JP6637970B2 - 光散乱促進剤としてナノ粒子を用いる分析対象物の検出 - Google Patents

Description

本開示は、溶液中の分析対象物、例えば、タンパク質、核酸、ＤＮＡ、細菌断片、その他の化合物の存在を検出する方法及びシステムに関し、この方法は、光散乱促進剤としてナノ粒子を用いる。

分析対象物、例えば、タンパク質、核酸、ＤＮＡ、細菌断片、その他の化合物）の検出は、分子生物学研究と医学的応用のいずれにおいても重要である。例えば、分析対象物の検出により、試料中のすべての生体分子について、実験的な治療の効果やＤＮＡ突然変異の効果を判断することができる。

分析対象物の検出方法については、いくつかの方法が利用可能である。

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、液体試料又は湿潤試料中の物質、通常は抗原の存在を検出するのに用いられる。ＥＬＩＳＡは、固体表面へ抗原を固定させることと、酵素に結合した抗体と前述の抗原とから錯化合物を生成することを用いる。検出処理は、測定可能な生成物を生成する物質と培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して抱合酵素活性を測定することによって行われる。測定可能な生成物の読み取りは、発光が弱い種類の化学発光を用いて行われる。

蛍光分子の検出に基づくその他の技術は、広く用いられている。これらの技術は、蛍光分子を目当ての分析対象物にグラフト化することと、蛍光発光の分析とを含む。しかしながら、この手法は、グラフト化された対象分子を単離するのに多くの工程を必要とする。また、蛍光信号の弱さ及びグラフト化した分子の光分解によって限定的なものになっている。

これらの問題を回避するために、金ナノ粒子（Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＧＮＰ）がバイオアッセイの開発において注目を集めている。金ナノ粒子は、その径を高い正確さと精度で、広範囲（２〜２５０ｎｍ）に調整することができる。金ナノ粒子は一度調製すれば長期間安定している。また、非常に低い濃度で通常は用いられるため、金ナノ粒子を構成する材料が比較的高価であっても、用いるのは経済的である。金ナノ粒子は、認識分子（抗体、抗原、オリゴヌクレオチドなど）によって容易に官能基化され、これにより非常に安定した抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）となる。金ナノ粒子を用いるアッセイの多くは、金ナノ粒子の光学特性及び触媒特性に基づいている。金属ナノ粒子は、局在表面プラズモン共鳴を示す能力から生じる特有の光学特性を有する。より正確には、局在表面プラズモン共鳴は、入射電磁場と共鳴しているナノ構造伝導帯電子の集団振動である。局在表面プラズモン共鳴のスペクトルは、ナノ構造のサイズ・形状・組成と、周囲環境の誘電率とに、強く依存している。このため、ナノ粒子の溶液は特徴的な色を有し、この色は、ナノ粒子自体の変化、ナノ粒子の構成の変化、又は、その両方に応じて変えられる。ナノ粒子特有のこれらの特性は、金属ナノ粒子ベースのセンサ技術の開発をもたらしている。

例えば、Ｅｌｇｈａｎｉａｎらによって、金ナノ粒子プローブを用いる選択的な比色検出法が開発された（「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２７７ （１９９７）を参照）。金ナノ粒子を含むプローブとターゲットとのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により凝集体が形成され、これによって、赤色（ハイブリダイゼーションのない状態）から紫色（ハイブリダイゼーション）へ、金コロイド溶液の色が視覚的に変化する。

化学的特異性と精度を確保しつつ粒子動力学に関する情報を得るために、Ｊａｎｓらは、光散乱促進剤として金ナノ粒子（ＧＮＰ）プローブを使用することと、読み取りシステムとして動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）とを組み合わせた技術について報告している（「Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ａｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ」（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８１， ９４２５−９４３２ （２００９））。動的光散乱の基本原理は、レーザビームを試料に照射し、粒子のブラウン運動に起因する散乱光の変動を、既知の散乱角で高速光子検出器により検出するというものである。散乱光の変動を固定角で時間の関数として測定する動的光散乱の機器は、限られた粒子径の範囲内において平均粒子径を測定することができる。

同様に、国際公開公報第２００９１１７１６８号は、光散乱促進剤としての金属ナノ粒子と読み取りシステムとしての動的光散乱とを用いて、分析対象物を検出する分析方法に関する。この方法では、金属ナノ粒子は、同一の又は異なる複数の受容体と結合してプローブを形成する。試料溶液は、分析対象物及びプローブを含むと予想される溶液を混合することによって生成される。分析対象物が存在する場合は、この分析対象物はプローブの受容体に結合する。分析対象物の存在を検出するために、試料溶液の方に光が当てられ、試料溶液に散乱された光の経時的な変動が測定される。この測定から、動的光散乱は、溶液中の凝集度を測定して分析対象物の量を定量化するのに用いられる。分析対象物を含む凝集体は、ＤＬＳ信号の性質を分析する際に、単離されたプローブとは区別される。しかしながら、この方法は信号対雑音比が低く、このため感度が限られており特異性が低くなる。

感度とは、単位容積当たりの分析対象物の最小数を検出する能力を意味する。特異性とは、特定の分析対象物を最大の信頼度で識別する能力を意味する。

本発明は、光散乱促進剤としてナノ粒子を用いて、分析対象物の存在を検出する独自の方法及びシステムであって、信号対雑音比に優れ且つ特異性が非常に良好な方法及びシステムを提案する。

本発明の目的は、コンパクトでかつ低コストのシステムを用い、溶液中の分析対象物の存在を良好な特異性及び精度で検出することである。

第１の態様によれば、上述の目的及び更なる利点は、溶液中の分析対象物の存在を検出する方法であって、前記分析対象物に特異的な受容体と結合したナノ粒子をそれぞれ含む、互いに異なる第１のプローブ及び第２のプローブを少なくとも設け、前記第１のプローブ及び第２のプローブの前記受容体は前記分析対象物との結合部位が互いに異なるものであり、かつ、前記第１のプローブ及び第２のプローブの前記ナノ粒子は互いに異なる光学応答を示すものであり、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブと、前記分析対象物を含むと推測される前記溶液とを接触させることにより、試料溶液を生成し、前記試料溶液は、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブと結合した前記分析対象物を含んだ凝集体を含み、互いに異なる第１の励起波長λｅＡ及び第２の励起波長λｅＢを少なくとも有する光源を用いて、前記試料溶液を照射し、前記第１の励起波長及び前記第２の励起波長は、前記試料溶液が照射されると前記第１のプローブ及び前記第２のプローブからそれぞれ特異的な光学応答を得るように選択されており、前記第１のプローブにより散乱された光を第１の検出波長で時間の関数として検出し、且つ、前記第２のプローブにより散乱された光を第２の検出波長λｄＢで時間の関数として検出して、第１の信号及び第２の信号をそれぞれ取得し、前記第１の信号と前記第２の信号との間の時間的な一致を検出する、ことを含む方法により達成される。

本開示において、光学応答は、検出波長の関数として定義することができる。この関数は、ナノ粒子によって散乱された光であって、検出波長での検出における所定立体角内での光の量と、このナノ粒子に入射する光の量との比として与えられる。実際には、広いスペクトル源（「白色光」）を用いてナノ粒子を照射し、検出波長の関数としての散乱光を測定することによって、光学応答を得ることができる。入射光の波長と比較してナノ粒子は非常に小さいため、散乱は等方的であるとみなすことができる。検出の立体角が異なる場合を考慮すれば、光学応答はわずかな変化を示す。

本発明の方法では、１つの分析対象物に結合した２つの異なるプローブを利用する。各プローブは特異的な光学応答を有するので、本方法では、少なくとも第１のプローブ及び第２のプローブと結合した分析対象物によって形成された凝集体を個別に検出することができる。プローブに散乱された光が経時的に同時に検出されると、溶液中に分析対象物が存在することが確認される。本方法では単独のプローブに由来する信号の検出を除くことができるので、特定の分析対象物に特有の特徴を良好な信号対雑音比で得ることができる。

また、ナノ粒子に散乱された光が強いので、非常に感度の高い検出器（例：ガイガーモードのアバランシェフォトダイオード、光電子増倍管等）や、高開口数の顕微鏡対物レンズを用いる必要はない。その結果、コンパクトでかつ低コストの装置を用いて、本明細書に係る方法を実施することができる。

いくつかの好適な実施形態において、第１のプローブのナノ粒子と第２のプローブのナノ粒子とにより散乱された光の検出は、小さな観測体積（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ、通常は１〜１０μｍ^３）で行われる。例えば、共焦点顕微鏡配置（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を用いて、観測体積を制限してもよい。観測体積を制限した場合は、分析対象物が１つのみ観測体積に存在し、これにより検出信号のコントラストが高くなり、分析対象物の存在についての検出精度が向上する。

いくつかの実施形態では、光源は広いスペクトルを有し、第１の波長及び第２の波長を有した１つのビームを用いることができる。このため、システムがさらにコンパクトになる。

あるいは、光源は、独立した２つの発光素子を備えてもよい。これらの発光素子は、それぞれの励起波長で光ビームを放射し、これにより照射工程を良好に制御できるものである。

いくつかの実施形態において、前述した第１の信号と第２の信号との間の時間的な一致の検出は、所定幅の時間窓において散乱光を検出することによって実現する。時間窓の幅は、観測体積における金ナノ粒子−分析対象物凝集体の滞留時間（「拡散時間」とも称する。）に応じて調節される。滞留時間は、通常１〜５０ｍｓの範囲（例：約１０ｍｓ）である。時間窓の幅は、検出器の時間分解能に相当し、数μｓから１ｍｓに設定される。時間的な一致の検出は、リアルタイムで行うことができ、また、両方の信号の事後分析によっても行うことができる。

他のいくつかの実施形態では、前述した第１の信号と第２の信号との間の時間的な一致の検出は、両方の信号間の相互相関データを提供する相関器を用いて行うことができる。相関器は、統合マイクロプロセッサシステムとして機能し得る。

第２の態様によれば、試料溶液が、互いに異なる第１のプローブ及び第２のプローブと少なくとも結合した前記分析対象物を含むと推測され、かつ、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブはそれぞれ前記分析対象物に特異的な受容体と結合したナノ粒子を含む場合に、前記試料溶液中の分析対象物の存在を検出するシステムが提案されている。前記システムは以下のものを備える。前記試料溶液を照射する光源であって、互いに異なる第１の励起波長及び第２の励起波長を少なくとも有し、前記試料溶液が照射されると前記第１のプローブ及び前記第２のプローブからそれぞれ特異的な光学応答を得るように、前記第１の励起波長及び前記第２の励起波長が選択されている光源。前記第１のプローブ及び前記第２のプローブによって散乱された光を集める、第１の光学系。少なくとも１つの検出器であって、前記第１のプローブによって散乱された光を第１の検出波長で時間の関数として検出し、且つ、前記第２のプローブによって散乱された光を第２の検出波長で時間の関数として検出して、第１の信号及び第２の信号をそれぞれ得る検出器。前記第１の信号と前記第２の信号との間の時間的な一致を検出する動作が可能なように、前記検出器に接続された信号解析システム。

前述の装置は高開口数の対物レンズ又は高感度センサを必要としないため、特にコンパクトで２０ｃｍ^３の容積に相当し得ることを、本出願人は示している。

他のいくつかの実施形態では、システムは、凝集体１つだけを検出できる観測体積を画定するように、共焦点ピンホールを備えてもよい。

他のいくつかの実施形態では、信号解析システムは、同時計数器（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）を備えてもよい。

他のいくつかの実施形態では、信号解析システムは、相関器を備えてもよい。

他のいくつかの実施形態では、第１の光学系は、光源によって放射された試料溶液中の光を集束させることにも用いられてもよい。

いくつかの実施形態では、システムは光ファイバを備えていてもよく、光ファイバの一端部（遠位部）が試料溶液の方を向いており、光ファイバの他端部（近位部）が光源及び少なくとも１つの検出器に光学的に接続されている。この実施形態によって、システムは、さらに実用的でかつさらに柔軟になる。

本開示の他の態様及び利点は、次の図面、説明及び添付の特許請求の範囲から明らかになる。

添付図面を参照して、例示のみのために示され限定されない次の説明を読むことにより、本発明がさらに十分に理解され、他の利点及び実施形態が明らかになる。

本明細書に係る、分析対象物を検出するための試料溶液を調製する各工程を示す。 本明細書に係る、分析対象物を検出するための試料溶液を調製する各工程を示す。 本明細書に係る、分析対象物を検出するための試料溶液を調製する各工程を示す。 本明細書に係る方法に適した２種類の異なるプローブの光学応答の例を示す。 プローブＡのみの場合、プローブＢのみの場合、プローブＡ・Ｂのみ（すなわち、分析対象物と結合していない）の場合、プローブＡとＢが分析対象物と結合している場合それぞれにおいての、ある例における信号検出を示す表である。この信号検出は、時間の関数として示されている。 本明細書の例に従う、分析対象物の存在存在を検出するシステムの例を示す。 本明細書の例に従う、分析対象物の存在存在を検出するシステムの例を示す。

ここで、本開示の実施形態について添付図面を参照して詳細に説明する。以下の各実施形態は例示としてのみ解釈されるものであり、本発明の範囲はこれらの実施形態に限定されないものとする。本開示の実施形態の以下の詳細な説明においては、本開示の理解をさらに十分なものとするため、多くの具体的な詳細が示されている。ただし、当業者であれば、これらの具体的な詳細がなくても、本開示を実施できることが明らかである。他の例においては、説明を不要に煩雑にしないために、周知の特徴は詳細に説明していない。

ここでは、「含む」の語については、「含有する」、「備える」と同義語であり（同じ意味を持ち）、包括的又はオープンエンド形式の表現であって未記載のさらなる要素を排除しない。また、ここでは、「約」及び「略」及び「実質的に」の語については、各値から上下前後２０％までの範囲を指す同義語である（同じ意味を持つ）。

図１Ａ〜図１Ｃは、本明細書に係る、分析対象物を検出するための試料溶液を調製する各工程を示している。

分析対象物１を含むと推測される溶液２（図１Ａ）を、第１のプローブＡ及び第２のプローブＢと接触させて（図１Ｂ）、試料溶液３を調整する（図１Ｃ）。

検出される分析対象物１は、例えば、タンパク質（抗原など）、核酸、ＤＮＡ、細菌断片又は他の生体化合物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を含んでもよい。溶液２は、分析対象物を含有する液体、気体媒質又は生物体を含んでもよい。

第１のプローブＡと第２のプローブＢは互いに異なり、このプローブＡ及びＢはそれぞれ、分析対象物１に特異的である受容体と結合した、特異的なナノ粒子を含んでいる。換言すると、第１のプローブＡは第１の受容体と第１のナノ粒子とを含み、第２のプローブＢは第２の受容体と第２のナノ粒子とを含み、少なくとも第２のナノ粒子が第１のナノ粒子とは異なっている。

上記のナノ粒子は、コア（ｈｅａｒｔ）のみ、又は、複数の層を備え得るシェルとコア、いずれから構成されてもよい。当該ナノ粒子は、サイズ、形状、組成、及び／又は材料の点で異なってもよい。また、当該ナノ粒子は、２０〜２００ｎｍの寸法が取り得る。前述のシェルやコアは誘電体又は金属であり、例えば、銀、金、シリカ若しくは他の金属又は誘電体材料から形成されていてもよい。ナノ粒子の形状は、例えば、球状又は棒状であってもよい。幾つかの例を以下に説明する。

各ナノ粒子は、検出される分析対象物に特異的な受容体に結合する。受容体は、天然の受容体（抗体、タンパク質、ＤＮＡ等）でもよく、合成した受容体（分子イオン、ポリマー、他の化学種など）でもよい。プローブＡの受容体は分析対象物の一部と相補的であり、プローブＢの受容体は分析対象物の別の部分と相補的である。各受容体は、対応するナノ粒子と化学結合で接合することができる（例：金から構成されるナノ粒子とチオール基の接合）。

図１Ｃに示すように、プローブＡ及びＢが分析対象物１を含む溶液２と接触すると、これらは、分析対象物１とそれぞれ受容体との間に生じる化学結合によって分析対象物と結合し、凝集体４を形成する。このため、試験される試料溶液３は凝集体４を含む。また、この試料溶液３は、単独のプローブＡ・Ｂと、プローブＡ・Ｂの一方のみと結合した分析対象物から形成された凝集体（図１Ｃでは不図示）との、いずれか又はその両方を含んでもよい。本明細書に係る方法は、プローブＡ・Ｂの両方と結合した分析対象物から形成された凝集体を選択的に検出することを目的とし、信号対雑音比を大きくしている。

２つの異なるプローブＡ・Ｂを用いる方法をこのあと説明するが、ある実施形態（例：三量体などの分析対象物を検出する場合）では、分析対象物１を含むと推測される溶液２を２つよりも多いプローブと接触させることが好適なこともある。この場合、分析対象物と少なくとも３つの異なるプローブとの凝集体が形成される。

ある実施形態においては、溶液２は、同時に検出することを意図するいくつかの異なる分析対象物も含んでもよい。この場合、溶液２は、各分析対象物に特異的な種々のプローブと接触させることで、さらに詳述するように、個別に検出可能な種々の凝集体が形成される。

検出される分析対象物を含むと推測される溶液２が、異なるプローブＡ・Ｂと接触し、これによって試料溶液３が生成される。この試料溶液に、互いに異なる第１の励起波長及び第２の励起波長（λ_ｅＡ、λ_ｅＢ）を少なくとも有する光源により照射される。そして、図４Ａ及び図４Ｂに示されているシステムを用いて、プローブＡ・Ｂのそれぞれによって散乱された光が検出され分析される。これについては、以下にさらに詳しく説明する。

本明細書の実施形態によれば、試料溶液３中の分析対象物１の存在を検出するシステムは、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、互いに異なる２つの励起波長（λ_ｅＡ、λ_ｅＢ）を有する光源１０２及び１０３と、ナノ粒子によって散乱された光を集める光学系１１４（図４Ａ、図４Ｂ）と、第１のプローブＡ及び第２のプローブＢによって散乱された光を時間の関数として検出する、少なくとも１つの検出器（１０４、１０５）と、前述の検出器（１０４、１０５）に連結された信号解析システムであって、検出器によって伝達された信号を解析する信号解析システム１２４とを備える。

各励起波長は、一方のプローブの光学応答を最小にしつつ他方のプローブの光学応答を最大にするように選択されることが好ましい。

本開示において、光学応答は、検出波長の関数として与えられる曲線と定義することができる。この曲線は、ナノ粒子によって散乱された光であって、検出波長での検出における所定立体角内での光の量と、このナノ粒子に入射する光の量との比を示す。

例示目的として、図２には、２つのナノ粒子の光学応答２１及び２３が示してある。第１の金ナノ粒子（「ナノ粒子Ａ」）は４０ｎｍの直径を有し、第２の金ナノ粒子（「ナノ粒子Ｂ」）は直径２５ｎｍかつ長さ６０ｎｍの棒状の形状を有する。このナノ粒子Ａ・Ｂを含有する水溶液に、ハロゲンランプからの白色光の平行ビームを照射する。この平行ビームの伝搬方向は、検出・集光路（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｐａｔｈ）に対して直交するように設定されている。いずれのスペクトルにも特定の中心波長での最大値が含まれている。この最大値は、ナノ粒子Ａでは５４５ｎｍ、ナノ粒子Ｂでは６４０ｎｍであり、ナノ粒子の性質によって異なる。実際には、ナノ粒子によって散乱された光は照射光のスペクトルとほぼ同様のスペクトルを有するので、励起波長で検出を行うことができる。スペクトルが十分に分離されている場合（換言すると、２つのスペクトル間の重なりを最小にした場合）、一方のナノ粒子の光学応答を最小にしつつ他方のナノ粒子の光学応答を最大にする励起波長を選択することができる。これにより、特定の分析対象物の存在の兆候をさらに正確なものとすることができる。従って、励起波長と検出波長は、図２に示すように中心波長からわずかにずれていてもよい。

図４Ａ及び図４Ｂに示すように、いくつかの好適な実施形態において、光源は、独立した２つの発光素子、例えば発光ダイオード又はレーザを備えてもよい。各発光素子は選択された励起波長において光ビームを放射する。

または、光源は、２つの励起波長を含む広いスペクトルを有する発光素子（例：白色発光素子）を備えてもよい。例えば、４００〜８００ｎｍのスペクトルを有するハロゲンランプ又はＬＥＤが挙げられる。この場合、光学スペクトルフィルタを検出チャネルに用いて、検出された光のスペクトル帯域幅を制限してもよい。

光源は、連続モード又はパルスモードで動作させることができる。光源をパルスモードにより動作させる場合、光源のパルスの繰り返し時間が観測体積の金ナノ粒子―分析対象物凝集体の滞留時間よりも比較的短い光源を選択する必要がありうる。

局在表面プラズモン共鳴によって金属ナノ粒子に散乱された光（例として、Ｍａｙｅｒ及びＨａｆｎｅｒ共著、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ２０１１， １１１， ３８２８−３８５７を参照）は、特定の励起波長に強く共鳴するため、いくつかの好適な実施形態においては、金属ナノ粒子を有するプローブが用いられ、検出のコントラスト及び感度が向上する。

また、誘電体ナノ粒子を用いることもでき、この場合には散乱効果の古典的法則が利用される。誘電体ナノ粒子は、金属ナノ粒子よりも低コストであるという利点を持ち得る。しかし、その散乱光は、金属ナノ粒子によって散乱した光よりも通常は強くない。

次の工程は、第１の検出波長λ_ｄＡにおける第１のプローブＡと、観測体積に存在する第２の検出波長λ_ｄＢにおける第２のプローブＢとによって散乱された散乱光を時間の関数として検出することで、第１の信号及び第２の信号をそれぞれ得ることを含む。

観測体積は、システムによって検出可能な試料溶液の体積に相当する。この観測体積は、散乱光を集めるように構成された光学系１１４によって通常は決まるものであり、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、例えば共焦点配置を用いて制限してもよい。

共焦点配置では、散乱光を集めることを意図した光学系１１４の後に、試料の対象領域と共役な面にフィールドピンホール１１８（例：開口部）を配置することにより、焦点からずれた光が除去される。対象領域とピンホール１１８との間において、レンズ１１３は光学系１１４と光学的に共役である。光学系１１４・１１３の組み合わせの物体空間内の被写界深度と、光学系１１４・１１３の組み合わせの物体空間内のピンホールの像の開口とにより、観測体積が定まる。観測体積よりも上又は下にある面からの信号は、共役な像体積（ｉｍａｇｅ ｖｏｌｕｍｅ）よりも上又は下に集束する。この像体積では、集束した像が通過するように開口部が位置するため、これらの信号を集めることは非効率になる。対象の試料中に存在する標識された分析対象物は、凝集体が共焦点体積（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｖｏｌｕｍｅ）に存在する場合にのみ検出される。観測体積を制限した場合は、分析対象物が１つのみ観測体積に存在し、これにより検出信号のコントラストが高くなり、分析対象物の存在についての検出精度が向上する。

いくつかの好適な実施形態において、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、プローブの１つにより散乱された光を検出する２つの異なる検出器１０４、１０５を用いてもよい。これらの検出器のそれぞれは、半導体フォトダイオード、光電子増倍管モジュール、アバランシェ検出器、ＣＭＯＳ又はＣＣＤセンサを含んでもよい。ビームスプリッタ１２２（例：ダイクロイックミラー）は各検出器に散乱光を送るのに用いられる。

各検出器は、特定の波長（例：励起波長に近い波長）での散乱光を検出するように構成されている。好適な実施形態において、検出スペクトル帯域は幅が限られており、１つのナノ粒子からの散乱光が個別に検出されるので、信号対雑音比が大きくなる。いくつかの好適な実施形態において、スペクトル帯域幅は２０ｎｍ未満、好ましくは１０ｎｍ未満である。ダイクロイックミラー１２２は、異なる検出スペクトル帯域を分離するのに用いることができる。また、それぞれの検出チャネルにおいて、特定のスペクトルフィルタも用いることができる。

図２に示されている例において、領域２５及び２７はそれぞれ、ナノ粒子Ａ（直径４０ｎｍの金ナノ粒子）及びナノ粒子Ｂ（直径２５ｎｍかつ長さ６０ｎｍの棒状の金ナノ粒子）の、検出「帯域幅」又は「検出に用いられるスペクトル帯域」を示している。この例では、ナノ粒子Ａによって散乱した光は、約５４５ｎｍ且つスペクトル帯域幅約５ｎｍにおいて検出され、ナノ粒子Ｂによって散乱した光は、約６５０ｎｍ且つスペクトル帯域幅約５ｎｍにおいて検出される。

検出は、十分に長い時間にわたる時間の関数として行われ、通常は１秒以上である。検出器は、シリコンフォトダイオード等を用いて、測定時に、又は時間ゲートモードにおいて、恒久的に信号を取得し得る。検出器の時間分解能は、およそ１０ｍｓの滞留時間よりもはるかに少ないと考えられる１ｍｓ未満であることが好ましい。

図３の表には、観測体積に存在する種々の試料について、各検出器により時間の関数として測定された信号を示す。

第１の例では、１種類のプローブＡのみが観測体積に存在する（試料３０２）。この第１の例では、ナノ粒子Ａの検出波長λ_ｄＡにおける散乱光を検出するように構成された検出器１０４において、信号３１０が観測されるが、ナノ粒子Ｂが観測体積に存在しないので検出器１０５上では信号は観測されない（３１８を参照）。第２の例では、１種類のプローブＢのみが観測体積に存在する（試料３０４）。この第２の例では、ナノ粒子Ｂの検出波長λ_ｄＢにおける散乱光を検出するように構成された検出器１０５において、信号３１２が観測されるが、ナノ粒子Ａが観測体積に存在しないので検出器１０４では信号は観測されない（３２０を参照）。一方で２つの信号３１０及び３１８を、他方では信号３１２及び３２０をそれぞれ解析する場合、２つの信号間に有意な数の時間的な一致は見られない。この結果から、分析対象物が観測体積に存在すると結論づけることはできない。なお、第１の例及び第２の例それぞれのプローブＡ及びＢそれぞれが１種類の分析対象物と結合する場合、観測される信号は同じとなることもある。ただし、分析対象物の存在に関して結論づけられない。

第３の例では、プローブＡ及びプローブＢは観測体積に存在する（試料３０６）が、これらは分析対象物と結合していない。この結果、検出器１０４では信号３１４が観測され、検出器１０５では信号３２２が観測される。ただし、これらの信号は相関しておらず、言い換えると時間の関数として独立して変動する。これは、ナノ粒子Ａ及びＢが互いに独立して観測体積の外にいることもあるからである。２つの信号３１４及び３２２を解析する場合、２つの信号間に有意な数の時間的な一致は見られない。この結果から、分析対象物が観測体積に存在すると結論づけることはできない。

第４の例では、プローブＡとプローブＢはともに観測体積に存在し、同じ分析対象物と結合する（試料３０８）。検出器１０４では信号３１６が観測され、検出器１０５では信号３２４が観測される。これらの信号は相関し、言い換えると協調して変動する。２つの信号間には有意な数の時間的な一致があり（すなわち、時間的な一致のノイズ発生を上回り）、分析対象物の存在に関して結論づけることができる。

時間的な一致が検出されるのは、ナノ粒子のブラウン運動に起因する、散乱光の変動の分析に基づく。また、散乱変動の測定は、相関器を用いて時間的な相互相関を計算することによって行うことができる。同じ共焦点体積内で検出可能な異なる２種のプローブであって、励起特性及び発光特性が明確に異なるプローブを導入することにより、相互相関は標準的な自己相関を拡張する。これは、２つの識別可能なプローブの強度変動を時間的に相関させる。同じ分析対象物に関するこれらの信号プローブの一致は、遅延時間τにおける振幅Ｆの変化として検出される。変動の相互相関関数の一般式を次に示す。

ここで、Ｆ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）は、プローブＡ・Ｂの散乱した光カウント信号であり、＜ ＞は時間の平均を表す。

このため、相互相関では、２つの信号の変動が同じ供給源によって生じる場合に、完全な相関がある。２つの信号が独立して変動する場合、これらの間の相関は常に０である。相互相関モードでは、２つの別個のチャネルからの一致する光子カウントの唯一の対は、正の結果として記録される。

本出願のいくつかの実施形態において、時間的な一致は、検出器に同時に達する（ｓｔｒｉｋｅ）検出信号を記録することが可能な同時計数器を用いて実行することができる。

本出願のいくつかの実施形態では、時間的な一致は、相互相関と同時計数器とを組み合わせて実行することができる。

本出願のいくつかの実施形態では、本発明の方法は、校正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）工程を含んでもよい。校正工程は、プローブＡ及びＢのみを含有し分析対象物を含有しない校正溶液を用いて、第１の検出波長及び第２の検出波長における散乱光を検出することを含む。このため、２つの信号（ノイズ閾値）間の時間的な一致の数を評価することによって、検出のノイズを推定することが可能である。このようにして、時間的な一致の数は、推定されるノイズ閾値を上回っている場合、有意であると考えることができる。

上述した図３の記載によって説明したように、本発明の方法は、１つの分析対象物と結合した２つの異なるプローブを利用する。各プローブは特異的な光学応答を有するため、２つの特異的な光学応答が同時に検出される場合、溶液中の分析対象物の存在が確認される。この方法によって、特定の分析対象物の存在に特有の特徴を得ることができる。

また、本開示に係る方法によって生じたデータから、様々な情報を得ることができる。例えば、この情報は、分析対象物の存在、溶液中の分析対象物の濃度・サイズ・動態などを含み、通常はＤＬＳ信号から得られる（Ｊａｎｓら、「Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ａｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂｉｏ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ）」、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８１， ９４２５−９４３２ （２００９）を参照）。

上述の例を２つの別個の検出器を用いて説明してきたが、１つの検出器のみを用いてもよい。検出器が１つの場合は、独立した２つの光源を用いることができる。これにより、１つの検出器によって、広いスペクトル上で検出することができ、独立した光源それぞれと同期させることができる。

図４（ａ）及び（ｂ）には、本明細書に係る、分析対象物の存在を検出する装置１００と２００による、異なる実施形態が示されている。

本明細書の例に係る分析対象物の存在を検出する装置は、光源１０２・１０３と、第１の光学系１１４と、検出器１０４・１０５と、信号解析システム１２４とを備える。

図４（ａ）及び（ｂ）の例において、光源は、試料溶液３を照射する、独立した２つの発光素子１０２、１０３を備えている。独立した２つの発光素子は、互いに異なる第１の励起波長及び第２の励起波長（λ_ｅＡ、λ_ｅＢ）をそれぞれ有する光ビームを放射する。これらの励起波長は、プローブＡ及びＢから特異的な光学応答を得るように構成されている。

第１の光学系１１４、例えばレンズ、複数のレンズ又は顕微鏡対物レンズは、観測体積のナノ粒子によって散乱した光を集めるのに用いられ、散乱光が戻り光ビームを構成している。

本発明の一実施形態において、本発明の装置は、光源によって放射された試料溶液中の光ビームを集束させる、第２の光学系を備えてもよい。

前に述べた本発明の一実施形態において、図４（ｂ）に示すように、第１の光学系と第２の光学系は同じである。第１の光学系も、光源によって放射された光を前記試料溶液中に集束させるのに用いられる。この場合、独立した２つの発光素子によって放射された光ビームを前述した第１の光学系に到達させるように、半反射ミラーを用いることができる。

本発明の一実施形態において、試料３の観測体積は、共焦点配置を用いてさらに制限してもよい。図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、共焦点配置は、レンズ１１３と、レンズ１１３の焦点に配置されたピンホール１１８とを備える。ピンホール１１８の寸法は、調節可能であるのが好適である。

本発明の一実施形態において、図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、第１のプローブ（Ａ）に散乱された光と第２のプローブ（Ｂ）に散乱された光を分離し且つこれらを各検出器に導くために、戻り光ビームの光路にスペクトルセパレータ１２２を配置してもよい。このセパレーターはダイクロイックフィルタでもよく、例えば、戻り光ビームの光路に対し４５°の角度で配置される。

検出器１０４及び１０５は、第１のプローブＡ及び第２のプローブＢそれぞれに散乱された光を受け、第１の検出波長（λ_ｄＡ）及び第２の検出波長（λ_ｄＢ）それぞれで散乱光を検出するように構成されている。

検出器は、前述した第１の信号と第２の信号との間の時間的な一致を検出するように、信号解析システムに動作可能に接続してもよい。信号解析システム１２４は、受信したデータを数値的に処理することが可能な、同時計数器、相関器、又は、その両方を備えてもよい。特に、同時計数器は、異なる時間窓における、検出散乱光の強度値を記録することができる。相関器は、受信した光強度変動の時間的分析を行うことができる。

本発明の一実施形態において、図４（ｂ）に示すように、第１の光学系と検出チャネルとの間に、光ファイバ１１２を配置してもよい。ファイバ１１２の一端部（遠位部）は、レンズ１１４及び試料溶液の方を向いている。ファイバ１１２の他端部（近位部）は、光源及び少なくとも１つの検出器に光学的に接続されており、光源によって放射された光を試料溶液の方に導き、試料溶液によって散乱した光をレンズ１１０及び検出器の方に導いている。

当業者であれば、共焦点配置について別の手段を用い得ることに気付くであろう。例えば、ピンホールを、金属板の穴又は光ファイバに換えることができる。また、光ファイバのコア径を有用な開口に設定できる。

本発明の一実施形態において、溶液２は、同時に検出することを意図するいくつかの異なる分析対象物を含んでもよい。この場合、溶液２は、それぞれの分析対象物に特異的な種々のプローブと接触させてもよい。これによって、個別に検出可能な種々の凝集体が形成される。この場合、それぞれのプローブに散乱された光は、特定の検出波長において検出される。そして、時間的な一致は、同じ凝集体に結合したプローブに散乱された光に起因する２つの信号間で検出することができる。このため、同じ試料溶液中の異なる分析対象物の存在を同時に検出することが可能である。

上述のシステムは、液体培地による生物学的試験の分野、具体的には、科学研究、医学検査、食品業界での分析、化学及び医薬業界並びに防衛において多くの用途を提供する。

本発明の先述した実施形態は例として示したものであり、いかなる方法においても限定的するものではない。当業者であれば、本特許の枠組みの中で本発明の種々の選択肢を実現できることは明らかである。

Claims (12)

1. 溶液（２）中の分析対象物（１）の存在を検出する方法であって、
   前記分析対象物（１）に特異的な受容体と結合したナノ粒子をそれぞれ含む、互いに異なる第１のプローブ（Ａ）及び第２のプローブ（Ｂ）を少なくとも設け、
   前記第１のプローブ（Ａ）及び第２のプローブ（Ｂ）の前記受容体は前記分析対象物（１）との結合部位が互いに異なるものであり、かつ、前記第１のプローブ（Ａ）及び第２のプローブ（Ｂ）の前記ナノ粒子は互いに異なる光学応答を示すものであり、
   前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）と、前記分析対象物（１）を含むと推測される前記溶液（２）とを接触させることにより、試料溶液（３）が生成され、前記試料溶液（３）は、前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）と結合した前記分析対象物（１）を含んだ凝集体（４）を含み、
   互いに異なる第１の励起波長（λ_ｅＡ）及び第２の励起波長（λ_ｅＢ）を少なくとも有する光源を用いて、前記試料溶液（３）を照射し、前記第１の励起波長及び前記第２の励起波長は、前記試料溶液が照射されると前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）からそれぞれ特異的な光学応答を得るように選択されており、
   前記第１のプローブ（Ａ）により散乱された光を第１の検出波長（λ_ｄＡ）で時間の関数として検出し、且つ、前記第２のプローブ（Ｂ）により散乱された光を第２の検出波長（λ_ｄＢ）で時間の関数として検出して、第１の信号及び第２の信号をそれぞれ取得し、
   前記第１の信号と前記第２の信号との間の時間的な一致を検出する、
   ことを含む方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）のそれぞれにより散乱された光を検出することは、共焦点顕微鏡配置を用いて制限された観測体積において行われることを特徴とする方法。
3. 請求項１及び２のいずれかに記載の方法であって、
   前記ナノ粒子が金属ナノ粒子であることを特徴とする方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
   後方散乱光が検出されることを特徴とする方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、
   前記第１の信号と前記第２の信号との間の時間的な一致を検出することは、所定幅の時間窓において散乱光を検出することによって行われることを特徴とする方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、
   前記第１の信号と前記第２の信号との間の時間的な一致を検出することは、相関器を用いて行われることを特徴とする方法。
7. 試料溶液（３）中の分析対象物（１）の存在を検出するシステム（１００、２００）であって、
   前記試料溶液（３）は、互いに異なる第１のプローブ（Ａ）及び第２のプローブ（Ｂ）と少なくとも結合した前記分析対象物を含むと推測され、かつ、前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）はそれぞれ前記分析対象物に特異的な受容体と結合したナノ粒子を含み、
   前記第１のプローブ（Ａ）及び第２のプローブ（Ｂ）の前記受容体は前記分析対象物（１）との結合部位が互いに異なるものであり、かつ、前記第１のプローブ（Ａ）及び第２のプローブ（Ｂ）の前記ナノ粒子は互いに異なる光学応答を示すものであり、
   前記試料溶液（３）を照射する光源（１０２、１０３）であって、互いに異なる第１の励起波長（λ_ｅＡ）及び第２の励起波長（λ_ｅＢ）を少なくとも有し、前記試料溶液が照射されると前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）からそれぞれ特異的な光学応答を得るように、前記第１の励起波長及び前記第２の励起波長が選択されている光源（１０２、１０３）と、
   前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）によって散乱された光を集める、第１の光学系と、
   少なくとも１つの検出器（１０４、１０５）であって、前記第１のプローブ（Ａ）によって散乱された光を第１の検出波長（λ_ｄＡ）で時間の関数として検出し、且つ、前記第２のプローブ（Ｂ）によって散乱された光を第２の検出波長（λ_ｄＢ）で時間の関数として検出して、第１の信号及び第２の信号をそれぞれ得る検出器（１０４、１０５）と、
   前記第１の信号と前記第２の信号との間の時間的な一致を検出する動作が可能なように、前記検出器（１０４、１０５）に接続された信号解析システム（１２４）
   とを備えるシステム。
8. 請求項７に記載のシステム（１００、２００）であって、
   前記試料溶液（３）は、前記第１のプローブ（Ａ）及び前記第２のプローブ（Ｂ）と結合した前記分析対象物（１）を含んだ凝集体（４）を含み、
   前記凝集体１つだけを検出できる観測体積を画定するように、共焦点ピンホール（１１８）をさらに備えることを特徴とするシステム。
9. 請求項７又は８に記載のシステム（１００、２００）であって、
   前記信号解析システムが同時計数器（１１８）を備えることを特徴とするシステム。
10. 請求項７〜９のいずれか１項に記載のシステム（１００、２００）であって、
    前記システム（１００、２００）が相関器（１１８）を備えることを特徴とするシステム。
11. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載のシステム（１００、２００）であって、
    前記第１の光学系が、前記光源によって放射された光を前記試料溶液中に集束させることにも用いられることを特徴とするシステム。
12. 請求項１１に記載のシステム（１００、２００）であって、
    前記システムは光ファイバをさらに備え、
    前記光ファイバの一端部が前記試料溶液の方を向いており、
    前記光ファイバの他端部が前記光源及び前記少なくとも１つの検出器に光学的に接続されていることを特徴とするシステム。