JP4814944B2 - キャピラリー電気泳動法による試料の分析方法 - Google Patents
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Description
前記キャピラリー電気泳動法に用いるキャピラリー管を準備する工程と、
前記キャピラリー管中において、試料と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する工程とを含み、
前記キャピラリー管が、前記キャピラリー管内壁に、下記A層が積層され、前記A層の上に、下記B層が積層されたキャピラリー管であることを特徴とする。
A層:ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(Polydiallyldimethylammoniumchloride)、無極性重合体および陽極性基含有化合物からなる群から選択される少なくとも一つから形成され、
前記ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドを含む場合は、前記ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドが物理的吸着により前記キャピラリー管内壁に固定され、
前記無極性重合体および前記陽極性基含有化合物の少なくとも一方を含む場合は、前記無極性重合体および前記陽極性基含有化合物の少なくとも一方が共有結合により前記キャピラリー管内壁に固定された介在層
B層:前記試料と複合体を形成する陰極性基含有化合物と同一又は異なる陰極性基含有化合物から形成された陰極性層
溶融シリカ製のキャピラリー管(全長32cm、有効長8.5cm、内径50μm)を準備した。このキャピラリー管に、水酸化ナトリウム水溶液(1mol/L)を圧力0.1MPa(1000mbar)で10分間通液し、ついで、精製水を前記と同じ圧力で20分間通液して洗浄した。つぎに、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド水溶液(10重量%)を、前記と同じ圧力で30分間通液し、ついで、精製水を、前記と同じ圧力で20分間通液することで、前記キャピラリー管の内壁に、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド製のA層を形成した。つぎに、100mMリンゴ酸とアルギニン酸水溶液に、0.5重量%の割合でコンドロイチン硫酸を添加したランニングバッファー(pH5.5)を準備した。このランニングバッファーを、前記A層が形成されたキャピラリー管に、前記と同じ圧力で通液して、前記A層の上に、前記B層を形成した。前記キャピラリー管内にランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビンを精製水に溶解した試料を前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を10kVで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン含有試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、415nmの吸光度で検出した。この結果を、図1のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常ヘモグロビン(HbA0)と糖化ヘモグロビン(HbA1c)を分離して検出することができた。また、本実施例で用いたキャピラリー管は、洗浄した後、前述のようにしてランニングバッファーを通液しただけで前記B層が形成されて、直ぐに分析可能となった。
内壁にアミノ基を有するシリル化剤が共有結合で固定されて形成されたA層を有する溶融シリカ製のキャピラリー管(全長32cm、有効長8.5cm、内径50μm)を準備した。このキャピラリー管に、精製水を圧力0.1MPa(1000mbar)で20分間通液して洗浄した。つぎに、100mMリンゴ酸とアルギニン酸水溶液に、0.5重量%の割合でコンドロイチン硫酸を添加したランニングバッファー(pH5.5)を準備した。このランニングバッファーを、前記キャピラリー管に、前記と同じ圧力で通液して、前記A層の上に、前記B層を形成した。前記キャピラリー管内にランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビンを精製水に溶解した試料を前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を10kVで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン含有試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、415nmの吸光度で検出した。この結果を、図2のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常ヘモグロビン(HbA0)と糖化ヘモグロビン(HbA1c)を分離して検出することができた。また、本実施例で用いたキャピラリー管は、洗浄した後、前述のようにしてランニングバッファーを通液しただけで前記B層が形成されて、直ぐに分析可能となった。そこで、前記と同じ試料で同じ分析を10回実施して、再現性を評価した。この結果を下記表1に示す。下記表1において、相対面積(%)は、全ピーク面積に対する正常ヘモグロビン(HbA0)および糖化ヘモグロビン(HbA1c)の各ピーク面積の比率(%)である。下記表1に示すように、正常ヘモグロビン(HbA0)および糖化ヘモグロビン(HbA1c)のそれぞれにおいて、変動係数(CV)の値が小さく、これにより、本発明の分析方法は、再現性に優れるといえる。
内壁にアミノ基を有するシリル化剤が共有結合で固定されて形成されたA層を有する溶融シリカ製のキャピラリー管(全長32cm、有効長8.5cm、内径50μm)を準備した。このキャピラリー管に、精製水を圧力0.1MPa(1000mbar)で20分間通液して洗浄した。つぎに、100mMリンゴ酸とアルギニン酸水溶液に、0.8重量%の割合でアルギン酸ナトリウムを添加したランニングバッファー(pH5.5)を準備した。このランニングバッファーを、前記キャピラリー管に、前記と同じ圧力で通液して、前記A層の上に、前記B層を形成した。前記キャピラリー管内にランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビンを精製水に溶解した試料を前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を10kVで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン含有試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、415nmの吸光度で検出した。この結果を、図3のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常ヘモグロビン(HbA0)と糖化ヘモグロビン(HbA1c)を分離して検出することができた。また、本実施例で用いたキャピラリー管は、洗浄した後、前述のようにしてランニングバッファーを通液しただけで前記B層が形成されて、直ぐに分析可能となった。
内壁にアミノ基を有するシリル化剤が共有結合で固定されて形成されたA層を有する溶融シリカ製のキャピラリー管(全長32cm、有効長8.5cm、内径50μm)を準備した。このキャピラリー管に、精製水を圧力0.1MPa(1000mbar)で20分間通液して洗浄した。つぎに、100mMリンゴ酸とアルギニン酸水溶液に、0.5重量%の割合でヘパリンナトリウムを添加したランニングバッファー(pH5.5)を準備した。このランニングバッファーを、前記キャピラリー管に、前記と同じ圧力で通液して、前記A層の上に、前記B層を形成した。前記キャピラリー管内にランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビンを精製水に溶解した試料を前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を10kVで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン含有試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、415nmの吸光度で検出した。この結果を、図4のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常ヘモグロビン(HbA0)と糖化ヘモグロビン(HbA1c)を分離して検出することができた。また、本実施例で用いたキャピラリー管は、洗浄した後、前述のようにしてランニングバッファーを通液しただけで前記B層が形成されて、直ぐに分析可能となった。
内壁にポリ(ジメチルシロキサン)が共有結合で固定されて形成されたA層を有する溶融シリカ製のキャピラリー管(全長32cm、有効長8.5cm、内径50μm)を準備した。このキャピラリー管に、精製水を圧力0.1MPa(1000mbar)で20分間通液して洗浄した。つぎに、100mMリンゴ酸とアルギニン酸水溶液に、1.0重量%の割合でコンドロイチン硫酸を添加したランニングバッファー(pH5.5)を準備した。このランニングバッファーを、前記キャピラリー管に、前記と同じ圧力で通液して、前記A層の上に、前記B層を形成した。前記キャピラリー管内にランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビンを精製水に溶解した試料を前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を10kVで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン含有試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、415nmの吸光度で検出した。この結果を、図5のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常ヘモグロビン(HbA0)と糖化ヘモグロビン(HbA1c)を分離して検出することができた。また、本実施例で用いたキャピラリー管は、洗浄した後、前述のようにしてランニングバッファーを通液しただけで前記B層が形成されて、直ぐに分析可能となった。そこで、前記と同じ試料で同じ分析を10回実施して、再現性を評価した。この結果を下記表2に示す。下記表2において、前記表1と同様に、相対面積(%)は、全ピーク面積に対する正常ヘモグロビン(HbA0)および糖化ヘモグロビン(HbA1c)の各ピーク面積の比率(%)である。下記表2に示すように、正常ヘモグロビン(HbA0)および糖化ヘモグロビン(HbA1c)のそれぞれにおいて、変動係数(CV)の値が小さく、これにより、本発明の分析方法は、再現性に優れるといえる。
Claims (10)
- キャピラリー電気泳動法による試料の分析方法であって、
前記キャピラリー電気泳動法に用いるキャピラリー管を準備する工程と、
前記キャピラリー管中において、試料と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する工程とを含み、
前記キャピラリー管が、前記キャピラリー管内壁に、下記A層が積層され、前記A層の上に、下記B層が積層されたキャピラリー管であることを特徴とする分析方法。
A層:ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(Polydiallyldimethylammoniumchloride)、無極性重合体および陽極性基含有化合物からなる群から選択される少なくとも一つから形成され、
前記ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドを含む場合は、前記ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドが物理的吸着により前記キャピラリー管内壁に固定され、
前記無極性重合体および前記陽極性基含有化合物の少なくとも一方を含む場合は、前記無極性重合体および前記陽極性基含有化合物の少なくとも一方が共有結合により前記キャピラリー管内壁に固定された介在層
B層:前記試料と複合体を形成する陰極性基含有化合物と同一又は異なる陰極性基含有化合物から形成された陰極性層 - 前記A層に、前記試料と複合体を形成する陰極性基含有化合物と同一の陰極性基含有化合物を含む液を接触させることにより、前記B層を形成する請求項1記載の分析方法。
- 前記試料と複合体を形成する陰極性基含有化合物と同一の陰極性基含有化合物を含む液が、前記試料と複合体を形成する陰極性基含有化合物と同一の陰極性基含有化合物を含むランニングバッファーである請求項2記載の分析方法。
- 前記キャピラリー管内壁に、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドを含む液を接触させることにより、前記キャピラリー管内壁にポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド製のA層を形成する請求項1から3のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記キャピラリー管において、陰極性基含有化合物を含むランニングバッファーに試料を添加し、ついで、前記キャピラリー管の両端を印加して、前記試料と陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動する請求項1から4のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記試料と複合体を形成する陰極性基含有化合物及び前記B層の陰極性基含有化合物の少なくとも一方が、陰極性基含有多糖類である請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記陰極性基含有多糖類が、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類およびリン酸化多糖類からなる群から選択される少なくとも一つの多糖類である請求項6記載の分析方法。
- 前記硫酸化多糖類が、コンドロイチン硫酸である請求項7記載の分析方法。
- 前記無極性重合体が、シリコーン重合体であり、前記陽極性基含有化合物が、アミノ基およびアンモニウム基の少なくとも一方の陽極性基を有するシリル化剤である請求項1から8のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記試料が、ヘモグロビンを含む試料である請求項1から9のいずれか一項に記載の分析方法。
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