CN100430723C

CN100430723C - 聚合高分子胶束在电泳用缓冲液中的应用

Info

Publication number: CN100430723C
Application number: CNB038061481A
Authority: CN
Inventors: 马场嘉信; 片冈一则; 田渕真理; 长崎幸夫; 田中靖子; 桑原智枝
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2008-11-05
Anticipated expiration: 2023-03-13
Also published as: CN1643374A; WO2003078993A1; KR20040094801A; CA2478659C; US20060040396A1; US7517441B2; JP3997203B2; KR100655669B1; JPWO2003078993A1; EP1489409A1; CA2478659A1

Abstract

以含有把通式HPLS-HPBS-PLZA(HPLS表示亲水性聚合物链段，HPBS表示疏水性聚合物链段，PLZA表示具有烯属不饱和双键的聚合性基团)所示的嵌段共聚物分散在水性介质中，接着使其聚合而形成的聚合高分子胶束的作为毛细管电泳、微型片型电泳的缓冲液使用，引入试样后，用规定的压力进行规定时间的加压后，在泳移电场下进行电泳，由此可以迅速地、并且以高分离能力对DNA等高分子化合物进行分离。

Description

聚合高分子胶束在电泳用缓冲液中的应用

技术领域

本发明涉及可以迅速地、并以高分离能力对高分子化合物进行分离的电泳用缓冲液和电泳法。

背景技术

已有的电泳用缓冲液，在对限定尺寸的分离能力方面具有优异性能，但由于使用了粘度高的聚合物(甲基纤维素、羟基纤维素、聚丙烯酰胺等)，所以存在有1)向微通道中注入缓冲液时耗费时间，2)随着通道宽度变窄，注入变得困难，3)需要按照DNA尺寸不同，变化聚合物的浓度，对宽范围DNA尺寸进行分离时，分离度有限制，4)缓冲液的粘度对温度敏感等缺点。因此希望有一种不存在上述1)～4)的问题，还能够迅速地、并且以高分离能力对高分子化合物进行分离的电泳用缓冲液。同时还希望有一种能够迅速地、并以高分离能力对高分子化合物进行分离的电泳法。

发明内容

本发明以提供能够迅速地、并以高分离能力对高分子化合物进行分离的电泳用缓冲液和电泳法作为目的。

也就是本发明的要点是涉及

[1]电泳用缓冲液，含有把通式(1)：

HPLS-HPBS-PLZA (1)

(式中，HPLS表示亲水性聚合物链段，HPBS表示疏水性聚合物链段，PLZA表示具有烯属不饱和双键的聚合性基团)，

所示的嵌段共聚物分散在水性介质中，接着使其聚合形成的聚合高分子胶束，

[2]电泳法，其特征是在前述[1]中所述的电泳用缓冲液的存在下，使含有高分子化合物的试样泳移，

[3]毛细管电泳法，它包括：(a)用1～30kV、1～60秒的电注入或0.2～5kPa、2～60秒的加压注入，把含有高分子化合物的试样注入到毛细管中，在可以对高分子化合物进行分离的泳移电场下，使该试样移动的工序，和

(b)用0.2～10kPa、2～60秒进行加压后，通过泳移电场使该高分子化合物泳移的工序，

[4]微型片型电泳法，它包括，在具备加料通道(channel)和与该加料通道交叉的分离用通道，并且在该加料通道的一端配置试样储存器，在该加料通道的另一端配置出口的微型片中：

(a)把含有高分子化合物的试样供给该试样储存器的工序，

(b)用5.5～7kPa对该加料通道加压0.1～5秒，使试样储存器中的该高分子化合物向加料通道和分离用通道的交叉部位泳移的工序，和

(c)用1～10kPa对分离用通道加压0.1～5秒，接着通过泳移电场使该高分子化合物在分离用通道内泳移的工序。

附图的简单说明

附图中所用符号的意义如下所示。

1 100bp的DNA峰

2 200bp的DNA峰

3 300bp的DNA峰

4 400bp的DNA峰

5 500bp的DNA峰

6 600bp的DNA峰

7 700bp的DNA峰

8 800bp的DNA峰

9 900bp的DNA峰

10 1kbp的DNA峰

11 1.1kbp的DNA峰

12 1.2kbp的DNA峰

13 1.3kbp的DNA峰

14 1.4kbp的DNA峰

15 1.5kbp的DNA峰

图1是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图2是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图3是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图4是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图5是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图6是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图7是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图8是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图9是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图10是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图11是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图12是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图13是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图14是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图15是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图16是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图17是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图18是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图19是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图20是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图21是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图22是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图23是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图24是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图25是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

图26是表示微型片型电泳中，对泳移条件进行研究的结果的图示。

实施发明的最佳方案

本发明电泳用缓冲液的一大特征是含有把通式(1)：

HPLS-HPBS-PLZA (1)

所示的嵌段共聚物分散在水性介质中，接着使其聚合形成的聚合高分子胶束。

本发明的电泳用缓冲液，与以往毛细管电泳或微型片型电泳中通常使用的缓冲液相比，具有粘度低的特征。因此具有可以顺利地向微通道或毛细管中注入缓冲液，并可以缩短缓冲液注入时间的优点。另外即使通道宽度变窄，也很容易注入缓冲液。本发明缓冲液对于过去只能用高粘度缓冲液进行分析的低碱基尺寸(例如2～200bp等)的核酸，也可以进行再现性好的分析。以往的缓冲液，必须按照各种核酸尺寸来变化缓冲液的粘度，但是本发明缓冲液可以用于核酸的宽范围尺寸中，因此可以同时对不同尺寸的核酸进行分析。而且本发明缓冲液不受由温度引起粘度变化问题的影响，所以具有不容易因气温或室温而引起日间误差的优点。

本说明书中，作为高分子化合物，可以列举蛋白质、肽、氨基酸、糖类、多糖类、核酸(例如DNA、RNA等)等。前述核酸可以是单链的，也可以是双链的。

前述通式(1)中HPLS-HPBS(亲水性聚合物链段-疏水性聚合物链段)组成的部分，只要是其本身在水性介质中形成高分子胶束的，则不管构成各链段的聚合物种类(例如聚合度、原料单体等)如何。因此本说明书中“聚合物”一词的概念包括低聚物在内。

前述通式(1)中的HPLS-HPBS部分中，在疏水性聚合物链段末端(与HPLS结合的相反侧)通过共价键结合PLZA基团、也就是具有烯属不饱和双键的聚合性基团。这种官能团，只要是不对HPLS-HPBS部分的胶束形成能力产生不良影响，则可以是任意的官能团。

并没有特别限定，但是作为构成HPLS的聚合物，可以列举聚乙二醇、聚乙烯醇、聚(甲基)丙烯酸、聚乙烯基吡啶、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和聚甲基乙烯基醚等，作为构成HPBS的聚合物，可以列举聚丙交酯(polylactide)、聚乙醇酸交酯、聚(丁内酯)、聚(戊内酯)、聚丙二醇、聚(α-氨基酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚苯乙烯、聚(α-甲基苯乙烯)、聚异戊二烯、聚丁二烯、聚乙烯、聚丙烯以及聚醋酸乙烯酯。

其中作为HPLS，从胶束形成能力的角度考虑，特别优选聚乙二醇。另外作为HPBS，从胶束形成能力的角度考虑特别优选聚丙交酯。

作为前述PLZA，只要是在水性介质中可以进行聚合的即可，可以列举如(甲基)丙烯酰基、丁烯基、乙烯基羰基氨基(CH₂＝CHCONH-；丙烯酰胺基)、异丙烯基羰基氨基[CH₂＝C(CH₃)CONH-；甲基丙烯酰胺基]、乙烯基氧羰基(CH₂＝CHOCO-)、p-乙烯基苄基(CH₂＝CH-C₆H₄-CH₂-)、p-异丙烯基苄基(CH₂＝C(CH₃)-C₆H₄-CH₂-)、p-异丙烯基苯基(CH₂＝CH-CH₂-)和乙烯基(CH₂＝CH-)等。

这些之中，作为PLZA，从形成稳定聚合的角度考虑，特别优选(甲基)丙烯酰基。

作为通式(1)所示的嵌段共聚物的具体例子，可以列举甲氧基-聚乙二醇/聚丙交酯-甲基丙烯酰基、甲氧基-聚乙烯醇/聚糖苷-丁烯基、甲氧基-聚(甲基)丙烯酸/聚丁基内酯-乙烯氧基羰基甲氧基-聚丙烯酰胺/聚苯乙烯-p-乙烯基苄基。在上述具体例子中从形成稳定胶束的观点考虑，特别优选甲氧基-聚乙二醇/聚丙交酯-甲基丙烯酰基。

这些通式(1)所示的嵌段共聚物，可以通过其本身已知的任意方法制造，但优选使用各对应的单体，通过所谓的活性阴离子聚合首先形成HPLS，然后直接在反应体系中使对应于HPBS的单体进行聚合，再加入含有烯属不饱和双键的卤化物、酸酐，引入PLZA基团而可制造。这种聚合方法适合用于制造各链段具有所需分子量的嵌段共聚物。具体的嵌段共聚物的分子量，HPLS为500～50,000，优选3,000～8,000；HPBS为500～80,000，优选3,000～8,000。各链段的分子量可以通过凝胶渗透色谱进行测定。

这样制造的通式(1)所示的嵌段共聚物，通过以一定浓度分散在水性介质(例如水或者是经适当缓冲剂缓冲的水溶液)中，可以形成高分子胶束。

在形成这种胶束方面，各链段的最佳分子量随亲水性聚合物链和疏水性聚合物链的种类以及这些链的组合情况不同而变化，所以不能对其加以限定。但是如果是本领域技术人员，则可以不必通过过多的实验，通过实际调制嵌段共聚物，对这些的胶束形成能力进行评定，就可以决定各链段的最佳分子量。如果以作为特别优选方案的具有以聚乙二醇(或者是聚环氧乙烷)作为亲水性聚合物链段，以聚丙交酯作为疏水性聚合物链段的嵌段共聚物为例，前者的分子量一般为500～50,000，优选3,000～8,000，特别优选5,500～6,500；后者的分子量一般为500～80,000，优选3,000～8,000，特别优选4,000～4,500。

如果按照本发明，用以上方法得到的高分子胶束，以反应混合液的状态或从反应混合液中分离后再度使其悬浮在水性介质中的状态，在适当聚合引发剂存在下，利用以共价键与疏水性聚合物链段末端结合的具有烯属不饱和双键的聚合性基团，使其聚合即可以制造聚合高分子胶束。作为聚合引发剂，只要是可以使前述聚合性基团在水性介质中进行聚合的引发剂，则不管其种类如何均可使用，但一般可以使用自由基聚合引发剂。作为这类引发剂，可以列举过氧化物、偶氮化合物和氧化还原引发剂。而且前述聚合，还可以采用光或射线进行引发。

本发明电泳用缓冲液中还可以优选使用通过在以通式(1)所示的嵌段共聚物中再加入低分子聚合性单体使其聚合而形成的聚合高分子胶束。在该方案中，通过在通式(1)所示的嵌段共聚物中添加低分子聚合性单体(例如苯乙烯、(甲基)丙烯酸甲酯、醋酸乙烯酯、α-c甲基苯乙烯、二烷基(甲基)丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇双(甲基)丙烯酸酯等)进行聚合，还具有可以高效制造聚合高分子胶束的优点。

这样得到的聚合高分子胶束，可以大致原样保持前体高分子胶束的形状，并且在水性介质中的所有浓度下都能稳定地保持胶束的形状，适合作为电泳缓冲液使用。

本发明电泳用缓冲液中本发明聚合高分子胶束的含量，从获得对测定物质的高分离能力角度考虑，优选为1～20mg/ml，更优选5～10mg/ml。

作为对前述胶束进行稀释的稀释液，可以列举水、tris～甘氨酸缓冲液、tris-甘氨酸缓冲液、tris-硼酸缓冲液、tris-盐酸缓冲液、tris-麦黄酮缓冲液、tris-磷酸一氢钠缓冲液、tris-硼酸-EDTA缓冲液等，一般作为高分子化合物的电泳用缓冲液中所用的缓冲液。稀释用水或为了调制缓冲液的水使用超纯水、去离子水、MilliQ水等一般电泳中所用的水，特别优选使用MilliQ水。

当被检测的高分子化合物是蛋白质或肽时，在前述通式(1)的嵌段共聚物的基础上可以添加十二烷基硫酸钠(SDS)，如果是肽，可以添加TritonX-100、ε-氨基己酸、3-(C3-胆酰氨(コヲミド)丙基)-二甲基氨基)-1-丙烷、CHAPS、6～8M尿素、四甲基乙二胺(TEMED)、己基三甲基溴化铵(HTAB)等。

本发明电泳用缓冲液的pH，从适宜的电泳和正常的峰分离角度考虑，当被检测高分子化合物为蛋白质时，优选2～9，更优选6.8～8.6。当被检测高分子化合物为肽时，优选为2～11，更优选为2.5～3.1。当被检物为核酸时，从适宜的电泳和正常的峰分离角度考虑，优选6.8～9.2，更优选7.5～8.5。

本发明电泳用缓冲液，用前述的稀释用缓冲液对本发明聚合高分子胶束进行适当稀释，再用氢氧化钠或前述的缓冲液调节其pH，进行调制。

作为本发明电泳法，可以列举在前述电泳用缓冲液的存在下，使含有高分子化合物的试样泳移为特征的方法。这里作为电泳的形式，没有特别的限定，可以适用于各种形式，其中特别优选使用毛细管电泳、微型片型电泳、纳米通道型电泳。

本发明电泳法更具体的是在毛细管电泳中，包括：

(a)把含有高分子化合物的试样注入到毛细管中，在可以使高分子化合物分离的泳移电场下使该试样移动的工序，和

(b)对毛细管内进行加压，接着通过泳移电场，使高分子化合物泳移的工序。

把试样注入到毛细管中，在可以使高分子化合物分离的泳移电场下使高分子化合物移动的工序，更具体的是通过电压法、加压法、落差法进行的，根据装置的种类，毛细管的粗细(内径)、长度等适宜地确定电压和施加压力的大小与它们的施与时间，但是从获得高速分离和高分离能力，并进一步达到高灵敏度进行检测的角度考虑，特别理想的是采用1～30kV、1～60秒的电注入或加压注入，优选采用0.2～5kPa、更优选采用1kPa进行加压注入，把含有高分子化合物的试样注入到毛细管中，然后使该试样在可以对高分子化合物进行分离的泳移电场下移动。这里前述加压，优选进行2～60秒、更优选进行5～10秒、特别优选进行7～8秒。然后从在保持高分离能力的状态下达到高速分离的角度考虑，在通过泳移电场使高分子化合物泳移的工序之前，最好进行加压，优选用0.2～10kPa、更优选1kPa进行加压。这里前述加压，优选进行2～60秒、更优选进行5～10秒、特别优选进行7～8秒。

本说明书中，毛细管电泳中的压力单位(kPa)是指在试样注入口加压的力。

用于毛细管电泳中的毛细管，对其内径、外径、全长、有效长度、并没有特别限定，可以使用一般常用尺寸的毛细管。对于有效长度，从能进行高速分析的角度考虑，可以使用有效长度短的毛细管。这里所说的毛细管有效长度是指从试样注入口到检测部分的距离。

毛细管电泳的泳移电场，从获得良好的分离能力和缩短移动时间的角度考虑，优选20V/cm～10kV/cm，更优选50V/cm～5kV/cm，特别优选100V/cm～1kV/cm。

微型片型电泳中，使用具备加料通道和与该加料通道交叉的分离用通道，并且在该加料通道的一端配置试样储存器，在该加料通道的另一端配置出口的微型片。

本发明的电泳法，在微型片型电泳中，具体包括：

(a)向试样储存器中提供含有高分子化合物的试样的工序，

(b)通过加压使该试样储存器中的高分子化合物向加料通道和分离用通道的交叉部位泳移的工序，和

(c)对该分离用通道加压，接着使高分子化合物在该分离用通道内泳移的工序。

向试样储存器中供给试样的工序，更具体的是通过向试样储存器中加入试样，优选加入1～10μl，更优选加入2～5μl而实现的。

使试样储存器中的试样向加料通道和分离用通道的交差部位泳移的工序，更具体的是，从得到足够检测灵敏度的角度考虑，优选在出口处不设置电泳用缓冲液的条件下从试样储存器对试样进行加压，优选加压3～7kPa，更优选5～7kPa，特别优选5.5～7kPa，使得试样向加料通道和分离用通道的交叉部位泳移。这里前述加压优选进行0.1～5秒，更优选进行0.5～2秒，特别优选进行1秒。

本说明书中，微型片型电泳中的压力单位(kPa)是指在分离用通道的压力加载口加压的力。

使试样在分离用通道内泳移的工序，更具体的是，从以更高速得到高分离能力的角度考虑，希望对分离用通道进行加压，优选加压1～10kPa、更优选3.5～10kPa、特别优选5～7kPa，接着通过泳移电压使试样泳移。这里前述加压，优选进行0.1～5秒，更优选进行0.5～2秒，特别优选进行1秒。

作为微型片的材质，可以列举如石英玻璃、硼硅玻璃、钠玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、二甲基硅氧烷等。其中从试样的吸附少、片容易加工的观点考虑，优选使用玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯。另外还可以与毛细管一样，使用对内壁进行过加工处理的材料。

在微型片型电泳中，微型片的尺寸，例如长为10～120mm，宽为10～120mm，厚为500～5000μm。

对微型片中加料通道和分离用通道各自的形状没有特别限定。可以使用在一块片上设置3～96条前述通道，能同时对多通道进行分析的片。多通道的排列方法，有平行排列、放射状排列、圆形排列等，但是对其形状没有特别限定。

前述通道的宽度，可以根据微型片的尺寸，使用目的等进行适当设定。具体是从获得足够分析灵敏度的角度考虑，通道的宽度在0.1μm或以上，优选在10μm或以上；从获得足够分析精度角度考虑，通道宽度在100μm或以下，优选在50μm或以下。同时，前述通道的深度可以根据微型片的尺寸，使用目的等进行适当设定。具体是从获得足够分析灵敏度的角度考虑，通道的深度在0.1μm或以上，优选在10μm或以上；从获得足够分析精度的角度考虑，通道深度在100μm或以下，优选在50μm或以下.而且前述分离用通道的长度，可以根据微型片的尺寸、分析的对象化合物，进行适当选择，但最好把有效长度设定得更长。有效长度是指从通道交叉部位至高分子化合物检测点(配置在分离用通道上)的距离。从获得足够分离能力的角度考虑，该有效长度在0.1mm或以上，优选10mm或以上，从进行高速分离的角度考虑，该有效长度在100mm或以下，优选在50mm或以下。

前述储存器的尺寸，可以根据试样容量进行适当设定。具体是从引入试样的操作和电极的厚度考虑，储存器直径在0.05mm或以上，优选3mm或以下。

微型片型电泳中的泳移电场，从获得良好的分离能力和缩短移动时间的角度考虑，优选20V/cm～50kV/cm，更优选50V/cm～5kV/cm，特别优选100V/cm～1kV/cm。

在微型片型电泳中，注入时的试样量(浓度)，从获得良好分离能力的角度考虑，当试样是肽或者蛋白质时，为0.1ng/ml～1g/ml，优选10ng/ml～100mg/ml，更优选0.1μg/m1～10mg/ml。当前速试样为糖或多糖时，注入时的试样量(浓度)，从获得良好分离能力的角度考虑，当试样是肽或者蛋白质时，为0.1μg/ml～10g/ml，优选1mg/ml～5g/ml，更优选100mg/ml～1g/ml。当前述试样为核酸时，注入时的试样量(浓度)，从获得良好分离能力的角度考虑，如果试样是肽或者蛋白质时，为0.1ng/ml～500μg/ml，优选10ng/ml～100μg/ml，更优选100ng/ml～50μg/ml。

所谓纳米通道型电泳是指使用形成了纳米尺寸，即宽度为1nm～1μm、优选10-500nm、更优选50～100nm通道构成的流路的片而进行的电泳。其中包括上述纳米尺寸结构体在微米尺寸通道中形成的。对纳米尺寸结构体的形状，没有特别限定，例如可以使用方形、圆形、三角形等形状，对结构体的设置间隔也没有特别限定。可以使用形成有这些结构体的纳米通道片。与毛细管电泳的情况一样，也包括能同时进行多通道分析的片。

纳米通道型电泳中的通道可以设计成各种各样的，尺寸具有纳米特征的通道形状弯曲成曲率的、蛇行形状、锯齿形状或者这些形状的组合等。通过如此，可以在微小尺度内形成多条通道。同时，通过如此，还可以一次处理多个样品，有可能实现高流通量。另外当在微米尺寸通道中形成纳米尺寸结构体时，具有可以自由变化其形状，也可以自由变化其设置间隔的优点。同时可以进行多通道测定。

纳米通道型电泳中，与微型片型电泳一样，包括有加料通道、与该加料通道交叉的分离用通道，在该加料通道一端配置试样储存器、在该加料通道另一端配置出口，但对其形状没有特别限定。

用于纳米通道型电泳的纳米通道片的材质可以使用与微型片相同的材质。例如可以使用石英玻璃、硼硅玻璃、钠玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、二甲基硅氧烷等。

纳米通道型电泳中纳米通道片的尺寸，可以适用与微型片相同的尺寸。例如，长为10～120mm、宽为10～120mm、厚为500～5000μm。纳米通道片的通道深度，通道长度、储存器尺寸等也都以微型片为准。

本发明还涉及毛细管电泳法，它包括(a)通过1～30kV、1～60秒的电注入或0.2～5kPa、更优选1kPa的加压注入，把含有高分子化合物的试样注入到毛细管中，在可以对高分子化合物进行分离的泳移电场下使该试样移动的工序，和

(b)以0.2～10kPa、更优选1kPa加压后，通过泳移电场使高分子化合物泳移的工序。这里前述加压，希望进行2～60秒、优选进行5～10秒、更优选进行7～8秒。

通过前述毛细管电泳法，针对试样注入时间为更短的时间即可、并可能进行高灵敏度检测的宽广范围的尺寸(2bp～15kbp)的核酸，可以同时进行分析，并且可以进行高速分析。

除加压条件以外，其它条件均以前述毛细管电泳的条件为准。

在前述毛细管电泳法中，可以使用各种电泳用缓冲液，也可以组合使用本发明的电泳用缓冲液。

本发明还涉及微型片型电泳法，包括，在具备加料通道、与该加料通道交叉的分离用通道，并且在该加料通道一端配置试样储存器，在该加料通道的另一端配置出口的微型片中：

(a)把含有高分子化合物的试样供应到该试样储存器中的工序，

(b)通过3～7kPa、优选5～7kPa、更优选5.5～7kPa对该加料通道进行加压，把该试样储存器中的该试样引入到分离通道中的工序，和

(c)通过1～10kPa、优选3.5～10kPa、更优选5～7kPa对分离用通道进行加压，接着使该试样泳移的工序。这里前述加压，希望进行0.1～5秒、优选进行0.5～2秒、更优选进行1秒。

通过前述微型片型电泳法，针对试验注入时间为更短的时间即可，并可能进行高灵敏度检测的宽广范围的尺寸(2bp～15kbp)的核酸，可以同时进行分析，并且可以进行高速分析。

除加压条件以外，其它条件以前述微型片型电泳的条件为准。

前述微型片型电泳法中，可以使用各种电泳用缓冲液，也可以组合使用本发明的电泳用缓冲液。

为检测核酸的荧光试剂，有溴化乙锭[510/595(激发波长/荧光波长，以下同)]、エチジウム同型二聚体-1[528/617]、吖啶橙[502/526]、噻唑橙(TO)[509/525]、YO-PRO-1[491/509]、YO-PRO-3[612/631]、TO-PRO-1[515/531]、TO-PRO-3[642/661]、YO-YO-1[491/509]、TO-TO-1[514/533]、YO-YO-3[612/631]、TO-TO-3[642/660]、サイバ-绿I(SYBR绿I)[494/521]、SYBRサイバ-绿[254/520]、SYBR金[300，495/537]、オリ绿(Oli绿)(ssDNA用)[500/520]、リボ绿(Ribo绿)(RNA用)[500/525]、FITC[494/519]、6-FAM[488/535]、HEX[515/559]、cy5[649/670]、cy3[550/570]等。这些荧光试剂，可以采用毛细管电泳装置BeckmanP/ACE[488/520(激发波长/检测波长，以下同)]、微型片型电泳装置Bioanalyzer(Agilent Technologies公司制造)[635/670～700]、cosmo-i SV1100(日立电子公司制造)[472/585]、cosmo-i SV2100(日立电子公司制造)[635/660]等装置进行检测。

作为供电泳的蛋白质的检测法，可以列举如通过UV波长光的吸收、UV线性成象检测，利用荧光、激光、灯、LED等进行的检测，电化学检测，化学发光检测等检测方法。具体讲，在蛋白质或肽的情况下，测定在200nm时的吸收；例如使SYPRO橙和蛋白质或肽发生反应，用460～550nm进行激发，用550～650nm测定荧光，或是使蛋白质与荧光标记(Agilent Technologies No.5065-4430)反应，用630～650nm进行激发，用670～700nm测定荧光，以及通过电化学测定、化学发光测定等方法可以检测蛋白质或肽。

在毛细管电泳中，例如可以在毛细管的出口处设置可以发射UV波长光的装置和检测该UV波长光的检测器，或者可以是设置可以发射荧光波长的装置和可以检测该荧光波长的检测器。

在微型片型电泳中，例如可以在配置于分离用通道上的检测点处设置UV波长光的检测器，或者可以设置可以发荧光波长的装置和可以检测该荧光波长的检测器。还可以同时进行多通道检测。

在纳米通道型电泳中，可以适用与微型片型电泳的情况相同的检测器、检测方法。另外在纳米通道型电泳中，当同时进行多通道检测时，可以同时检测比微型片型电泳的情况更多的试样。

在检测过程中，当对蛋白质、肽、氨基酸等进行鉴定时，可以通过UV吸收、分子量标记、与标样的移动时间比较、质谱分析等进行。

如果按照本发明的电泳法，可以迅速获得高分离能力，所以可预期应用于基因分析PCR分析、癌的基因诊断分析、通过SSCP进行的SNPs分析、VNTR分析、PCR-RFLP分析、微卫星分析，除此之外，痴呆症、肌肉萎缩症、心脏病、心肌梗塞、道氏综合征、感染症、糖尿病、苯丙酮酸尿症等各种疾病的分析，还有用于在蛋白体分析或酵解酶体分析中对蛋白质或糖链进行高流通量的筛选分析，应用于医疗诊断设备，以及应用于判明生物功能、疾病发病机理等。

实施例

调制聚合高分子胶束

使乙二醇130mmol、6.5ml与干燥THF 30ml、2-甲氧基乙醇0.16ml、萘钾(ナフタレンカウム)1mmol一起在25℃下聚合两天，再与3，6-二甲基1，4-二噁烷-2，5-二酮32mmol、31ml一起在25℃下聚合2小时后，再用甲基丙烯酸酐20mmol、3.6mL终止反应。在冷异丙醇600mL中进行再沉淀精制，通过离心分离进行沉淀，回收生成物。把该生成物溶解在苯100mL中，冷冻干燥后回收得到2.5g共聚物。把所得的共聚物2.5g溶解在1000mL水中，在油浴中保持80℃，一面搅拌，一面加热6小时，加热后保持原样放置一晚，回收胶束溶液。在30分钟后，一面把所得的胶束溶液10000mL保持在60℃，一面进行20小时的热聚合。回收该溶液，采用超过滤膜将其浓缩到规定浓度，得到用式(2)表示的聚合高分子胶束。

(通过凝胶渗透色谱求出的分子量为PEO/PLA＝6100/4000)

调制电泳用缓冲液

用0.1N氢氧化钠把100mg/ml的式(2)所示的聚合高分子胶束(用超纯水调制，pH 2.94)的pH调节到8.8，备用。

本实施例的电泳采用日立微型片型电泳装置{cosmo-i(SV1100)}进行。作为电泳用缓冲液，采用10mg/ml的式(2)所示聚合高分子胶束(pH 8.8)(以下称为高分子胶束)。作为对照例的电泳用缓冲液，采用0.7％羟丙基甲基纤维素(以下称为现有聚合物)。

作为电泳法，通过以下3种方法进行电泳：

普通法

在加料通道和分离用通道中填充电泳用缓冲液后，在试样储存器中装满10μl试样，在剩余的储存器中充满电泳用缓冲液，对加料通道施加电压，10μl、300V、60秒，把试样储存器中的试样加到加料通道中。接着一面对分离用通道施加挤压电压130V，一面施加890V的分离电压180秒；

PP法

在加料通道和分离用通道中填充电泳用缓冲液后，在试样储存器中装入2μl试样，对检测侧出口以外的储存器，在没有充满电泳用缓冲液的状态下，对试样储存器施加1～5.5kPa压力、1秒钟时间，把试样引入至加料通道，更具体地是引入至加料通道和分离用通道的交叉部位，接着从分离用通道出口的相反一侧，对分离用通道施加1～7kPa、1秒钟的压力，使试样向分离用通道的下游移动；

改良PP法

在上述PP法中，把试样引入到加料通道时的压力为5.5～7kPa、1秒，对分离用通道施加的压力为1～10kPa、1秒钟。或者是把试样引入到加料通道时的压力为1～5.5kPa、1秒钟，对分离用通道施加的压力为7～10kPa、1秒。这里，在PP法中把适量的试样引入到加料通道和分离用通道的交叉部位，具体讲是引入0.2μl，而在改良PP法中则引入过量的，具体讲是引入0.5μl试样。

以下把向加料通道(具体讲是加料通道和分离用通道的交叉部位)注入试样时的压力称为前者压力，把对分离用通道加压，使交叉部位的试样向分离用通道下游部位(检测部位侧)移动的压力称为后者压力。

本实施例中所用的PP法和改良PP法中的前者和后者的压力强度为：

L：0.1cm³空气注入

1～2kPa，

LM：0.2～0.4cm³空气注入

2～3kPa，

M：0.5cm³空气注入

3～3.5kPa，

MH：0.6～0.9cm³空气注入

3.5～5.5kPa，

H：1cm³空气注入

5.5～7kPa，

HH：1～1.5cm³空气注入

7～10kPa。

例1(高分子胶束+普通法)

使用高分子胶束作为电泳用缓冲液，按照普通法进行电泳，对100bp、800bp的2条DNA标记物进行分离。其结果在180s的泳移时间以内没有出现峰。(图1)

例2(高分子胶束+PP法)

按照PP法，进行例1中的操作。把前者的P强度定为M、后者的P强度为L。其结果在180s的泳移时间以内可以看到2个峰。(图2)

例3(高分子胶束+PP法)

把例2中的前者P强度定为M、后者的P强度定为M。其结果加速了100bp的移动时间。(图3)

例4(高分子胶束+PP法)

把例2中的前者P强度定为M、后者的P强度定为H。其结果缩短了泳移时间。(图4)

例5(高分子胶束+普通法)

使用高分子胶束作为电泳用缓冲液，按照普通法对100bp、500bp、800bp的3条DNA进行分离。其结果在180s的泳移时间以内没有出现峰。(图5)

例6(高分子胶束+PP法)

按照PP法，进行例5中的操作。把前者的P强度定为L，后者的P强度定为LM。其结果在120s的泳移时间以内可以看到3个峰。(图6)

例7(高分子胶束+PP法)

按照PP法，进行例5中的操作。把前者的P强度定为L、后者的P强度定为M。其结果加速了100bp、500bp的移动时间。(图7)

例8(高分子胶束+PP法)

使用高分子胶束作为电泳用缓冲液，按照PP法对100bp～1000bp的10条DNA进行分离。把前者的P强度定为M、后者的P强度定为L。其结果在180s的泳移时间以内可以看到10个峰。(图8)

例9(高分子胶束+PP法)

按照PP法，进行例8中的操作。把前者的P强度定为M、后者的P强度定为LM。其结果在90s的泳移时间以内可以看到10个峰。(图9)

例10(高分子胶束+PP法)

按照PP法，进行例8中的操作。把前者的P强度定为M、后者的P强度定为H。其结果在大约60s的泳移时间以内可以看到10个峰。(图10)

例11(高分子胶束+改良PP法)

按照PP法，进行例8中的操作。把前者的P强度定为M，后者的P强度定为HH。其结果同样地在60s的泳移时间以内可以看到10个峰，被加速了。(图11)

例12(高分子胶束+PP法)

使用高分子胶束作为电泳用缓冲液，按照PP法对100～800bp的8条DNA进行分离。把前者的P强度定为M、后者的P强度定为MH。(图12)

在60s以内可以看到～8个峰。

例13(高分子胶束+PP法)

使用高分子胶束作为电泳用缓冲液，按照PP法对1～15bp的15条(5kbp：高)DNA进行分离。把前者的P定为M、后者定为L。(图13)其结果在180s以内可以看到5个峰。

例14(高分子胶束+PP法)

对于例13，按照PP法，把前者定为M、后者定为M。其结果缩短了泳移时间。(图14)

例15(高分子胶束+PP法)

对于例13，按照PP法，把前者定为M、后者定为H进行。其结果缩短了泳移间隔。(图15)

例16(高分子胶束+改良PP法)

对于例13，按照PP法，把前者定为M、后者定为HH。其结果可以检测进一步至7kbp。(图16)

例17(高分子胶束+改良PP法)

对于例13，按照PP法，把前者定为H、后者定为L。其结果在180s以内可以确认有8个峰。(图17)

例18(高分子胶束+改良PP法)

对于例13，按照PP法，把前者定为H、后者定为M。其结果在180s以内可以检测出15个峰。(图18)

例19(高分子胶束+改良PP法)

对于例13，按照PP法，把前者定为H、后者定为H。其结果在100s以内可以确认有15个峰。(图19)

例20(背景)

本电泳中，对没有DNA，只有高分子胶束缓冲液和荧光试剂的背景进行分析。其结果，由于检测不出由高分胶束产生的峰，所以可以认为检测出的一系列的峰是使用本高分子胶束作为电泳缓冲液时各DNA的峰。(图20)

把对现有电泳用缓冲液实施PP法的结果和对使用高分子胶束的电泳用缓冲液实施PP法的结果进行比较，研究本高分子胶束的有效性。与以现有聚合物(0.7％HPMC(羟丙基甲基纤维素))作为电泳用缓冲液的情况进行了比较。

例21(现有聚合物+普通法)

以现有聚合物溶液(0.7％HPMC(羟丙基甲基纤维素))作为电泳用缓冲液，按照普通方法对100bp、800bp的2条DNA标记进行分离。(图21)

例22(现有聚合物+PP法)

用早前申请的电泳法进行例21的操作。把前者定为M、后者的P定为LM。其结果显示出缩短了泳移时间。(图22)

例23(现有聚合物+PP法)

在例22中，把前者定为M、后者P定为MH。其结果峰变宽。(图23)

例24(现有聚合物+普通法)

以现有聚合物溶液(0.7％HPMC(羟丙基甲基纤维素))作为电泳用缓冲液，按照普通方法对100bp-800bp的8条DNA标记进行分离。(图24)

例25(现有聚合物+PP法)

利用PP法进行例24的操作，把前者定为M，后者的P定为LM。其结果加速了前者峰，峰的间隔变宽。(图25)

例26(现有聚合物+PP法)

在例25中，把前者定为M，后者P定为MH。其结果峰变宽。(图26)

根据以上可知，在以现有聚合物溶液作为电泳用缓冲液时，如果采用PP法，虽然可以提高DNA的移动时间，但是当分离DNA时，其高速分离有限制。另一方面，使用高分子胶束时，可以施加更高压力(例1～20)，这样就显示出本高分子胶束的有用性。

本高分子胶束，如果是单独使用，则在毛细管、微型片型电泳中体现不出对DNA的分离效果，但是如果通过与PP法配合使用，则可以发挥对DNA的尺寸分离效果。而且，通过使用对PP法进行改良的电泳法，可以实现进一步超过用现有高分子聚合物溶液(使用例如纤维素衍生物或聚丙烯酰胺溶液、已有的电泳法)得到的最高检测速度(10kbp，约80s)的泳移时间(10kbp，约60s，15kbp，约100s)。

产业上的实用性

Claims

1.聚合高分子胶束在电泳用缓冲液中的应用，所述聚合高分子胶束是把通式(1)所示嵌段共聚物分散在水性介质中，然后使其聚合而形成的：

HPLS-HPBS-PLZA (1)

式中，HPLS表示亲水性聚合物链段，HPBS表示疏水性聚合物链段，PLZA表示具有烯属不饱和双键的聚合性基团。

2.根据权利要求1中所述的应用，其中所述高分子胶束是在所述嵌段共聚物中进一步加入低分子聚合性单体而聚合形成的。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，构成HPLS的聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚(甲基)丙烯酸、聚乙烯基吡啶、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和聚甲基乙烯基醚，HPBS选自聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚丁内酯、聚戊内酯、聚丙二醇、聚α-氨基酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚苯乙烯、聚α-甲基苯乙烯、聚异戊二烯、聚丁二烯、聚乙烯、聚丙烯和聚醋酸乙烯酯。

4.根据权利要求1所述的应用，其中，HPLS是聚乙二醇，HPBS选自聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚丁内酯、聚戊内酯、聚丙二醇和聚α-氨基酸。

5.电泳法，其特征是在含有权利要求1～4任意一项中所记载的高分子胶束的电泳用缓冲液存在下，使含有选自蛋白质、肽、氨基酸、糖类和核酸的化合物的试样泳移。

6.根据权利要求5中所述的电泳法，其中，电泳的形式是毛细管电泳、微型片型电泳或纳米片型电泳。

7.根据权利要求5中所述的电泳法，其中，电泳的形式是毛细管电泳，它包括：

(a)通过1～30kV、1～60秒的电注入或加压注入，把含有选自蛋白质、肽、氨基酸、糖类和核酸的化合物的试样注入到毛细管中，在可使所述化合物分离的泳移电场下，使该化合物移动的工序，和

(b)对毛细管内进行加压后，通过泳移电场使所述化合物泳移的工序。

8.根据权利要求5中所述的电泳法，其中，电泳的形式是使用微型片的微型片型电泳，所述微型片具备加料通道和与该加料通道交叉的分离用通道，并且在该加料通道的一端配置有试样储存器，在该加料通道的另一端配置有出口，本方法包括在该微型片中：

(a)把含有选自蛋白质、肽、氨基酸、糖类和核酸的化合物的试样供给该试样储存器的工序，

(b)通过对所述加料通道加压，使所述试样储存器中的所述化合物向加料通道和分离用通道的交叉部分泳移的工序，和

(c)对分离用通道加压，接着通过泳移电场使该所述化合物在分离用通道内泳移的工序。

9.权利要求5所述的电泳法，其为毛细管电泳法，包括：

(a)通过1～30kV、1～60秒的电注入或0.2～5kPa、2～60秒的加压注入，把含有选自蛋白质、肽、氨基酸、糖类和核酸的化合物的试样注入到毛细管中，在可使所述化合物分离的泳移电场下，使该试样移动的工序，和

(b)0.2～10kPa、2～60秒加压后，通过泳移电场使所述化合物泳移的工序。

10.权利要求5所述的电泳法，其为使用了一种微型片的微型片型电泳法，该微型片具备加料通道和与该加料通道交叉的分离用通道，并且在该加料通道的一端配置有试样储存器，在该加料通道的另一端配置有出口，本方法包括在该微型片中：

(b)通过以5.5～7kPa对该加料通道加压0.1～5秒，使该试样储存器中的所述化合物向加料通道和分离用通道的交叉部分泳移的工序，和

(c)以1～10kPa对分离用通道加压0.1～5秒，接着通过泳移电场使所述化合物在分离用通道内泳移的工序。

11.根据权利要求5所述的电泳法，其中，还包括对泳移的所述化合物进行检测的工序。