WO2004063752A1 - 微粒子表面電荷制御剤を含む組成物、それを利用した微粒子分離方法および微粒子分離装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料中の目的の微粒子の表面電荷量を改変し、当該改変された表面電荷量に基づいて、当該試料中の当該目的の微粒子を分離または定量するための組成物であって、溶液中で正または負の電荷を有し、当該目的の微粒子に特異的に結合し得る電荷制御剤を含む、組成物に関する。本発明はまた、試料中の目的の微粒子を分離または定量する方法に関する。この方法は、目的の微粒子を含む試料と、当該目的の微粒子に特異的に結合し、かつ当該試料中で正または負の電荷を有する電荷制御剤とを混合し、それにより当該目的の微粒子に当該電荷制御剤を結合させる、混合工程、および前記混合して得られた試料に電圧または電流を印加し、前記電荷制御剤が結合した前記目的の微粒子を、当該電荷制御剤の結合によって改変された表面電荷に基づいて分離または定量する工程、を包含する。

Description

明細書 微粒子表面電荷制御剤を含む組成物、 それを利用 し た微粒 子分離方法および微粒子分離装置 技術分野

本発明は、 微粒子の表面電荷を制御するための組成物、 それを利用 して微粒子を分離する方法、 および微粒子分離 装置に関する。 背景技術

細胞、 ノ ク テ リ ア、 ウィ ルス 、 有機あ る い は無機ポ リ マ 一な どの微粒子を分離する ため の方法と して、 イ オ ン交換 液体ク ロ マ ト グラ フ ィ ーおよび電気泳動を利用する方法が 知 ら れてい る 。 これ ら の方法は、 測定対象物であ る上記そ れぞれの微粒子の表面電荷の差を利用 して、 固相 と の電気 的相互作用 あ る いは電気移動度に よ っ て分離する。 例え ば

、 キ ヤ ビ ラ リ 一電気泳動デバイ ス を利用 して T リ ンパ細胞 と B リ ンパ細胞を分離 した報告 （ 日 本ェム · ィ 一学会雑誌 、 V o l . 1 5 、 N o . 1 0 ( 2 0 0 1 ) 、 p 1 2 - 1 6 ) があ るが、 それぞれの細胞は完全には分離さ れてお ら ず 、 簡便かつ正確な微粒子分離技術が求め ら れてい る 。

一方、 微粒子表面 を修飾 して、 その表面電荷を人為的 に 変化させる方法が知 ら れてい る 。

例えば、 タ ンパク 質を電気泳動法で分析する 際に、 ド デ シル硫酸ナ ト リ ウ ム （ S D S と 略記） を タ ンパク表面に疎 水結合的に結合さ せて分離する方法 （ S D S 電気泳動法） は周知であ る 。

また、 細胞の活動度を測定する ため に、 細胞内 ま たは細 胞破碎液に標識化 (例えば、 蛍光も し く は放射性物質 によ る標識） した基質を注入する と い う 方法が知 ら れてい る。 標識化 した基質を細胞内へ注入する と 、 細胞内 に存在 して い る酵素によ り その基質が改変 （例えば、 燐酸化） さ れる ため、 基質の表面電荷が変化する 。 そのため、 基質の細胞 内 または細胞破碎液への注入の前後において、 その基質の 電気移動度が変化する ため、 キ ヤ ビ ラ リ ー電気泳動法によ り 、 その変化 した基質量を測定する こ と によ り 細胞の活動 度を検出する こ とができ る （例えば、 米国特許出願公開第

2 0 0 2 / 0 1 4 2 3 2 3 A 1 号明細 よび米国特許 出願公開第 2 0 0 2 / 0 0 3 7 5 4 2 A 1 号明細書を参照

発明の開示

上記の 日 本ェム ' ィ 一学会雑誌、 V o l . 1 5 、 N o . 1 0 ( 2 0 0 1 ) 、 p 2 _ 7 に記載さ れる従来技術を利用 した場合、 測定対象 と な る微粒子を、 それ自 身の表面電荷 のみに依存 して分離する ため、 夾雑物質 と の分離が不十分 であ る場合が多 く 見 ら れる 。 こ れは、 異な っ た微粒子のそ れぞれの表面を構成する物質の間 に著 し い差がな く 、 しか もそれ ら物質の有する電荷が比較的弱いため、 微粒子を電 気的に分離 し ょ う と して もそれ ら の電気移動度に有意な差 が生 じな いためであ る。 一方、 上記 S D 泳動法は、 S D S を蛋白質表面に 非特異的に結合する ため、 原則的 に蛋白質の大き さ に依存 して結合する S D S 量が変化する 。 よ つ て、 人為的に結合 量を制御する こ とが不可能であ る と い 問題があ る 。 また

、 S D S はイ オン性の界面活性剤であ り 、 蛋白質を は じ め とする生体物質を変性させて し ま う ため、 現在では変性 し た蛋白質に対 してのみ利用 さ れる方法であ る 。

また、 上記細胞活動度測定法では、 細胞中 の酵素を利用 して基質の表面電荷を変化させてお り 、 細胞内酵素の量お よび、 種類によ り 表面電荷量が制御されてお り 、 人為的に 電荷制御できない と い う 欠点があ つ た また、 こ の方法は 、 細胞中 の酵素及び、 その酵素 と反応する基質のみを利用 する ため、 細胞表面を修飾する こ と ち 、 細胞表面電荷を変 化させる こ と もできない

本発明は、 上記従来技術の課題を解決する手段を提供す る 。

本発明は 、 1 つ の局面にお いて、 試料中 の 目 的の微粒子 の表面電荷量を改変 し、 その改変さ れた表面電荷量に基づ いて、 試料中 の 目 的の微粒子を分離または定量する ため の 組成物を提供する 。 こ の組成物は、 溶液中で正また は負 の 電荷を有 し、 当該 目 的の微粒子に特異的に結合 し得る電荷 制御剤を含んでい る 。

本発明の組成物の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御 剤は、 目 的の微粒子表面上に存在する 、 有機ポ リ マー、 夕 ンパ ク 質、 糖、 脂質、 およ び核酸か ら なる群か ら選択さ れ る 生体機能性物質に特異的 に結合する 。 本発明 の組成物の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御 剤は、 力 ルポ ン酸基、 リ ン酸基、 スルホ ン酸基、 フ エ ノ ー ル基、 アルコ一ル基、 3 級ァ ミ ノ 基、 および 4 級ァ ミ ノ 基 カゝ ら なる群か ら選択される基を含む。

本発明の組成物の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御 剤は、 目 的の微粒子に特異的に結合 し得る タ ンパク 質、 ぺ プチ ド 、 または核酸を含む。 好ま し く は、 前記核酸は、 ァ プタ マ一またはその機能的等価物であ る 。 さ ら に好ま し く は、 上記電荷制御剤は、 溶液中で正または負の電荷を有す る fe B¾物質を さ ら に含む。

本発明の組成物の さ ら に好ま し い実施形態では、 上記電 荷制御剤は、 上記生体機能性物質に特異的に結合し得る抗 体またはその機能的等価物 と 、 上記標識物質 と が結合 して 成る複合体であ る

別の さ ら に好ま し い実施形態では、 上記電荷制御剤は、 上記 目 的の微粒子表面に存在する レセプタ ー に対する リ ガ ン ド またはその機能的等価物 と 、 上記標識物質 とが結合 し て成る複合体であ る。 好ま し く は、 上記 リ ガ ン ド は、 ぺプ チ ド ホルモ ン、 増殖因子、 サイ ト カ イ ン、 また は力 テコ 一 ルア ミ ンであ る 。

別の さ ら に好ま し い実施形態では、 上記電荷制御剤は、 ァプタ マー ま たはその機能的等価物 と 、 上記標識物質 と が 結合 して成る複合体であ る 。

好ま し く は、 上記標識物質は、 色素標識、 金コ ロ イ ド 、 または ラ テ ツ ク ス であ る 。

好ま し く は、 上記色素標識は、 ア ミ ノ エチル 4 _ ア ジ ド ベンズア ミ ド三ナ ト リ ウム塩、 または N — ( 3 — ト リ ェチ ルア ンモニゥム プロ ピル） 一 4 一 （ 4 一 （ジォク タ デシル ァ ミ ノ ） スチ リ ル） ピ リ ジニゥム ジー 4 一 ク ロ 口 ベ ンゼン スルホネ一 ト であ る 。

本発明の組成物の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御 剤は、 上記 目 的の微粒子に可逆的に結合する 。

本発明の組成物の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御 剤は、 イ オ ン結合ま たは水素結合によ っ て前記 目 的の微粒 子に特異的に結合する。

本発明の組成物の好ま し い実施形態では、 目 的の微粒子 は、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および赤血球か ら な る群 か ら選択さ れる細胞であ る 。 好ま し く は、 上記 リ ンパ球は 、 T細胞、 B 細胞、 または N K細胞のいずれかであ る 。

本発明の組成物は、 好ま し く は、 被検体の免疫機能を検 査する ため に使用 さ れる 。

本発明の組成物は、 好ま し く は、 被検体の疲労ま たは被 検体が受けてい る ス ト レス の程度を検査する ため に使用 さ れる 。

本発明の組成物は、 好ま し く は、 被検体がウィ ルス感染 してい る か否か を検査する ため に使用 さ れる 。

本発明の組成物の好ま し い実施形態では、 目 的の微粒子 は、 細菌、 ウィ ルス 、 ま たは真菌のいずれかであ る 。 好ま し く は、 前記細菌は、 病原性大腸菌、 サルモネ ラ菌、 エル シニア菌、 腸炎 ビブ リ オ菌、 セ レウス菌、 カ ン ピ ロ ノ ク タ 一、 ウエルシュ菌、 および黄色ブ ド ウ球菌か ら なる 群か ら 選択さ れる 。 本発明の組成物は、 好ま し く は、 食中毒の予防ま たは検 査のため に使用 さ れる。

本発明は、 別の局面において、 試料中 の 目 的の微粒子の 表面電荷量を改変 し、 当該改変さ れた表面電荷量に基づい て、 当該試料中の 該目 的の微粒子を分離または定量する ため の電荷制御剤の製造方法を提供する

本発明の電荷制御剤の製造方法は、 目 的の微 ^IL 椅 的に結合 し得る 夕 ンパク 質 も し く は核酸、 またはそれ ら の 機能的等価物に、 液中で正ま たは負の電荷を有 し得る標 識物質を結合させるェ程を包含する こ と を特徴 とする。

本発明の電荷制御剤の製造方法の好ま し い実施形態では 、 上記夕 ンパ ク 質 し ぐ は核酸、 またはそれ ら の機能的等 価物は、 目 的の微粒子表面上に存在する有機ポ リ マー、 夕 ンパク 質、 糖、 脂 、 お よび核酸か ら なる群か ら選択さ れ る 生体機能性物質 特異的に結合する。

本発明の電荷制御剤の製造方法の さ ら に好ま し い実施形 態では、 上記タ ン ク質は、 抗体であ る

本発明の電荷制御剤の製造方法の さ ら に好ま し い実施形 態では、 上記核酸は、 ァ プタ マーであ る

本発明 の電荷制御剤の製造方法の さ ら に好ま し い実施形 態では、 上記タ ンパク 質は、 目 的の微粒子表面に存在する レセ プ夕 一 に対する リ ガ ン ド であ る。

本発明 の電荷制御剤の製造方法の好ま し い実施形態では 、 上記標識物質は 力ルボ ン酸基、 リ ン酸基、 スルホ ン酸 基、 フ エ ノ 一ル基 ァルコ ール基、 3 級ァ ミ ノ 基、 お よび

4 級ア ミ ノ 基力、 ら な る群か ら 選択さ れる基を含む。 本発明 の電荷制御剤の製造方法の好ま し い実施形態では 、 上記標識物質は、 色素標識、 金コ ロ イ ド 、 ま たはラテ ツ ク スであ る 。 好ま し く は、 前記色素標識は、 ア ミ ノ エチル

4 ー ァジ ドベ ンズア ミ ド三ナ ト リ ウム塩、 または N — ( 3 一 卜 U ェチルア ンモニゥム プロ ピル） - 4 - ( 4 - (ジォ ク 夕デシルァ ミ ノ ） スチ リ ル） ピ リ ジニゥム ジ 一 4 — ク ロ 口 ベ ンゼンスルホネー ト であ る

本発明の電荷制御剤の製造方法の好ま し い実施形態では 、 目 的の微粒子は、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および赤 血球か ら なる群か ら選択さ れる細胞であ る 。

本発明の電荷制御剤の製造方法の別の好ま し い実施形態 では、 目 的の微粒子は、 細菌、 ウィ ルス 、 または真菌の い ずれかであ る

本発明の電荷制御剤の製造方法の好ま し い実施形態では 、 夕 ンパ ク 質 も し く は核酸、 またはそれ ら の機能的等価物 に対して 結合させる前記標識物質の割合または量を調節 し得る

本発明はさ ら に別の局面において、 試料中 の 目 的の微粒 子を分離ま /こは定量する方法を提供する 。 こ の方法は、 目 的の微粒子を含む試料 と 、 当該 目 的の微粒子に特異的に結 合 し、 かつ 当該試料中で正ま たは負の電荷を有する電荷制 御剤 と を混合 し、 それに よ り 当該目 的の微粒子に当該電荷 制御剤 を結合さ せる 、 混合工程、 およびその よ う に混合 し て得 ら 1 9 料に電圧ま たは電流を印加 し 、 上記電荷制御 剤が結合 した 目 的の微粒子を、 当該電荷制御剤 の結合に よ つ て改変さ れた表面電荷に基づいて分離または定量する ェ 程を包含する こ と を特徴 とする 。

好ま し く は、 上記混合工程は、 複数種の微粒子の各々 の 種について別個 に独立 して行われる。

好ま し く は、 上記混合工程は、 複数種の微粒子の各々 の 種につ いて互い に異な る電荷制御剤を用 いて行われる。

本発明の分離また は定量方法の好ま し い実施形態では、 上記 目 的の微粒子は、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および 赤血球か ら な る群か ら選択さ れる細胞、 または細菌、 ウイ ルス 、 および真菌か ら な る群か ら選択さ れる微生物であ る 本発明の分離または定量方法のさ ら に好ま し い実施形態 では、 上記電荷制御剤は、 目 的の微粒子表面上に存在する 、 有機ポ リ マ一、 タ ンパク 質、 糖、 脂質、 お よ び核酸か ら なる群か ら選択さ れる 生体機能性物質に結合する。

本発明の分離また は定量方法のさ ら に好ま し い実施形態 では、 上記電荷制御剤は、 目 的の微粒子に特異的に結合 し 得る タ ンパ ク 質、 ペプチ ド、 または核酸を含む。

本発明の分離または定量方法の さ ら に好ま し い実施形態 では、 上記核酸は、 ア ブタ マ一またはその機能的等価物で あ る 。

本発明の分離または定量方法の さ ら に好ま し い実施形態 では、 上記電荷制御剤は、 溶液中で正または負 の電荷を有 する標識物質 を さ ら に含む。

本発明の分離また は定量方法の さ ら に好ま し い実施形態 では、 上記電荷制御剤は、 上記生体機能性物質 に特異的に 結合 し得る抗体ま た はその機能的等価物 と 、 上記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 。

本発明 の分離または定量方法の さ ら に別の好ま し い実施 形態では、 上記電荷制御剤は、 上記 目 的の微粒子表面に存 在する レセプ夕一 に対する リ ガ ン ド またはその機能的等価 物 と 、 上記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 。 さ ら に好ま し く は、 上記 リ ガ ン ド は、 ペプチ ド ホルモ ン、 増殖 因子、 サイ ト 力イ ン、 ま たはカ テ コ ールア ミ ンであ る。

本発明の分離ま たは定量方法の さ ら に別の好ま し い実施 形態では、 上記電荷制御剤は、 ア ブタ マ一またはその機能 的等価物 と、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 本発明の分離ま たは定量方法の さ ら に好ま し い実施形態 では、 上 G標識物質は、 色素 ¾¾ B欺、 金コ ロ イ ド 、 またはラ テ ッ ク ス であ る。 さ ら に好ま し く は、 上記色素標識は、 ァ ミ ノ エチル 4 — ァ ジ ドベ ンズア ミ ド三ナ 卜 リ ウム塩、 ま た は N — ( 3 - 卜 リ エチルア ンモニゥムプ口 ピル ) _ 4 一 （

4 一 (ジォク タテ シ レァ ミ ノ ) ス チ リ ル ) ピ U ジニゥム ジ 一 4 一 ク ロ 口べンゼンス レホネー 卜 であ る 。

本発明はさ ら に別の局面にお いて 、 Bェ、'料中 の 目 的の微粒 子を分離または定量する装置を提供する 。 こ の装置は、 目 的の微粒子を含む試料 と 、 当該 目 的の微粒子に特異的に結 口 し 、 かつ 当該試料中で正または負の電荷を有する電荷制 御剤 と を混合 し、 それに よ り 当該目 的の微粒子に 当該電荷 制御剤 を結合させる 、 混合手段、 および こ の よ う に混合 し て得 ら れた試料に電圧ま たは電流を印加 、 刖記電荷制御 剤が結合 した前記 目 的の微粒子を、 当該電荷制御剤の結合 に よ っ て改変さ れた当該目 的の微粒子の表面電荷に基づい て分離ま たは定量するため の分離 · 定量手段を備え る こ と を特徴とする。

本発明の装置の好ま しい実施形態では、 上記混合手段に 、 目 的の微粒子を含む試料および電荷制御剤 を、 それぞれ 別々 に注入する ため の複数の注入手段を さ ら に備え る 。

本発明の装置の好ま しい実施形態では、 目 的の微粒子は 、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および赤血球か ら なる群か ら選択さ れる細胞、 または細菌、 ウィ ルス 、 および真菌か ら な る群か ら選択さ れる微生物であ る 。

本発明の装置の好ま し い実施形態では、 電荷制御剤は、 目 的の微粒子表面上に存在する 、 有機ポ リ マー、 タ ンノ \° ク 質、 糖、 脂質、 お よび核酸か ら な る群か ら 選択される生体 機能性物質に結合する。

本発明の装置の好ま し い実施形態では、 電荷制御剤は、 上記 目 的の微粒子に特異的に結合 し得る タ ンパ ク 質、 ぺプ チ ド 、 ま た は核酸を含む。 好ま し く は、 前記核酸は、 ア ブ タ マ一ま たはその機能的等価物であ る。

本発明の装置の好ま しい実施形態では、 上記電荷制御剤 は、 溶液中で正ま たは負の電荷を有する標識物質を さ ら に 含む。

本発明の装置の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御剤 は、 上記生体機能性物質に特異的に結合 し得る抗体また は その機能的等価物 と 、 上記標識物質 とが結合 して成る複合 体であ る

本発明 の装置の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御剤 は、 上記 目 的の微粒子表面に存在する レセ プ夕一に対する リ ガ ン ド ま たはその機能的等価物 と 、 上記標識物質 とが結 合 して成る複合体であ る。 好ま し く は、 上記 リ ガ ン ド は、 ペプチ ドホルモ ン、 増殖因子、 サイ ト 力イ ン、 またはカ テ コ 一ルア ミ ンであ る 。

本発明の装置の好ま し い実施形態では、 上記電荷制御剤 は、 アブタ マ一 ま た はその機能的等価物 と 、 前記標識物質 と が結合 して成る複合体であ る。

本発明の装置の好ま し い実施形態では、 上記標識物質は 、 色素標識、 金コ ロ イ ド 、 ま たはラ テ ッ ク ス であ る 。 好ま し く は、 上記色素標識は、 ア ミ ノ エチル 4 — ア ジ ド ベ ンズ ア ミ ド三ナ ト リ ウム塩、 または N — （ 3 — ト リ ェチルア ン モニゥム プロ ピル） - 4 - ( 4 — ( ジォク タ デシルア ミ ノ ) ス チ リ ル） ピ リ ジニゥム ジ _ 4 一 ク ロ 口 ベ ンゼンスルホ ネー 卜 であ る 。

本明細書において、 抗体な どのタ ンパク 質またはべプチ ド ホルモ ンな どのペプチ ド に関 して 「機能的等価物」 と は 、 元のタ ンパク 質ま たはペプチ ド の ア ミ ノ 酸配列 と は 1 つ 以上のア ミ ノ 酸の置換、 付加、 または欠失に よ っ て異な る が、 元のタ ンパク 質 またはペプチ ド と 同 じ標的分子 （例え ば、 抗原または細胞表面 レセ プター） に対 して同様の特異 性お よび親和性を も っ て結合 し得る ポ リ ペプチ ド またはぺ プチ ド の こ と を い う 。 さ ら に、 元の タ ンパ ク 質 も し く はべ プチ ド または上記の機能的等価物を、 リ ン酸化 （ S e r、 T h r 、 T y r )、 ァセチル化 （ N末、 L y s )、 ま たは C 末端ア ミ ド化 な どのペプチ ド修飾基によ り 修飾 し た も のであ っ て も 、 元 の タ ンノ \° ク 質またはべプチ ド と 同 じ標的分子に対して同様 の特異性および親和性を も っ て結合 し得る 限 り 、 上記 「機 能的等価物」 に含まれる も の とする 。

本明細書において、 ア ブタ マ一 に関 して 「機能的等価物 」 と は、 元のア ブ夕 マ一の塩基配列 と は 1 つ以上の塩基の 置換、 付加 、 ま たは欠失に よ っ て異なるが、 元のア ブタ マ 一 と 同 じ標的分子に対 して同様の特異性および親和性を も つ て結合 し得る核酸 （ R N A または D N A ) の こ と をい う 。 さ ら に、 元のア ブタ マ一 または上記の機能的に等価な核 酸を、 修飾 (例え ば、 蛍光色素によ り 5 ' 末端を修飾） し た も のであ つ て も 、 元のア ブタ マ一 と 同 じ標的分子に対 し て同様の特異性および親和性を も っ て結合 し得る 限 り 、 上 記 「機能的等価物」 に含まれる も の とする 。

本発明 において、 「 目 的の微粒子に対 して特異的に結合 する」 と は、 他の微粒子に対 してよ り も 、 目 的の微粒子に 対 して、 よ り 高い結合親和性で結合する よ う な結合の こ と を意味する 。 その特異的結合親和性は、 K a (結合定数）

= [ A -B ] / ( [ A ] · [ B ] ) (但 し 、 Aお よ び B は 2 種の分子、 A -B は A と B の複合体であ る） で表 した場 合、 少な く と も約 1 0 ⁵ 、 1 0 ⁶ 、 1 0 ⁷ 、 1 0 ⁸ 、 1 0 ま たは 1 0 ^{1 0} M ¹ であ る こ とが好ま し い。

本発明 によ り 、 簡便かつ正確な微粒子分離技術が提供さ れる 。 本発明は、 表面電荷制御剤 を使用する こ と に よ っ て 微粒子表面電荷の効率よ い制御 を可能に し、 微粒子の正確 かつ簡便な分離お よび測定を実現 し得る 。

本発明 に よ り 、 標的微粒子に対 して特異的な電荷付与が 可能であ る 。 従っ て、 試料中 の標的微粒子 と他の分子と の 大き さ が同 じ く ら いであ っ て も 、 電気泳動によ っ て分離す る こ とができ る 。

本発明の電荷制御剤 と標的微粒子 と の結合は可逆的な結 合であ る と と も に、 本発明では S D S な どの界面活性剤 を 使用 しないため分離 · 検出後の細胞、 細菌を無傷で回収す る こ とが可能であ る 。 図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明の原理の概略を示す図であ る 。

図 2 は、 本発明 に よ る へルパ一 T細胞 と キ ラー T細胞 と の分離を示すク ロ マ ト グラ ムであ る 。

図 3 は、 本発明 に よ るバク テ リ ア細胞の分離を示すク ロ マ 卜 グラムであ る 。

図 4 は、 本発明 に よ る微粒子分離装置の概略を示す図で め る 。 発明 を実施する ため の最良の形態 本発明は、 試料中 の 目 的の微粒子の表面電荷量を改変 し 、 その改変さ れた表面電荷量に基づいて、 試料中の 目 的の 微粒子を分離ま たは定量する ため の組成物 に関 し、 こ の組 成物は、 溶液中で正または負の電荷を有 し 、 当該目 的の微 粒子に特異的に結合 し得る電荷制御剤 を含んでいる 。

本発明 の電荷制御剤は、 例え ば、 スルホ ン酸基、 リ ン酸 基、 ア ミ ノ 基、 アルコ ール基、 フ エ ノ ール基、 またはカ ル ボ ン酸基等の水溶液中で電離 し得る基を有 し、 かつ他の物 質に結合可能な官能基を有する こ と が好ま し い。 本発明 に おいて好適な電荷制御剤 と しては、 例え ば、 細胞表面に存 在する抗原に対 して特異的に結合する抗体 と 、 溶液中で正 または負の電荷を有する標識物質 と の複合体、 あ る いはそ れ 自体で特異的に他の物質に結合 し、 かつ溶液中で電荷を 有する ア ブ夕 マーな どが挙げ られる 。

本発明 にお いて測定対象となる 目 的の微粒子は、 一般に 、 被検対象 とな る赤血球、 白血球、 血小板な どの血液細胞 、 ノ ク テ リ ア、 ウィ ルス 、 真菌な どの微生物細胞を包含す るが これ ら に限定さ れる わけではな く 、 本発明は、 試料中 で微粒子形態に ¾ る任意の物質に適用可能であ る。

以下、 本発明の実施の形態について説明する 。

図 1 に本発明の原理の概略を示す。 一般に、 固体 （微粒 子） と液体が相対運動をする と き、 固体に密着 して動 く 層 (固定層） の最外面 （滑 り 面） の電位 と 、 液体内部の電位 と の差は、 ζ 電位ま たは界面動電電位 （ e 1 e c t r o k i n e t i c p o t e n t i a 1 ) と 呼ばれる。 言い換 えれば、 ζ 電位は、 固体 と液体 と の間に相対運動がお こ る と き の界面動電現象を支配する。

図 1 の （ a ) は、 電荷制御剤 と して標識抗体を用 いた場 合の例 を模式的 に示 し、 そ して図 1 の （ b ) は、 電荷制御 剤 と してア ブタ マ一 を用 いた場合の例 を模式的 に示 してい る 。

図 1 の （ a ) に示すよ う に、 被検対象であ る血球細胞な どの微粒子 （図 1 の （ a ) および （ b ) の左に丸で示さ れ る 。 血球細胞、 微生物菌体な どは一般に負 に荷電 してい る ) は、 溶液中 を移動する と き、 その微粒子に固有の ζ 電位 であ る ζ 1 を生 じ る 。 こ の微粒子に、 免疫反応によ つ て特 異的に結合する抗体分子 1 を結合させる と (図 1 の ( a ) の真ん中 に示さ れる） 、 こ の抗体 · 微粒子複合体も また、 溶液中 を移動する と き、 ζ 電位 ζ 2 を生 じ る 。 通常、 饥体 分子 1 は有意な有効電荷を も っ ていないので、 ζ 2 は ζ 1 と ほぼ等 し く な る 。 こ こで、 抗体分子 1 が電荷を有する標 識物質 2 を有 してい る場合 （図 1 ( a ) に示す例ではマイ ナス電荷を も っ て レ る） 、 標識抗体 • 微粒子複合体が溶液 中 を移動する と き生 じる ζ 電位 ζ 3 は、 標識物質 2 のマイ ナス電荷に起因 して ζ 1 よ り 小さ く なる （例え ば、 ζ 1 = - 1 0 m V の と き、 ζ 2 = — 1 1 m V 、 そ し て ζ 3 = 一 2 0 m Vな ど ) 。 これによ つ て、 電気泳動や電気浸透のよ う な動電現象にお ける微粒子の挙動が増大さ れ得る。 被検対 象が正に荷電 してい る微粒子であ る 場合であ っ て も 、 プラ ス電荷を有する標識物質を用 いて微粒子の挙動を改変 し得 る 。

被検対象であ る微粒子に特異的に結合する抗体は、 当該 分野で公知の方法に よ っ て調製さ れ得るか、 ま たは市販の 抗体を利用 し得る 。 こ の よ う な抗体は、 ポ リ ク ロ 一ナル抗 体、 モ ノ ク ローナル抗体、 抗体フ ラ グメ ン ト 、 一本鎖抗体 、 キメ ラ抗体であ り 得る 。 こ のよ う な抗体は、 微粒子上の 有機ポ リ マ一、 タ ンパク 質、 糖、 脂質、 お よび核酸か ら な る 群か ら選択さ れる 生体機能性物質のェ ピ ト ープを特異的 に ¾ゼ、識し得、 そ してそれに結合 し得る 。 本発明 にお いて使 用 する抗体は、 K a (結合定数） = [ A g - A b ] / ( [ A g ] · [ A b ] ) (但 し、 A g は抗原、 A b は抗体、 そ して A g - A b は抗原抗体複合体を表す） で表 した場合、 例えば、 被検対象であ る微粒子に対 して少な く と も約 1 0 ⁵ 、 1 0 ⁶ 、 1 0 ⁷ 1 0 ⁸ 、 1 0 ⁹ または 1 0 ^{1 0} M— ¹ の 特異的結合親和性を示す こ とが好ま し い。

こ のよ う な抗体は、 当該分野で公知の方法によ っ て調製 さ れ得る 。 すなわち 、 ャギ、 ヒ ッ ジ、 ゥ シ、 モルモ ッ ト 、 ゥサギ、 ラ ッ ト 、 マ ウス のよ う な宿主を、 微粒子またはそ の一部分を用 い、 肉趾、 筋肉内、 皮内、 リ ンパ節周辺ま た は腹腔内 に投与 し、 ァ フ ィ 二ティ 一精製を含む慣用的な方 法によ っ て、 宿主中で産生さ れた免疫グロ プ リ ンを沈殿、 単離、 お よび精製 して得る こ とができ る 。

あ る いは、 こ の よ う な抗体は、 K o e h l e r ぉょび M i l s t e i n ( N a t u r e 2 5 6 : 4 9 5 , 1 9 7 5 ) によ っ て最初に記載されたハイ プ リ ドーマ技術、 ヒ ト B 細胞ノ、イ ブ リ ドーマ技術 （ K o s b o r ら 、 1 9 8 3 、 I m m u n o l . T o d a y 4 7 2 ; C o t e ら 、 1 9 8 3 、 P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 、 8 0 ： 2 0 2 6 ) 、 および E B Vノ、イ ブ リ ドーマ技術 （ C o l e ら 、 M O N O C L O N A L A N T I B O D I E S A N D C A N C E R T H E R A P Y , A l a n R L i s s I n c . 、 N e w Y o r k , N Y , 7 7 一 9 6 頁、 1 9 8 5 ) な ど を含む公知技術を用 い、 モ ノ ク ロ ーナル抗体 と して得る こ とができ る 。 モ ノ ク ロ ーナル抗 体を得る ため の具体的な手順は、 例え ば、 G o d i n g ら 、 M O N O C L O N A L A N T I B O D I E S ： P R I N C I P L E S A N D P R A C T I C E (第 2 版） A c a d . P r e s s 、 N . Y . な どに記載さ れてい る 。

上述の抗体の 「機能的等価物 」 には、 測定対象粒子に特 異的に結合する饥体の結合部位のみを切 り 出 した断片な ど が含まれる 。 抗体は H鎖 と L 鎖か ら な り 、 それぞれに 3 箇 所の抗原 （本発明の 目 的の微粒子に相当） 結合部位 ( C D R ： c o m p 1 e m e n t a r y d e t e r m i n a n t r e g i o n ) が存在する 。 それぞれの結合部位のみ で抗原に特異的に結合する こ とがでさ る 。 こ の結合形態は 、 蛋白質 （ぺプチ ド を含む） 一蛋白質間結合形態 （例え ば 、 抗原抗体結 口 ヽ Kたはぺプチ ドホルモ ン一レセプター結 合な ど ) と 同様であ り 、 水素結 イ オ ン 口 □ よび疎水 結合か ら な る複合的な結合形態であ る。 一般的に、 こ の よ う な結合部位を切 り 出すには、 ΫΛ体を コ 一 ドする D N A あ る いは、 R N Aか ら それぞれの C D R に相 当するポ り ヌ ク レオチ ド鎖を作製 し、 それを公知の分子生物学的手法に よ つ て発現さ せる こ と によ り 、 目 的のぺプチ ド 断片を得る こ とができ る 。

体またはその機能的等価物は、 溶液中で電荷を有する 適当 な標識物質 （蛍光物質であ る こ とが好ま し い） で標識 して、 本発明の電荷制御剤 と して使用 さ れ得る 。 これ ら の 檩識物質が結合 した抗体は、 代表的には、 例えば、 細胞表 面な どに存在する有機ポ リ マー、 タ ンパク 質、 糖、 脂質、 核酸な どの生体機能性物質に、 イ オ ン結合、 疎水結合、 水 素結合、 またはそれ ら の組み合わせに よ っ て結合する 。

測定対象の微粒子に特異的に結合 し得る 、 抗体以外の他 の物質 も ま た、 本発明の電荷制御剤 と して使用 され得る 。 そのよ う な例 と しては、 目 的の微粒子が細胞であ る場合で は、 例え ば、 細胞表面に存在する レセ プターに特異的に結 合する リ ガ ン ド が挙げ ら れる 。 そのよ う な リ ガ ン ド と して は、 例えば、 ペプチ ドホルモ ン、 増殖因子、 サイ ト 力 イ ン 、 またはカ テコ ールア ミ ンな どが挙げ ら れる。 これ ら の分 子は、 形質膜上に存在する受容体 （細胞表面 レセプタ ー） に特異的に結合 してその作用 を発現する も のであ る 。 こ れ ら の分子は、 それ自 身が溶液中で電荷を有する場合には、 単独で本発明の電荷制御剤 と して使用 し得る。 また、 他の 物質に結合 し得る官能基を有 し 、 溶液中で電荷を有する標 識物質 と の複合体の形態で も 、 本発明の電荷制御剤 と して 使用 し得る。

図 1 の （ b ) は、 電荷制御物質 と してマイ ナス電荷を も つア ブ夕 マー を用 いた場合を模式的に示す。 ア ブ夕 マ一は 、 リ ン酸基が水溶液中で電離 してい る ため に生理的 p Hで マイ ナス の電荷を帯びてい る 。 図示さ れる よ う に、 ァ プ夕 マー分子は直接微粒子に結合 し、 それによ つ て、 微粒子 - ア ブ夕 マ一複合体の もつ ζ 電位 ζ 3 が、 微粒子単独の場合 の ζ 電位 ζ ΐ よ り 小 さ く な る 。 こ のため、 上記図 1 の （ a ) に示さ れる の と 同様に、 電気泳動や電気浸透のよ う な動 電現象にお ける微粒子の挙動が増大さ れ得る。 被検対象が 正に荷電 してい る微粒子であ る場合であ っ て も 、 プラ ス電 荷を有する ア ブタ マ一を用 いて同様に微粒子の挙動を改変 し得る 。

上記のよ う に、 ア ブタ マ一 はそれ 自体が水溶液中で電荷 を有 してい る ため、 電荷を有する標識物質で標識 しな':'く て も 、 アブ夕 マー単独で本発明の電荷制御剤 と して使用 し得 る 。 さ ら に 、 ア ブ夕 マー に、 電荷を有する標識物質を結合 させた fe H ア ブタ マ一 と して も、 本発明 の電荷制御剤 と し て使用 し得る こ と はも ち ろ んであ る。

なお、 本明細書で用 い る用語 「アブタ マ一」 は、 当該分 野で用 い ら れる通常の意味で用 い ら れ、 細胞内で D N A と 結合 し、 標的 とする タ ンパク 質の働き を抑える物質を指 し

、 2 本鎖 D N Aや 1 本鎖 R N Aで こ の性質を もつ物質が知 ら れてい る

ァ プタ マ ―は、 一般に、 以下の手順で得 ら れ得る 。

ず、 ラ ンダム にォ リ ゴ D N A ( 6 0 塩基） を合成する 論的に 1 0 兆 以上あ る ォ リ ゴ D N A の プ—ルか ら

、 次に 目 的の タ ンパク 質 と結合する オ リ ゴ D N A を ァ フ ィ

―丁ィ 一 · カ ラ ムで分離する 。 分離 したォ リ ゴ D N A をポ U メ ラーゼ連鎖反応 （ P C R ) で増幅 し、 再び、 ァ フ ィ 二 ティ 一 · 力 ラ ムで分離する こ と を繰 り 返す。 こ の操作を 5 回以上繰 り 返す こ と によ っ て、 目 的のタ ンパク 質に親和性 の強いァ プ々 マ " ~ を選抜 し得る。 あ る い は、 必要に応 じて 、 市販のァ プタ マ― を利用 し得る 。 例え ば、 M 0 1 e c u 1 a r P r o e 社製な どか ら ア ブタ マ一が市販さ れて い る。 一般に 、 これ ら のァ プタ マ一は、 溶液または粉末の 形態で市販さ れてい る

R N A ァ プタ マ―あ る い は、 D N A ァ プタ マ 一 を利用す る場合にお いて、 試料中 あ る い はノ ッ フ ァ 中 の リ ポヌ ク レ ァ一ゼに よ り ア ブタ マ 一 が分解さ れ、 ア ブタ マ一が所有す る電荷が変化する場合が多々 あ る 。 こ のため、 通常 リ ポヌ ク レアーゼを阻害する物質 （ リ ポヌ ク レアーゼイ ン ヒ ビタ 一 ； 例え ば、 R N a s i n ( P r o m e g a 社製） ） を あ ら か じめ添加 してお く こ とが好ま し い。

一方、 抗体やペプチ ド な どの蛋白質を利用する場合にお いて も、 適宜、 蛋白質分解酵素阻害物質を添加する こ とが 好ま し い。

目 的の微粒子に特異的に結合する タ ンパク 質 （例えば、 抗体、 も し く は細胞表面 レセプ夕一 に対する リ ガ ン ド） ま た は核酸 （例えば、 ア ブタ マ一） に電荷 （プラ ス ま たはマ ィ ナス） を付与する標識物質の例 と しては、 例えば、 スル ホ ン酸基、 リ ン酸基、 ア ミ ノ 基、 アルコ ール基、 フ エ ノ ー ル基、 ま たはカルボ ン酸基等の水溶液中で電離 し得る基を 有 し、 かつ他の物質 に結合可能な官能基を有する化合物が 好適であ る 。

スルホ ン酸基および他の物質 に結合可能な官能基を有す る化合物の例 と しては、 例え ば、 カ スケー ド ブルー （登録 商標） 、 タ ウ リ ン、 2 — ヒ ド ロ キシ ー 5 — スルホア二 リ ン サ リ チ リ デン、 1 一 （ 2 — ヒ ド ロ キ シー 4 — スルホナフ チ ルァ ゾ） 2 — ナフ ト 一リレー 3 , 6 — ジスルホ ン酸、 ルシ フ ァ ーイ ェ ロ ー、 モ ンダン 卜 ブルー 3 1 、 ま たは 5 — スルホ 一 8 — キ ノ リ ノ ールな ど、 あ る い はそれ ら の化合物誘導体 が挙げ ら れる。 その う ち 、 と り わ けカ ス ケ一 ド ブル一、 1 一 ( 2 ー ヒ ド ロ キ シ — 4 — スルホナ フチルァ ゾ） 2 — ナ フ ト ール一 3 ， 6 一 ジ スルホ ン酸、 ルシ フ ァ ーイ エ ロ ー、 モ ンダン ト ブルー 3 1 、 ま た は 5 — スルホ ー 8 — キ ノ リ ノ 一 ルな ど、 あ る いはそれ ら の化合物誘導体は、 蛍光物質であ り 、 それ 自体で検出手段 （色素標識） と して利用でき る た め好ま し い。

リ ン酸基および他の物質に結合可能な官能基を有する化 合物の例 と しては、 例えば、 アデノ シンモ ノ リ ン酸、 ゥ ラ シルモ ノ リ ン酸、 チミ ジルモ ノ リ ン酸、 グァニジルモ ノ リ ン酸、 またはオ レゴング リ ー ン 4 8 8 あ る い はそれぞれの 化合物誘導体な どがあ る。 その う ち 、 と り わ けオ レ ゴン グ リ ー ン 4 8 8 またはその化合物誘導体は、 蛍光物質であ り 、 それ自体で検出手段 （色素標識） と して利用でき る ため 好ま しい。

ア ミ ノ 基および他の物質に結合可能な官能基を有する化 合物 と しては、 3 級ァ ミ ノ 基または 4 級ア ミ ノ 基を有 し 、 かつ他の物質に結合可能な官能基を有する化合物が好ま し い

3 級ア ミ ノ 基および他の物質 に結合可能な官能基を有す る化合物の例 と しては、 例え ば、 ジメ チルエチ レ ンジア ミ ン、 ジメ チルダ リ シ ン、 ジメ チルフ エ二 レ ンジア ンモニゥ ム、 力ルセイ ン、 ダン シルク 口 ライ ド、 またはジェチルァ ミ ノ ク マ リ ンカリレボ ン酸 ヒ ド ラ ジ ド あ る い はそれぞれの化 合物誘導体な どがあ る。 その う ち 、 と り わ け力ルセイ ン、 ダン シルク 口 ラ イ ド 、 またはジェチルァ ミ ノ ク マ リ ンカ ル ボ ン酸 ヒ ド ラ ジ ド あ る いはそれぞれの化合物誘導体は、 蛍 光物質であ り 、 それ自体で検出手段 （色素標識） と して利 用でき る ため好ま し い。

4 級ア ミ ノ 基お よび他の物質に結合可能な官能基 を有す る化合物 と しては、 例えば、 F M 3 - 2 5 (登録商標） 、 ベ夕 イ ン、 カルチニ ン、 テ ト ラ メ チルロ ダミ ンカ ダベ リ ン 、 または 口 ーダミ ン X あ る いはそれぞれの化合物誘導体な どがあ る 。 その う ち 、 と り わ け F M 3 - 2 5 、 テ ト ラ メ チ ルロ ダミ ンカ ダベ リ ン、 またはローダミ ン X あ る い はそれ ぞれの化合物誘導体は、 蛍光物質であ り 、 それ自体で検出 手段 （色素標識） と して利用でき る ため好ま し い。

アルコ ール基お よび他の物質に結合可能な官能基を有す る化合物の例 と しては、 例え ば、 ア ミ ノ エ夕 ノ ール、 ア ミ ノ ブタ ノ 一ル、 ア ミ ノ プロパ ノ ール、 またはァ ミ ノ べ ンジ ルアルコ ールな どがあ る。

フ エ ノ ール基お よび他の物質に結合可能な官能基を有す る化合物の例 と しては、 例えば、 ア ミ ノ ヒ ド ロ キシ安息香 酸、 ァ ミ ノ メ チルフ エ ノ 一ル、 8 一 キ ノ リ ノ 一ル、 または サ リ チ リ デンァ ミ ノ フ エ ノ ―ルな ど、 あ る いはそれ ら の化 合物誘導体な どがあ る。 その う ち 、 と り わ け 8 — キ ノ リ ノ ール、 またはサ リ チ リ デンァ ミ ノ フ エ ノ ールな ど、 あ る い はそれ ら の化合物誘導体は、 蛍光物質であ り 、 それ 自体で 検出手段 （色素標識 ) と して利用でき る ため好ま し い。

カ ルボ ン酸基お よ び他の物質に結合可能な官能基を有す る化合物の例 と しては、 例えば、 ァ ミ ノ 酪酸、 ァ ミ ノ 安息 香酸、 または力ルセイ ンな どがあ る 。 その う ち 、 と り わ け 力 .ルセィ ンは、 多価のカルボ ン酸を有する物質で、 蛍光物 質であ り 、 それ自体で検出手段 （色素標識） と して利用 で き る ため好ま し い。

多 く の色素標識が市販さ れてい る 。。 以下に示す実施例で は、 カ ス ケー ド ブルー （登録商標） 誘導体、 F M (登録商 標） 3 — 2 5 を使用 してい る 。

目 的の微粒子に特異的に結合 し得る分子 （例え ば、 抗体 、 も し く は細胞表面 レセプタ ー に対する リ ガ ン ド 、 あ る い はア ブ夕 マー） に結合 し、 マイ ナス電荷またはプラ ス電荷 を有する標識物質のその他の例 と しては、 例え ば、 金コ ロ イ ド 、 ラテ ッ ク ス な どが挙げ ら れる 。

こ のよ う な標識物質で上記のタ ンパク 質、 ぺプチ ド また は核酸等を標識する技術は当該分野で公知であ る 。 市販さ れてい る色素標識を用 い る場合、 通常、 製造業者の指示書 に従っ て色素標識を これ ら の分子に結合する 。

本発明の電荷制御剤 を使用する場合、 適宜最適な試料液 の p H を選択する こ と に注意すべきであ る。 例えば、 カル ボ ン酸基の p K a はおよそ 2 〜 5 であ り 、 試料液の p Hが 2 〜 5 以上の範囲ではプロ ト ンがとれてマイ ナス電荷を有 する 。 そのため、 カルボ ン酸基を有する電荷制御剤 を、 マ ィ ナス電荷を有する状態で 目 的の微粒子と反応させる場合 には、 試料液の p H を 4 以上 に設定 してお く こ とが好ま し い

同様に、 フ エ ノ ール基あ る い は、 アルコ ール基を含む電 荷制御剤 を使用する場合に は、 フ エ ノ ール基お よびアルコ —リレ基の p K a がおよそ 9 〜 1 1 であ るため、 マイ ナス電 荷を有する 状態で使用する に は、 p H を 9 〜 1 1 以上の範 囲 に設定する こ とが好ま し い。

3 級ア ミ ン基を含む電荷制御剤 を使用する 場合に は、 3 級ァ ミ ン基の P K a が 1 0 〜 1 2 であ る ため、 プラ ス電荷 を有する状態で使用する に は、 P H 0 1 2 以下の ρ H 力

で使用する こ とが好ま し い。

方、 ス レホ ン酸基、 リ ン酸基及び 4 級ア ミ ノ 基の場合 には、 P H 2 〜 1 3 の溶液中で電荷を有 してい るため、 広 範囲な p Hで使用可能であ る 。 マイ ナス電荷を欲する場合 にはスルホ ン酸基あ る いは、 リ ン酸基を、 プラ ス電荷を欲 する場合には 4 級ァ ミ ノ 基を有する化合物を使用する こ と が最も望ま し い

本発明の電荷制御剤で表面電荷を改変 した測定対象の微 粒子を分離お よび Zまたは定量する ため の方法は、 微粒子 の表面電 ¾ に づいて分離または定量する も のであればよ い。 代表的に は、 キ ヤ ピ ラ リ ー電気泳動法が、 最も好適に 使用 され得る 。 本発明の 目 的のため には、 市販のキ ヤ ピ ラ リ一 泳動装置が使用 さ れ得るが、 本願の図 4 に概略を 示したよ う な、 電荷制御剤 と試料 と を混合する手段を備え た も のがよ り 好適であ る。

その他、 本発明の電荷制御剤 を用 いて試料中 の 目 的の微 粒子を分离 び /または定量する ため に使用 し得る方法 および装置 と しては、 例え ば、 キ ヤ ビ ラ リ 一電気泳動を利 用 したチ ッ プを用 い る も の等が挙げ ら れる 。

血液細胞が測定対象物の場合、 本発明は、 以下のよ う な 用途に適用 さ れ得る 。

(疲労お よびス 卜 レス の診断）

性疲労や過重労働、 強い精神的なス ト レス によ り 体の 免疫 能が影響を受け感染症な ど に罹 り やす く なる と い う こ と 般的 に知 ら れてい る 。 そ こ で免疫系の細胞を調べ る こ と によ り 、 労働要因 に起因する と こ ろ の現在受けてい る健康に対する影響、 特に、 蓄積さ れつつ あ る疲労やス ト レス の度合を測る こ とが可能であ る。

免疫機能の検査 と して、 比較的簡便に調べる こ と のでき る リ ンパ球表面抗原の解析が知 ら れてい る 。 リ ンパ球細胞 の 中で も N K細胞 （ナチュ ラルキ ラー細胞） は、 急性ス ト レスが与え ら れる と抹消血液中 の数が増加 しその活性も上 昇、 また慢性ス ト レス を受けた と き に数は減少 しその活性 も低下する と い う こ とが知 ら れてい る。 例えば、 う つ病患 者に、 N K細胞機能の低下が報告されてい る （河野友信編 、 「ス ト レス診断ハ ン ド ブ ッ ク 」 、 メ ディ カ ル ' サイ エ ン ス ' イ ンターナシ ョ ナル、 1 9 9 0 年 1 月 、 p l l 、 表 2 - 2 ) 。 また、 試験に伴 う ス ト レス によ り N K細胞活性の 低下とイ ンター フ ェ ロ ン産生低下が報告さ れてい る （河野 友信編、 「ス ト レス診断ハ ン ド ブ ッ ク 」 、 メ ディ カ ル · サ ィ エ ンス ' イ ンタ ーナシ ョ ナル、 1 9 9 0 年 1 月 、 p l l 、 表 2 — 2 ) 。

N K細胞は、 抗腫瘍作用 、 抗ウィ ルス作用な ど人体にお いて生体防御機構の 中心的役割を担っ てい る 。 ナチュ ラル キ ラー活性は前も っ て感染源に さ ら されな く て も存在 し 、 先天性の防御機構に特徴的な あ ら ゆ る性質を示す。 よ っ て 、 N K細胞の役割は免疫機構にお ける一次防衛 ライ ンであ り 、 こ の よ う なナチュ ラルキ ラ ー活性あ る い は、 N K細胞 数の変化 を検出する こ と に よ り 、 被験者の免疫機能の変化 を検出 し得る （例 え ば、 D . M . ワ イ ア著、 「免疫学概説 」 、 共立出版株式会社、 1 9 9 9 年 4 月 、 P 3 6 — 3 7 ； 河野友信編、 「ス ト レス診療ハ ン ド ブッ ク 」 、 メ ディ カル • サイ エ ンス · ィ ン夕一ナシ ョ ナル、 1 9 9 0 年 1 月 、 P

1 1 、 表 2 - 2 )

N K細胞表面に表現さ れる C D 抗原は、 C D 1 6 C D 5 6 C D 5 7 等あ るが 、· なかで も C D 5 6 はその 9 0 % 以上が N K細胞に見 ら れる と い う こ とか ら 、 単独で も N K 細胞のマ一力一 と して有用であ る 。 本発明の電荷制御剤 を 利用 して被験者の N K細胞数を測定する には、 例えば こ の C D 5 6 に特異的に結合する抗体な どの物質に電荷を有 する標識物質で標識する と い う 改変を し （すなわち 、 本発 明の電荷制御剤 を作製 し ) こ の改変抗体 と被験者力、 ら の 血液 と を混合 して、 その血液中 の N K細胞にその改変抗体 を結合さ せる 。 次いで、 その改変抗体の結合 した N K細胞 を、 キ ヤ ピ ラ リ ー電気泳動に よ っ て分湾 feおよび定量する こ と によ り N K細胞数を測定 し得る 。

(ゥィ ルス感染の診断 )

ウィ ルス感染する と U ンパ球の組成が変化する こ とが知 ら れてい る 。 例え ば、 口 ンベルグ ら は、 エイ ズウィ ル ス に感染する と血液中の C D 4 発現 T細胞数の減少及び C Ό 4 / C D 8 比率の減少が起 こ る こ と を示 してい る ( I m m u n o l o g y T 0 d a y V o l 1 9 , I s s u e l , 1 9 9 8 P 1 0 一 1 7 ) A I D S 感染の場合に は、 C D 4 陽性細胞が減少 し、 その他の ウィ ルス感染の場 合は、 C D 8 陽性細胞が増加する 。 そのため、 これ ら リ ン パ球の数の増減を検出する と に よ り 、 被験者が A I D S ウィ ルス ま たはその他の ゥィ ルス に感染 して い る か否か を 検出 し得る 。

本発明の電荷制御剤 を利用 して、 そのよ う な検出 を行 う に は、 まず、 C D 4 および C D 8 に特異的に結合する物質 (例えば、 これ ら に対する抗体） を改変 して電荷を付与す る と い う 改変を行い （すなわち 、 本発明の電荷制御剤を作 製 し ) 、 こ の改変钪体と測定対象者の血液を混合 して、 そ の血液中 の C D 4 および C D 8 陽性細胞にその改変 体を 結合させる 。 次いで、 その改変抗体の結合 した N K細胞を 、 キ ャ ピ ラ リ ー電気泳動によ っ て分離お よび定量する こ と に よ り 、 C D 4 および C D 8 陽性細胞の数を測定 し得る 。

方、 測定対象ウィ ルス に特異的に結合する物質を用 い る場合には、 直接的にウィ ルス の数を検出す る こ とができ る 。 例え ば、 測定対象ウィ ルス に特異的に結合する抗体に 電荷を有する標識物質を結合させた本発明の電荷制御剤 を

、 目 的の ウィ ルス に結合させ、 それをキ ヤ ピ ラ リ ー電気泳 動な どの手法に よ り 分離および定量する こ と によ り 、 ゥィ ルス の数を直接測定する こ と が可能であ る

方、 微生物であ る細菌が測定対象物の場合、 本発明は

、 以下の よ う な用途に適用可能であ る 。

(食中毒の予防および診断）

微生物であ る細菌が測定対象物の場合、 食中毒関連細菌 の検出に本発明が適用 さ れ得る 。 食中毒細菌 と しては、 以 下 のよ う な も のがあ り 、 それぞれに汚染 しやすい食品が存 在す る。

原性大腸菌は、 家畜、 主に牛が感染 して レ る こ と の多 ぐ 、 牛肉が こ の細菌に よ る食中毒の原因食品 と なる こ と が 普通であ る 。 それ以外には、 レ夕 ス 、 カイ ヮ レ等、 あ ら ゆ る食品および水が原因 と な る可能性があ る

サルモネ ラ菌は、 も と も と 人畜共通疾患の原因菌であ る ため、 家畜および家禽の腸管に高率に保菌さ れてい る。 ま た、 鶏、 豚、 および牛に限 らず、 ト カゲやカ メ 等のペ ッ ト も保菌 してい る こ とがあ る 。 サルモネ ラ菌が付着 した肉や 卵 を原材料 と して使用 し た と さ に、 加熱調理が不十分であ つ たため にサルモネ ラが残存 した り 、 調理済食品 を汚染し た り して、 食中毒を引き起す こ と も あ る 。 ま た、 サルモネ ラ菌を保菌 したねずみの糞や尿によ り 、 調理場ゃ食品が汚 染さ れる こ と によ っ て、 食中毒を引き起す こ と ち あ る。 原 因食品 と しては、 う なぎ、 レノ 一剌身、 卵焼き、 自 家製マ ヨ ネーズ、 口一ス 卜 チキ ンな ど、 食肉や卵等の畜産食品が 多 く 見 ら れる。

ェルシニァ菌は、 哺乳動物をは じめ と して、 鳥類、 は虫 類、 淡水魚等多 く の動物や水か ら検出される ため、 人への 感染は こ れ ら の動物 と の接触、 または こ の菌に汚染された 肉、 特に豚肉な どの食品 を介 して感染する 。

腸炎 ビブ リ ォ菌は、 海水中や海泥中 に存在 し 、 海水温度 が 2 0 度以上、 最低気温が 1 5 度以上にな る と 海水中で大 量に増殖 し、 魚介類に付着 して陸上に運ばれる 。 原因 と な る 食品は、 魚介類の刺身やす し類が代表的だが、 野菜の一 夜漬けが原因食品 となる ケース も あ り 、 生 の魚介類を調理 し た後の調理器具や手指等を介 して こ の菌に汚染さ れる こ と があ る

セ レゥス菌は、 土壌、 ほ こ り 、 水中な ど 自 然界に広範囲 に分布する菌で、 土にかかわ り の あ る穀類、 豆類、 香辛料 等か ら高率に検出 さ れる 。 原因食品は、 チャ ーハ ン、 スパ ゲティ ー、 やきそば、 およびオム ライ ス等で、 前 日 に一度 炊いた も のや茹でた も の を翌 日 に使用 した と き に起 こ り 易 い。

カ ン ピ 口 Aク 夕 ー菌は 畜、 家禽または鳩等のぺ ッ 卜 の腸管内 に存在 し、 特に鶏の保菌率が高い こ とか ら 、 鶏肉 か ら検出 さ れる こ とが多 く なつ てい る。 また豚肉や牛肉か ら も検出 さ れる。 また、 野鳥、 ぺ ッ 卜類等の保菌動物の糞 便由来か ら か、 河川水や井戸水か ら検出 さ れる こ と fc あ る 。 鶏の さ さ み、 バ一べキ ―、 焼肉等、 肉の生食や加熱不 足によ る こ とが多 く サラ ダや生水等も原因食品 となる。

ゥエルシュ菌は、 土壌細菌の一種でめ るが、 海水等自 然 界に も広 く 分布 し、 人や動物の腸管に も高率に存在する 。 「給食病」 の異名 の とお り 大 調理加熱さ れたカ レー、 シチュー、 めんつゆな どが原因食ロロ と /よる 。

黄色ブ ド ゥ球菌は化膿 した 限 らず 、 おでき、 水虫、 にきび、 喉や鼻の 中、 皮膚、 よび毛髪等に常在 してお り 、 健康な人で も保菌 してい る 。 手指な どか ら 食品 を汚染す る機会が多いため、 あ ら ゆ る 食品が原因食品 と なる可能性 があ るが、 特に握 り 飯が多 く を 占め、 その他弁当 、 和菓子 、 シユー ク リ 一ムな どが原因食品 と な る

こ の よ う な細菌に感染 した食ロロか ら細菌を検出する場合 に は、 例 え ば、 各食品検体 2 5 g に ノ ポ ピオシ ン力 Π E C 培 地 を 2 2 5 m 1 加え、 ス 卜 マ ッ 十 ン グ し た溶液か ら 適当 量 取 り 出す ( こ の よ う な手順は、 当 該分野で慣用 さ れて い る ) 。 これに測定対象細菌に特異的に結合する抗体を用 いて 作製 した本発明の電荷制御剤 を混合 して、 細菌 と電荷制御 剤 と の複合体を形成させた後に、 キ ヤ ピ ラ リ ー電気泳動を 実施する こ と によ り 上記細菌 -電荷制御剤複合体を検出す る こ とが可能であ る 。 こ の よ う に して、 食中毒が発生 した 場合に も、 それの原因菌を検出する こ と が可能 となる 。 さ ら に、 そのよ う な原因菌を予め検出する こ と によ り 、 その よ う な食中毒の原因菌を含んだ食品が市場に出回る こ と を 予防する こ とができ る 。

以下、 実施例 を用 いて本発明 を説明する 。 これ ら の実施 例は、 本発明の例示であ っ て本発明 を制限する も のではな い

(実施例 1 )

(血液細胞の分離）

ヘルパー T細胞特有に発現する C D 4 ( c 1 u s t e r o f d i f f e r e n t i a t i o n 4 ) に対する坊 体 と、 キ ラ一 T細胞特有に発現する C D 8 に対する抗体に 、 以下の手順に従っ て、 式 1 で示さ れる カ ス ケー ド ブルー (登録商標） 誘導体 （ M o 1 e c u 1 a r P r o b e 社 製 ： ア ミ ノ エチル 4 — ア ジ ド ベ ンズア ミ ド三ナ ト リ ウム塩 : C _{2 7} H _{1 8} N ₅ N a ₃ 〇 _{1 2} S ₃ : 以下、 単にカ ス ケー ド ブルー誘導体 と記す） を結合 し た。

(式 1 ) OCH₂-C-NH(CH₂)₂NH -C-< "^N3

3Na

なお 、 式 1 に示さ れる よ う に、 カ ス ケー ド ブル一誘導体 は、 スルホ ン酸基を有 してい る 。

シグマ社か ら 入手 した抗 C D 4 体 l m g Z m l 、 p H 7 . 0 の リ ン酸緩衝液 ( P B S ) 中） と 、 抗体量に対 し て 1 0 倍モル量のカ スケ— ド ブルー誘導体 （ 5 . 1 g / m 1 、 p H 7 . 0 の P B S 中） を添加 し、 室温で 3 時間放 置する こ と によ り カ スケ一 ド ブルー誘導体を抗 C D 4 抗体 に結合させた。 次いで、 得 ら れた反応液を 、 ゲルろ過 （ S e p h a d e X G - 2 5 ) に供する こ と に よ り 、 未結合力 ス ケ一 ド ブル一誘導体を除去 した。 その結果、 抗 C D 4 抗 体分子あた り 2 個のカス ケー ド ブル一誘導体が結合 した抗 C D 4 抗体が得 ら れた。

同様に、 シグマ社か ら 入手 した抗 C D 8 抗体を処理 し、 抗 C D 8 抗体分子あ た り 8 個 のカ ス ケ一 ド ブルー誘導体が 結合 した抗 C D 8 抗体が得 ら れた。

なお、 力 ス ケー ド ブル一誘導体が抗体に結合 し た数は、 以下の式か ら算出 した。

カ スケ一 ド ブルー誘導体の抗体への結合数 = [ C b 4 1 O n m ] / ( [ A b - C b 2 8 0 n m ] - X [ 4 1 0 η m ] )

し し し 、

[ A b 2 8 0 n m ] ： 抗体の 2 8 O n mにお ける 吸光度

[ C b 2 8 0 n m ] ： カスケー ド ブルー誘導体の 2 8 0 n mにおける 吸光度

[ C b 4 1 0 n m ] ： カ ス ケ一 ド ブル一誘導体の 4 0 n mにおける 吸光度

[ A b — C b 2 8 O n m ] ： カ ス ケー ド ブル一誘導体標 識化抗体の 2 8 0 η mにおける 吸光度

= C C b 2 8 0 n m ] / [ C b 4 1 0 n m ] であ る 。 れ ら のカ ス ケ一 ド ブル一誘導体で標識 した抗体を、 以 下に詳細に示す手順に従つ て、 血液か ら得 ら れた T細胞を 含む試料 とイ ンキュベー 卜 ( 2 5 °C、 1 時間） した後、 そ の混合液をキ ヤ ピ ラ リ 一電気泳動装置 (ベ ッ ク マ ン社製、

P / A C E ンスアム M D Q ) に導入 した。 その結果、 図 2 に示すよ う にヘルパ一 T細胞と キ ラ一 T細胞 と を分離す る こ とができた。 なお、 図 2 は、 電気泳動後のキヤ ピ ラ リ 一につ いて、 波長 4 1 0 n mの光で励起 し、 カ ス ケー ド ブ ル一誘導体に 由来する波長 4 3 0 n mの蛍光の強度をス キ ャ ン した結果を示 し た も のであ る 。

(電荷制御剤 と血液細胞と の接触および血液細胞の分離

) C D 4 を発現 した細胞を含む溶液 5 0 0 x l および C D 8 を発現 した細胞を含む溶液 5 0 0 z l を 1 . 5 m l 容量 のサンプルチユ ーブに と り 、 カ ス ケ一 ド ブルー標識抗 C D 4 抗体溶液 （ 1 m g / m 1 ) およびカ ス ケ一 ド ブル一標識 抗 C D 8 抗体溶液 ( 1 m g / m l ) 5 1 を力卩え、 室温、 暗所で 3 時間放置 し た後、 以下の条件下で蛍光キヤ ピ ラ リ 一電気？永動を行つ た。

<キ ャ ピ ラ リ ー電気泳動および検出条件 >

P / A C E s y s t e m M D Q ( B e c k m a n C o u 1 t e r )

キ ヤ ピ ラ リ ー ： ヒ ューズ ド シ リ カ管 （ B e c k m a n 社 製） 内径 1 0 0 m、 総長 3 2 . O c m、 有効長 2 1 c m 泳動条件 ： 1 0 k V、 2 0 分

泳動緩衝液 ： 卜 リ ス 1 0 . 8 g 、 ホウ酸 5 . 5 g 、 0

. 5 M E D T A ( H 8 ) 4 m l 、 アルギ ン酸ナ ト リ ウ ム 0 . 1 g塩化ナ 卜 リ ウム 2 g を水に溶解 して 1 0 0 O m 1 に調

検出条件 励起波長 4 1 0 n m、 蛍光波長 4 3 0 n m

検出器 ： M D Q レ一ザ誘導蛍光 （ L I F ) ディ テク その結果、 それぞれの ピー ク は、 B a c L i g h t S Y T 0 9 ( M o l e c u l a r P r o b e 社製） を入れた と き と 同 じ移動度で検出 さ れ、 これ ら ピーク 画分を収集 し 、 蛍光顕微鏡に よ り 観察 した と こ ろ 、 蛍光を発する それぞ れの細胞が確認でき た。 こ れに よ り 、 カ ス ケー ド ブルー標 識抗 C D 4 体およびカス ケー ド ブルー標識抗 C D 8 抗体 が、 C D 4 細胞および C D 8 細胞とそれぞれ特異的 に結合 して検出 さ れた こ とが判明 した。 なお、 l O O m M ト リ ス - ホ ゥ酸緩衝液にカス ケ一 ド ブルー標識抗 C D 4 抗体溶液 、 力 ス ケ一 ド ブル一標識抗 C D 8 抗体溶液だけを入れた コ ン 卜 ロ ール標品は、 電気浸透流 と ほぼ同 じ保持時間 に ピ一 ク が検出 さ れ、 他の ピ一ク は観察さ れなか っ た。

(実施例 2 )

(バク テ リ アの分離）

実施例 1 と 同様に して、 サルモネ ラ チフ イ リ ミ ゥム (

S . t y p h i m u r i u m、 以下 S . T . と記す） に対 する抗体 （常法に従っ て調製） と 、 サルモネ ラ ェ ンテ リ ティ デイ ス ( S . e n t e r i t i d i s 、 以下 S . E . と記す） （常法に従っ て調製） に対する抗体 と に、 カ ス ケ ― ド ブル一誘導体を結合させた。 その結果、 1 分子あた り 5 個のカ ス ケ一 ド ブル一誘導体が結合 した抗 S T抗体

、 および 1 分子あた り 9 個のカ ス ケ一 ド ブルー誘導体が結 合 し た抗 S E抗体が得 ら れた。

れ ら のカ ス ケ一 ド ブル一誘導体で標識 した抗体を、 以 下に詳細 に示す手順に従つ て、 サルモネ ラ菌を含む試料 と ィ ンキュべ一 卜 （ 3 7 °C、 3 0 分間） した後、 得 ら れた混 合液をキ ヤ ピ ラ リ一電気泳動装置 （ベ ッ ク マ ン社製、 P Z

A C E システム M D Q ) に導入 した。 その結果、 図 3 に示すよ う にそれぞれのサルモネ ラ菌を分離する こ と がで きた。 なお、 図 3 も また、 電気泳動後のキ ヤ ピ ラ リ ー につ いて、 波長 4 1 0 n mの光で励起 し、 カ ス ケー ド ブルー誘 導体に 由来する波長 4 3 0 n mの蛍光の強度をスキ ャ ン し た結果を示 した も のであ る 。

(電荷制御剤 とサルモネ ラ菌 と の接触お よびサルモネ ラ 菌の分離）

S . T . の斜面固体培養物か ら 、 菌体を 1 白金耳 と り 、 常法に従っ て調製 し た E E Mブイ ョ ン培地 ( E n t e r b a c t e r i a c e a e E n r i c h m e n t M a n n i t o 1 ( E E M ) ブイ ヨ ン培地 ： 4 . 3 5 g / 1 0 0 m 1 ) 5 0 m l を含む 2 0 0 m l 容の三角 フ ラ ス コ に別個 に接種し、 3 7 °Cで 1 6 時間振盪培養 した。 同様に、 S . E . につ いて もその培養液を調製 し た。 得 ら れた培養液の 各 5 0 0 1 を 5 m 1 容量のサ ンプルチューブに と り 、 力ス ケー ド ブル一標識抗 S T抗体溶液 ( 1 m g / m 1 ) およびカ ス ケ一 ド ブルー標識抗 S E 抗体溶液 （ 1 m g / m 1 ) を各 5 1 加え、 3 7 °Cで 3 0 分間暗所に放置 して サルモネ ラ菌 と各サルモネ ラ菌に対する標識化抗体と を接 触させた。 次いで以下の条件下で蛍光キ ヤ ピ ラ リ ー電気泳 動を行つ に。

<キ ャ ピ ラ U 一電気泳動お よび検出条件 >

P Z A C E s y s t e m M D Q ( B e c k m a n C o u 1 t e r )

キヤ ピ ラ リ ー ： ヒ ューズ ド シ リ カ管 （ B e c k m a n 社 製） 内径 7 5 m、 総長 3 1 . 2 c m、 有効長 2 1 c m 泳動条件 ： 1 0 k V、 2 0 分

泳動緩衝液 ： ト リ ス 1 0 . 8 g 、 ホウ酸 5 . 5 g、 0 . 5 M E D T A ( p H 8 ) 4 m l 、 ァリレギ ン酸ナ ト リ ウ ム 0 . 1 g および塩化ナ ト リ ウム 2 g を水に溶解して 1 0 0 0 m l に調整

検出条件 ： 励起波長 4 1 0 n m、 蛍光波長 4 3 0 η m

検出器 ： M D Q レーザ誘導蛍光 （ L I F ) ディ テク タ ·― - また、 1 0 O m M ト リ ス — ホウ酸緩衝液 5 0 0 n 1 に、 上記の 2 つ のカ ス ケ一 ド ブル一標識抗サルモネ ラ抗体の い ずれかを含む溶液 5 1 を添加 した も の （コ ン ト ロール標 品 ) 、 な ら ひに B r u c e l l a s ρ . s t r a i n K Y M— 1 、 S t e n o t r o p h o m o n a s s p . s t r a i n K Y M 2 、 A c i n e t o b a c t e r s p . s t r a i n K Y M 3 、 C o m m a n o n a s s p . s t r a i n K Y M 4 , A u r e o b a c t e r i u m s p . s t r a i n K Y M 6 、 C e l l u l o m o n a s s p . s t r a i n Κ Υ Μ 7 _Λ A c i n e t o b a c t e r i u m s p . s t r a i n K Y M 8 、 3 種の E s c h e r i c h i a c o l i の合計 1 0 種類 のバク テ リ ア をそれぞれ 1 0 ⁵個 Z m 1 と な る よ う に 1 0 O m M ト リ ス ー ホウ酸緩衝液 5 0 0 1 に溶解 し、 上記 2 つ のカス ケー ド ブルー標識抗サルモネ ラ抗体の いずれか を 含む溶液 5 1 を加え、 室温で 1 5 分間暗所に放置 し た も の （比較標品） につ いて も 同様に して蛍光キ ヤ ピ ラ リ ー電 気泳動を行っ た。 その結果、 卜 リ ス — ホウ酸緩衝液中 に力 ス ケー ド ブル一標識抗サルモネ ラ抗体だけを含むコ ン ト 口 一ル標品は、 電気浸透流 と ほぼ同 じ保持時間に、 フ リ ー の カ ス ケ一 ド ブルー標識抗サルモネ ラ抗体の ピーク が検出 さ れ、 他の ピーク は観察さ れなか っ た。 同様に、 1 0 種類の ノ ク テ リ ア を含む溶液 （比較標品） につ いて も 、 コ ン ト 口 ール と 同様に フ リ ーのカ ス ケー ド ブル一標識抗サルモネ ラ 抗体の ピーク のみが検出 さ れた。

こ れに対 し、 サルモネ ラ菌を含む試料においては、 フ リ —のカ ス ケ一 ド ブルー標識抗サルモネ ラ抗体に相当する ピ ー ク のほか に、 B a c L i g h t S Y T 0 9 を入れた と き と 同 じ移動度に ピーク が検出 さ れ、 こ の ピーク画分を収集 し蛍光顕微鏡に よ り 観察 した と こ ろ 、 蛍光を発する 各サル モネ ラ菌が確認できた。 これによ り 、 カ ス ケー ド ブルー標 識抗サルモネ ラ抗体の各々 が、 各サルモネ ラ菌 とそれぞれ 特異的に結合 して検出さ れた こ とが判明 した。

(実施例 3 )

カ ス ケ一 ド ブルー誘導体の代わ り に、 プラス電荷を有す る 、 以下の式 2 に示す F M (登録商標） 3 _ 2 5 ： N - ( 3 — ト リ ェチルア ンモニゥム プロ ピル） — 4 — ( 4 — (ジ ォク タデシルァ ミ ノ ） スチ リ ル） ピ リ ジニゥム ジ一 4 ー ク ロ ロ ベ ンゼンスルホネー ト （ C _{6 8} H _{1 1 3} C 1 ₂ N 3 O ₆ S ₂ ) を用 いた こ と を除いて、 実施例 1 と 同様に、 ヘルパー T細胞と キ ラ一 T細胞と を分離 した。 電気泳動後のキ ヤ ピ ラ リ ー につ いて、 波長 5 1 0 n mの光で励起 し、 上記に 由 来する波長 6 2 4 n mの蛍光強度をス キ ャ ンする こ と に よ り 、 ヘルパー T細胞 と キ ラ ー T細胞 と を分離 して検出する こ と ができた。

(式 2 ) ' (CH₃CH₂)₃ {CH₂)₃N

(実施例 4 )

図 4 に概略を示 した構成の微粒子分離装置を用 いて実施 例 1 と 同様に血球を分離 し で、 図 4 に電荷制御剤 1 で示さ れる槽には、 2 個のカ ス ケ一 ド ブル一誘導体が結 合 した C D 4 抗体を入れ、 図 4 に電荷制御剤 2 で示さ れる 槽には 0 個のカ スケ一 ド ブル一誘導体が結合し た C D 8 抗体を入れ、 図 4 に電荷制御剤 3 で示される槽に は、 2 0 個 の力 ス ケー ド ブルー誘導体が結合 した C D 4 5 抗体を 入れ、 そ して図 4 のサンプルで示さ れる槽には、 血球サ ン プリレを入れた。 図 に示すすベてのポ ンプを作動 させ、 こ れ ら ポ ンプに連結される ミ キサ一でそれぞれの標識化抗体を ¾ レた後、 キ ャ ピ ラ リ ー電気泳動装置に導入 した。 電気 泳動後のキ ャ ピ ラ リ 一 につ いて、 波長 4 1 0 n mの光で励 起 し、 上記化合物に 由来する波長 4 3 0 n mの蛍光強度を ス キ ヤ ンする こ と によ り 、 へルパ一 T細胞 とキ ラー T細胞 と を分離 して検出する こ とができた (実施例 5 )

(グラ ム陽性菌の分離）

ス 卜 レ ブ 卜 コ ッ カ ス サーモ フ ィ ラ ス ( S . T h e r m

0 p h i 1 u s 、 以下 S T と記す） に対する钪体 （常法に 従っ て調製） と 、 ス 卜 レブ 卜 コ ッ カ ス ミ ュータ ンス （ S . M u t a n s 、 以下 S M と記す） （常法に従っ て調製） に対する抗体 と に、 カ ス ケ一 ド ブル一誘導体を結合させた 。 その結果、 1 分子あた り 2 個 のカ スケ― ド ブル一誘導体 が結合 した抗 S T抗体、 および 1 分子あた り 5 個のカ ス ケ 一 ド ブルー誘導体が結合した抗 S M抗体が得 ら れた

これ ら のカ ス ケー ド ブルー誘導体で標識した 体を、 以 下に詳細に示す手順に従っ て、 それぞれのス ト レプ 卜 3 ッ カス菌を含む試料 とイ ンキュベー ト （ 3 7 °C、 3 0 分間） した後、 得 ら れた混合液をキ ヤ ピ ラ リ ー電気泳動装置 （ベ ッ ク マ ン社製、 P / A C E シス テム M D Q ) に導入 し た 。 その結果、 それぞれのス ト レプ ト コ ッ カ ス菌を分離する こ とができた (不図示） 。 検出 につ いて、 波長 4 1 0 n m の光で励起 し 、 カ ス ケー ド ブルー誘導体に 由来する 波長 4 3 0 η mの楚光の強度を測定 し た。

(電荷制御剤 とス ト レプ ト コ ッ カ ス菌 と の接触お よび菌 の分離 )

S Τ の斜面固体培養物か ら 、 菌体を 1 白金耳 と り 、 常法 に従 つ て調製 し 7こ t r y p t i c s o y b e a n 培地 2 0 0 m 1 容の三角 フ ラ ス コ に別個 に接種 し、 二酸化炭素 9 5 % 雰囲気下、 3 7 °Cで 1 6 時間静置培養 した。 同様に 、 S M につ いて もそ の培養液を調製 した。 得 ら れた培養液の 各 5 0 0 1 を 、 1 . 5 m l 容量のサ ン プルチ ュ ー ブに と り 、 カ ス ケー ド ブルー標識抗 S T抗体溶液 （ l m g Z m l ) お よびカ ス ケ一 ド ブルー標識抗 S M抗体溶液 （ 1 m g Z m l ) を各 5 1 力 Bえ、 3 7 °Cで 3 0 分間暗所 に放置 し て ス ト レ プ ト コ ッ カ ス 菌 と 各ス ト レ プ ト コ ッ カ ス菌に対す る 標識化抗体 と を接触 さ せた。 次い で以下の条件下で蛍光キ ャ ピ ラ リ ー電気泳動 を行っ た。

<キ ヤ ピ ラ リ 一電気泳動お よ び検出条件 >

装置 ： P Z A C E s y s t e m M D Q ( B e c k m a n C o u l t e r )

キ ヤ ピ ラ リ ー ： ヒ ュ ーズ ド シ リ カ 管 （ B e c k m a n 社 製） 内径 7 5 m、 総長 3 1 . 2 c m、 有効長 2 1 c m 泳動条件 ： 1 0 k V、 2 0 分

泳動緩衝液 ： ト リ ス 1 0 . 8 g 、 ホ ウ酸 5 . 5 g、 0 . 5 M E D T A ( p H 8 ) 4 m l 、 アルギ ン酸ナ ト リ ウ ム 0 . 1 g お よ び塩化ナ ト リ ウ ム 2 g を水 に溶解 し て 1 0 0 0 m l に調整

検出条件 ： 励起波長 4 1 0 n m、 蛍光波長 4 3 0 η m

検出器 ： M D Q レーザ誘導蛍光 （ L I F ) ディ テ ク 夕一。

ま た、 1 0 0 m M ト リ ス ー ホ ウ酸緩衝液 5 0 0 1 に 、 上記 の 2 つ の カ ス ケー ド ブルー標識抗ス ト レ プ ト コ ッ カ ス 抗体の い ずれか を含む溶液 5 / 1 を添力 Π し た も の （ コ ン ト 口 一ル標品） 、 な ら びに B r u c e 1 1 a s p . s t r a i n K Y M — 1 、 S t e n o t r o p h o m o n a s s p . s t r a i n K Y M 2 、 A c i n e t o b a c t e r s p . s t r a i n K Y M 3 、 C o m m a n o n a s s p . s t r a i n K Y M 4 、 A u r e o b a c t e r i u m s p . s t r a i n K Y M 6 、 C e l l u l o m o n a s s p . s t r a i n K Y M 7 、 A c i n e t o b a c t e r i u m s p . s t r a i n K Y M 8 、 3 種の E s c h e r i c h i a c o l i の合計 1 0 種類のバク テ リ ア をそれぞれ 1 0 ⁷個 111 1 とな る よ う に 1 0 O m M ト リ ス ー ホウ酸緩衝液 5 0 0 n 1 に溶解 し、 上記 2 つのカ ス ケ一 ド ブル一標識抗ス ト レプ ト コ ッ カ ス抗 体の いずれか を含む溶液 5 1 を加え、 室温で 1 5 分間暗 所に放置 した も の （比較標品） につ いて も 同様に して蛍光 キ ヤ ピ ラ リ ー電気泳動を行っ た。 その結果、 ト リ ス ー ホウ 酸緩衝液中 にカ ス ケ一 ド ブルー標識抗サルモネ ラ抗体だけ を含むコ ン ト ロ ール標品は、 電気浸透流 と ほぼ同 じ保持時 間に、 フ リ 一のカ ス ケ一 ド ブルー標識抗サルモネ ラ抗体の ピーク が検出 さ れ、 他の ピーク は観察さ れなかっ た。 同様 に、 1 0 種類のバク テ リ ア を含む溶液 （比較標品） につ い て も 、 コ ン ト ロ ール と 同様に フ リ ーのカ ス ケー ド ブルー標 識抗サルモネ ラ抗体の ピーク のみが検出 さ れた。

これに対し、 ス ト レプ ト コ ッ カ ス菌を含む試料にお いて は、 フ リ ーのカ ス ケ一 ド ブルー標識抗ス ト レプ ト コ ッ カ ス 抗体に相当する ピー ク の ほか に、 B a c L i g h t S Y T 0 9 を入れた と き と 同 じ移動度に ピーク が検出 され、 こ の ピーク 画分を収集 し蛍光顕微鏡によ り 観察 し た と こ ろ 、 蛍 光を発する各ス ト レ プ ト コ ッ カ ス菌が確認できた。 こ れに よ り 、 カ ス ケ一 ド ブルー標識抗ス ト レプ ト コ ッ カ ス抗体の 各々 が、 各ス ト レプ ト コ ッ カ ス菌 とそれぞれ特異的に結合 して検出された こ とが判明 した。 産業上の利用可能性

本発明の電荷制御剤は、 試料中 の 目 的の微粒子の表面電 荷量を改変する こ と に有用であ る 。 本発明はさ ら に、 前記 改変された表面電荷量に基づいて、 試料中 の 目 的の微粒子 を分離または定量する こ と に有用であ る 。 本発明は、 簡便 かつ正確な微粒子分離技術 と して有用であ る 。

本発明はまた、 疲労ま たはス ト レス の検査、 ウィ ルス感 染の検査、 食中毒の予防 も し く は検査等のため に有用であ る。

Claims

請求の範囲

1 . 試料中 の 目 的の微粒子の表面電荷量を改変 し、 当該改 変さ れた表面電荷量に基づいて、 当該試料中 の 当該 目 的の 微粒子を分離ま たは定量する ため の組成物であ っ て、 溶液 中で正また 負の電荷を有 し、 当該 目 的の微粒子に特異的 に結合 し得る電荷制御剤を含む、 組成物。

2 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子表面上に存在す る 、 有機ポ リ マ一、 タ ンパ ク 質、 糖、 脂質、 および核酸か ら な る群か ら選択される生体機能性物質に特異的に結合す る 、 請求項 1 に記載の組成物。

3 . 前記電荷制御剤は、 カルボ ン酸基、 リ ン酸基、 スルホ ン酸基、 フ エ ノ ール基、 アルコ ール基、 3 級ァ ミ ノ 基、 お よ び 4 級ァ ミ ノ 基か ら なる群か ら選択される基を含む、 請 求項 1 に記載の組成物。

4 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子に特異的 に結合 し得る タ ンパ ク 質、 ペプチ ド 、 または核酸を含む、 請求項 2 に記載の組成物。

5 . 前記核酸は、 アブ夕 マー ま たはその機能的等価物であ る 、 請求項 4 に記載の組成物。

6 . 前記電荷制御剤は、 溶液中で正または負の電荷を有す る標識物質 を さ ら に含む、 請求項 4 に記載の組成物。

7 . 前記電荷制御剤は、 前記生体機能性物質に特異的に結 合 し得る抗体ま たはその機能的等価物 と 、 前記標識物質 と が結合 して成る複合体であ る 、 請求項 6 に記載の組成物。

8 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子表面 に存在する レセ プ夕 一 に対する リ ガ ン ド ま た はその機能的等価物 と 、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 、 請求項 6 に 記載の組成物。

9 . 前記 リ ガ ン ド は、 ペプチ ド ホルモ ン、 増殖因子、 サイ ト カ イ ン、 ま たはカ テコ ールア ミ ンであ る 、 請求項 8 に記 載の組成物。

1 0 . 前記電荷制御剤は、 ア ブタ マ一またはその機能的等 価物 と 、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 、 請 求項 6 に記載の組成物。

1 1 . 前記標識物質は、 色素標識、 金コ ロイ ド 、 ま たはラ テ ッ ク ス であ る 、 請求項 6 に記載の組成物。

1 2 . 前記色素標識は、 ア ミ ノ エチル 4 — アジ ド ベ ンズァ ミ ド三ナ ト リ ウム塩、 または N — ( 3 — ト リ ェチルア ンモ ニゥム プロ ピル） 一 4 — ( 4 — (ジォク タ デシルァ ミ ノ ） スチ リ ル） ピ リ ジニゥム ジ一 4 — ク ロ 口 ベ ンゼンスルホネ ー ト であ る 、 請求項 1 1 に記載の組成物。

1 3 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子に可逆的に結 合する 、 請求項 1 に記載の組成物。

1 4 . 前記電荷制御剤は、 イ オ ン結合または水素結合に よ つ て前記 目 的の微粒子に特異的 に結合する 、 請求項 1 に記 載の組成物。

1 5 . 前記 目 的の微粒子は、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および赤血球か ら な る群か ら 選択さ れる細胞であ る 、 請求 項 1 に記載の組成物。

1 6 . 前記 リ ンパ球は、 T細胞、 B 細胞、 または N K細胞 の いずれかであ る 、 請求項 1 5 に記載の組成物。

1 7 . 被検体の免疫機能を検査する ための、 請求項 1 6 に 記載の組成物。

1 8 . 被検体の疲労または被検体が受けてい る ス ト レス の 程度を検査する ため の、 請求項 1 6 に記載の組成物。

1 9 . 被検体がウィ ルス感染 してい るか否か を検査する た め の、 請求項 1 6 に記載の組成物。

2 0 . 前記 目 的の微粒子は、 細菌、 ウィ ルス、 または真菌 のいずれかであ る 、 請求項 1 に記載の組成物。

2 1 . 前記細菌は、 病原性大腸菌、 サルモネ ラ菌、 エルシ 二ァ菌、 腸炎 ビブ リ オ菌、 セ レウス菌、 カ ン ピ ロバク タ一 、 ウエルシュ菌、 および黄色ブ ド ウ球菌か ら なる群か ら 選 択される 、 請求項 2 0 に記載の組成物。

2 2 . 食中毒の予防または検査のための、 請求項 2 1 に記 載の組成物。

2 3 . 試料中 の 目 的の微粒子の表面電荷量を改変 し 、 当該 改変さ れた表面電荷量に基づいて、 当該試料中 の 当該目 的 の微粒子を分離または定量する ため の電荷制御剤の製造方 法であ っ て、

前記 目 的の微粒子に特異的に結合 し得る タ ンパク 質、 ぺ プチ ド 、 も し く は核酸、 ま たはそれ ら の機能的等価物 に、 溶液中で正または負の電荷を有 し得る標識物質を結合さ せ る工程を包含する 、 方法。

2 4 . 前記タ ンパ ク 質、 ペプチ ド 、 も し く は核酸、 また は それ ら の機能的等価物は、 前記 目 的の微粒子表面上に存在 する有機ポ リ マー、 タ ンパ ク 質、 糖、 脂質、 お よび核酸か ら な る群か ら選択さ れる 生体機能性物質に特異的に結合す る 、 請求項 2 3 に記載の方法。

2 5 . 前記タ ンパク 質は、 抗体であ る 、 請求項 2 4 に記載 の方法。

2 6 . 前記核酸は、 アブタ マ一であ る 、 請求項 2 4 に記載 の方法。

2 7 . 前記タ ンパ ク 質または前記ペプチ ド は、 前記 目 的の 微粒子表面に存在する レセプ夕一 に対する リ ガ ン ド であ る 、 請求項 2 4 に記載の方法。

2 8 . 前記標識物質は、 カルボ ン酸基、 リ ン酸基、 スルホ ン酸基、 フ エ ノ 一ル基、 アルコ ール基、 3 級ァ ミ ノ 基、 お よび 4 級ァ ミ ノ 基か ら なる群か ら 選択される基を含む、 請 求項 2 3 に記載の方法。

2 9 . 前記標識物質は、 色素標識、 金コ ロ イ ド 、 ま たは ラ テ ッ ク ス であ る 、 請求項 2 3 に記載の方法。

3 0 . 前記色素標識は、 ア ミ ノ エチル 4 _ ア ジ ドベ ンズァ ミ ド三ナ ト リ ウム塩、 または N — （ 3 — ト リ ェチルア ンモ ニゥム プロ ピル） - 4 - ( 4 — (ジォク タ デシルァ ミ ノ ） ス チ リ ル） ピ リ ジニゥム ジ ー 4 — ク ロ 口 ベ ンゼンス ルホネ ー ト であ る 、 請求項 2 9 に記載の方法。

3 1 . 前記 目 的の微粒子は、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および赤血球か ら なる群か ら 選択さ れる細胞であ る 、 請求 項 2 3 に記載の方法。

3 2 . 前記 目 的の微粒子は、 細菌、 ウィ ルス 、 また は真菌 の いずれかであ る 、 請求項 2 3 に記載の方法。

3 3 . 前記タ ンパ ク 質、 ペプチ ド 、 も し く は核酸、 また は それ ら の機能的等価物に対 して、 結合させる 前記標識物質 の割合または量を調節 し得る こ と を特徴 とする 、 請求項 2 3 に記載の方法。

3 4 . 試料中 の 目 的の微粒子を分離または定量する方法で あ っ て、

目 的の微粒子を含む試料 と、 当該 目 的の微粒子に特異的 に結合 し、 かつ 当該試料中で正ま たは負の電荷を有する電 荷制御剤 と を混合 し、 それによ り 当該目 的の微粒子に当該 電荷制御剤 を結合させる 、 混合工程、 お よび

前記混合 して得 ら れた試料に電圧または電流を印加 し、 前記電荷制御剤が結合 した前記 目 的の微粒子を、 当該電荷 制御剤の結合によ っ て改変さ れた表面電荷に基づいて分離 または定量する工程、 を包含する 、 方法。

3 5 . 前記混合工程は、 複数種の微粒子の各々 の種につ い て別個 に独立 して行われる 、 請求項 3 4 に記載の方法。

3 6 . 前記混合工程は、 複数種の微粒子の各々 の種につ い て互い に異な る電荷制御剤を用 いて行われる 、 請求項 3 4 に記載の方法。

3 7 . 前記 目 的の微粒子は、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および赤血球か ら な る群か ら選択さ れる細胞、 または細菌 、 ウィ ルス 、 および真菌か ら な る群か ら選択さ れる微生物 であ る 、 請求項 3 4 に記載の方法。

3 8 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子表面上に存在 する 、 有機ポ リ マー、 タ ンパ ク 質、 糖、 脂質、 および核酸 か ら な る群か ら選択さ れる生体機能性物質 に結合する 、 請 求項 3 7 に記載の方法。

3 9 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子に特異的に結 合 し得る タ ンパク 質、 ペプチ ド 、 または核酸を含む、 請求 項 3 8 に記載の方法。

4 0 . 前記核酸は、 ア ブタ マ一またはその機能的等価物で あ る 、 請求項 3 9 に記載の方法。

4 1 . 前記電荷制御剤は、 溶液中で正または負 の電荷を有 する標識物質を さ ら に含む、 請求項 3 9 に記載の方法。

4 2 . 前記電荷制御剤は、 前記生体機能性物質に特異的に 結合 し得る抗体またはその機能的等価物 と、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る、 請求項 4 1 に記載の方法

4 3 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子表面に存在す る レセプター に対する リ ガ ン ド ま たはその機能的等価物 と

、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 、 請求項 4 1 に記載の方法。

4 4 . 前記 リ ガ ン ド は、 ペプチ ド ホルモ ン、 増殖因子、 サ イ ト 力 イ ン、 またはカ テコ ールア ミ ンであ る 、 請求項 4 3 に記載の方法。

4 5 . 前記電荷制御剤は、 ア ブ夕 マーまたはその機能的等 価物 と 、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 、 請 求項 4 1 に記載の方法。

4 6 . 前記標識物質は、 色素標識、 金コ ロ イ ド 、 またはラ テ ッ ク ス であ る 、 請求項 4 1 に記載の方法。

4 7 . 前記色素標識は、 ア ミ ノ エチル 4 _ ア ジ ドベ ンズァ ミ ド三ナ ト リ ウム塩、 または N — （ 3 — ト リ ェチルア ンモ ニゥム プロ ピル） 一 4 一 （ 4 — (ジォク タ デシルア ミ ノ ） ス チ リ ル） ピ リ ジニゥム ジ ー 4 — ク ロ 口 ベ ンゼンスリレホネ ー ト であ る 、 請求項 4 6 に記載の方法。

4 8 . 試料中 の 目 的の微粒子を分離ま た は定量する装置で あ っ て、

目 的の微粒子を含む試料 と 、 当該 目 的の微粒子に特異的 に結合し、 かつ 当該試料中で正または負の電荷を有する電 荷制御剤 と を混合 し 、 それによ り 当該目 的の微粒子に当該 電荷制御剤 を結合させる 、 混合手段、 および

前記混合 して得 ら れた試料に電圧または電流を印加 し、 前記電荷制御剤が結合 した前記 目 的の微粒子を、 当該電荷 制御剤の結合に よ っ て改変された当該 目 的の微粒子の表面 電荷に基づいて分離または定量する ため の分離 · 定量手段 、 を備え る 、 装置。

4 9 . 前記混合手段に、 前記 目 的の微粒子を含む試料およ び前記電荷制御剤を、 それぞれ別々 に注入する ためめ複数 の注入手段を さ ら に備え る 、 請求項 4 8 に記載の装置。

5 0 . 前記 目 的の微粒子は、 白血球、 リ ンパ球、 血小板、 および赤血球か ら なる群か ら選択さ れる細胞、 または細菌 、 ウィ ルス 、 お よび真菌か ら な る群か ら 選択さ れる微生物 であ る 、 請求項 4 8 に記載の装置。

5 1 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子表面上に存在 する 、 有機ポ リ マー、 タ ンパ ク 質、 糖、 脂質、 および核酸 か ら な る群か ら選択さ れる 生体機能性物質に結合する 、 請 求項 5 0 に記載の装置。

5 2 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子に特異的に結 合 し得る タ ンパク 質、 ペプチ ド 、 ま たは核酸を含む、 請求 項 5 1 に記載の装置。

5 3 . 前記核酸は、 ア ブタ マ一またはその機能的等価物で あ る 、 請求項 5 2 に記載の装置。

5 4 . 前記電荷制御剤は、 溶液中で正または負の電荷を有 する標識物質 を さ ら に含む、 請求項 5 2 に記載の装置。

5 5 . 前記電荷制御剤は、 前記生体機能性物質に特異的に 結合 し得る抗体ま たはその機能的等価物 と 、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 、 請求項 5 4 に記載の装置

5 6 . 前記電荷制御剤は、 前記 目 的の微粒子表面に存在す る レセプター に対する リ ガ ン ド またはその機能的等価物 と 、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 、 請求項 5 4 に記載の装置。

5 7 . 前記 リ ガ ン ド は、 ペプチ ド ホルモ ン、 増殖因子、 サ イ ト 力イ ン、 またはカ テコ ールア ミ ンであ る 、 請求項 5 6 に記載の装置。

5 8 . 前記電荷制御剤は、 ア ブタ マ一またはその機能的等 価物 と、 前記標識物質 とが結合 して成る複合体であ る 、 請 求項 5 4 に記載の装置。

5 9 . 前記標識物質は、 色素標識、 金コ ロイ ド 、 またはラ テ ッ ク スであ る 、 請求項 5 4 に記載の装置。

6 0 . 前記色素標識は、 ア ミ ノ エチル 4 _ ア ジ ドベ ンズァ ミ ド三ナ ト リ ウム塩、 または N — ( 3 — ト リ ェチルア ンモ ニゥ ム プロ ピル） 一 4 — ( 4 - (ジォク タ デシルァ ミ ノ ） スチ リ ル） ピ リ ジニゥム ジ ー 4 — ク ロ 口 ベ ンゼンスリレホネ ー ト であ る 、 請求項 5 9 に記載の装置。