CN102109490B - 利用电泳法分析血红蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用电泳法分析血红蛋白的方法，其能提高血红蛋白A1c(HbA1c)及修饰血红蛋白的分析精度，能缩短分析时间。一种利用电泳法分析血红蛋白的方法，其特征在于，前述电泳法在泳动液中含有具有两个以上羧基的酸性物质的条件下实施，前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。
Description
该申请要求2009年12月25日提出的日本专利申请2009-296426的优先权。
技术领域
本发明涉及利用电泳法分析血红蛋白的方法。
背景技术
血液中的血红蛋白与血液中的葡萄糖反应而变成糖化血红蛋白。前述糖化血红蛋白中，特别是血红蛋白A1c(HbA1c)是糖尿病的诊断和治疗等中重要的指标。HbA1c是血红蛋白A(HbA0)的β链N末端的缬氨酸被糖化而成的，根据糖化反应的阶段，存在稳定型血红蛋白A1c(以下，也称为“稳定型A1c”或“s-A1c”。)及不稳定型血红蛋白A1c(以下，也称为“不稳定型A1c”或“L-A1c”。)。不稳定型A1c是HbA0的β链N末端的缬氨酸与葡萄糖键合形成席夫碱而变成醛亚胺的。前述不稳定型A1c进一步受到Amadori重排而变成酮胺化合物，其为稳定型A1c。稳定型A1c反映过去几个月间的血糖值，成为日本糖尿病学会的标准测定法的测定项目。
血液中的糖化血红蛋白的测定方法例如有免疫法、酶法、亲和色谱法、HPLC法、毛细管电泳法等。前述免疫法及前述酶法能够应用于自动分析装置。因此，具有能大量处理待测体的优点，但作为糖尿病患者的血糖控制指标和/或并发症的发病预防标记物使用时，测定精度欠缺。前述亲和色谱法在分离原理上对β链N末端的糖化缬氨酸的特异性低，导致测定值中包含Hb分子中的糖化赖氨酸，因此HbA1c的测定精度低。此外，前述HPLC法被广泛用作糖尿病患者的治疗中的糖化血红蛋白的测定方法(例如JP3429709B)，但需要大型且昂贵的专用装置，难以实现装置的小型化及低成本化。从集体健康检查中的利用等理由出发，对于血红蛋白的分析装置要求小型化，但如前所述，前述HPLC法难以满足该要求。
另一方面，在前述毛细管电泳法中，通过施加电压而使集合于毛细管流道内壁的离子移动，从而产生电渗流，由此使试样移动而进行电泳。前述毛细管电泳法例如通过前述毛细管流道的缩短化、毛细管电泳装置的部分微芯片化，能够实现装置整体的小型化。利用前述毛细管电泳法进行的HbA1c的分析方法，例如报道了使用毛细管的内壁层叠有阴极性层的毛细管的方法(例如WO2008/029684A1和WO2008/029685A1)。
发明内容
本发明的分析方法是利用电泳法分析血红蛋白的方法，其特征在于，在泳动液中含有具有两个以上羧基的酸性物质的条件下实施电泳，前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。
本发明的分析方法优选的是：前述酸性物质的两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。
本发明的分析方法优选的是：前述泳动液含有缓冲剂及分离改善剂，前述分离改善剂包括前述酸性物质。
本发明的分析方法优选的是：前述酸性物质的两个以上的羧基的各酸解离常数(pKa)比分析时的前述泳动液的pH低0.7以上。
本发明的分析方法优选的是：前述泳动液含有缓冲剂，前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKa)为分析时的前述泳动液的pH-0.3的值以上。
本发明的分析方法优选的是：前述泳动液含有缓冲剂及分离改善剂，前述分离改善剂包括前述酸性物质，由前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKa)减去前述分离改善剂的前述酸性物质的羧基的第二酸解离常数(pKa2)得到的差为0.2以上。
本发明的分析方法优选的是：含有血红蛋白的试样液的pH与前述泳动液的pH之差小于0.3。
本发明的分析方法优选的是：前述酸性物质是具有环己烷环的结构。
本发明的分析方法优选的是：利用前述电泳法进行的血红蛋白的分离在分离用毛细管流道中实施。
本发明的分析方法优选的是：通过连续试样导入法实施分离，所述连续试样导入法将含有血红蛋白的试样液连续地导入到前述分离用毛细管流道中。
本发明的分析方法也可以是如下方式：前述分离用毛细管流道形成于微芯片上，前述电泳法为微芯片电泳法。
本发明的分析方法也可以是如下方式：前述分离用毛细管流道为毛细管，前述电泳法为毛细管电泳法。
本发明的分析方法优选的是：前述血红蛋白为血红蛋白A1c。
本发明的分析方法优选的是：前述血红蛋白A1c为稳定型血红蛋白A1c及不稳定型血红蛋白A1c中的至少一种。
本发明的分析方法优选的是：前述血红蛋白为选自由氨基甲酰化血红蛋白、醛化血红蛋白及乙酰化血红蛋白组成的组中的至少一种修饰血红蛋白。
其次，本发明的分离改善剂是用于前述本发明的分析方法的分离改善剂，其特征在于，其含有具有两个以上羧基的酸性物质，前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。本发明的分离改善剂的优选的条件及方式与本发明的血红蛋白的分析方法相同。
其次，本发明的泳动液试剂的特征在于，其含有用于本发明的分析方法的前述分离改善剂。本发明的泳动液试剂的优选的条件及方式与本发明的血红蛋白的分析方法相同。
其次，本发明的微芯片为用于前述本发明的分析方法的微芯片，其特征在于，其包括分离用毛细管流道及多个液槽，前述多个液槽被前述分离用毛细管流道连通，前述分离用毛细管流道及前述液槽中的至少一者填充有泳动液，前述泳动液含有具有两个以上羧基的酸性物质，前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。本发明的微芯片的优选的条件及方式与本发明的血红蛋白的分析方法相同。
其次，本发明的试剂是用于前述本发明的分析方法的试剂，其特征在于，其含有前述本发明的分离改善剂。前述本发明的试剂中，除前述分离改善剂以外，还可以含有例如泳动液、缓冲剂、添加剂、表面活性剂、稳定化剂等。本发明的试剂例如也可以作为泳动液试剂、稀释液试剂、试样液试剂等使用。
本发明的分析试剂盒的特征在于，其含有前述本发明的试剂。前述本发明的分析试剂盒的特征在于，其含有用于前述本发明的分析方法的分离改善剂，前述分离改善剂含有具有两个以上羧基的酸性物质，前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。即，本发明的分析试剂盒含有前述本发明的分离改善剂。
附图说明
图1是表示实施例1中的血红蛋白的检测结果的图表。
图2是表示实施例2中的血红蛋白的检测结果的图表。
图3是表示实施例3中的血红蛋白的检测结果的图表。
图4是表示实施例4中的血红蛋白的检测结果的图表。
图5是表示实施例5中的血红蛋白的检测结果的图表。
图6是表示比较例1中的血红蛋白的检测结果的图表。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。以下，将血红蛋白记载为“Hb”。
如前所述，本发明的分析方法是利用电泳法进行的Hb的分析方法，其特征在于，在泳动液中含有具有两个以上羧基的酸性物质的条件下实施电泳，前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。本发明的分析方法没有特别限制，例如如后所述，前述电泳优选为毛细管电泳或微芯片电泳。
本发明中，前述泳动液是指用于施加电压通过电泳分离Hb的溶液。前述泳动液例如可分为电泳前的泳动液和电泳时的泳动液。本发明中，电泳前的泳动液可称为“分析前的泳动液”，电泳时的泳动液可称为“分析时的泳动液”。“电泳前”或“分析前”例如意味着对前述泳动液施加电压之前，“电泳时”或“分析时”例如意味着正在对前述泳动液施加电压的状态，是添加了试样的状态。前述分析时的泳动液含有前述酸性物质，前述分析前的泳动液可以含有前述酸性物质，也可以不含前述酸性物质。前述分析前的泳动液及前述分析时的泳动液例如也可以含有缓冲剂等。
前述酸性物质只要分析时存在于前述泳动液中即可。因此，前述酸性物质例如可以预先添加到前述分析前的泳动液中，也可以预先添加到含有Hb的试样液中。前者的情况下，例如，作为分析前填充到分离用毛细管流道内的溶液，优选使用含有前述酸性物质的溶液。前述分离用毛细管流道，例如可列举出毛细管、毛细管流道等。后者的情况下，例如可以将前述酸性物质直接添加到溶血试样等之类的液体试样中，也可以预先添加到如后所述那样的用于稀释试样的溶剂中。
如前所述，前述酸性物质具有两个以上羧基。前述酸性物质中的前述羧基的数目例如为2～6，优选为2～4。
前述酸性物质例如还可以具有羧基以外的官能团。其他的官能团没有特别限制，例如可列举出氢原子、氨基、羟基、碳原子数1～5的烷基、前述碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数1～5的烷硫基等。前述官能团中的其中一个以上氢原子例如可以被任意的取代基取代。前述取代基可列举出例如氟基、溴基、氯基、氟、碘基等卤素基团，优选为氟基。
前述酸性物质具有两个以上的羧基，每个羧基具有各自的酸解离常数(pKa)。本发明中，至少两个羧基的酸解离常数(pKa)的范围例如为2～5，优选为2～4。
前述酸性物质的两个以上羧基的酸解离常数(pKa)与分析时的前述泳动液的pH相比，优选低0.5以上，更优选低0.7以上，进一步更优选低1.0以上。
具体而言，前述酸性物质例如可列举出羧酸、氨基酸等。
前述羧酸例如可列举出二羧酸、三羧酸、四羧酸、五羧酸、六羧酸、七羧酸、八羧酸、九羧酸、十羧酸等，优选为二羧酸、三羧酸、四羧酸、五羧酸、六羧酸。前述羧酸例如可以使用任意一种，也可以使用两种以上。
前述羧酸例如可列举出脂肪族羧酸、碳环羧酸等。前述脂肪族羧酸例如可列举出富马酸、D-酒石酸等，优选为D-酒石酸。前述碳环羧酸例如可列举出环己烷羧酸等。
前述环己烷羧酸是具有环己烷环的结构。前述环己烷羧酸例如优选为下述通式(1)所示的化合物、其互变异构体或立体异构体、或它们的盐、溶剂化物或水合物。
其中，前述通式(1)具有至少两个羧基，前述通式(1)中，R1～R12为分别相同或不同的官能团。前述R1～R12中，至少两个官能团为具有羧基的官能团，和/或，至少一个官能团为具有至少两个羧基的官能团。前者即具有至少一个羧基的官能团例如为羧基、羧基烷基。前述羧基烷基中，烷基部分为例如碳原子数1～5，优选碳原子数为1，前述羧基烷基的具体例子例如可列举出-CH2COOH。后者即具有至少两个羧基的官能团例如为双(羧基烷基)氨基。前述双(羧基烷基)氨基中，烷基部分例如为碳原子数1～5，优选为碳原子数1，前述双(羧基烷基)氨基的具体例子例如可列举出-N(CH2COOH)2。前述官能团，具体而言，除前述含有羧基的官能团以外，例如为氢原子、氨基、碳原子数1～5的烷基、碳原子数1～5的烷氧基或碳原子数1～5的烷硫基。前述R1～R12上的一个以上氢原子可以被任意的取代基取代。前述R1～R12上的氢原子及前述取代基中至少二个可以被羧基取代。前述取代基没有特别限制，例如可列举出羧基、酰基、氨基、烷基、羟基等。前述羟基例如也可以异构化，以氧基(＝O)的形式存在。前述取代基中的氢原子例如可以被羧基、氨基、羟基等取代基取代。
前述烷基没有特别限定，例如可列举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基等，结构中含有烷基。烷氧基及烷硫基也同样。前述烷基中的一个以上氢原子例如可以被任意的取代基取代。前述烷基中的取代基没有特别限制，例如可列举出前述的取代基等。
前述烷氧基没有特别限定，例如可列举出甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等。前述烷氧基中的一个以上氢原子例如可以被任意的取代基取代。前述烷氧基中的取代基没有特别限制，例如可列举出前述的取代基等。
前述烷硫基没有特别限制，例如可列举出甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基等。前述烷硫基中的一个以上氢原子例如可以被任意的取代基取代。前述烷硫基中的取代基没有特别限制，例如可列举出前述的取代基等。
对于前述R1～R12，前述具有羧基的官能团的具体例子没有特别限制，例如可列举出羧基(-COOH)、前述羧基烷基、前述双(羧基烷基)氨基等，前述羧基烷基优选为-CH2-COOH，前述双(羧基烷基)氨基优选为-N-(CH2COOH)2。
具体而言，前述环己烷羧酸例如优选为反式-1，2-环己二胺-N，N，N’，N’-四乙酸(CyDTA)、1，1-环己烷二乙酸、(1α，2α，4α)-1，2，4-环己烷三羧酸、1，2，3，4，5，6-环己烷六羧酸一水合物等。前述环己烷羧酸可以使用一种，也可以并用两种以上。
前述氨基酸例如可列举出天门冬氨酸、谷氨酸等，优选为谷氨酸。前述氨基酸可以使用一种，也可以并用两种以上。
如前所述，前述酸性物质例如具有两个以上的羧基，每个羧基具有各自的酸解离常数(pKa)。至少两个羧基的酸解离常数(pKa)的范围例如为2～5，优选为2～4。具有这种范围的酸解离常数的酸性物质，例如可列举出CyDTA、(1α，2α，4α)-1，2，4-环己烷三羧酸、L-谷氨酸、D-酒石酸、L-酒石酸、富马酸、柠檬酸、天门冬氨酸、邻苯二甲酸、D-苹果酸等。
前述酸性物质的两个以上羧基的酸解离常数(pKa)优选低于分析时的前述泳动液的pH，更优选比其低0.5以上，进一步优选比其低0.7以上，特别优选比其低1.0以上。这样的酸性物质没有特别限制，例如可列举出CyDTA、D-酒石酸、富马酸、天门冬氨酸等。这样的酸性物质例如还可以作为金属的螯合剂使用，由此，例如还可以除去试样中的钙离子、镁离子等离子。此外，通过除去这些离子，例如还可以抑制如后所述的含阴极性基团的化合物的聚集。
前述泳动液可以含有前述酸性物质中的任意一种，也可以含有两种以上。前述酸性物质的组合及比例没有特别限制，可适当设定。
前述泳动液中的前述酸性物质的浓度没有特别限制，例如为0.1～100mmol/L，优选为0.1～50mmol/L，更优选为0.5～10mmol/L，进一步更优选为1～5mmol/L。
前述泳动液例如含有分离改善剂和缓冲剂，前述分离改善剂可以含有前述酸性物质。
前述分离改善剂中，例如除前述酸性物质以外，还可以含有任意的物质。前述物质的组合及比例没有特别限制，可适当设定。
前述分离改善剂例如只要在分析时存在于前述泳动液中即可。因此，前述分离改善剂例如可以预先添加到分析前的前述泳动液中，也可以预先添加到前述试样液中。前者的情况下，例如，作为分析前填充到分离用毛细管流道内的溶液，优选使用含有前述分离改善剂的溶液。前述分离用毛细管流道例如可列举出毛细管、毛细管流道等。后者的情况下，例如可以将前述分离改善剂直接添加到前述试样中，也可以预先添加到后述那样的用于稀释试样的溶剂中。
前述缓冲剂例如可列举出现有公知的缓冲物质。具体而言，前述缓冲物质例如可列举出磷酸、硼酸等无机酸，L-酒石酸、乙酸、马来酸、丙二酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、安息香酸、琥珀酸、丙酸、苹果酸、戊二酸、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、吗啉代乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺)亚胺基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、2-(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸(HEPES)等有机酸，半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸等氨基酸等。前述泳动液中，作为前述缓冲剂，可以含有前述缓冲物质中的任意一种，也可以含有两种以上。前述缓冲物质的组合及比例没有特别限制，可适当设定。前述泳动液含有缓冲剂和分离改善剂的情况下，前述缓冲剂例如可以是前述酸性物质以外的缓冲物质，也可以是前述酸性物质。
前述缓冲剂例如只要分析时存在于前述泳动液中即可。因此，前述缓冲剂例如可以预先添加到分析前的前述泳动液中，也可以预先添加到前述试样液中。前者的情况下，例如，作为分析前填充到分离用毛细管流道内的溶液，优选使用含有前述缓冲剂的溶液。前述分离用毛细管流道例如可列举出毛细管、毛细管流道等。后者的情况下，例如，可以将前述缓冲剂直接添加到前述试样中，也可以预先添加到后述那样的用于稀释试样的溶剂中。前述缓冲剂例如优选预先添加到分析前的前述泳动液中。通过向分析前的前述泳动液中添加前述缓冲剂，例如可以将前述试样液与分析前的前述泳动液的pH之差设定在后述的范围内。
前述缓冲剂的酸解离常数(pKa)没有特别限制，例如为4.5～6，优选为4.5～5.5。具有这样的范围的酸解离常数的缓冲剂，例如可列举出L-酒石酸、柠檬酸、戊二酸、琥珀酸、乙酸、邻苯二甲酸、丙二酸、马来酸、苹果酸、丙酸等。
前述缓冲剂具有多个酸解离常数(pKa)的情况下，前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKan(B))是指，例如前述缓冲剂的酸解离常数(pKa)中与分析时的前述泳动液的pH(X)最接近的值的酸解离常数。前述缓冲剂具有一个酸解离常数(pKa)的情况下，例如，前述酸解离常数为前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKan(B))。前述缓冲剂的酸解离常数(pKa)中，前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKan(B))，例如优选为分析时的前述泳动液的pH-0.3的值以上。即，设分析时的前述泳动液的pH的值为“X”时，前述酸解离常数(pKan(B))例如优选为[X-0.3]以上。
前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKan(B))与前述分析时的前述泳动液的pH(X)之差例如为-0.3以上。具有这种范围的酸解离常数的缓冲剂例如可列举出L-酒石酸、戊二酸、乙酸、邻苯二甲酸、苹果酸、丙酸等。
前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKan(B))例如优选高于前述分离改善剂的前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)。前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKan(B))与前述分离改善剂的前述酸性物质的至少两个羧基的各酸解离常数(pKa(A))之差，即，[pKan(B)-pKa(A)]例如为0.2以上，优选为0.5以上，更优选为0.7以上。具体而言，前述缓冲剂的酸解离常数(pKan(B))与前述分离改善剂的前述酸性物质的第二酸解离常数(pKa2)之差，即，[pKan(B)-pKa2]例如为0.2以上，优选为0.5以上，更优选为0.7以上。满足这种关系的前述缓冲剂与前述酸性物质的组合没有特别限制，例如可列举出L-酒石酸与CyDTA的组合、L-酒石酸与L-谷氨酸的组合、苹果酸与CyDTA的组合、苹果酸与D-酒石酸的组合、柠檬酸与CyDTA的组合、柠檬酸与富马酸的组合等。
前述泳动液例如还可以含有添加剂、表面活性剂、稳定化剂等。前述添加剂例如只要分析时存在于前述泳动液中即可。因此，前述添加剂例如可以预先添加到分析前的前述泳动液中，也可以预先添加到前述试样液中。前者的情况下，例如，作为分析前填充到分离用毛细管流道内的溶液，优选使用含有前述添加剂的溶液。前述分离用毛细管流道例如可列举出毛细管、毛细管流道等。后者的情况下，例如，可以将前述添加剂直接添加到前述试样中，也可以预先添加到后述那样的用于稀释试样的溶剂中。前述表面活性剂及稳定化剂例如也只要分析时存在于前述泳动液中即可。前述表面活性剂及稳定化剂例如只要与前述的添加剂同样地添加到前述泳动液、前述试样液等中即可。
前述添加剂没有特别限制，例如可列举出含阴极性基团的化合物、阴离子性离液序列高的离子等。
前述含阴极性基团的化合物没有特别限制，例如可列举出含阴极性基团的多糖类等。前述含阴极性基团的多糖类没有特别限定，例如可列举出硫酸化多糖类、羧酸化多糖类、磺酸化多糖类、磷酸化多糖类等，其中，优选为硫酸化多糖类及羧酸化多糖类。前述硫酸化多糖类例如优选为硫酸软骨素、肝素或它们的盐等，更优选为硫酸软骨素或其盐。前述羧酸化多糖类例如优选为海藻酸、透明质酸或它们的盐。前述盐例如可列举出海藻酸钠、透明质酸钠等。前述硫酸软骨素例如可列举出硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E、硫酸软骨素H及硫酸软骨素K等。前述含阴极性基团的化合物例如可以使用任意一种，也可以并用两种以上。前述含阴极性基团的化合物的组合及比例没有特别限制，可适当设定。
分析时的前述泳动液中的前述含阴极性基团的化合物的浓度没有特别限定，例如为约0.01～5重量％，优选为约0.1～2重量％。如前所述，前述含阴极性基团的化合物例如可以预先添加到前述泳动液中，也可以预先添加到前述试样中。因此，前者的情况下，前述泳动液中的前述含阴极性基团的化合物的浓度没有特别限制，例如优选在分析时按照前述的范围来添加。后者的情况下，前述试样中的前述含阴极性基团的化合物的浓度没有特别限制，例如优选在分析时按照前述的范围来添加。
在前述含阴极性基团的化合物的存在下对前述试样液进行电泳的情况下，例如，前述试样液中的Hb以与前述含阴极性基团的化合物形成复合体的状态在前述泳动液中进行电泳。通过形成该复合体，例如可以进一步提高分析精度，并进一步缩短前述分离用毛细管流道的长度(分离长度)。因此，例如可以进一步缩短分析时间。
离液序列高的离子通常是如下所述的离子：破坏水分子间的相互作用，利用与疏水性分子的接触来抑制水的熵值的减少，从而提高疏水性分子的水溶性。前述阴离子性离液序列高的离子没有特别限制，例如可列举出高氯酸根离子(ClO4 -)、硫氰酸根离子(SCN-)、三氯乙酸根离子(CCl3COO-)、三氟乙酸根离子(CF3COO-)、硝酸根离子(NO3 -)、二氯乙酸根离子(CCl2COO-)、卤化物离子等。前述卤化物离子没有特别限制，例如可列举出氟化物离子(F-)、氯化物离子(Cl-)、溴化物离子(Br-)、碘化物离子(I-)、砹化物离子(At-)等，优选溴化物离子(Br-)、碘化物离子(I-)。前述离液序列高的离子例如可以使用一种，也可以并用两种以上。前述离液序列高的离子的组合及比例没有特别限制，可适当设定。
前述泳动液例如可以含有前述阴离子性离液序列高的离子，也可以含有含前述阴离子性离液序列高的离子的盐、及电离而生成前述阴离子性离液序列高的离子的物质中的至少任一种。本发明中，如后所述，前述阴离子性离液序列高的离子例如优选不使用，或者以低浓度使用。前述盐例如可列举出酸性盐、中性盐、碱性盐。前述含阴离子性离液序列高的离子的盐、及前述电离而生成阴离子性离液序列高的离子的物质没有特别限定，具体而言，例如可列举出碘化钾、溴化钾等卤化钾，高氯酸钠、硫氰酸钾、三氯乙酸钾、三氟乙酸钾等。因此，本发明中，前述阴离子性离液序列高的离子例如也包括前述含阴离子性离液序列高的离子的盐、或前述电离而生成阴离子性离液序列高的离子的物质等。前述阴离子性离液序列高的离子例如可以使用任意一种，也可以并用两种以上。前述阴离子性离液序列高的离子的组合及比例没有特别限制，可适当设定。
如前所述，使用前述阴离子性离液序列高的离子时，例如可以提高分离精度，但若在高浓度的阴离子性离液序列高的离子存在下实施电泳法，则随着电流量的增加，发热量会增加。该发热量的增加例如会导致Hb的分离精度降低，泳动速度变慢。根据本发明，如前所述，通过在前述泳动液中具有前述酸性物质的条件下实施电泳，从而Hb的分离精度提高。因此，即使在例如降低前述阴离子性离液序列高的离子的浓度的条件下，也能够以高精度分离Hb。因此，本发明例如通过减少前述阴离子性离液序列高的离子，能够抑制对前述的Hb的分离精度及泳动速度的影响，能够以更高精度进行分析。
分析时的前述泳动液中的前述阴离子性离液序列高的离子例如优选不含有，或者为比较低的浓度。分析时的前述泳动液中的前述阴离子性离液序列高的离子的浓度，具体而言，例如为1～3000mmol/L，优选为5～100mmol/L，更优选为10～50mmol/L。前述阴离子性离液序列高的离子例如可以在分析时按照前述的范围预先添加到前述泳动液中，也可以预先添加到前述试样中。
前述表面活性剂没有特别限定，例如可列举出非离子性表面活性剂等。前述非离子性表面活性剂没有特别限制，例如可列举出聚氧乙烯异辛基苯基醚(商品名“Triton(注册商标)X-100”)等。
前述稳定化剂没有特别限制，例如可列举出叠氮化钠、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸(EDTA)等。
分析前及分析时的前述泳动液的离子强度没有特别限制。前述泳动液的pH没有特别限制，例如为4.5～6，优选为4.5～5.5。
本发明的分析方法例如优选将试样液导入到前述泳动液中进行电泳。前述试样液是含有Hb的试样。前述试样例如可以是生物体来源的试样，也可以是包含含有Hb的市售品的试样。前述生物体来源的试样例如可列举出血液试样，具体而言，例如可列举出全血、血细胞级分等含血细胞物质。前述试样液例如可以是从生物体中采集的试样本身，也可以是将前述采集的试样用溶剂稀释后的稀释试样。
前述血液试样没有特别限制，可列举出将前述含血细胞物质进行溶血处理而得到的溶血试样等。前述溶血处理没有特别限制，例如可列举出超声波处理、冷冻解冻处理、加压处理、渗透压处理、表面活性剂处理等，优选为渗透压处理。前述渗透压处理没有特别限制，例如可以将前述含血细胞物质用低渗液等进行处理。前述低渗液没有特别限制，例如可列举出水、缓冲液等。前述缓冲液没有特别限制，例如也可以含有前述的缓冲剂、添加剂等。
前述稀释用的溶剂没有特别限制，例如可列举出水、生理盐水、缓冲液等。前述缓冲液没有特别限制，例如可以含有前述的分离改善剂、缓冲剂、添加剂、表面活性剂、稳定化剂等。
如前所述，向前述试样液中添加前述分离改善剂的情况下，前述分离改善剂例如可以在溶血处理时添加，也可以在稀释时添加。前者的情况下，例如可以在用于渗透压处理的前述低渗液中预先添加前述分离改善剂。后者的情况下，例如可以在前述稀释用的溶剂中预先添加前述分离改善剂。将前述缓冲剂、添加剂、表面活性剂、稳定化剂添加到前述试样中的情况下，例如也与前述的分离改善剂同样。
前述试样液的离子强度没有特别限制。前述试样液的pH没有特别限制，例如优选为4.5～6，更优选为4.5～5.5。
由于试样液而使泳动液的pH发生变化的情况下，前述试样液的pH与前述泳动液的pH之差越小越优选，前述差例如为0～0.3，优选为0～0.1。前述泳动液的pH例如为分析前及分析时的任一种前述泳动液的pH，优选为分析时的前述泳动液的pH。
前述pH的差例如可以通过向前述试样液中添加前述缓冲剂来进行调整，如前所述，也可以通过向分析前的前述泳动液中添加前述缓冲剂来进行调整。优选为后者。仅通过前述分离改善剂调整后的试样液的pH与分析时的泳动液的pH之差例如为0.3以上，但优选添加缓冲剂而使pH的前述差小于0.3。
前述Hb没有特别限定，例如可列举出血红蛋白A1a(HbA1a)、血红蛋白A1b(HbA1b)、稳定型血红蛋白A1c(稳定型A1c、s-A1c)、不稳定型血红蛋白A1c(不稳定型A1c，L-A1c)等糖化血红蛋白，氨基甲酰化血红蛋白(氨基甲酰化Hb)，乙酰化血红蛋白(乙酰化Hb)等修饰血红蛋白；血红蛋白S(HbS)、血红蛋白C(HbC)、血红蛋白M(HbM)、血红蛋白H(HbH)等突变型血红蛋白；正常血红蛋白(HbA0)；胎儿血红蛋白(HbF)；HbA2等。本发明例如能够以高精度且短时间分离并检测HbA1c和其他Hb。因此，本发明的分析对象例如优选包含HbA1c，更优选包含HbA1c及修饰Hb。
除前述Hb以外，本发明还可以以其他成分为分析对象。前述其他成分没有特别限制，例如可列举出白蛋白(A1b)、球蛋白(α1、α2、β、γ球蛋白)、纤维蛋白原、葡萄糖、糖化白蛋白等。
本发明的分析方法中，利用电泳法的Hb的分离例如可以在分离用毛细管流道中实施。这种情况下，前述电泳法也称为毛细管电泳法。前述分析方法例如优选通过连续试样导入法实施，连续试样导入法通常是将含有Hb的试样液连续地导入到前述分离用毛细管流道中的方法。
前述分离用毛细管流道没有特别限制，例如可列举出毛细管、形成于微芯片等基板上的毛细管流道等。因此，前述分析方法也可以是，例如前述分离用毛细管流道形成于微芯片上，前述电泳法为微芯片电泳法。此外，前述分析方法也可以是，例如前述分离用毛细管流道为毛细管，前述电泳法为毛细管电泳法。
本发明的分析方法中，例如也可以使用具备毛细管、毛细管流道的微芯片等作为具备前述分离用毛细管流道的装置。前述具备分离用毛细管流道的装置例如可以自己制作，也可以使用市售品。
首先，对前述毛细管进行以下说明。本发明并不限定于此。
前述毛细管的内径没有特别限定，例如为10～200μm，优选为25～100μm。前述毛细管的长度没有特别限定，例如为10～1000mm，优选为15～300mm。
前述毛细管的材质没有特别限定，例如可列举出玻璃、聚合物等。前述毛细管例如可以使用市售品。前述玻璃没有特别限制，例如可列举出合成石英玻璃、熔融二氧化硅、硼硅酸玻璃等。前述聚合物没有特别限制，具体而言，例如可列举出聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)、环烯烃聚合物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乳酸等。
前述毛细管的内壁例如可以被具有阳极性基团的包覆剂或具有阴极性基团的包覆剂包覆。
前述具有阳极性基团的包覆剂例如可以使用含有前述阳极性基团及反应基的化合物。前述反应基可列举出例如甲硅烷基(例如烷基甲硅烷基以及烷氧基甲硅烷基)、烷氧基、卤素基团等。前述烷氧基可列举出例如甲氧基、乙氧基等。前述卤素基团可列举出例如氟基、溴基、氯基、氟、碘基等，优选为氯基。如前所述，例如，前述毛细管为玻璃制的情况下，前述具有阳极性基团的包覆剂例如优选使用具有阳极性基团及硅的化合物(硅烷化剂)。前述阳极性基团例如可列举出氨基、铵基等。前述具有阳极性基团的包覆剂例如优选为具有氨基及铵基中的至少一种阳极性基团的硅烷化剂。前述氨基可以是伯氨、仲氨、叔氨中的任一种。通过使用前述具有阳极性基团的硅烷化剂作为前述具有阳极性基团的包覆剂，例如可进一步提高分析精度。
前述具有阳极性基团的硅烷化剂例如可列举出N-(2-二氨基乙基)-3-丙基三甲氧基硅烷、氨基苯氧基二甲基乙烯基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-氨基丙基甲基双(三甲基甲硅烷氧基)硅烷、3-氨基丙基五甲基二硅氧烷、3-氨基丙基硅烷三元醇、双(对氨基苯氧基)二甲基硅烷、1，3-双(3-氨基丙基)四甲基二硅氧烷、双(二甲基氨基)二甲基硅烷、双(二甲基氨基)乙烯基甲基硅烷、双(2-羟基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氰丙基(二异丙基)二甲基氨基硅烷、(氨基乙基氨基甲基)苯乙基三甲氧基硅烷、N-甲基氨基丙基三乙氧基硅烷、四(二乙基氨基)硅烷、三(二甲基氨基)氯硅烷、三(二甲基氨基)硅烷等。
作为前述具有阳极性基团的硅烷化剂，例如可以使用硅原子被钛或锆取代而得到的物质。前述具有阳极性基团的硅烷化剂例如可以单独使用一种，也可以并用两种以上。
使用前述具有阳极性基团的硅烷化剂时，前述毛细管的内壁的包覆例如可以如下进行。首先，将前述硅烷化剂溶解或分散到有机溶剂中而调制处理液。前述有机溶剂例如可列举出二氯甲烷、甲苯等。前述处理液中的前述硅烷化剂的浓度没有特别限定。将前述处理液通入到玻璃制的毛细管中，进行加热。通过该加热，前述硅烷化剂以共价键与前述毛细管的内壁键合。其结果是，前述硅烷化剂的前述阳极性基团配置于前述毛细管的内壁。然后，利用洗涤液来洗涤前述毛细管的内壁。前述洗涤液例如可以使用选自由有机溶剂、酸性溶液、碱性溶液及表面活性剂溶液组成的组中的至少一种。前述有机溶剂例如可列举出二氯甲烷、甲醇、丙酮等，前述酸性溶液可列举出磷酸溶液等。该洗涤是任选的，但优选实施。内壁被前述具有阳极性基团的硅烷化剂包覆而成的毛细管也可以使用市售品。
前述具有阴极性基团的包覆剂没有特别限制，例如可以使用前述含阴极性基团的化合物，其中，优选含阴极性基团及反应基的化合物。前述反应基可列举出例如甲硅烷基(例如烷基甲硅烷基以及烷氧基甲硅烷基)、烷氧基、卤素基团等。前述烷氧基可列举出例如甲氧基、乙氧基等。前述卤素基团可列举出例如氟基、溴基、氯基、氟、碘基等，优选为氯基。前述含阴极性基团及反应基的化合物例如可列举出具有阴极性基团及硅的化合物(硅烷化剂)等。前述具有阴极性基团的包覆剂例如优选具有阴极性基团的硅烷化剂。前述阴极性基团例如可列举出硫酸基、羧酸基、磺酸基、磷酸基等。通过使用前述具有阴极性基团的硅烷化剂作为前述具有阴极性基团的包覆剂，例如可以进一步提高分析精度。使用前述具有阴极性基团的硅烷化剂时，前述毛细管的内壁的包覆例如可以与利用前述具有阳极性基团的硅烷化剂的包覆同样地进行。
前述具有阴极性基团的硅烷化剂，例如可列举出氯磺酰基苯基乙基三甲氧基硅烷，氯磺酰基苯基乙基三氯硅烷等。
前述含阴极性基团的化合物除这些以外，例如还可列举出含阴极性基团的多糖类。前述含阴极性基团的多糖类可以使用与前述同样的多糖类。具有前述含阴极性基团的多糖类的包覆也可以与利用前述硅烷化剂的包覆同样地进行。此外，例如也可以通过采用现有的方法(例如参照日本专利2711112号等)，利用共价键包覆前述内壁。
使用前述毛细管时，本发明的分析方法例如可以如下实施。
首先，将含有前述酸性物质的泳动液通过泵等减压或加压，通入到前述毛细管中。通液的时间例如为1～60分钟，通液的压力例如为0.05～0.1MPa。
接下来，在前述毛细管内存在前述泳动液的状态下，将含有Hb的前述试样液导入到前述泳动液中。然后，对配置于前述毛细管两端的电极间施加电压，进行电泳。前述试样液的导入从前述毛细管的阳极侧进行。通过施加电压，在前述毛细管内的前述泳动液中产生电渗流，所导入的前述试样液中的Hb向前述毛细管的阴极侧移动。分析时，例如在前述泳动液中存在前述含阴极性基团的化合物的情况下，所导入的前述试样液中的Hb在与前述含阴极性基团的化合物形成复合体的状态下，向前述毛细管的阴极侧移动。对前述毛细管施加前述电压的程度例如为1～30kV。前述Hb的移动例如通过光学手段检测。前述利用光学手段的检测方法没有特别限制，例如优选在415nm的波长下进行。前述试样中的各Hb通过移动速度之差而分离。用检测器检测分离得到的前述试样液中的各Hb。本实施方式中，前述分离用毛细管流道中的、从前述试样液的泳动起始点到前述检测器所检测的检测点为止的长度称为分离长度。前述毛细管中的分离长度例如为10～1000mm，优选为15～300mm。
接着，对前述具备分离用毛细管流道的微芯片进行以下说明。本发明并不限定于此。
前述形成于微芯片上的分离用毛细管流道没有特别限制，例如可列举出在前述微芯片的基板上挖槽而形成的毛细管流道、埋设在形成于微芯片的基板上的槽内的毛细管等。
在前述基板上挖槽而形成的毛细管流道，例如其截面形状没有限制，可列举出圆形、半圆形、矩形等。前述截面形状例如是前述毛细管流道的沿着与试样的流向垂直的方向截断时的截面形状。前述毛细管流道的内壁例如可以与前述毛细管的内壁同样地进行包覆。
在前述基板上挖槽而形成的毛细管流道的材质没有特别限制。前述材质例如可列举出玻璃、聚合物等。前述玻璃没有特别限制，例如可列举出合成石英玻璃、熔融二氧化硅、硼硅酸玻璃等。作为前述聚合物，没有特别限制，例如可列举出聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃聚合物(COP)、聚碳酸酯(PC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)，聚乳酸、聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)等。由于其是在前述基板上挖槽而形成的，因此前述基板也可以是这些材质。
前述埋设在形成于基板上的槽内的毛细管的材质没有特别限定。前述材质例如可列举出与前述的毛细管同样的材质。此外，前述埋设的毛细管的内壁例如可以与前述毛细管同样地进行包覆。
前述微芯片中，前述分离用毛细管流道的内径的最大径例如为10～200μm，优选为25～100μm。其最大长度例如为0.1mm～15cm，优选为0.5mm～15cm。形成于前述微芯片上的前述分离用毛细管流道的内径的最大径，例如在前述分离用毛细管流道的截面形状为半圆形的情况下，是指前述半圆的直径，在前述分离用毛细管流道的截面形状不是半圆形的情况下，是指与截面积最大的部分的该截面积对应的面积的圆的直径。
使用形成于前述微芯片上的分离用毛细管流道的情况下，本发明的分析方法例如可以如下实施。
作为前述微芯片，使用基板上形成有两端具有溶液槽的分离用毛细管流道的微芯片。具体而言，前述基板具有前述分离用毛细管流道和前述两个溶液槽，前述流道的两端分别与前述溶液槽连通，为了能够施加电压而在前述流道的两端配置电极。前述基板中，前述溶液槽例如是设置于前述基板上的凹状的空隙。前述溶液槽中的一个是用于导入前述试样液的导入槽，另一个是流经前述分离用毛细管流道后的前述试样液所到达的回收槽。
前述分离用毛细管流道中填充有含前述酸性物质的泳动液。向形成于前述分离用毛细管流道的一端的前述导入槽中导入含有Hb的前述试样液后，对配置在前述分离用毛细管流道的两端的电极间施加电压。电压例如为0.5～10kV。通过该施加电压，前述试样液向形成于前述分离用毛细管流道的另一端的前述回收槽移动。前述Hb的移动例如通过光学手段而检测。前述利用光学手段的检测方法没有特别限制，例如优选在415nm的波长下进行。前述试样中的各Hb通过移动速度之差而分离。用检测器检测所分离得到的前述试样液中的各Hb。前述分离用毛细管流道中的分离长度例如为0.1mm～15cm，优选为0.5mm～15cm。这样，能够对前述试样液中的各成分进行分离、分析。通过使用前述微芯片，例如能够使分析装置更加小型化。
使用形成于前述微芯片上的分离用毛细管流道的情况下，本发明的分析方法例如并不限于连续地导入试样的前述电泳法，例如，也可以如下实施。只要没有特别说明，与前述方法相同。
作为前述微芯片，使用导入毛细管流道及分离用毛细管流道以十字状交叉地形成于基板上的微芯片。前述导入毛细管流道和前述分离用毛细管流道通过前述交叉部分连通。具体而言，前述基板具有前述导入毛细管流道、分离用毛细管流道和两个溶液槽，前述导入毛细管流道的一端与一侧的溶液槽连通，前述分离用毛细管流道的一端与另一侧的溶液槽连通，为了能够施加电压而在前述导入毛细管流道的两端及前述分离用毛细管流道的两端分别配置电极。与前述导入毛细管流道连通的前述溶液槽为用于导入前述试样液的导入槽，与前述分离用毛细管流道连通的前述溶液槽是流经前述分离用毛细管流道后的前述试样液所到达的回收槽。
前述导入毛细管流道及前述分离用毛细管流道中填充有含有前述酸性物质的泳动液。向形成于前述导入毛细管流道的一端的前述导入槽中导入含有Hb的前述试样液后，对配置在前述导入毛细管流道的两端的电极间施加电压。电压例如为0.5～10kV。通过该施加电压，前述试样液移动至前述交叉部分。再对配置于前述分离用毛细管流道的两端的电极间施加电压。电压例如为0.5～10kV。通过该施加电压，前述试样液向形成于前述分离用毛细管流道的一端的前述回收槽移动。前述Hb的移动例如通过光学手段而检测。前述利用光学手段的检测方法没有特别限制，例如优选在415nm的波长进行。前述试样中的各Hb通过移动速度之差而分离。用检测器检测所分离得到的前述试样液中的各Hb。本实施方式中，从前述分离用毛细管流道中的前述交叉部分、即分离用毛细管流道中的前述试样液的泳动起始点到利用前述检测器的检测点为止的长度称为前述分离长度。前述分离用毛细管流道中的分离长度例如为0.1mm～15cm，优选为0.5mm～15cm。这样，能够对前述试样液中的各成分进行分离、分析。通过使用前述微芯片，例如能够使分析装置更加小型化。
其次，如前所述，本发明的分析试剂盒含有前述本发明的分离改善剂。本发明的分析试剂盒例如除此以外还可以含有泳动液、缓冲剂、添加剂、表面活性剂、稳定化剂等。本发明的分析试剂盒例如还可以具备前述分离用毛细管流道。前述分离用毛细管流道例如与前述相同，可列举出毛细管、形成于基板上的毛细管流道等，作为后者，例如可列举出微芯片。本发明的分析试剂盒例如还可以具备使用说明书。
实施例
以下，结合比较例对本发明的实施例进行说明。本发明并不限制于下述实施例及比较例。
实施例1
本例中，作为前述分离改善剂，使用作为前述酸性物质的环己烷羧酸，分析了含有氨基甲酰化Hb的试样液。
调制组成如下表所示的泳动液。首先，调制下述L-酒石酸-精氨酸水溶液作为缓冲液，向其中添加各种成分，从而调制前述泳动液。前述泳动液中，前述分离改善剂使用作为前述环己烷羧酸的CyDTA(pKa1＝2.42，pKa2＝3.53)、1，1-环己烷二乙酸、1，2，4-环己烷三羧酸(pKa1＝2.6，pKa2＝4.59)及1，2，3，4，5，6-环己烷六羧酸一水合物。L-酒石酸的酸解离常数为：pKa1＝3.02，pKa2＝4.54。
[表1]
(泳动液：pH4.8)
成分浓度
L-酒石酸-精氨酸※水溶液100mmol/L
硫酸软骨素C1.0w/v％
叠氮化钠1mmol/L
Triton(注册商标)X-1000.01w/v％
丙酸2mmol/L
分离改善剂2mmol/L
※添加精氨酸用于调节pH
此外，作为用于调制试样液的稀释液，分别调制了将前述各泳动液设定为1.1倍浓度的溶液(pH4.8)。
向Hb对照样品(BML公司制造)中添加氰酸钠使其为10mg/100mL，在37℃下反应2小时。通过该反应，将Hb氰化。将该反应液与前述各稀释液以1∶10的体积比混合，调制成试样液(pH4.8)。
使用具有分离用毛细管流道(全长35mm，内径50μm)的PMMA制微芯片。向前述微芯片的前述分离用毛细管流道中通入0.01重量％的海藻酸水溶液，对前述分离用毛细管流道的内壁进行包覆处理。
将前述泳动液在0.1MPa(1000mbar)的加压下填充到前述毛细管流道中，然后将前述试样液注入到前述毛细管流道的阳极侧。对配置于前述毛细管流道的两端的电极间施加1400V的电压，使前述试样液进行电泳。使用分光光度计，在检测点处，测定415nm下的吸光度。本例中，以距离前述试样液的注入位置20mm的阴极侧作为检测点，分离长度为20mm。制作表示检测时间与吸光度的关系的图表，用下式算出稳定型HbA1c(s-A1c)与修饰Hb(本例中为氨基甲酰化Hb)的峰的分离度。
分离度＝1.18×(t2-t1)/(p1+p2)
t1＝修饰Hb的峰的检测时间
t2＝稳定型HbA1c的峰的检测时间
p1＝修饰Hb的峰的峰半值宽度※
p2＝稳定型HbA1c的峰的峰半值宽度※
※峰半值宽度：峰高中点处的峰宽
图1的图表中示出了实施例1的检测结果。图1中，(A)表示添加L-酒石酸及CyDTA得到的结果，(B)表示添加L-酒石酸及1，1-环己烷二乙酸得到的结果，(C)表示添加L-酒石酸及1，2，4-环己烷三羧酸得到的结果。图1的图表中，粗线表示415nm下的吸光度，细线表示梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)。这些图表中，左边的纵轴为415nm下的吸光度值(mAbs)，右边的纵轴为梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)，横轴为时间(秒)。这些图表中，箭头所指示的峰从左侧起依次为修饰Hb(氨基甲酰化Hb)及稳定型HbA1c(s-A1c)。
如图1的(A)～(C)所示，实施例1中，s-A1c及氨基甲酰化Hb的峰在测定开始后约40秒以内被分离并检测到。在(A)添加L-酒石酸及CyDTA的情况下、(B)添加L-酒石酸及1，1-环己烷二乙酸的情况下、(C)添加L-酒石酸及1，2，4-环己烷三羧酸的情况下，分离度均为1.3。特别是如图1的(A)及(B)所示，在(A)添加L-酒石酸和CyDTA或(B)添加L-酒石酸和1，1-环己烷二乙酸的情况下，s-A1c及氨基甲酰化Hb的峰得到更明显的分离，在测定开始后约30秒以内被检测到。此外，虽未图示，但在添加1，2，3，4，5，6-环己烷六羧酸一水合物的情况下，s-A1c及氨基甲酰化Hb也同样地分离并被检测到，分离度为1.2。另外，实施例1中，分析时的前述泳动液的pH为4.8。这样，通过添加前述酸性物质，s-A1c及氨基甲酰化Hb的分离精度提高，分析时间缩短。
实施例2
本例中，使用人全血来代替Hb对照样品，为了将Hb醛化，使用乙醛来代替前述氰酸钠。并且，除了将乙醛以10mg/100mL的方式添加到人全血中以外，与前述实施例1同样地调制了试样液(pH4.8)。除了使用该试样液以外，与实施例1同样地进行分析。
图2的图表中示出了实施例2中添加CyDTA时的检测结果。图2的图表中，粗线表示415nm下的吸光度，细线表示梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)。图2的图表中，左边的纵轴为415nm下的吸光度值(mAbs)，右边的纵轴为梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)，横轴为时间(秒)。图2的图表中，箭头所指示的峰从左侧起依次为修饰Hb(醛化Hb)及稳定型HbA1c(s-A1c)。
如图2所示，实施例2中，添加CyDTA的结果是，s-A1c及醛化Hb的峰在测定开始后约30秒以内分离并被检测到。此外，虽未图示，但在添加前述实施例1中使用的其它环己烷羧酸的情况下，与CyDTA同样，s-A1c及醛化Hb也分离并被检测到。如图2所示，特别是在添加CyDTA的情况下，s-A1c及醛化Hb的峰得到更明显的分离。另外，实施例2中，分析时的泳动液的pH为4.8。这样，通过添加前述酸性物质，s-A1c及醛化Hb的分离精度提高。
实施例3
本例中，使用人全血来代替Hb对照样品，为了将Hb糖化，使用葡萄糖来代替前述氰酸钠。并且，除了将葡萄糖以1500mg/100mL的方式添加到人全血中以外，与前述实施例1同样地调制了试样液(pH4.8)。除了使用试样液以外，与实施例1同样地进行分析。
图3的图表中示出了实施例3中添加CyDTA时的检测结果。图3的图表中，粗线表示415nm下的吸光度，细线表示梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)。图3的图表中，左边的纵轴为415nm下的吸光度值(mAbs)，右边的纵轴为梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)，横轴为时间(秒)。图3的图表中，箭头所指示的峰从左侧起依次为不稳定型A1c(L-A1c)及稳定型A1c(s-A1c)。
如图3所示，实施例3中，添加CyDTA的结果是，s-A1c及不稳定型A1c的峰在测定开始后约30秒以内分离并被检测到。此外，虽未图示，但在添加前述实施例1中使用的环己烷羧酸以外的环己烷羧酸的情况下，与CyDTA同样地，s-A1c及不稳定型A1c也分离并被检测到。如图3所示，特别是在添加CyDTA的情况下，s-A1c及不稳定型A1c的峰得到更明显的分离。另外，实施例3中，分析时的泳动液的pH为4.8。这样，通过添加前述酸性物质，s-A1c及不稳定型A1c的分离精度提高。
实施例4
本例中，作为前述分离改善剂，使用L-谷氨酸(pKa1＝2.18，pKa2＝4.20)来代替前述环己烷羧酸，除此以外，与实施例1同样地进行了分析。
图4的图表中示出了实施例4的检测结果。图4的图表中，粗线表示415nm下的吸光度，细线表示梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)。图4的图表中，左边的纵轴为415nm下的吸光度值(mAbs)，右边的纵轴为梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)，横轴为时间(秒)。图4的图表中，箭头所指示的峰从左侧起依次为修饰Hb(氨基甲酰化Hb)及稳定型HbA1c(s-A1c)。
如图4所示，实施例4中，添加L-谷氨酸的结果是，s-A1c及氨基甲酰化Hb的峰在测定开始后约35秒以内分离并被检测到。其分离度为1.24。另外，实施例4中，分析时的泳动液的pH为4.8。这样，通过添加前述酸性物质，s-A1c及氨基甲酰化Hb的分离精度提高，分析时间缩短。
实施例5
本例中，在前述表1的泳动液的组成中，不添加前述分离改善剂，代替作为缓冲剂的L-酒石酸，以100mmol/L的方式添加作为前述酸性物质的D-酒石酸，调制了泳动液。此外，根据该泳动液的组成，与前述实施例1同样地调制了稀释液。除了使用前述泳动液及前述稀释液以外，与实施例1同样地进行了分析。此外，D-酒石酸的酸解离常数为：pKa1＝2.82，pKa2＝3.96。
图5的图表中示出了实施例5的检测结果。图5的图表中，粗线表示415nm下的吸光度，细线表示梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)。图5的图表中，左边的纵轴为415nm下的吸光度值(mAbs)，右边的纵轴为梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)，横轴为时间(秒)。图5的图表中，箭头所指示的峰从左侧起依次为修饰Hb(氨基甲酰化Hb)及稳定型HbA1c(s-A1c)。
如图5所示，实施例5中，添加D-酒石酸的结果是，s-A1c及氨基甲酰化Hb的峰在测定开始后约35秒以内分离并被检测到。另外，实施例5中，分析时的泳动液的pH为4.8。这样，通过添加D-酒石酸，s-A1c及氨基甲酰化Hb的分析精度提高，分析时间缩短。
比较例1
本例中，在前述表1的泳动液的组成中，不添加前述分离改善剂，作为缓冲液，使用100mmol/L戊二酸-精氨酸水溶液或100mmol/L丙酸-精氨酸水溶液来代替L-酒石酸-精氨酸水溶液，调制了泳动液。此外，根据该泳动液的组成，与前述实施例1同样地调制了稀释液。除了使用前述泳动液及前述稀释液以外，与实施例1同样地进行了分析。戊二酸具有2个羧基，前述羧基的酸解离常数为：pKa1＝4.13，pKa2＝5.01。此外，丙酸仅具有1个羧基，酸解离常数为pKa4.86。
图6的图表中示出了比较例1的检测结果。图6中，(A)为使用戊二酸-精氨酸水溶液得到的结果，(B)为使用丙酸-精氨酸水溶液得到的结果。图6的图表中，粗线表示415nm下的吸光度，细线表示梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)。两图表中，左边的纵轴为415nm下的吸光度值(mAbs)，右边的纵轴为梯度(吸光度变化率，mAbs/秒)，横轴为时间(秒)。图6的(A)的图表中，箭头所指示的峰从左侧起依次为修饰Hb(氨基甲酰化Hb)及稳定型HbA1c(s-A1c)。
如图6的(A)所示，在使用戊二酸-精氨酸水溶液的情况下，s-A1c及氨基甲酰化Hb的峰较低且宽，未能分离和检测。其分离度为0.5。如图6的(B)所示，在使用丙酸-精氨酸水溶液的情况下，未检测到峰。另外，比较例1中，分析时的泳动液的pH为5.0。这样，在戊二酸或丙酸的存在下，未能分离和检测s-A1c及氨基甲酰化Hb。
由前述实施例1～5及前述比较例1的结果表明，通过在前述酸性物质的存在下对试样液进行电泳，从而使Hb的分离精度提高，分析时间缩短。特别是稳定型HbA1c(s-A1c)与修饰Hb或不稳定型A1c的分离精度提高。
如上所述，本发明例如能够提高HbA1c及修饰血红蛋白等Hb的分析精度，缩短分析时间。本发明例如可以应用于临床检查、生化检查、医学研究等分析血红蛋白的全部领域中，其用途没有限定，可以应用于广泛的领域中。
应理解，上述讨论和实施例仅展示一些示例性实施方案的具体描述。因此，对于本领域普通的技术人员而言应显而易见，在没有脱离本发明精神和宗旨的情况下，可以进行改进和等同改变。在本申请中示出的所有期刊文献、其它参考文献、专利和专利申请以其整体引入以作参考。
Claims (15)
1.一种利用电泳法的血红蛋白的分析方法，其特征在于，在泳动液中含有具有两个以上羧基的酸性物质的条件下，在分离用毛细管流道中实施用于分离试样中的血红蛋白的电泳，
前述泳动液含有缓冲剂及分离改善剂，
前述分离改善剂包括前述酸性物质，
前述酸性物质为反式-1,2-环己二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(CyDTA)、1,1-环己烷二乙酸、(1α,2α,4α)-1,2,4-环己烷三羧酸、1,2,3,4,5,6-环己烷六羧酸一水合物和L-谷氨酸中的至少一者，
由前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKa)减去前述分离改善剂中的前述酸性物质的羧基的第二酸解离常数(pKa2)得到的差为0.2以上，
前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，前述酸性物质的两个以上的羧基的各酸解离常数(pKa)比分析时的前述泳动液的pH低0.7以上。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，前述泳动液含有缓冲剂，前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKa)为分析时的前述泳动液的pH-0.3的值以上。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，含有血红蛋白的试样液的pH与前述泳动液的pH之差小于0.3。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，前述酸性物质为具有环己烷环的结构。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，通过连续试样导入法实施分离，所述连续试样导入法将含有血红蛋白的试样液连续地导入到前述分离用毛细管流道中。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，前述分离用毛细管流道形成于微芯片上，
前述电泳法为微芯片电泳法。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，前述分离用毛细管流道为毛细管，
前述电泳法为毛细管电泳法。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，前述血红蛋白为血红蛋白A1c。
10.根据权利要求9所述的分析方法，其特征在于，前述血红蛋白A1c为稳定型血红蛋白A1c及不稳定型血红蛋白A1c中的至少一种。
11.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，前述血红蛋白为选自由氨基甲酰化血红蛋白、醛化血红蛋白及乙酰化血红蛋白组成的组中的至少一种修饰血红蛋白。
12.一种泳动液试剂，其含有用于权利要求1所述的分析方法的分离改善剂，
在泳动液中含有具有两个以上羧基的酸性物质的条件下，在分离用毛细管流道中实施用于分离试样中的血红蛋白的电泳，
前述泳动液含有缓冲剂及分离改善剂，
前述分离改善剂包括前述酸性物质，
前述酸性物质为反式-1,2-环己二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(CyDTA)、1,1-环己烷二乙酸、(1α,2α,4α)-1,2,4-环己烷三羧酸、1,2,3,4,5,6-环己烷六羧酸一水合物和L-谷氨酸中的至少一者，
由前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKa)减去前述分离改善剂中的前述酸性物质的羧基的第二酸解离常数(pKa2)得到的差为0.2以上，
前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。
13.一种用于权利要求1所述的分析方法的分离改善剂，其特征在于，其含有具有两个以上羧基的酸性物质，在泳动液中含有具有前述酸性物质的条件下，在分离用毛细管流道中实施用于分离试样中的血红蛋白的电泳，前述泳动液含有缓冲剂及前述分离改善剂，
前述酸性物质为反式-1,2-环己二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(CyDTA)、1,1-环己烷二乙酸、(1α,2α,4α)-1,2,4-环己烷三羧酸、1,2,3,4,5,6-环己烷六羧酸一水合物和L-谷氨酸中的至少一者，
由前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKa)减去前述分离改善剂中的前述酸性物质的羧基的第二酸解离常数(pKa2)得到的差为0.2以上，
前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。
14.一种分析试剂盒，其特征在于，其含有权利要求13所述的分离改善剂。
15.一种用于权利要求7所述的分析方法的微芯片，其特征在于，其包括分离用毛细管流道及多个液槽，在分离用毛细管流道中实施用于分离试样中的血红蛋白的电泳，
前述多个液槽被前述分离用毛细管流道连通，
前述分离用毛细管流道及前述液槽中的至少一者填充有泳动液，
前述泳动液含有具有两个以上羧基的酸性物质，
前述泳动液含有缓冲剂及分离改善剂，
前述分离改善剂包括前述酸性物质，
前述酸性物质为反式-1,2-环己二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(CyDTA)、1,1-环己烷二乙酸、(1α,2α,4α)-1,2,4-环己烷三羧酸、1,2,3,4,5,6-环己烷六羧酸一水合物和L-谷氨酸中的至少一者，
由前述缓冲剂的与缓冲能力相关的酸解离常数(pKa)减去前述分离改善剂中的前述酸性物质的羧基的第二酸解离常数(pKa2)得到的差为0.2以上，
前述酸性物质的至少两个羧基的酸解离常数(pKa)低于分析时的前述泳动液的pH。
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