を促進するのに有利であり うる。陽子化されていないアミン類は電子供与体として作用してホウ素酸塩と中 性複合体を形成することができ、この複合体中ではホウ素酸塩には負の電荷密度 、アミンには正の電荷密度がかかる。この状態では、２つのホウ素ヒドロキシル がまだ１．２−シス−ジオール、例えばグリコヘモグロビンとの結合に使用でき る状態にある。好ましくは、アミノバッファ例えばＨＥＰＥＳバッファをホウ素 ／ジオール反応、好ましくは赤血球溶解反応に加える。アミン類は、おそらくホ ウ素酸塩の見かけ上のｐＫａを低下させて、形成されたホウ素酸塩／ジオール複 合体を強化するのであろう。しかし、ヒドロキシル−アミノバッファ例えばトリ スバッファはホウ素と複合体を形成することによりホウ素酸塩／ジオール複合体 の形成を妨害することがある。

好ましくはＭｇ２＋の存在下でホウ素酸塩／ジオール複合体を形成する。本出願 人による、本明細書に参考として含む米国特許出願第７１７．５５８号「グリコ ヘモグロビンの迅速な側窓Ｊ　、Ｍｉｄｄｌｅ、ｅｌ　Ｍｌ、、　Ｂｉｏｃｂｓ ｔ　１．２０９＋７７１−７７９　（１９８３）及び１１ｏｒｏｎ畠１ｅ　Ｌｉ Ｈｓｎｄ＋　ｉｎ　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃｓｌ　Ｓ＠ｐ＊ｒ＊１ｉｏｎｔ、　Ｐｓ ｂｌｉｅｓｊｉｏｍ５Ｇ！、＾ｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒｓｌｉｏｎ　（＋９１ １１）に、二価陽イオン主として２＋ Ｍ　ｇ　Ｃ１２またはＭｇＳＯ４由来のＭｇ　を使用して、負に荷電されたホウ 素酸塩と負に荷電されたリガンドとの間の反発作用を克服することが述べられて いる。

好ましくは、分離過程はグリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンを含有する溶 解した赤血球の試料を、グリコヘモグロビンに特異的な特異結合物質を結合させ た固相と接触させ、固相と試料の残部を分離して実施する。特異結合物質は物理 的または化学的手段、好ましくは直接共有結合によって固相に結合させることが できる。特異結合物質は、後続反応中に特異結合物質の実質的に全部がはずれる ことのな％ｓような方法で固相（こ結合させるとよい。選択した特異結合物質及 び結合方法の如何署こ関わらず、その特異結合物質はグリコヘモグロビンｌこ結 合できなければならない。例えば、選択したジヒドロキシボ１ノル部分及び結合 方法に関係なく、ジヒドロキシボリル部分（よグリコヘモグロビンの糖部分に結 合できなければならな（１゜本発明の固相はグリコヘモグロビンに特異的な特異 結合物質が化学的または物理的に結合したポリマー微小粒子の混合物でありうる 。使用できる微小粒子には、直径約０．１μｍ〜約０．２５インチのポリスチレ ン、カルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレートまたは同様の粒子が 含まれる。これらの粒子の好ましい分離法は、多孔質マトリックス例え（ｆガラ ス繊維上への微小粒子捕獲である。

使用できる他の固相には、グリコヘモグロビンに特異的な特異結合物質が化学的 または物理的に結合した磁化できるポリマー微小粒子を含んでいる。使用できる 磁化可能な微小粒子（よ好ましくは酸化鉄または酸化クロムの核とポリスチレン 、カルボキシル化ポリスチレンまたはポリメチルアクリレートの被覆を有してい る。その他の固体支持体も当業界で公知であり、反応トレーのウェルの壁、試験 管、ポリスチレンビーズ、ニトロセルロース・ストリップ、膜等を含んでいる。

天然、合成または合成的に修飾した天然物質を固相材料として使用でき、これに は多糖、紙及びセルロース誘導体、例えば酢酸セルロース及びニトロセルロース のようなセルロース材料；シリカ；ポリマー例えば塩化ビニル、塩化ビニル−プ ロピレンコポリマー、及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーを含む多孔性ポリ マーマトリックスに均一に分散した無機物質、例えば不活性化アルミナ、珪藻土 、ＭｇＳＯ４、または他の無機の微細に分割した物質；天然布（例えば、綿）及 び合成布（例えばナイロン）；多孔質ゲル例えばシリカゲル、アガロース、デキ ストラン及びゼラチン；ポリマーフィルム例えばポリアクリルアミド等を含んで 〜亀る。固相材料は適当な強度を持つとよくまたは支持体により強度を提供する こともでき、検出すべき信号の発生を妨害してはならない。

別の好ましい分離法は、同時係属中の米国特許出願第１５０、２７８号及び米国 特許出願第３７５．０２９号に記載の方法である。

これらの特許出願は両方とも本出願人によるもので、両方とも参考として本明細 書に含むものとする。これらの出願でＩ！イオン捕獲分離の使用を記載しており 、ここで、当該アッセイに使用する特異結合物質は最初のポリイオン化合物及び その第一のポリイオン化合物に結合した第二のポリイオン化合物が結合されてい る多孔質マトリックスに結合している。特異結合対が形成され、第一のポリイオ ン化合物と第二のポリイオン化合物の間の静電的相互作用により反応混合物から 分離される。特異結合物質は好ましくは第一のポリイオン化合物と共有的に結合 している。

好ましくは、第一のポリイオン化合物はポリ陰イオン酸、例えばポリアスパラギ ン酸、ヘパリン、カルボキシメチルアミロース、ポリグルタミン酸またはポリア クリル酸であり、第二のポリイオン化合物は陽イオンポリマー、例えば、高分子 第四アンモニウム化合物であるＧ＊ｌＱｗ［ｌｓ　（ＧＡＦ　Ｃｏｒｐｏｔ＊１ ｉｏｎ。

Ｗｓｙｎｅ、　ＮＪ、　０７４７０　）　、ジエチルアミノエチル−デキストラ ン（Ｓｉｇｓ＊　Ｃｂｅｍｉｃｓｌ　Ｃｏ５ｐｓＢ、　３１．　Ｌｏｕ口９ＭＯ ）　、水溶性セルロース誘導体、例えば、いずれも高分子第四化合物であるＣｅ １ｑｉ＊ｌ”　Ｌ−２００及び　Ｃｅ１ｑ■ｊ”　Ｈ−１００（Ｎｉｔｉｏｎｓ ｌ　Ｓｌｓ＋ｃｈ　＆Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｔ＊ｊｉｏａ、　Ｂ＋ｉｄ ｇｅｖ麿１ｅｒ、　Ｎ１．　０８８０７）　、またはＭｅ＋ｑａ＊１Ｒ１００（ Ｃ＊１１ｏｎ　Ｃ＋ｒｐｏｒ＊ｊｉｏｎから市販されている）である。多孔質マ トリックスを陽イオンポリマーで処理してマトリックスを正に荷電する。陽イオ ンポリマーは吸収、吸着または共有もしくはイオン結合によってマトリックスに 結合する。

反応生成物は、正に荷電したパッドと負に荷電したポリ陰イオン複合体の間の静 電性相互作用を利用して分離する。

多孔質マトリックスは、好適な多孔性物質を含むことができる。「多孔性」とは 、流体が流れ、容易に通過できる物質を意味する。本発明では、マトリックスは ポリプロピレン、ポリエチレン、丁ｅ＋Ｉｏｎ、ガラス繊維、セルロースまたは ナイロンパッド、または１つ以上のアッセイ試薬を含む１つ以上の層を持つ注入 ・フロースルー・アッセイ・デバイスに使用するために当業者によく知られてい る他の多孔性物質を含むことができる。

好ましい固相材料には、多孔質ガラス繊維材料、例えば見かけ上の厚さ０．３３ ｍｍのｒ　Ｗｈｓｊｍｓ＋　９３４−＾■」濾紙、本出願人の使い捨てＩ　Ｍ　 ｘ　カートリッジ及びＴｅｓ山ｅｋ”　（繊維マトリックス）装置が含まれる。

このような物質の厚さは臨界的ではなく、アッセイすべき試料または分析物の特 性、例えば被験試料の流動性に大きく基づいて選択する。

ヘモグロビンによる実際の蛍光消光は、当業界で公知の任意の方法で測定できる 。例えば、蛍光スペクトルは可視スペクトロメータで観察するか、または高い集 光力のスペクトログラフで撮影することができるが、蛍光スペクトロメータが好 ましい。

好ましい実施態様では、水銀アークランプを光源として使用するフルオロメータ である光学アセンブリーを持つＩ　Ｍ　ｘ　”（本出願人）自動卓上分析器を使 用して蛍光を検出する。この機器はＦ：ａｒｔ、　Ｍ、ｅＩｔｌ、１９８８　、 　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　３４／９＋１７２６−１７３２に記載しており、こ の内容は参考として本明細書に含む。観察された蛍光消光は、測定された試料中 のヘモグロビン量に比例する。

最も好ましい方法では、同じ繊維マトリックス、例えばＩ　Ｍ　ｘ　Ｒ使い捨て カートリッジ（本出願人から市販）を使用して、２回の蛍光測定を行なう。試料 中の赤血球は溶解させる。

溶血物は、第一の容器またはウェル中で、溶血物のアリコートを水性バッファ例 えばＨＥＰＥＳバッファと混合して希釈し、第二の容器またはウェルで、溶血物 のアリコートに、微小粒子またはポリイオン化合物に結合したグリコヘモグロビ ンに特異的な特異結合物質、例えばラテックス微小粒子またはポリアクリル酸に 共有結合したメタ−アミノベンゼンホウ素酸を含有する水性バッファ、例えばＨ ＥＰＥＳバッファと混合して希釈する（または、ホウ酸塩またはポリマーを溶解 溶液に加えることもできる）。ホウ素酸塩・グリコヘモグロビン複合体は、第二 容器中の混合物中で形成され、第一容器中では形成されない。第二容器中の混合 物のアリコートを繊維マトリックス、例えばガラス繊維または第一のポリイオン 化合物に結合するポリイオン化合物例えばＭｅｒｑｗｓｌで被覆したガラス繊維 に移す。ホウ素酸塩・グリコヘモグロビン複合体はこのマトリックスに捕獲され 、マトリックスは蛍光化合物例えば４−メチルウンベリフェロンを含む洗浄バッ ファで洗う（また、好ましくは、蛍光化合物はアッセイに使用する全ての溶液中 に存在してよい）。洗浄により非糖化ヘモグロビンは除去され、マトリックスの 蛍光を測定する。測定した蛍光消光はマトリックスに存在するグリコヘモグロビ ンによるものである。次に、マトリックスをシス−１，２−ジオール化合物例え ばソルビトールのような糖を含有する溶液で洗う。好ましくは、シス−１，２− ジオール化合物も第一容器の混合物に加える。ソルビトールはグリコヘモグロビ ンと結合親和性試薬について競合し、グリコヘモグロビンが除去される。洗浄溶 液は、好ましくは約１〜３０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約５〜約３０％、最 も好ましくは１０％の濃度のソルビトールを含む。ホウ素酸塩・グリコヘモグロ ビン複合体を壊す他の化合物、例えば１．２−アミノ−ヒドロキシ化合物例えば トリス・バッファも使用できる。第一容器の混合物のアリコートを洗浄したマト リックスに移し、マトリックスの蛍光を測定する。測定した蛍光消光はグリコヘ モグロビンと非糖化ヘモグロビンの両方によるものである。これにより、総ヘモ グロビン濃度及びグリコヘモグロビン濃度が各較正曲線から決定でき、総ヘモグ ロビン中のグリコヘモグロビンの百分率を計算する。

較正曲線は一般に既知の濃度のグリコヘモグロビンまたはヘモグロビンを含む較 正溶液から作成する。「グリコヘモグロビンの迅速な測定」という表題の米国特 許出願第７１７．５５８号は本出願人によるもので、本明細書に参考として含む が、グリコヘモグロビンのアッセイに有用な安定なグリコヘモグロビン較正溶液 及び対照を開示している。好ましくは６種の濃度の較正溶液を使用して較正曲線 を得るが、所望の正確さや精密さに応じてそれより多くまたは少なくすることが できる。ヘモグロビンは順次多くするが、総ヘモグロビンに対するグリコヘモグ ロビンの割合（％Ｇｌｙ　Ｈｂ）は一定に維持するとよい。例えば、第１表は１ 組の較正溶液の組成を示している（実施例４参照）。

当業者は他の較正溶液や対照処方に変えることもできよう。対照は一般に較正曲 線またはアッセイ試薬の信頼性を確認するために、アッセイの際に使用する。好 ましくは、対照の処方は較正溶液の処方と同じであるが、グリコヘモグロビンの 百分率、ヘモグロビン濃度及びグリコヘモグロビン濃度は、いずれの較正溶液の それとも一致しなくてよい。

第１表 較正溶液　［総Ｈｂｌ　ｃＧ＋ｙ　ＨｂＦ　％ｃｙ＋ｙ　ＨｂＦ　１２　２．４ 　２０ Ｅ　９　１．８　２０ Ｄ　６　１．２　２０ Ｃ３０，６２０ ８１０，２２０ Ａ　Ｏ０，００ 操作の間、無菌状態を維持するために、溶媒、抗生物質及び毒を含む抗微生物剤 を系に少量加えるのが望ましいことがある。

グリコヘモグロビンの測定に使用する他の生化学物質例えばＫＣＮを溶血試料に 入れることができる。

以下の実施例は本発明を説明するものであって、請求の範囲に記載の本発明の範 囲を限定するものではない。当業者は本発明の概念を応用できる多くの他のデバ イスや方法を考えられることが理解されよう。

実施例１ ヘモグロビン試料（第２表参照）５０μｌを、５０ｍＭＭｇＣ１２及び５０％（ ｖ／ｖ）ジヒドロボリル樹脂（Ｇ１７ｃｏ−ｇｅｌ　５Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐｓｎ７．　ＩＬから市販されている）を含むｐＨ８，０の５ ０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファ中０．２５ｍＭのメチルウンベリフェロン２０ ０μＩと混合した。

混合物を吸着パッドと液体でつながっているガラス繊維マトリックス（例えば、 本出願人から市販の使い捨てＩ　Ｍ　ｘ　Ｒカートリッジ）に移し、（Ｆｉ＋＋ ｒｅ、Ｍ、ｃｌ　ｓｌ、、１９１１ｇ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｂｅｓ。

３４／９：１７２６−１７３２、この内容は参考として本明細書に含むものとす る、に記載のように）光源として水銀アークランプを使用するフルオロメータで 蛍光を測定した。蛍光消光の大きさは総ヘモグロビンによるものである。マトリ ックスを０．２０ｍＭメチル−ウンベリフェロンを含む酢酸アンモニウムバッフ ァ２００μｌで３回洗った。蛍光を再度測定した。蛍光消光の大きさはグリコヘ モグロビンによるものである。総ヘモグロビン濃度（［総Ｈｂｌ　）及びグリコ ヘモグロビン濃度（［ＧｌｙＨｂ］）はＯ，０，１，０，６，２，９ｍＭのヘモ グロビン較正溶液から作成した標準曲線から得られる（第２表参照）。総ヘモグ ロビンに対するグリコヘモグロビンの割合であるグリコヘモグロビン百分率（％ Ｇｔｙ　Ｈｂ）も測定できる（第２表（Ｇ１７秒）　（鳳Ｍ）　（ｔＭ） 総Ｈｂ／ｃ＋ｙ　Ｆｉｂ 正零コントロール　３４３７／８３０５　１．５ｇ　０．１１　７．０中伺コン ト０−ル　３５９Ｇ／７６５１ｉ　１．４８　０．１８　１２．２高いコントロ ーｂ　３０４９／６４９２　１．８２　０．３８　２０．９”　Ｐｉｅｒｃｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ−ｐｔｍ７．　ＩＬ　からのヘモグロビン較正１１実施 例２ 第３表に示す既知ヘモグロビン濃度の各試料５０μ！を、５０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ 　Ｃｌ　２を含むｐＨ８，０の５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファ中の０．２５ ｍＭメチルウンベリフェロン２００μ！と混合し、混合物を吸着パッド（例えば 、本出願人から市販されている使い捨てＩ　Ｍ　ｘ　Ｒカートリッジ）と液体で つながっている繊維マトリックスに移した。直ちに、（Ｆｉｏｒｅ。

Ｍ、　ｅｌ　ｔｌ、！９８ｇ、ｃｌｉＩ１．　Ｃｈｅｗ、　３４／９＋１７２６ −１７３２、この内容は参考として本明細書に含む、に記載のような）光源とし て水銀アークランプを使用するフルオロメータで蛍光を測定した。第３表に示す 結果は、ヘモグロビン濃度が上昇するにつれて蛍光強度（ミリボルト）が低下す ることを示している。

第３表 ［Ｈｂｌ　（ｍＭ）　蛍光（ｍ　Ｖ） ０、０００　４．９５ ０、００５　４．５０ ０、０１０　４．２８ ０、０１５　３．９７ ０、０３０　３．３０ ０、０７０　２．６５ ０、１４０　１．７２ ０、３５０　０．７０ ０、８００　０．４０ 実施例３ 第４表に示す試料の総ヘモグロビンによる蛍光消光は、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ、、 を含むｐＨ８，０の５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファ中０．２５ｍＭのメチル ウンベリフェロン２００μｌと各試料５０μ！を混合し、混合物を吸着パッド（ 例えば、本出願人から市販されている使い捨てＩ　Ｍ　ｘ　Ｒカートリッジ）と 液体でつながっている繊維マトリックスに移し、（Ｆｉｏｒｅ、　Ｍ、　ｅｌ　 ＊１．　１９８ｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　３４／９＋　１７２６−１７３ ２、　この内容は参考として本明細書に含む、に記載のような）光源として水銀 アークランプを使用するフルオロメータで蛍光を１１１１−）で測定した。

第４表に示す試料のグリコヘモグロビンによる蛍光消光は、５０　ｍ　Ｍ　Ｍ　 ｇ　Ｃ１２及び５０％（ｖ　／　ｖ　）ジヒドロボリル樹脂（Ｇｌｙｃｏｌｅｌ 　）を含むｐＨ８，０の５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファ中０．２５ｍＭのメ チルウンベリフェロン２００μｌと各試料５０μ！を混合し、混合物をにＭｘ　 使い捨てカートリッジの繊維マトリックスに移し、マトリックスを０．２０ｍＭ メチルウンベリフェロンを含有する酢酸アンモニウムバッファ３００μ！で洗い 、Ｉ　Ｍ　ｘ　機器を使用して繊維マトリックス上の蛍光を測って、測定した。

次に、０．２０ｍＭメチルベリフエロン及び２００ｍＭソルビトールを含有する 酢酸アンモニウムバッファでマトリックスを洗った後、再度、蛍光消光を測定し た。蛍光は全てミリボルト単位で読み取る。

第４表 試　料　蛍光　（−Ｖ） 総）１ｂ　ＧＩＦ　Ｈｂｌ　ＧＩＦ　Ｈｂ２’５％　Ｇｌ、Ｆｌｂ　Ｏ，９４２ ，４７３，９７１７％　Ｇｌ、Ｗｂ　Ｏ，９２＋、７９　３．９５１　最初のグ リコヘモグロビン測定値 ２　ソルビトールで洗浄した後のグリコヘモグロビン測定値１　ヘモグロビンの 不在下の蛍光は４．０６ｍＶ明らかに、ソルビトールがマトリックス上にあるグ リコヘモグロビンを実質的に全て置換した。

実施例４ ヘモグロビン及びグリコヘモグロビン較正溶液は、（本出願人による、参考のた めに本明細書に含む［グリコヘモグロビンの迅速な測定」という表題の米国特許 出願第７１７．５５８号に記載のように）２５０ｍＭグルコースを３７℃で９６ 時間混合して約４０％糖化となるまで人工的にヘモグロビンに糖付加した赤血球 溶解ヒト血液試料（Ｇ１７ｅ−Ａ目ｎ、ｌ５ｏｌｒｂ　）を順次希釈して調製し た。Ｇ１７ｃｍ＾ｆｉｎ＾５ｚｉ７　（ｌ５ｏｌｉｂ、Ｉｎｃ、　、　ＯＨ）を 使用して試料中のヘモグロビン及びグリコヘモグロビン濃度を測定した。グリコ ヘモグロビンを最も高い濃度で含む較正溶液−一（Ｆ　ｃＩｌ　）は、２０％の グリコヘモグロビン濃度が得られように（本出願人による、参考のために本明細 書に含む「グリコヘモグロビンの迅速な測定」という表題の米国特許出願第７１ ７、５５８号に開示した方法で調製した）低及び高バルクのヒトのグリコヘモグ ロビン試料を混合し、次に、総ヘモグロビン濃度が１２ｍＭ　（１９，３ｇ／　 ｄｉ　）となるようにリン酸緩衝食塩水で混合物を希釈して調製した。次に、他 の較正溶液を、最終ヘモグロビン濃度９．６．３及び１ｍＭ（各々ＥＳＤ、Ｃ及 びＢ較正溶液）となるまでリン酸塩緩衝食塩水で希釈してＦｃｔｌから調製した 。６番目の較正溶液はリン酸塩緩衝食塩水自体から調製し、総ヘモグロビン濃度 はＯｍＭであった。各較正溶液のヘモグロビン及びグリコヘモグロビン濃度を第 １表に示す。典型的な総ヘモグロビン及びグリコヘモグロビンの較正曲線を第１ 図に示し、この調製は実施例６に示すように実施した。

実施例５ ホウ葉酸ポリアクリル酸を次のように調製した。２５ｍＭＭＥＳバッファ（ｐＨ ５，５）中のポリアクリル酸（４８，６ｇ）と２５ｍＭ　ＭＥＳバッフｙ　（ｐ Ｈ５，５）　中ｃＦ）ｍ−７ミノベンゼンホウ素酸（８ｇ）を混合し、ｐＨを６ ．１に合わせた。１−エチル−３〜（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ ミド（ＥＤＡＣ）（２０，７ｇ）を加えた。混合物を室温で５０分間撹拌し、ｐ Ｈ９，８で２４％グリシンを加えて反応を止めた。反応液を６容の５０ｍＭタウ リン（ｐ　Ｈ９，０）に対して透析濾過し、無菌的に濾過した。

実施例６ 本明細書のアッセイ手順をＩ　Ｍ　ｘ　機器（本出願人がら市販されており、Ｅ Ｐ−＾−２８８７９３及びＦｉｏ＋ｅ　ｅｌ　Ｉｌ、、　Ｃｌ１ａ、　Ｃｈｉｓ 。

３４／９：１７２６−１７３２　（１９８８１に記載されており、このいずれも 参考として本明細書に含む）で実施した。試料（１０μｍ）中の赤血球を、溶解 溶液（５０ｍＭ　ＭｇＣｌ　、１００ｍＭ塩化＋トリウム及び０．１％アジ化ナ トリウムを含有する５０ｍＭＨＥＰＥＳバッフｙ　（ｐＨ８，０）中の１％（ｗ ／　ｖ　）　Ｔ＋１ｌｏａ！−１００及び０．７０ｍＭの４−メチル−ウンベリ フェロン）７０μ！及びポリ陰イオン試薬溶液（ｐＨ９，０の５０ｍＭタウリン 中０．９％（Ｗ／Ｖ）の実施例５からのホウ葉酸ポリアクリル酸）を加え、次に 機器のピペットから混合物を２回吸い上げ、吹き出した。この方法で、はぼ瞬時 に新鮮な全血を溶血させた。

第二混合物は、この第一混合物のアリコート（１７μｊ）をＩ　Ｍ　ｘ　Ｒ使い 捨てカートリッジの反応ウェルに移し、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐｉ （７，５の１００ｍＭトリスバッファ１７０μｌとソルビトール洗浄溶液（３０ ０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７，５の１００ｍＭ　）リスバッファ中１０ ％（Ｗ／　Ｖ　）のソルビトール及び１７．５ｍＭの４−メチル−ウンベリフェ ロン）４０μ！を反応ウェルに加えることにより、この第一混合物から調製する 。

第一混合物の第二のアリコート（５０μｍ）を、０．２％（ｗ／ｖ）　（５，４ ２５ｇ／Ｊ）　Ｍｅ＋…１Ｒ１００（Ｃ山ｏｎＣｏ＋ｐｏｒ＊１ｉｏｏから市販 されている）溶液（Ｔｒｏｓｓｌｂ＊ｌ１ｔ６．３５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ ．　８４　ｇｌｌ　、蔗糖１　ｇ　／　Ｌ及び魚ゼラチン０．９５ｍｊ／ｊ）で 被覆したＩＭｘ’使い捨てカートリッジの繊維マトリックス（本出願人から市販 されている）に移す。ホウ葉酸ポリアクリル酸・グリコヘモグロビン複合体はＭ ｅ＋…１Ｒ１００と結合し、マトリックスを洗浄溶液（２５ｍＭアスパラギン、 ２５ｍＭメチオニン、１００ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　２及び０．１％アジ化ナトリウ ムを含む５０ｍＭタウリンバッフｙ　（ｐＨ９，０）中７．５ｍＭの４−メチル −ウンベリフェロン）２４０μ！で洗って、非糖化ヘモグロビンを実質的に全部 除去する。次に、マトリックス上のグリコヘモグロビンによる蛍光消光を測定す る。

マトリックスを約５０μｌのソルビトール洗液で洗う。ソルビトールはグリコヘ モグロビンと結合親和性について競合し、グリコヘモグロビンが除去される。第 二混合物のアリコート（５０μりをマトリックスに移し、グリコヘモグロビン及 び非糖化ヘモグロビンの両者による蛍光消光を測定する。総ヘモグロビン濃度及 びグリコヘモグロビン濃度を、このアッセイ手順に従って実施例４の較正溶液を 使用して作成した別々の較正曲線から決定し、グリコヘモグロビンの百分率を計 算する。

実施例７ 実施例６のアッセイ手順を使用して、２０１個の患者試料をテストし、１ｓｏｌ ＊ｂのＧＩ２ｃｍ＾目ｎアッセイから得た結果と比較した。データは第２図の相 関曲線に示す。

実施例８ 粒子（）ＩＢｒ＋＋＊ｎ　ｃｌ　ｇｌ、、＾ｎｗ１．　Ｂｉｏｃｈｅｇ＋　、　 ８０：５４７　（１９７７）及びＩｎｍ５Ｌｌｅｌ　ｓｌ、、Ｂｉｏｅｈｅａ、 　８：４０７ｇ（１９６９）の方法を使用して作製）を用いて、鳥グリコヘモグ ロビンを測定するように変更した実施例６のアッセイ手順を使用してグリコヘモ グロビンを測定した。ホウ酸微小粒子の１％（Ｗ／　Ｖ　）溶液をホウ葉酸ポリ アクリル酸の代わりに使用した。較正曲線は実施例４の較正溶液から作成し、第 ３図及び第４図に示す。２０人の患者試料をこのアッセイ手順を使用してテスト し、ｌ５ｏｌ＊ｂのＧ１７ｃｍ＾１１ｎアッセイから得た結果と比較した。第５ 図はこのアッセイ手順及びｌ５ｏｌｉｂのＧｌｙｅ−ＡＩＩｎアッセイを使用し てグリコヘモグロビン百分率についてテストした２０人の患者試料の相関曲線を 示す。

記載した実施態様及び示した別の実施態様は限定のためではな（例示のためのも のである。従って、本発明は本発明を開示した特定の実施態様に限定されるもの ではなく、上記及び添付の請求の範囲に記載した発明の精神及び範囲内の全ての 均等物及び主題も含むものと意図される。

Ｉ　５ＯＬＡＢホウ素酸化した 図２　１ｓＯＬＡＢ（％ＧＨｂ） グリコヘモグロビン較正曲線 図３　（ＧＨｂ）、ｍＭ 図４　（Ｈｂ）・ｍＭ ホウ素酸塩化した １図５ フロントページの続き （７２）発明者　レーン、テリーザ・エルアメリカ合衆国、イリノイ・６０２０ １、エバンストン、オーク・アベニュー・１３２１、ナンバー・３・エイ （７２）発明者　ウィルソン、ディピッド・エルアメリカ合衆国、イリノイ・６ ０２０２、エバンストン、シエリダン・ロード・６１３・１／２、アパートメン ト・１０７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリ陰イオン酸に共有結合したホウ酸からなる組成物。 ２．ホウ酸がアミノフェニルホウ酸である請求項１の組成物。 ３．ポリ陰イオン酸がポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ヘパリン、カルボ キシメチルアミロースまたはポリグルタミン酸である請求項１の組成物。 ４．血液試料中のヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンを定量する方法であっ て、 ８．試料の赤血球細胞を溶解させてヘモグロビンを放出させ；ｂ．グリコヘモグ ロビンの場合には、前記試料から前記グリコヘモグロビンを分離し； ｃ．ヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンを蛍光化合物と接触させ； ｄ．前記ヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンで生じた蛍光消光を測定し； ｅ．前記ヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンの蛍光消光をヘモグロビンまた はグリコヘモグロビンの較正曲線と比較する ことからなる方法。 ５．前記赤血球溶解が前記赤血球を活性剤と混合することからなる請求項４の方 法。 ６．前記活性剤がＴｒｉｔｏｎＸ−１００である請求項５の方法。 ７．前記グリコヘモグロビンの前記分離が、前記グリコヘモグロビンをグリコヘ モグロビンに特異的な特異結合物質と接触させて特異結合物質／グリコヘモグロ ビン複合体を形成し、前記試料から前記複合体を分離することからなる請求項４ の方法。 ８．前記特異結合物質が固相と結合している請求項７の方法。 ９．前記固相が粒子、フィルム、繊維、管またはウェルである請求項８の方法。 １０．特異結合物質が、固相と結合した第二のポリイオン化合物に結合する第一 のポリイオン化合物に結合している請求項７の方法。 １１．前記第一のポリイオン化合物がポリアスパラギン酸、ヘパリン、カルボキ シメチルアミロース、ポリグルタミン酸またはポリアクリル酸である請求項１０ の方法。 １２．前記第二のポリイオン化合物が高分子第四アンモニウム化合物、ジエチル アミノエチル−デキストランまたはＭｅｒｑｍａｔＲ１００である請求項１０の 方法。 １３．前記固相が繊維マトリックスである請求項１０の方法。 １４．前記特異結合物質がジヒドロキシボリル部分、抗グリコヘモグロビン抗体 またはレクチンである請求項７の方法。 １５．前記蛍光化合物がフルオレセン、ローダミン、ウンベリフェロンまたはそ の誘導体である請求項４の方法。 １６．前記蛍光化合物が固相に結合している請求項４の方法。 １７．血液試料中のグリコヘモグロビンを定量する方法であって、 ａ．試料の赤血球を溶解させてヘモグロビンを放出させ；ｂ．前記ヘモグロビン と蛍光化合物を混合し、前記ヘモグロビンにより生じた蛍光消光を測定し； ｃ．グリコヘモグロビンをヘモグロビンから分離し、前記グリコヘモグロビンを 前記蛍光化合物と接触させ、前記グリコヘモグロビンで生じた蛍光消光を定量し ；そしてｄ．前記ヘモグロビンの蛍光消光と前記グリコヘモグロビンの蛍光消光 を比較する ことからなる方法。 １８．前記グリコヘモグロビンの前記分離が、前記グリコヘモグロビンをグリコ ヘモグロビンに特異的な特異結合物質と接触させて特異結合物質／グリコヘモグ ロビン複合体を形成し、前記試料から前記複合体を分離することからなる請求項 １７の方法。 １９．前記特異結合物質が粒子、または繊維マトリックスに結合した第二のポリ イオン化合物に結合している第一のポリイオン化合物に結合する請求項１７の方 法。 ２０．ステップｂ及びｃの蛍光消光測定を共通のマトリックスで実施する請求項 １７の方法。 ２１．前記ステップｃをステップｂの前に実施し、ステップｃの後で洗浄溶液で このマトリックスを洗浄する請求項２０の方法。 ２２．前記洗浄用溶液が１，２−シスジオール化合物からなる請求項２１の方法 。 ２３．前記１，２−シスジオール化合物がソルビトールである請求項２１の方法 。