JP2007232400A - 生体分子の親和性解析装置及び該装置を使用する生体分子間の親和性を解析する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備する生体分子の親和性解析装置の試料容器に、相互作用を判別する少なくとも2種類の生体分子の混合物の溶液を保持させ、前記電極間に交流電圧を印加することによって生体分子を溶液中で往復運動させ、反応前後の個別の分子の運動の指標の変化を比較することによって、分子の会合状態を評価する。
【選択図】図1
Description
Nucleic Acids Research 23, 6505-6525 (1981)
フットプリンティング法:特定の遺伝子配列を認識し、結合するタンパク質の遺伝子結合部位を決定する方法。(非特許文献2)
サウスウェスタン法:SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法にてタンパク質を分離した後、ニトロセルロースフィルターなどへ転写する。これにラジオアイソトープなどで標識したDNAをプローブとして用い、標的物質との結合を測定する方法。(非特許文献3)
2本鎖DNAアレイ:2本鎖DNAをガラス基板などにアレイ化し、基板上でタンパク質を反応させた後、DNAに結合したタンパク質を抗体などを用いて検出する方法。(非特許文献4〜6)
Nucleic Acids Research 5, 3157-3170 (1978) Cell 52, 415-423 (1988) Nature Biotechnology 17,536-537(1999) Nature Biotechnology 17, 573-577 (1999) Proc Natl Acad Sci USA 98, 7158-7168(2001)
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さらに、従来の相互作用解析では、目的とするタンパク質に対する抗体が必要であったが、新規のタンパク質を解析する手段にも適応可能な検出法が求められている。
1.少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備し、試料容器内で相互作用を判別する生体分子を往復運動させることを特徴とする生体分子の親和性解析装置。
2.前記局所照明手段が蛍光照明による蛍光励起手段であって、蛍光励起光源及び蛍光選別光学フィルターを有することを特徴とする1に記載の生体分子の親和性解析装置。
3.前記局所照明手段がエバネッセント照明による蛍光励起手段であることを特徴とする2に記載の生体分子の親和性解析装置。
4.前記試料容器が流路形状を成し、前記流路内に一対あるいは複数対の電極を配置し、前記電極間の電圧の周波数変化によって、前記生体分子を電気泳動させることを特徴とする1〜3のいずれかに記載の生体分子の親和性解析装置。
5.少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備する生体分子の親和性解析装置の試料容器に、相互作用を判別する少なくとも2種類の生体分子の混合物の溶液を保持させ、前記電極間に交流電圧を印加することによって生体分子を溶液中で往復運動させ、反応前後の個別の分子の運動の指標の変化を比較することによって、分子の会合状態を評価することを特徴とする生体分子間の親和性を解析する方法。
6.前記生体分子の一方が、生体分子を表面に固定した粒子であることを特徴とする5に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
7.前記生体分子の一方が蛍光標識されていることを特徴とする5又は6に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
8.前記運動の指標が、前記生体分子の最大移動速度または移動距離(振幅)であることを特徴とする5〜7のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
9.前記試料容器が流路形状を成し、試料溶液を保持する際に、フロー式あるいは合流フロー式流路を用いて、前記電極間の電圧の周波数変化によって、前記生体分子を電気泳動させることを特徴とする5〜8のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。(本発明において、合流フロー式流路とは、フロー式流路を2つ以上組合わせ、溶液を試料容器内で混合させる流路を意味する。)
10.前記生体分子の少なくとも一方が核酸分子であることを特徴とする5〜9のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
11.前記生体分子の少なくとも一方がタンパク質であり、前記試料溶液のpHを少なくとも一方のタンパク質の等電点でないpH、あるいは2つの生体分子の等電点に挟まれたpHに調製することを特徴とする5〜10のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
さらに、試料容器を流路形状とし、微量な希薄試料溶液を保持する際に、フロー式あるいは合流フロー式流路を用いて、配置した電極間の電圧の周波数を変化させ、生体分子を表面に固定した粒子または生体分子を電気泳動させることによって、連続的な検出が可能となる。
図1は、本発明の生体分子の親和性解析装置の1例を示す図で、(A)は装置の概略を示す模式図、(B)は該装置の試料容器に交流電圧を印加した状態を示す模式図である。この装置1は、少なくとも一対の電極103を配置した試料容器102、光源105、局所照明手段107、高倍率光学観察手段107、選別光学フィルター109及び交流電圧印加手段104を具備するものである。
この装置2は、相互作用を判別する対象となる生体分子を表面に固定した粒子または生体分子として蛍光粒子または蛍光標識した分子201を使用するものである。この装置2では、図1の装置1における局所照明手段及び高倍率光学観察手段107を、試料容器202の下方に配置した局所照明手段及び高倍率光学観察手段207による蛍光照明あるいはエバネッセント照明212による蛍光励起手段とし、蛍光励起光源205及び蛍光選別光学フィルター209によって、蛍光粒子または蛍光標識した分子213のみを検出し、その運動の指標の変化を比較することによって、粒子または分子の会合状態を評価することにより分子間の親和性を調べるものである。
また、局所照明手段及び高倍率光学観察207をエバネッセント照明とした場合には、試料容器202内の照明範囲212が、蛍光照明と比べ、局所照明手段及び高倍率光学観察207に非常に近接した範囲(励起光206の波長と入射角に依存するが、一般的に100〜200nm)に限定することが可能であるため、より低いバックグラウンドノイズで蛍光検出が可能となる。
図3(a)は、図1の装置1における試料容器102を流路形状を成した試料容器302としたものである。この試料容器302には一対の電極304を配し、交流電源303により電極間の電圧の周波数を変化させ、一対の電極304の部分までフローさせた相互作用を判別する粒子または分子301を電気泳動させることによって往復運動を検出するものである。
図3(c)は、流路形状を成した試料容器302内部に複数対の電極307を配置したものである。さらに、図3(d)は図3(a)、図3(e)は図3(b)において、それぞれ一対の電極304に代えて複数対の電極307を配置したものである。
また、図3(c)、(d)および(e)のように複数対の電極307を配置し、それぞれの電極間に異なった周波数変化をさせることにより、一対の電極の場合と比較して、最大移動速度または移動距離(振幅)のより大きな変化を得ることが可能となる。
好適な解析対象としては、分子量が30〜150kDa程度のタンパク質、例えばアクチン、ストレプトアビジン、IgG、或いはサイズが20塩基対程度の二本鎖DNA、例えば転写因子認識配列等が挙げられる。
これらの生体分子は、生体分子そのものを測定対象とすることができるが、生体分子の少なくとも一方を平均粒径が0.1〜10μm程度の微粒子の表面に固定した状態で測定対象とすることも可能である。生体分子を表面に固定する微粒子としては、例えばポリスチレン等のプラスチックビーズや、シリカビーズ等通常この分野で使用される微粒子はいずれも使用することができる。
測定対象とする生体分子、或いは生体分子を表面に固定した粒子は,通常は例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース等を含むリン酸緩衝液等を溶媒とする希薄水系溶液として測定される。これらの生体分子、或いは生体分子を表面に固定した粒子としては、少なくとも一方を蛍光標識したものを使用することが好ましい。
図4(b)は、振幅電圧一定の場合の周波数fの2つの条件について、相互作用を判別する粒子または分子のもつ電荷に対する移動距離(振幅)Aの関係を示している。振幅電圧一定の測定を行う場合、周波数fが大きいほど、移動距離(振幅)Aの絶対値が小さくなる。振幅電圧一定、かつ周波数f一定の測定を行うことにより、親和性がある場合、電荷の変化により、移動距離(振幅)Aが変化することを示している。
図4(c)は、相互作用を判別する粒子または分子のもつ電荷の4つの条件について、振幅電圧一定の場合の周波数fに対する最大移動速度vmaxの関係を示している。振幅電圧一定の測定を行う場合、最大移動速度vmaxの絶対値は、周波数fに依存せず、電荷に依存した値となる。振幅電圧一定の測定を行うことにより、親和性がある場合、電荷の変化により、最大移動速度vmaxが変化することを示している。
図4(d)は、相互作用を判別する粒子または分子のもつ電荷の4つの条件について、振幅電圧一定の場合の周波数fに対する移動距離(振幅)Aの関係を示している。振幅電圧一定の測定を行う場合、周波数fが大きいほど、移動距離(振幅)Aの絶対値が小さくなり、電荷の絶対値が大きいほど、移動距離(振幅)Aの絶対値は大きい。振幅電圧一定、かつ周波数f一定の測定を行うことにより、親和性がある場合、電荷の変化により、移動距離(振幅)Aが変化することを示している。
本装置を使用して生体分子の親和性を調べる場合、最大移動速度または移動距離(振幅)の変化が最も大きい条件で測定することによって、より高精度な結果を得ることが可能である。
(実施例1)
図2に示す生体分子の親和性解析装置2において、光源205として市販の倒立蛍光顕微鏡(ニコンインストルメンツカンパニー製、TE2000−U)の超高圧水銀ランプを用いた。幅60mm、奥行き40mm、厚さ1mmのポリメチルメタクリレート板の中央に幅方向に沿って、長さ40mm、幅375μm、深さ400μmの溝状の流路をエキシマレーザー加工機(ビーム社製)により切削し、長さ方向の両端部に直径2.5mmの貫通孔を設けた後に、幅50mm、奥行き40mm、厚さ0.17mmのカバーガラスで覆って、流路状の試料容器202を構成した。ポリメチルメタクリレート板とカバーガラスの間にはメルカプトエステルを成分とするUV硬化接着剤を流し込み、紫外光を10分間照射して接着剤を硬化させた。この流路の両端部には、径0.5mmの白金線からなる一対の電極203を配置した。この試料容器202の下方には、蛍光選別フィルター209として緑色検出用の標準フィルターセット(ニコンインストルメンツカンパニー製、G−2A)、及びイメージセンサ211として冷却CCDカメラを配置した。
この装置では、流路状の試料容器202に測定対象とする少なくとも2種類の生体分子201の希釈溶液を試料容器202の一方の貫通孔から注入し、流路内を生体分子201の希釈溶液で完全に充填した。交流印加手段204となる交流電源から電圧0〜300V、周波数0.1〜1.0Hzの交流電圧を例えば15秒間程度印加し、交流電圧を印加している間、CCDカメラにより生体分子201の往復運動の連続画像を取得し、生体分子の最大移動距離(振幅)から生体分子相互作用の親和性を解析するものである。
印加する交流電圧の電圧依存性や周波数依存性を測定するため、測定対象として、直径1.0μmの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズ〔インビトロジェン社製、FluoSpheres polystyrene microspheres, 1.0μm, orange fluorescent(540/560)〕を使用した。このビーズを測定装置に導入するための水溶液としては、0.25%ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
測定条件として、この測定試料に対して、周波数を0.1,0.2,0.3Hzで交流電圧を50,100,200,300V(12.5,25,50,75V/cm)印加し、データを解析した。その結果、各周波数の印加電圧あたりの振幅は、0.1Hzでは290μm/100V(相関係数0.86)、0.2Hzでは100μm/100V(相関係数0.98)、0.3Hzでは54μm/100V(相関係数0.98)の比例関係があった。また、各印加電圧の周波数あたりの振幅は、反比例の関係があった。
測定を行った周波数の範囲では、周波数が高くなるほど振幅が小さくなり、0.2Hzおよび0.3Hzで印加電圧あたりの振幅の相関が高い結果となった。
水溶液のpHによる振幅の変化を測定するため、測定対象として、実施例2と同じ直径1.0μmの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズを使用した。このビーズを測定装置に導入するための水溶液としては、0.25%ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む広域緩衝液(0.1Mクエン酸水溶液に0.2Mリン酸二水素ナトリウム水溶液を加え、目的とするpHに調製した緩衝液)を用いた。
測定条件として、この測定試料の水溶液のpHを4.0、5.0、6.0、7.0、8.0とし、周波数を0.2Hzで交流電圧を200V(50V/cm)印加し、データを解析した。その結果、各pHでの振幅は、pH4.0では6.4μm(標準偏差1.8μm)、pH5.0では25.6μm(標準偏差1.8μm)、pH6.0では38.7μm(標準偏差10.6μm)、pH7.0では55.4μm(標準偏差7.8μm)、pH8.0では164μm(標準偏差13.2μm)となった。
測定を行ったpHの範囲では、pHが高くなるほど振幅が大きくなり、測定試料の電荷によって振幅が変化することが判った。
異種タンパク質の固定化による振幅の変化を測定するため、測定対象となる生体分子として、タンパク質のイムノグロブリンG(IgG:分子量150kDa、等電点pI7付近)、及びアクチン(分子量43kDa、等電点pI5付近)を使用した。これらの生体分子を測定装置に導入するための水溶液としては、0.25%ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
これらの生体分子を表面に固定する粒子として、実施例2と同じ直径1.0μmの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズ(以下、「非固定ビーズ」という)を使用し、このビーズにタンパク質のイムノグロブリンG(IgG:分子量150kDa)をカルボジイミドで固定化した(以下、「IgGビーズ」という)。同様に、このビーズにタンパク質のアクチン(分子量43kDa)をカルボジイミドで固定化した(以下、「アクチンビーズ」という)。
異種タンパク質の固定化による振幅の変化の測定は、実施例1の解析装置2の試料容器202の流路内にこれらの測定試料を充填し、流路の中心付近を冷却CCDカメラで蛍光観察し、水溶液中のビーズの動きが測定する往復運動より十分小さくなってから交流電圧を印加し、連続画像を取得した。取得した画像から任意のビーズ10個を選択し、それぞれの連続画像上の座標から、ビーズの往復運動の最大移動距離、即ち振幅を取得した。
測定条件として、これらの測定試料に対して、周波数を0.3Hzで交流電圧を250V(63V/cm)印加し、データを解析した。その結果、各試料の振幅として、非固定ビーズでは45.3μm(標準偏差7.9μm)、IgGビーズでは32.0μm(標準偏差4.2μm)、アクチンビーズでは63.8μm(標準偏差12.8μm)であり、アクチンビーズ、非固定ビーズ、IgGビーズの順に振幅が大きかった。
IgGビーズでは、水溶液(pH7.0)のpHとIgG(等電点pI7付近)の等電点pIが近いため、電荷が小さくなる。一方、アクチンビーズでは、水溶液と(pH7.0)のpHとアクチン(等電点pI5付近)の等電点pIが遠いため、電荷が大きくなる。そのため、非固定ビーズと比較して、IgGビーズでは振幅が小さく、アクチンビーズでは振幅が大きくなったことが判る。
測定対象となる生体分子として、タンパク質のイムノグロブリンG(IgG:分子量150kDa)、ビオチン化IgG(分子量150kDa)、及びストレプトアビジン(分子量60kDa)を使用した。これらの生体分子を測定装置に導入するための水溶液としては、0.25%ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
これらの生体分子を表面に固定する粒子として、実施例2と同じ直径1.0μmの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズを使用し、このビーズにタンパク質のイムノグロブリンG(IgG:分子量150kDa)をカルボジイミドで固定化した(以下、「非ビオチン化ビーズ」という)。つぎに、定法により非ビオチン化ビーズのIgGをビオチン化試薬によってビオチン化したビーズ(以下、「ビオチン化ビーズ」)を調製した。
生体分子の親和性の測定は、実施例1の解析装置2の試料容器202の流路内にこれらの測定試料を充填し、流路の中心付近を冷却CCDカメラで蛍光観察し、水溶液中のビーズの動きが測定する往復運動より十分小さくなってから交流電圧を印加し、連続画像を取得した。取得した画像から任意のビーズ10個を選択し、それぞれの連続画像上の座標から、ビーズの往復運動の最大移動距離、即ち振幅を取得した。
測定条件として、これらの測定試料に対して、周波数を0.2Hzで交流電圧を300V(75V/cm)印加し、データを解析した。その結果、各試料の振幅として、非ビオチン化ビーズのみの試料では151μm(標準偏差18μm)、ストレプトアビジン及び非ビオチン化ビーズを混和した試料では143μm(標準偏差13μm)となり、6%程度の差であったのに対して、ビオチン化ビーズのみの試料では94.1μm(標準偏差4.6μm)、ストレプトアビジン及びビオチン化ビーズを混和した試料では39.3μm(標準偏差8.7μm)となり、ストレプトアビジン及びビオチン化ビーズを混和した試料では、ビオチン化ビーズのみの試料の振幅の42%程度であった。
ストレプトアビジン及び非ビオチン化ビーズを混和した試料の振幅は、非ビオチン化ビーズのみの試料の振幅との差が小さいので、表面の電荷に大きな変化がなく、ストレプトアビジンと非ビオチン化ビーズの間の親和性が低いことが判る。一方、ストレプトアビジン及びビオチン化ビーズを混和した試料の振幅は、ビオチン化ビーズのみの試料の振幅との差が大きいので、表面の電荷に大きな変化があり、ストレプトアビジンとビオチン化ビーズの間の親和性が高いことが判る。
測定対象となる生体分子として核酸分子を使用する場合には、核酸分子はタンパク質と異なり、負電荷を持ち、その電荷量は、核酸分子の塩基配列には依存せず、核酸分子の塩基長及び分子数に比例するため、実施例5の様にタンパク質の親和性が測定可能であれば、同様に測定可能である。
102、202、302 試料容器
103、203、304、307 一対の電極
104、204、303 交流電圧印加手段
105 光源
106 光
107、207 局所照明手段及び高倍率光学観察
108 像
109 選別光学フィルター
110 光学フィルターによって選別された像
111 イメージセンサ
112 粒子または分子の往復運動
201、213 蛍光粒子または蛍光標識分子
205 蛍光励起光源
206 励起光
208 蛍光励起像
209 蛍光選別光学フィルター
210 光学フィルターによって選別された蛍光励起像
211 蛍光イメージセンサ
212 蛍光照明あるいはエバネッセント照明
302 流路形状を成した試料容器
306 合流フロー式流路の合流部
Claims (11)
- 少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備し、試料容器内で相互作用を判別する生体分子を往復運動させることを特徴とする生体分子の親和性解析装置。
- 前記局所照明手段が蛍光照明による蛍光励起手段であって、蛍光励起光源及び蛍光選別光学フィルターを有することを特徴とする請求項1に記載の生体分子の親和性解析装置。
- 前記局所照明手段がエバネッセント照明による蛍光励起手段であることを特徴とする請求項2に記載の生体分子の親和性解析装置。
- 前記試料容器が流路形状を成し、前記流路内に一対あるいは複数対の電極を配置し、前記電極間の電圧の周波数変化によって、前記生体分子を電気泳動させることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の生体分子の親和性解析装置。
- 少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備する生体分子の親和性解析装置の試料容器に、相互作用を判別する少なくとも2種類の生体分子の混合物の溶液を保持させ、前記電極間に交流電圧を印加することによって生体分子を溶液中で往復運動させ、反応前後の個別の分子の運動の指標の変化を比較することによって、分子の会合状態を評価することを特徴とする生体分子間の親和性を解析する方法。
- 前記生体分子の一方が、生体分子を表面に固定した粒子であることを特徴とする請求項5に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
- 前記生体分子の一方が蛍光標識されていることを特徴とする請求項5又は6に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
- 前記運動の指標が、前記生体分子の最大移動速度または移動距離であることを特徴とする請求項5〜7のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
- 前記試料容器が流路形状を成し、試料溶液を保持する際に、フロー式あるいは合流フロー式流路を用いて、前記電極間の電圧の周波数変化によって、前記生体分子を電気泳動させることを特徴とする請求項5〜8のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
- 前記生体分子の少なくとも一方が核酸分子であることを特徴とする請求項5〜9のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
- 前記生体分子の少なくとも一方がタンパク質であり、前記試料溶液のpHを少なくとも一方のタンパク質の等電点でないpH、あるいは2つの生体分子の等電点に挟まれたpHに調製することを特徴とする請求項5〜10のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
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