JP2001183356A

JP2001183356A - ヘモグロビン類の測定方法

Info

Publication number: JP2001183356A
Application number: JP36512199A
Authority: JP
Inventors: Yuji Setoguchi; 雄二瀬戸口; Kazuyuki Oishi; 和之大石; Kazuhiko Shimada; 一彦嶋田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2001-07-06

Abstract

(57)【要約】【課題】従来法より短時間で測定可能であり、分離能
が良く、ベースラインの変動が少なく、カラムの耐久性
を向上し得るヘモグロビン類の測定方法であって、特に
ＨｂＡ１ｃの分離能に優れたヘモグロビン類の測定方法
を提供する。【解決手段】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、充填剤として
非多孔性充填剤を用い、溶離液としてカオトロピックイ
オン及び、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、
有機酸又はこれらの塩を含む溶離液を用いるヘモグロビ
ン類の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ
１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は糖尿病診断の指標と
して広く利用されている。ＨｂＡ１ｃとは血液中の糖が
赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆的に結合し
て生成したものであり、過去１〜２カ月間の血液中の平
均的な糖濃度を反映する。

【０００３】このＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一般
に液体クロマトグラフィー法（以下、ＬＣという場合が
ある）や免疫法が用いられている。

【０００４】液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１
ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー
法により行われている（特公平８−７１９８号公報な
ど）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィ
ーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以
下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以
下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、Ｈｂ
Ｆという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並
びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などの
ピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使
用されているＨｂＡ１ｃは、最近では、上記のうちの安
定型ＨｂＡ１ｃであり、その割合は、全ヘモグロビンピ
ークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比
率（％）として求められている。

【０００５】しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不
安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通
常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定するこ
とが困難であった。そこで、不安定型ＨｂＡ１ｃピーク
の影響をなくす方法が以下のように種々考えられ、実施
されているがそれぞれまだ欠点がある。例えば、特開昭
６３−２９８０６３号公報に記載の試薬を添加すること
により不安定型ＨｂＡ１ｃを除く方法があるが、この方
法は前処理操作が煩雑となる点が問題となる。また、特
公平８−７１９７号公報に記載のような充填剤を用いる
ことにより、クロマトグラム上でピークとして分離する
方法も考えられるが、測定時間が長くなる点が問題とな
る。

【０００６】また、液体クロマトグラフィー法でのヘモ
グロビン類の測定においては、アセチル化ヘモグロビン
（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン
（以下、ＣＨｂという）などの修飾ヘモグロビンの影響
を受けるといわれ、ＡＨｂやＣＨｂのピークも安定型Ｈ
ｂＡ１ｃピーク付近に溶出するため、従来法によって
は、短時間での分離が困難であった。

【０００７】一方、一般的に液体クロマトグラフィーに
用いられる充填剤は、多孔性の架橋重合体が用いられて
いる。このような多孔性の架橋重合体は、多孔化するこ
とにより充填剤の比表面積を大きくして、測定試料との
相互作用できる有効な官能基量を増やし、分離性能の向
上や、試料添加量の増加が期待できる。これに対して、
架橋重合体の細孔径を極力小さくすることで、試料添加
量等は、減少するが、他の諸条件を最適化することによ
って、より高い分解能を有する充填剤が得られることが
ある。特に上記Ｈｂ類の測定のように短時間での高精度
測定が要求されるときには有効となる場合がある。そこ
で、充填剤表面の細孔を極力小さくする検討が行われて
いる。例えば、特開平１−２６２４６８号公報では、グ
リシジル基を加水分解し得られる水酸基にイオン交換基
を導入した架橋重合体によるタンパク質の測定方法が開
示されている。しかしながら、上記公報は多孔性ポリマ
ーの機械強度を高くする目的で行われたものであった。
また、特許第２９２９４５６号公報では、シリカ系また
は合成高分子の非多孔質粒子に、カチオン交換基を導入
した充填剤にて、ヘモグロビン類を測定する方法が開示
されている。しかしながら、上記公報では、現在一般に
用いられているＬＣの測定時間と比較して測定時間が長
く、また、ヘモグロビン類の中でもＨｂＦの分離精度が
不十分であり、さらにＨｂＦの溶出順が、通常と異なり
安定型ＨｂＡ１ｃやＨｂＡ０等の大きいピーク間に挟ま
れているため、測定時間を短くすると、ＨｂＦはこれら
の両ピークとの分離が困難になり測定精度が低下すると
いう問題点があった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
ヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑み、従来法より
短時間で測定可能であり、分離能が良く、ベースライン
の変動が少なく、カラムの耐久性を向上し得るヘモグロ
ビン類の測定方法であって、特にＨｂＡ１ｃの分離能に
優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することであ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、請求項１記載の本発明は、カチオン交換液体クロマ
トグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法におい
て、充填剤として非多孔性充填剤を用い、溶離液として
カオトロピックイオン及び、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝
能を持つ無機酸、有機酸又はこれらの塩を含む溶離液を
用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法を提
供する。

【００１０】また、請求項２記載の本発明は、カチオン
交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測
定方法において、充填剤として非多孔性充填剤を用い、
溶離液としてカオトロピックイオン及び、酸解離定数
（ｐＫａ）を２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．
５０の範囲に少なくとも一つずつ持つ緩衝剤を含む溶離
液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法
を提供する。

【００１１】また、請求項３記載の本発明は、カチオン
交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測
定方法において、ヘモグロビンＡ０を溶出するために、
カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点と等
しいか、又は、等電点よりアルカリ側になるようにｐＨ
を設定した溶離液を用いることを特徴とする請求項１又
は２記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。以
下、本発明の詳細を説明する。

【００１２】［溶離液］本発明におけるカオトロピック
イオンとは、化合物が水溶液に溶解したとき解離して生
じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水
が接触したときに起こる、水のエントロピー減少を抑制
するものである。

【００１３】陰イオンのカオトロピックイオンとして
は、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チ
オシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、
ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化
物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオン
としては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウ
ムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシ
ウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。

【００１４】上記カオトロピックイオンの中でも、陰イ
オンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イ
オン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸
イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオ
ン等を、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウム
イオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウ
ムイオン、グアニジンイオン等を用いるのが好ましい。
さらに、より好ましくは、チオシアン酸イオン、過塩素
酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられ
る。

【００１５】上記カオトロピックイオンの溶離液中の濃
度は、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定にお
いて、分離効果が低下する恐れがあり、また、３０００
ｍＭよりも高くてもヘモグロビン類の分離効果はそれ以
上向上しないので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好まし
く、より好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭ、また更に好
ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。また、カオト
ロピックイオンは複数種混合して用いてもよい。

【００１６】上記カオトロピックイオンは、測定サンプ
ルと接触する液、例えば、溶血試薬、サンプル希釈液等
にも添加してもよい。

【００１７】本発明におけるｐＨ４．０〜６．８で緩衝
能を持つ無機酸、有機酸又はこれらの塩としては、以下
のものが挙げられる。上記無機酸としては、例えば、炭
酸、リン酸などが挙げられる。上記有機酸としては、例
えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、
ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリ
ン酸などが挙げられる。

【００１８】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸などが挙げられる。上記ジカルボン酸とし
ては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸などが挙げら
れる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β
−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸な
どが挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、
例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸などが挙げられる。上
記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパ
ラギンなどが挙げられる。

【００１９】上記無機酸又は有機酸の塩としては、公知
のものでよく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など
が挙げられる。

【００２０】上記無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩
としては、複数混合して用いても良く、無機酸と有機酸
を混合して用いてもよい。

【００２１】上記無機酸、有機酸又はこれらの塩の溶離
液中の濃度は、水に溶解された状態で溶離液のｐＨを
４．０〜６．８にする緩衝作用があれば良く、１〜１０
００ｍＭが好ましく、１０〜５００ｍＭが特に好まし
い。

【００２２】上記溶離液のｐＨは、４．０〜６．８であ
り、好ましくは４．５〜５．８である。溶離液のｐＨが
４未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があ
り、ｐＨが６．８をこえると、ヘモグロビン類のプラス
荷電が減少し、カチオン交換基に保持されにくくなり、
ヘモグロビン類の分離が悪くなる。

【００２３】本発明における緩衝剤としては、酸解離定
数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１
０．５０の範囲に少なくとも一つずつ存在するものを用
いる。すなわち、単一の物質でｐＫａを、２．１５〜
６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも
一つずつ持つ物質を用いるか、あるいは、２．１５〜
６．３９の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と
６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫａ
を持つ物質とを組み合わせて用いる。また、上記緩衝剤
を複数組み合わせて用いてもよい。上記緩衝剤のｐＫａ
の範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離
液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発揮できる
ように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０
の範囲が好ましく、より好ましくは、２．８０〜６．３
５及び６．８０〜１０．００の範囲である。さらに好ま
しくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の
範囲である。

【００２４】上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホ
ウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン
酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリ
ン又はアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾ
ール類、アルコール類などの有機物が挙げられる。ま
た、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、
カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジ
ン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピ
リジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリ
ン、ピペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、グリシルグリシン等の有機物でもよい。上記カル
ボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香
酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例え
ば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マ
レイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。上記カ
ルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチル
グルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチルバルビ
ツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボ
ン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。上記ヒド
ロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クエン
酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。上記アニリン又は
アニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジメチル
アニリン等が挙げられる。上記アミノ酸としては、例え
ば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−ア
ラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン
等が挙げられる。上記アミン類としては、例えば、エチ
レンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、
ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール
類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロ
キシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、
２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−
メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−
エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−
メチル−１−プロパノール等が挙げられる。

【００２５】また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モ
リホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）
メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）
イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビ
ス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロ
パン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセト
アミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、
３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸
（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリ
シルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシ
ン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰ
Ｓ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれる
ものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫ
ａを表１・２に示す。（引用文献：堀尾武一・山下仁平
蛋白質・酵素の基礎実験法南江堂、１９８５年）

【００２６】

【表１】

【００２７】

【表２】

【００２８】上記緩衝剤の溶離液中の濃度は、緩衝作用
がある範囲であればよく、好ましくは１〜１０００ｍ
Ｍ、より好ましくは１５〜５００ｍＭである。また、上
記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いてもよく、例え
ば、有機物と無機物を混合して用いても良い。

【００２９】本発明においてＨｂＡ０を溶出するために
は、カラムに流入する際の溶離液のｐＨが、ヘモグロビ
ンの等電点と等しいか、又は等電点よりアルカリ側にな
るように設定した溶離液を用いることが好ましい。

【００３０】すなわち、ＨｂＡ０は、ＨｂＡ１ｃより強
く充填剤に保持されているため、これを溶出するには、
カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点より
アルカリ側になるように設定した溶離液を用いるのが好
ましい。これは、ヘモグロビンは、ｐＨが等電点より酸
性側からアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイ
ナスに変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気
的反発力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることがで
きるためである。

【００３１】上記溶離液のｐＨは、ヘモグロビンの等電
点（ヘモグロビンの等電点については、理化学事典（第
４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、
１１７８頁に記載あるように、ｐＨ６．８〜７．０であ
る）よりもアルカリ側である６．８以上であることが好
ましい。

【００３２】ＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液のｐ
Ｈは、７．０〜１２が好ましく、より好ましくは７．５
〜１１．０、また更に好ましくは８．０〜９．５であ
る。溶離液のｐＨが６．８以下になるとＨｂＡ０溶出が
不十分となり、ｐＨが１２より高いと充填剤の分解が起
こるものと考えられる。

【００３３】充填剤の分解が測定に影響ない場合は、溶
離液をｐＨ１２以上にするのが好ましく、ｐＨ１０〜１
３．５がより好ましい。ｐＨを高くしたとき、充填剤の
分解が測定値に影響する場合は、溶離液を流す時間を短
くすることにより、充填剤の分解を抑えることもでき
る。

【００３４】ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられる、
ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例え
ば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；
クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチル
グルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカ
ルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩から
なる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリ
ノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−
（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒ
ｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａ
ｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥ
Ｓ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリ
シルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド
（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。ま
た、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴ
Ａ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダ
ゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルア
ミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエ
タノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等
の有機物も使用できる。

【００３５】本発明におけるＨｂＡ０溶出用溶離液に
は、カオトロピックイオンを含有することが好ましい。
添加するカオトロピックイオンとしては、上述と同様の
ものを用いることができる。カオトロピックイオンの濃
度としては、１〜３０００ｍＭが好ましく、より好まし
くは１０〜１０００ｍＭ、更に好ましくは５０〜５００
ｍＭである。

【００３６】本発明では、測定目的のピークを分離する
のに際し、ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用いること
が好ましい。例えば、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモ
グロビン類を溶出するために用いる溶離液のｐＨが４．
０〜６．８の範囲にあり、ヘモグロビンＡ０の溶出に、
カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点より
アルカリ側になるようにｐＨを設定した溶離液を用い
る。

【００３７】ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン
類を分離するための溶離液のｐＨは、４．０未満である
と、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、６．８を
超えると、ヘモグロビンのプラス電荷が減少し、カチオ
ン交換樹脂に保持されにくくなり、分離能が低下するの
で４．０〜６．８が好ましく、４．５〜５．８がより好
ましい。

【００３８】上記ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用い
る場合、同一の緩衝剤を含むものを用いることが好まし
い。但し上記溶離液は、溶離液を切り替える際の、ベー
スライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、同一
の緩衝剤を含むものを用いる必要はない。

【００３９】さらに、ベースライン変動をより小さくす
るために、上記測定目的のピークを分離するにあたって
用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用い
るのがより好ましい。なお、溶離液のｐＨは、例えば、
下記ｐＨ調節剤の添加量により調節できる。

【００４０】また、本発明の測定方法において、溶離液
を測定途中で切り替えたり、勾配溶出法（グラディエン
ト溶出法）、段階溶出法（ステップアップグラディエン
ト溶出法）を行ってもよい。

【００４１】上記測定目的のピークとは、例えば、Ｈｂ
Ａ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ、ＡＨｂ、ＣＨｂ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＡ2 、
ＨｂＦ、ＨｂＡ０等が挙げられる。

【００４２】上記溶離液には、以下の物質を添加しても
よい。（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなど）を
添加してもよい。これらの塩類の濃度は、特に限定され
ないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えてもよ
い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等
が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリ
ウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、
塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．
００１〜５００ｍＭである。（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセ
トンなどの水溶性有機溶媒とを混合してもよい。これら
の有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは
０〜８０体積％であり、カオトロピックイオン、無機
酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度で用いる
のが好ましい。

【００４３】（４）アジ化ナトリウム、チモールなど防
腐剤を添加してもよい。（５）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例
えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレー
ト剤、グルタチオン、アジ化ナトリウムなどの還元剤・
酸化防止剤などを添加してもよい。

【００４４】［充填剤］本発明における非多孔性充填剤
は、非架橋性単量体及び架橋性単量体を重合開始剤の存
在下で重合して得られる架橋性重合体に、カチオン交換
基を導入することにより得られる。（非架橋性単量体）本発明に用いられる非架橋性単量体
としては、特に限定されず、例えば、スチレン、α- メ
チルスチレン、p-メチルスチレン、クロロメチルスチレ
ンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどの脂肪族系
単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン
酸ビニル等のビニルエステル類；メチル（メタ）アクリ
レート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メ
タ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ヒド
ロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシメチル
（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）ア
クリレート、グリセリン（メタ）アクリレート、エチレ
ングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレン
グリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリ
コール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミ
ド、（メタ）アクリロニトリル等の（メタ）アクリル酸
エステル類；（メタ）アクリルアミド、アクリロニトリ
ルなど（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。な
お、例えば上記（メタ）アクリル酸エステルとは、アク
リル酸エステル、又は、メタクリル酸エステルを意味す
る。これらは、２種以上が混合されて用いられてもよ
い。

【００４５】（架橋性単量体）本発明に用いられる架橋
性単量体としては、１分子中に２個以上のビニル基を有
する単量体であることが好ましい。このような架橋性単
量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルト
ルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、
ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリ
コールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコール
ジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ
（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）
アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）ア
クリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）ア
クリレート、テトラメチルロールメタントリ（メタ）ア
クリレート、テトラメチルロールメタンテトラ（メタ）
アクリレート、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）ア
クリロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロキ
シ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，
１０−ジ（メタ）アクリロキシー５−メチル−４，７−
ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メ
タ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−２，
６，１０−トリオール等の（メタ）アクリル酸エステル
の誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−
ヘキサジエン等の脂肪族ジエン化合物；および上記単量
体の誘導体などが挙げられる。その中でも、特に（メ
タ）アクリレート誘導体が好ましい。これらは、２種以
上が混合されて用いられてもよい。

【００４６】上記架橋性単量体の量は、充填剤が適度な
強度を保つために、上記非架橋性単量体１００重量部に
対して１０〜１００重量部であることが好ましい。

【００４７】（重合開始剤）本発明に用いられる重合開
始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公
知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤
の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリ
ウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイ
ドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウ
ロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、
ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオ
キサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブ
チルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソ
ブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパー
オキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサ
ノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過
酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，
２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、
４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，
２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビ
スシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物など
が挙げられる。上記重合開始剤の使用量は、用いた単量
体の合計量（非架橋性単量体、架橋性単量体及び重合に
カチオン交換基含有単量体使用した場合はこれを含む合
計量）１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ま
しい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になる
と、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要す
ることがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行
により、凝集物が発生することがある。

【００４８】（重合反応）本発明における充填剤の重合
反応は、公知の重合方法、例えば乳化重合法、懸濁重合
法、分散重合法などにより行われる。その中でも、操作
の簡便性から、懸濁重合を用いることが好ましい。例え
ば、懸濁重合法を用いる場合には、水溶性分散剤を溶解
した水性分散媒に、上記重合開始剤を溶解した上記架橋
性単量体および親水性単量体の混合物を分散させ、攪拌
後、窒素雰囲気下で昇温することにより重合反応を行わ
せることができる。上記懸濁重合の重合反応の温度およ
び時間は、使用する単量体および重合開始剤の種類や量
などによって異なるが、４０〜１００℃、０．３〜５０
時間程度であることが好ましい。その後、上記重合工程
を経て得られた重合物を、水および有機溶媒等で洗浄し
て乾燥することにより架橋重合体が得られる。

【００４９】本発明の充填剤にカチオン交換基を導入す
る方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。イ）カチオン交換基含有単量体を、上記非架橋性単量体
及び架橋性単量体と共に重合する方法。ロ）上記非架橋性単量体及び架橋性単量体を重合した
後、得られた重合体にカチオン交換基を導入する方法。

【００５０】（カチオン交換基含有単量体）本発明にお
ける非多孔性充填剤には、１分子中に１個以上のカチオ
ン交換基を含有する単量体を用いるのが好ましい。この
ような単量体としては、下記のものが挙げられる。

【００５１】(1) カルボキシル基含有単量体：上記カル
ボキシル基含有単量体としては、例えば、（メタ）アク
リル酸、２-（メタ）アクリロイルオキシエチルコハク
酸、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン
酸、マレイン酸、フマル酸およびこれらの誘導体などが
挙げられる。 (2) リン酸基含有単量体：上記リン酸基含有単量体とし
ては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）
アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオ
キシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）ア
クリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェートおよ
びこれらの誘導体などが挙げられる。 (3) スルホン酸基含有単量体：上記スルホン酸基含有単
量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、（メタ）
アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−
メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）
アクリレート、（３−スルホプロピル）- イタコン酸、
３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸およびこれらの
誘導体などが挙げられる。

【００５２】上記親水性単量体は、２種以上が混合され
て用いられてもよく、さらに、上記単量体及びその各種
誘導体は、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、塩化
物などであってもよい。

【００５３】上記カチオン交換基含有単量体の使用量
は、上記架橋性単量体１００重量部に対して１０〜１０
０重量部以下であることが好ましい。１０重量部より少
ないと分離精度が低下し、１００重量部を超えると重合
中に凝集物が発生しやすくなるためである。

【００５４】上記イ）の重合反応において、カチオン交
換基含有単量体の導入方法は、例えば、以下の方法が挙
げられる。 a)重合反応開始時に、非架橋性単量体及び架橋性単量体
と混合されて反応系に添加されてもよく、例えば、ポリ
ビニルアルコールやポリビニルピロリドンなどの公知の
水溶性分散剤を溶解した水性分散媒に、重合開始剤を溶
解した非架橋性単量体、架橋性単量体およびカチオン交
換基含有単量体混合物を分散させ、攪拌後、窒素雰囲気
下で昇温することにより重合反応を行う方法を用いるこ
とができる。 b)非架橋重合体及び架橋性単量体を用いて重合開始剤の
存在下で重合を行い、重合反応の途中で、カチオン交換
基含有単量体類を添加しても良い。該単量体類の途中添
加を行う場合、その添加時期は、重合反応における重合
率が、好ましくは７０〜９８％の段階にあることが好ま
しい。ここでの重合率の算出方法は、所定の重合時間経
過後重合物を取り出し、水および有機溶媒で洗浄した後
乾燥して、その乾燥重量を測定し、以下の式により求め
ることができる。重合率（％）＝（得られた重合物の重量／単量体仕込
量）×１００また上記重合反応には、有機溶媒等を途中で添加しても
よいが、必ずしもカチオン交換基含有単量体と同時期に
添加する必要はない。

【００５５】上記有機溶媒は、上記カチオン交換基含有
単量体の重合率を向上するためにも用いられる。この場
合、重合に用いられる単量体の良溶媒を添加することが
好ましい。

【００５６】上記有機溶媒は、用いる架橋性単量体およ
び親水性単量体によって異なるが、カチオン交換基含有
単量体に対して良溶媒であるものが好ましく、例えば、
メタノール、エタノール、プロパノール、イソアミルア
ルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコールな
どのアルコール類、トルエン、キシレン等の芳香族炭化
水素類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン
類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル
類、ジメチルホルムアミド、トルエン、キシレン、ジエ
チルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素
類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭
化水素等が挙げられる。

【００５７】上記有機溶媒の使用量は、上記架橋性単量
体１００重量部に対し、２０〜５００重量部が好まし
い。有機溶媒の使用量が２０重量部未満になると、効果
がなくなり、５００重量部を越えると、重合中に凝集し
やすくなる。

【００５８】本発明の有機溶媒の添加方法は特に限定さ
れず、重合系に添加分を一括して添加しても良いし、数
分〜数時間かけて添加してもよい。また添加時に重合系
の温度を一度室温まで下げるなど、温度を変化させても
よい。

【００５９】上記イ）の重合方法では、化学反応により
カチオン交換基に変換しうる官能基を有する単量体を用
い重合を行い、重合終了後に、該化学反応を行い、カチ
オン交換基に変換することで重合体を調製し得る。上
記、化学反応としては、公知の反応を用いることがで
き、例えば、加水分解反応や転移反応などが用いられ
る。また、上記化学反応によって変換し得る官能基とし
ては、例えば、加水分解反応によってカチオン交換基に
変換し得るエステル基、水酸基に変換しうるエポキシ
基、あるいは硫酸塩を反応しスルホン酸基を付加し得る
水酸基等が挙げられる。具体的には、例えばメチルメタ
クリレートを単量体として用い、重合後、アルカリ性下
で加温する事により、エステル結合が分解してカルボキ
シル基に変化されることで、カチオン交換充填剤が調製
し得る。

【００６０】上記ロ）の重合方法において、各カチオン
交換基の導入方法としては、例えば、以下の方法が挙げ
られる。 a)スルホン酸基：重合体が有する水酸基に、プロムエタ
ンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン
酸類を水酸化ナトリウム水溶液中で反応させる。あるい
は重合体が有する水酸基に、１，３−プロパンスルトン
または１，４−ブタンスルトンを水酸化ナトリウムを含
有する有機溶媒中で反応させる。あるいはエピクロルヒ
ドリンやグリセロールトリグリシジルエーテルのような
エポキシ化合物を水酸化ナトリウム水溶液中で反応させ
て、重合体表面をエポキシ化した後、硫酸ナトリウムや
タウリンなどスルホンサン基を有する化合物と反応させ
る方法等が挙げられる。 b)カルボキシル基：重合体が有する水酸基に、モノクロ
ル酢酸ナトリウムやモノクロル酢酸カリウム等のハロゲ
ン化酢酸類を水酸化ナトリウム水溶液中で反応させる。
エピクロルヒドリンやグリセロールトリグリシジルエー
テルのようなエポキシ化合物を水酸化ナトリウム水溶液
中で反応させて、重合体表面をエポキシ化した後、グリ
コール酸などのカルボキシル基を有する化合物と反応さ
せる方法等が挙げられる。

【００６１】上記（イ）または（ロ）方法により得られ
た重合体は、必要に応じて洗浄・乾燥され、さらに必要
に応じて分級されることにより、適当な平均粒径と粒度
分布を有する充填剤とされる。

【００６２】上記の重合工程により得られた重合体を、
ＬＣ用充填剤とするには、粒径および粒度分布を一定の
範囲となるよう調節する。

【００６３】本発明におけるＬＣ用充填剤の好ましい平
均粒径は０．５〜２０μｍであり、さらに好ましくは１
〜１５μｍである。０．５μｍ未満では、カラムに充填
して使用する場合、圧力損失が大きくなったり、あるい
は重合による粒径調整が困難である。また、２０μｍよ
り大きいと、分離性能が低下する。

【００６４】本発明のＬＣ用充填剤のＣＶ値は４０％以
下であることが好ましい。４０％を越える場合は、分級
性能が低下したりカラム寿命が短くなってしまうためで
ある。

【００６５】また、架橋重合体粒子を、必要に応じて公
知の分級方法によって分級することにより、上記範囲に
調節することもできる。分級方法は、乾式又は湿式の公
知の方法が用いら得る。好ましくは、上記の反応条件を
設定する方法で粒子径を調整する。

【００６６】本発明におけるＬＣ用充填剤は、ステンレ
ス製などのカラムに充填されてＬＣ測定に適用される。
カラムへの充填に際しては、適宜に公知の方法を用いる
ことができるが、充填剤を溶離液として用いる溶媒など
の分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経
由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。

【００６７】［ＬＣ装置］本発明におけるＬＣ装置は公
知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置
（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。ま
た、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置な
ど）が適宜付属されてもよい。

【００６８】上記充填剤はカラムに充填されて液体クロ
マトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知の
ステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されな
い。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長
さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０
ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填
剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用で
きるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例
えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたス
ラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することに
より行う。

【００６９】また、本発明においては、セミミクロ対応
装置、すなわち、装置の接液部であるポンプ、ミキシン
グカラム、サンプラ、配管、プレフィルター（ホルダ
ー、フィルター）、カラム及び検出器（セル）などのデ
ッドボリュームを可及的に小さくした装置を用いること
もできる。この場合、例えば、ミキシングカラムは５０
０μｌ以下が好ましく、２５０μｌ以下が特に好まし
い。また、サンプラのインジェクションバルブ容量は１
０μｌ以下が好ましく、５μｌ以下がより好ましく、２
μｌ以下が特に好ましい。また、配管は、内径０．２５
ｍｍ以下が好ましく、０．１３ｍｍ以下がより好まし
く、０．０６５ｍｍ以下が特に好ましい。また、サンプ
ラ、プレフィルタ、カラム、検出器などを配管で連結す
る場合、配管の長さは、可及的短い方が好ましい。ま
た、検出器（セル）の容量は、２０μｌ以下が好まし
く、１０μｌ以下がより好ましく、５μｌ以下が特に好
ましい。送液ポンプは、脈流が極めて少なく安定した送
液が可能なものが好ましい。

【００７０】上記装置の中でも短時間でより精度の良い
分離を行うためには、例えば、装置の接液部に、テフロ
ン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等の不活
性な素材を用い、さらに装置内のデッドボリュームを極
めて小さくする、また、送液ポンプも脈流が少ないもの
を用いることが好ましい。

【００７１】上記測定方法における、他の測定条件とし
ては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは
０．００１〜３ｍｌ／分、より好ましくは０．０１〜
１．８ｍｌ／分、更に好ましくは、０．０３〜１ｍｌ／
分である。０．００１ｍｌ／分より遅いと流速が安定せ
ず、２ｍｌ／分より早いと分離精度が低下する。ヘモグ
ロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、
特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、
通常、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液
により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体
クロマトグラフへの試料注入量は、希釈倍率により異な
るが、好ましくは０．１〜１００μｌ程度である。

【００７２】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。（実施例１）（充填剤の調製）４．４重量％のポリビニルアルコール
（ポバールＧＨ−２０：日本合成化学社製）水溶液２．
５Ｌに硫酸ナトリウム（和光純薬社製）２０ｇを添加し
て溶解した。これに２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト（新中村化学製）２００ｇ、エチレングリコールジメ
タクリレート（新中村化学社製）４０ｇ、メチルメタク
リレート（和光純薬社製）１５ｇおよびｔｅｒｔ−ブチ
ルパービバレート（和光純薬社製）６ｇの混合溶液を添
加し、６０℃で１２時間重合反応を行った。温水で洗浄
した後に分級し、２〜４μｍの非多孔性重合体を得た。
得られた重合体１００ｇを２０重量％の水酸化ナトリウ
ム水溶液に分散させ、室温でエピクロルヒドリン４０ｇ
を滴下して４時間反応させた。得られたエポキシ化重合
体を分離し、２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液１００
ｍＬに分散させ、８０℃で１６時間反応させた。反応後
温水で洗浄し、スルホン酸基含有充填剤を得た。

【００７３】（充填剤のカラムへの充填）得られた粒子
をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇ
を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分
散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量を
ステンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接
続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー
に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００
ｋｇ／ｃｍ²で定圧充填した。

【００７４】（Ｈｂの測定）上記のカラムを用いて、糖
尿病診断の指標となる、ヒト血液中のＨｂ類を含むＨｂ
類の測定を行った。

【００７５】（測定条件）システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社
製）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）検出器：紫外可視検出器ＳＰＤ−６ＡＶ（島津
製作所社製）溶離液：リン酸及び過塩素酸を含む３種類の緩衝液に
よるステップグラディエント法で溶出した。溶離液Ａ：５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク
酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：７０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク
酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｃ：２５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハ
ク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）流速：１．５ｍＬ／分検出波長：４１５ｎｍ

【００７６】（測定試料の調製）フッ化ナトリウム採血
した健常人血に以下の処理を行い、ａ）糖負荷血試料；
ｂ）カルバミル化Ｈｂ（ＣＨｂ）含有試料；ｃ）アセチ
ル化Ｈｂ（ＡＨｂ）含有試料を調製した。ａ）グルコースを５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加
し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血希釈液
（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オク
チルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化
成社製）を含むリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶
血し、１５０倍に希釈して測定試料ａ）とした。ｂ）ＣＨｂ含有試料：健常人血１０ｍＬに、０．３％の
シアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、
３７℃で３時間反応させて、次いで、溶血希釈液で150
倍に希釈して測定試料ｂ）とした。ｃ）ＡＨｂ含有試料：健常人血１０ｍＬに、０．３％の
アセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、室
温で３時間反応させて、次いで、溶血希釈液で150 倍に
希釈して測定試料ｃ）とした。

【００７７】（測定結果）試料ａ）を測定した結果、得
られたクロマトグラムを図１−ａ）に示す。図１−ａ）
中の各ピークは、ヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１
ａ及びｂ：ピーク１）；ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ：ピー
ク２）；不安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク３）；安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ（ピーク４）；ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０：ピ
ーク５）を示す。ＨｂＦ（ピーク２）及び糖尿病診断の
指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク４）の良好
な定量性が確保されるためには、ＨｂＦ、不安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される
ことが好ましいが、図1 ではこの順序通りに各ピークが
溶出し、高濃度の不安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク３）を、
安定型ＨｂＡ１ｃから良好に、しかも短時間に分離でき
た。試料ｂ）およびｃ）を測定した結果を、それぞれ図
１−ｂ）およびｃ）に示す。図１−ｂ）およびｃ）中に
おいて、各ピークはＣＨｂ（ピーク6 ）；ＡＨｂ（ピー
ク7 ）を示す。いずれのピークも安定型ＨｂＡ１ｃから
良好に分離された。

【００７８】（測定再現性の試験）試料ａ）を３０回繰
り返し測定し、ＨｂＦおよび安定型ＨｂＡ１ｃの測定値
の再現性を調べた。結果を表３に示した。実施例１は、
ＨｂＦおよび安定型ＨｂＡ１ｃの測定再現性に優れてい
る。変動係数（ＣＶ値）（＝標準偏差÷平均値×１００）

【００７９】

【表３】

【００８０】（カラム耐久性試験）試料ａ）を繰り返し
測定し、ＨｂＦおよび安定型ＨｂＡ１ｃの測定値の変化
をみた。結果を表４に示した。実施例１では多数の検体
を測定しても測定値の変化が少なく、良好な耐久性を有
する。

【００８１】

【表４】

【００８２】（実施例２）以下の溶離液を用いた以外は
実施例１と同様にしてＨｂ類の測定を行った。溶離液：リン酸及び過塩素酸を含む２種類の緩衝液に
よるリニアグラディエント法で溶出した。溶離液Ｃ：５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５）溶離液Ｄ：５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．８）流速：１．５ｍＬ／分検出波長：４１５ｎｍ（測定結果）実施例１と同様に、安定型ＨｂＡ１ｃが良
好に分離された。また測定再現性試験およびカラム耐久
性試験の結果も実施例１と同様、良好であった。

【００８３】（実施例３）以下の充填剤を用いた以外
は、実施例１と同様にしてＨｂ類の測定を行った。実施
例１で得られたエポキシ化重合体１００ｇをジオキサン
で洗浄し、２０重量％のグリコール酸のジオキサン溶液
に分散させ、フッ化ホウ素エーテラート（和光純薬製）
５ｍＬを添加して、５０℃で４時間反応させた。反応後
温水で洗浄し、カルボキシル基含有充填剤を得た。（測定結果）測定結果は、実施例１と同様であった。

【００８４】（実施例４）以下の充填剤を用いた以外
は、実施例１と同様にしてＨｂ類の測定を行った。４重
量％のポリビニルアルコール水溶液２．５Ｌにグリシジ
ルメタクリート３２０ｇ、エチレングリコールジメタク
リレート４０ｇおよびアゾビスイソブチロニトリル１４
ｇの混合物を添加し、６０℃で１０時間重合反応を行っ
た。温水で洗浄した後に分級し、２〜４μｍの非多孔性
重合体を得た。得られた重合体１００ｇにキシレン３０
０ｇを添加して分散させた。キシレン含浸重合体を、濃
硫酸１５ｇを含む４重量％のポリビニルアルコール水溶
液１Ｌに添加して、８０℃で１時間反応させた。反応後
洗浄し、水酸基含有重合体を得た。得られた重合体１０
０ｇをジオキサン５００ｍＬに分散させ、フッ化ホウ素
エーテラート５ｍＬを添加して、６０℃で８時間反応さ
せた。次に得られた重合体１００ｇをジオキサン５００
ｍＬに分散させ、１，３−プロパンスルトン（和光純薬
製）２５ｇおよび１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液
６０ｇを添加し、３０℃で６時間反応させた。反応後温
水で洗浄し、スルホン酸基含有充填剤を得た。（測定結果）測定結果は実施例１と同様であった。

【００８５】（比較例１）上記実施例１の充填剤を用
い、かつカオトロピックイオンを含まない下記溶離液を
用いて測定試料ａ）の測定を行った。測定結果を図２に
示した。比較例１では、ＨｂＦが安定型ＨｂＡ１ｃ（ピ
ーク４）とＨｂＡｏ（ピーク５）の間に溶出した。実施
例１と同様の測定再現性試験を実施したところ、特にＨ
ｂＦの測定値のバラツキが大きく、正確な測定ができな
かった。またカラム耐久性試験を実施例１と同様に実施
したところ、ＨｂＦおよび安定型ＨｂＡ１ｃの測定値と
も変化が顕著であり、カラム寿命が実施例１に比べて短
かった。

【００８６】（測定条件）システム：実施例１に同じ溶離液：リン酸緩衝液によるリニアグラディエント法で溶出した。溶離液Ｃ：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）溶離液Ｄ：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．8 ）流速：１．５ｍＬ／分検出波長：４１５ｎｍ

【００８７】（比較例２）実施例４の充填剤を用い、か
つカオトロピックイオンを含まない実施例１の溶離液
Ａ、Ｂ及びＣを用いて測定試料ａ）の測定を行った。測
定結果を図３に示す。実施例１に比べて測定時間が長い
にも関わらず、安定型ＨｂＡ１ｃを分離することができ
なかった。

【００８８】（実施例５）以下の測定条件を用い、測定
試料ａ）のみ測定した、以外は実施例１と同様に測定を
行った。（測定条件）システム：送液ポンプ：イナートポンプ２００１、ＮＡＮＯＳＰＡＣＥＳＩ−１（資生堂社製）オートサンプラ：オートサンプラー２００３（資生堂社製）検出器：ＵＶ−ＶＩＳ検出器２００２（資生堂社製）（測定結果）実施例５で得られた結果を図４に示した。
実施例１（図１）に比べて、ヘモグロビン類（ＨｂＦ、
安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃ）のピークがシ
ャープに分離された。実施例５では測定装置を最適化
し、前記セミミクロ対応装置を用いた、このため、より
短時間・高性能な分離測定を行うことができた。

【００８９】

【発明の効果】本発明は上記構成の如く非多孔性充填剤
と溶離液よりなるので、従来より短時間で、分離能良好
な測定が可能となった。また、特に安定型ＨｂＡ１ｃを
従来より短時間に、高い分離能で測定することが可能と
なった。さらに、ヘモグロビンＡ０の溶出に、カラムに
流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点よりアルカリ
側になるようにｐＨを設定した溶離液を用いているの
で、カラム劣化を抑え、耐久性を向上でき、さらにヘモ
グロビンＡ０ピーク幅も狭くなり測定時間の短縮にも寄
与できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ、ｂ、ｃ）を行った際に得られたクロマト
グラムを示す図。

【図２】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図３】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【図４】実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類の
測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを
示す図。

【符号の説明】

１ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク２ＨｂＦのピーク３不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク４安定型ＨｂＡ１ｃのピーク５ＨｂＡ０のピーク６ＣＨｂのピーク７ＡＨｂのピーク

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、充填剤として
非多孔性充填剤を用い、溶離液としてカオトロピックイ
オン及び、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、
有機酸及び／又はこれらの塩を含む溶離液を用いること
を特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、充填剤として
非多孔性充填剤を用い、溶離液としてカオトロピックイ
オン及び、酸解離定数（ｐＫａ）を２．１５〜６．３９
及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つずつ
持つ緩衝剤を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモ
グロビン類の測定方法。
【請求項３】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビン
Ａ０を溶出するために、カラムに流入する際のｐＨがヘ
モグロビンの等電点と等しいか、又は、等電点よりアル
カリ側になるようにｐＨを設定した溶離液を用いること
を特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の測
定方法。