JP5320416B2 - 電気泳動装置，キャピラリアレイ、及びキャピラリユニット - Google Patents

Description

本発明は核酸やタンパク質等を電気泳動により分離分析する技術に関し、例えば、キャピラリ電気泳動装置に関する。

ＤＮＡの塩基配列及び塩基長の決定等を目的として、キャピラリを用いた電気泳動法が用いられている。

複数のキャピラリへの光照射方式の一つに、特許文献１に記載されているマルチフォーカス方式がある。この方式では、平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリに次々と伝搬してキャピラリアレイを横断し、キャピラリアレイにおいて発生する発光を光検出器によって検出する。蛍光色素によって標識されたＤＮＡを含む試料をキャピラリ内に導入し、１列に並べられた複数のキャピラリを伝播するようにレーザ光を照射している。キャピラリに照射されたレーザ光によって、蛍光標識されたＤＮＡは蛍光を発する。キャピラリの各々からの蛍光を測定することにより、各キャピラリに導入された試料のＤＮＡ解析を行うことができる。タンパク質等の解析を行う場合も同様である。

米国特許第５５８２７０５号公報

本発明者が鋭意検討した結果、次のような課題が判明した。

上記の複数のキャピラリから構成されるキャピラリアレイ装置では、複数のキャピラリが一体で構成されているため、以下に示す通り分離媒体であるポリマーを無駄に消費してしまうという問題がある。 例えば、８本のキャピラリ電気泳動装置において、４個のサンプルを測定する場合、４本のキャピラリのみ使用するものの、残り４本のキャピラリにもポリマーを注入することになる。ランニングコストの上昇をもたらすという問題が存在する。

一方で、上記キャピラリアレイにポリマーを注入するためのポンプ機能から構成されている装置において、稼動頻度が少なく、週１から２回程度の場合、その数回のために、ポンプ内流路をポリマーで満たしたり、メンテナンスとしての洗浄のために、大量のポリマーを消費してしまい、ランニングコストが上昇するとともに、性能を維持のために、常時メンテナンスを行うことが必要であるといった問題がある。

本発明は、平面上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの端のキャピラリに励起光を照射し、前記励起光が隣接するキャピラリに次々と伝搬してキャピラリアレイを横断し、キャピラリアレイにおいて発生する発光を、集光・光検出器上に結像する発光伝達・検出系を有するキャピラリアレイ電気泳動装置において、前記複数のキャピラリは電気泳動装置に対して、分離媒体が封入された状態で、１本ずつ独立に脱着可能であり、装置の陰極側のキャピラリ末端が、個別の穴の開いた樹脂部材に接続され、装置の陽極側のキャピラリ末端が、個別の穴に開いた樹脂部材に接続され、陰極陽極側のどちらも、緩衝液面に対して垂直に装置に接続されることを特徴とするキャピラリアレイ電気泳動装置を提供する。

また、本発明は、上記前記１本ごとに脱着可能な複数のキャピラリからなるキャピラリアレイを構成し、ポリマー詰め替え用ポンプ機能を必要としないことを特徴とする電気泳動装置を提供する。

また、上記前記１本ごとに脱着可能なキャピラリは、分離媒体であるポリマーが封入され、両端は密封された状態で保管され、使用毎、装置取り付け前に陰極側の密閉を取り外すことで、使用可能になる。

複数の異なる種類のサンプルを同時に分析する際、サンプルごとに適切な長さのキャピラリ、適切な分離媒体を選択することが可能なキャピラリ電気泳動装置を提供する。

平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリに次々と伝搬する光照射方式である電気泳動装置において、サンプル数に応じて必要なキャピラリ数を使用することができる。また、使用毎に新しい分離媒体を含んだキャピラリを装着し、分析を行うことができる。

分離媒体であるポリマーの詰め替え用ポンプを使用しないため、メンテナンスが不要である。

本実施例にかかる電気泳動装置の概略図である。 本発明の第１の実施形態であるキャピラリユニットの概略図である。 図２のＡ部を拡大して示す図である。 図２のＢ部を拡大して示す図である。 図２のＣ部を拡大して示す図である。 本発明の第１の実施形態であるキャピラリの陽極側の概略図である。 本発明の第１の実施形態であるキャピラリの陰極側の概略図である。 本発明の第１の実施形態であるマルチキャピラリの照射検出部の概略図である。 本発明の第２の実施形態である異なる長さのキャピラリ装着時の電気泳動装置の概略図である。 本発明の第３の実施形態による外部ポリマー詰め替え機構概略図である。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と利益を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

図１は、本実施例にかかる電気泳動装置の概略図である。以下、図１を参照して、本装置の構成について説明する。

本装置は、サンプルを光学的に検出するための検出部１１６，キャピラリを恒温に保つための恒温槽１１８，キャピラリ陰極端に様々な容器を搬送するための搬送機１２５，キャピラリに高電圧を加えるための高圧電源１０４，高圧電源から発せられる電流を検出するための第１電流計１０５，陽極側電極に流れる電流を検出するための第２電流計１１２，単数もしくは複数本のキャピラリユニット１０３により構成されるキャピラリアレイ１１７により構成される。

キャピラリアレイ１１７は、独立に脱着可能な４本のキャピラリユニット１０３から構成され、ポリイミドでコーティングをされたキャピラリ１０２を含む交換部材であり、キャピラリ陰極端１２７，検出部１１６、及びキャピラリ陽極端１０６となるキャピラリヘッドを含む。測定手法を変更する場合、キャピラリアレイを置き換え、キャピラリの長さを調節する。また、キャピラリに破損や品質の劣化が見られたとき、新品のキャピラリアレイに交換する。

キャピラリは、内径数十〜数百ミクロン，外形数百ミクロンのガラス管で構成され、強度を向上させるために表面をポリイミドでコーティングしている。ただし、レーザ光が照射される光照射部は、内部の発光が外部に漏れやすいように、ポリイミド被膜が除去された構造になっている。キャピラリ１０２の内部は、電気泳動時に泳動速度差を与えるための分離媒体が充填される。分離媒体は流動性と、非流動性の双方が存在するが、本実施例では流動性のポリマーを用いる。

検出部１１６は、試料に依存した情報を取得する部材であり、励起光が照射され、試料に依存した波長の光を放出する。各４本のキャピラリの検出部は、キャピラリ検出部取付部１０８に取り付けられ、光照射部近傍を、光学フラット平面に高さ数ミクロンの精度で配列固定している。

光学系照射検出部は、検出部１１６を照射するための光源１１４と、検出部１１６内の発光を検出するための光学検出器１１５で構成されている。電気泳動時、レーザ光１０９が照射され、全ての光照射部を連続して透過する。このレーザ光により、試料から情報光（試料に依存した波長を有する蛍光）が生じ、光照射部から外部に放出される。この情報光を光学検出器１１５により検出して、試料を分析する。レーザ光は、キャピラリ検出部取付部１０８に固定されたすべてのキャピラリ検出部を照射し、光学検出器は、すべてのキャピラリから発した蛍光を検出する。

キャピラリ陰極端１２７は、それぞれ金属製の中空電極１２６を通して固定されており、キャピラリ先端が中空電極１２６から０.５mm程度突き出た状態になっている。また、キャピラリ毎に装備された中空電極１２６は、各キャピラリユニット１０３ごとに、装置に付属したロードヘッダ１２９に装着される。さらに、すべての中空電極１２６は、ロードヘッダ１２９を介して装置本体に搭載されている高圧電源１０４と導通しており、電気泳動やサンプル導入など電圧を印加する必要がある際に陰極電極として動作する。

キャピラリ陰極端１２７の反対側のキャピラリ陽極端１０６は、ブロック１０７に気密に接続できる。そして、ブロック１０７内には、陽極バッファ１１０が満たされており、キャピラリ陽極端１０６は、キャピラリヘッド接続部１１３を介して、陽極バッファに接続される。ブロック１０７には、複数のキャピラリヘッド接続部が設けられており、キャピラリ毎に接続され、陽極バッファに浸ることで、陽極電極として動作する。

恒温槽１１８は、恒温槽内を一定の温度に保つために、断熱材で覆われ、加熱冷却機構により温度が制御される。また、ファン１１９が恒温槽内の空気を循環及び攪拌させ、キャピラリアレイ１１７の温度を位置的に均一かつ一定に保つ。

搬送機１２５は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備えており、上下，左右、および奥行き方向の３軸に移動可能である。また、搬送機１２５の移動ステージ１３０には少なくとも１つ以上の容器を載せることができる。さらに移動ステージ１３０には電動のグリップ１３１が備えられており、各容器を掴むことや放すことができる。このため、バッファ容器１２１，洗浄容器１２２，廃液容器１２３及びサンプル容器１２４を必要に応じて、陰極端まで搬送できる。尚、不必要な容器は、装置内の所定収容所に保管されている。

装置本体１０１は、制御用コンピュータ１２８と通信ケーブルで接続された状態で使用される。オペレータは、制御用コンピュータ１２８により、装置の保有する機能を制御し、装置内の検出器で検出されるデータを授受できる。

図２に本装置のキャピラリユニットの模式図を示し、一例について説明する。

図２に示すように、キャピラリユニットは１本のキャピラリからなり、キャピラリ陽極端１０６，検出部１１６，キャピラリ陰極端１２７から構成されている。キャピラリ内には、分離媒体であるポリマーが封入されている。

図３は、キャピラリ陽極端の詳細断面を示す。キャピラリは、接着材２０３を用いてキャピラリヘッド２０１に固定されている。キャピラリヘッドは、絶縁性の樹脂材料である。キャピラリ内には、分離媒体であるポリマー２０４が、あらかじめ注入されており、陽極密閉材２０２で、封入されており、キャピラリ保管中に、外気と触れることはないものの、陽極密閉材は、導電性物質からなっており、電気的に外部との導通が確保される。そのため、陽極側バッファに浸した場合、陽極電極とキャピラリ内部のポリマー間の導通を取ることができる。つまり、キャピラリ中に気泡を入れることなく、ポリマーを固定したまま、電気泳動を行うことができる。陽極密閉材の材質は、導電性樹脂であり、高電圧下で安定なものが望まれる。

また、陽極密閉材は、使用前にはずすことも可能であり、装置自身は、キャピラリヘッドを直接装置側のブロック１０７に接続して、電気泳動を行うことができる。

図４は、キャピラリユニットの検出部１１６を示す。キャピラリは石英のガラス管がポリマー薄膜で覆われたものであるが、検出部においては、ポリマー被膜が除去され、石英がむき出しの状態になっている。石英管の内径／外径は５０／３２０μｍ、ポリマー薄膜を含めたキャピラリ外径は３６３μｍである。キャピラリは被覆除去部２０７を保護するような形で、基準ベース２０６に固定される。各キャピラリの検出部は、基準ベースを取付基準として、キャピラリ検出部取付部１０８に取り付けられ、複数のキャピラリからなる検出部を構成する。詳細は、図８で示す。

図５は、キャピラリ陰極端の断面図を示す。キャピラリは、接着材２０３を用いて中空電極１２６に固定されている。キャピラリ内には、分離媒体であるポリマー２０４が、あらかじめ注入されており、キャピラリユニット保管時は、陰極密閉材２０５で、封入されており、キャピラリ保管中に、外気と触れることはない。陽極密閉材は、キャピラリユニットを装置へ装着する際、つまり分析前に、取り外される。

次に、図６から図８を用いて、キャピラリユニットの装置装着方法及び蛍光検出方法について示す。

図６は、キャピラリユニットの陽極側接続を示す。陽極側には、陽極バッファ１１０を蓄えたブロック１０７が装置に取り付けられている。陽極バッファ１１０は、電極１１１を介して、グランドに接続している。陽極バッファ１１０は交換可能であり、必要に応じて、ユーザが入れ替えることができる。ブロック１０７には、接続可能なキャピラリと同数のキャピラリヘッド接続部１１３が取り付けられている。キャピラリヘッド接続部１１３は、耐電圧性の高い樹脂材で製作されており、キャピラリヘッドの直径とほぼ同等の穴が設けられており、この穴を利用し、キャピラリヘッドは、ブロックに固定される。また、この穴を通して、キャピラリヘッドは、陽極バッファに浸ることになり、キャピラリ内部のポリマーと溶液バッファ，グランド間に導通が確保される。

図７は、キャピラリユニットの陰極側接続を示す。陰極側は、中空電極１２６を接続し、固定するための、ロードヘッダ１２９が、装置に取り付けられている。ロードヘッダ１２９内には、中空電極１２６を固定するための、接続可能なキャピラリと同数の陰極接続子４０１が組み込まれている。各キャピラリユニットの中空電極は、陰極接続子に２点で接触し、装置に付属したロードヘッダ１２９に、中空電極は、垂直に装着される。さらに、陰極接続子は、高圧電源１０４と導通しているので、すべての中空電極１２６は、ロードヘッダを介して装置本体に搭載されている高圧電源１０４と導通することになる。中空電極１２６が、電気泳動やサンプル導入など電圧を印加する必要がある際に陰極電極として動作する。

図８は、キャピラリユニットの検出部の取付方法及び、複数のキャピラリの照射及び励起光検出について示す。キャピラリユニットでは、キャピラリを、基準ベース２０６上にならべて固定している。その独立な各キャピラリユニットは、キャピラリ検出部取付部１０８上に、取付面を基準として配列され、複数のキャピラリアレイを形成する。

キャピラリ検出部取付部上の４本のキャピラリの中心軸が形成する平面およびその平面を全空間に延長した仮想の平面を、キャピラリ配列平面と呼ぶ。また、キャピラリ配列平面にあって、４本のキャピラリ軸に垂直であり、検出部の中央を貫く仮想の直線を、以下光軸基本軸と呼ぶ。キャピラリアレイ片側から導入されるレーザ光１０９は、キャピラリ配列平面に対して平行であり、光軸基本軸と同軸である。

キャピラリアレイにおける蛍光検出部に、アレイの片側側面からレーザ光１０９を照射し、検出部から発せられる蛍光を観測することにより、ＤＮＡを検出する。アレイの端に位置し、レーザが導入されるキャピラリを以下、第１キャピラリとする。第１キャピラリに導入されたレーザ光は、隣接するキャピラリに次々と伝搬し、４本のキャピラリを横断する。４本程度であれば、レーザ光の強度はそれほど弱まらず、第１キャピラリと反対側のキャピラリまで伝搬し、４本ともに同様の蛍光検出強度を得ることができる。

以下、本発明により得られる性能を説明する。

本発明の効果は、
１）分析サンプル数と同数のキャピラリを用いて分析を行うことができるので、分析に使用しないキャピラリに無駄なポリマーを使用しない。
２）ポリマー注入機構が不要であり、メンテナンスや分析開始時にポリマーを必要としない。

以上のことから、ポリマー注入機構が不要であり、ポリマーを浪費しない電気泳動装置が提供できる。

実施例２について説明する。図９には、実施例２のキャピラリアレイと本装置の模式図を示す。

実施例１では、複数の同種類のキャピラリユニットからなるキャピラリアレイを用いた電気泳動装置を説明した。本実施例では、異なる種類のキャピラリユニットから構成されるキャピラリアレイを用いた例を説明する。異なる種類とは、異なるキャピラリ長さを有するキャピラリユニットや、異なる種類の分離媒体を封入しているキャピラリユニットを指す。本実施例では、５０cmキャピラリユニット６０１と３６cmキャピラリユニット６０２を同時に装置に接続する。この際、５０cmキャピラリユニットと、３６cmキャピラリユニットの平面面積は、ほぼ同じになるように、５０cmキャピラリユニットのキャピラリが配置されている。そのため、恒温槽を大型化する必要が無く、装置全体を小型化することができる。

異なる長さのキャピラリユニットを装着することで、各サンプルにおいて、それぞれのサンプルに適した分析を、同時に行うことができる。装置稼動時間や、消耗品等を節約することができる。

また、同サンプルを別々のキャピラリユニットを用いて分析することにより、より長塩基の分析が可能になる。つまり、短いキャピラリユニットにて、１０〜６００塩基と短い部分を、長いキャピラリユニットにて、４００から１２００塩基と長い部分を分析することにより、計１２００塩基分を１度に分析することが可能になる。

実施例３について説明する。図１０には、実施例３の外部ポリマー注入機構とキャピラリユニットのキャピラリヘッド部の模式図を示す。

実施例１では、事前に分離媒体であるポリマーが封入されたキャピラリユニットを、保存状態から、装置に接続して使用することを説明した。本実施例では、一度分析を終了したキャピラリユニットにおいて、キャピラリ内の分離媒体を入れ替えるための外部ポリマー注入機構について示す。

図１０に示すポリマー注入機７０１は、シリンジ７０２とポリマーブロック７０４，キャピラリ接続部７０５から構成される。シリンジ及びポリマーブロック内には、新鮮なポリマーが満たされており、ポリマー注入機は、常時冷蔵保管することができる。使用時は、冷蔵庫から取り出し、装置から外した使用済みキャピラリユニットに接続し、ポリマーの入れ替えを行う。キャピラリユニットの接続は、キャピラリ接続部７０５とキャピラリユニットのキャピラリヘッドを接続する。

キャピラリユニットを繰り返して使用することができると共に、ポリマー入れ替え時の無駄が無くなり、さらにポリマーを新鮮な状態で、長期保管することができる。

以上、本発明の例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に理解される。各実施例を適宜組み合わせることも、本発明の範囲である。

１０１ 装置本体
１０２ キャピラリ
１０３ キャピラリユニット
１０４ 高圧電源
１０５ 第１電流計
１０６ キャピラリ陽極端
１０７ ブロック
１０８ キャピラリ検出部取付部
１０９ レーザ光
１１０ 陽極バッファ
１１１ 電極（ＧＮＤ）
１１２ 第２電流計
１１３ キャピラリヘッド接続部
１１４ 光源
１１５ 光学検出器
１１６ 検出部
１１７ キャピラリアレイ
１１８ 恒温槽
１１９ ファン
１２１ バッファ容器
１２２ 洗浄容器
１２３ 廃液容器
１２４ サンプルプレート
１２５ 搬送機
１２６ 中空電極
１２７ キャピラリ陰極端
１２８ 制御用コンピュータ
１２９ ロードヘッダ
１３０ 移動ステージ
２０１ キャピラリヘッド
２０２ 陽極密閉材
２０３ 接着材
２０４ ポリマー
２０５ 陰極密閉材
２０６ 基準ベース
２０７ 被覆除去部
４０１ 陰極接続子
６０１ ５０cmキャピラリユニット
６０２ ３６cmキャピラリユニット
７０１ ポリマー注入機
７０２ シリンジ
７０３ シリンジ内ポリマー
７０４ ポリマーブロック
７０５ キャピラリ接続部

Claims (3)

1. 内部に分離媒体が充填され、少なくとも一部を除いて外部がコーティングされたキャピラリと、
   該キャピラリの両端を封止する封止材とを備えたキャピラリユニット。
2. 請求項１において、キャピラリの一端側に導電性の中空パイプが設けられ、キャピラリの先端が該中空パイプから突き出ていることを特徴とするキャピラリユニット。
3. 請求項１において、少なくとも一方の封止材は、導電性を有することを特徴とするキャピラリユニット。