CN101372709A - 一种快速定量评价药物核酸相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：使用专用的阵列微流控芯片对药物核酸相互作用进行定量评价。相对于现有的技术，本发明具有直接、快速、操作简单和样品用量少的特点，对作用于核酸靶药物的高通量筛选有广泛的应用。
Description
技术领域：
本发明属于化学与物理科学，具体涉及芯片电泳技术；特别提供了一种使用专用的阵列微流控芯片对药物核酸相互作用进行定量评价的方法。
背景技术：
核酸分子是多态的(包括序列、结构等)，在它们的结构中往往含有特定的位点作为一些药物的作用靶点，一些药物与核酸作用会导致核酸的裂解或者空间螺旋结构的畸变，而许多这些核酸-药物的相互作用能显示出生物学和临床药学方面的效能，如：抑制肿瘤细胞增长、病毒、细菌、真菌和寄生虫感染等，因此，研究核酸-药物的相互作用对药物设计、开发性研究和临床用药有极其重要的指导意义。尽管目前已有很多基于核酸靶点的药物应用于临床治疗，但是这些药物往往具有很大的毒性；另一方面，这些药物的作用机理大都不十分明确。现有报道的药物与核酸作用的方式有三种：共价结合、非共价结合和断裂作用。共价结合主要表现为核酸的烷基化、链间交联和链内交联等，其中以顺铂和卡铂为典型代表药物。非共价结合则以嵌插结合和沟区结合二种方式进行，其中沟区结合包括大沟区结合和小沟区结合，以纺锤菌素为代表药物。而博来霉素类抗肿瘤药物是一类天然存在的糖肽类抗生素，这类药物直接作用于肿瘤细胞的核酸，使核酸链断裂和裂解，最终导致肿瘤细胞的死亡。阐明药物和核酸之间相互作用的本质，包括作用位点、作用模式、序列长短的影响、诱导结构变化等等，是生物学家、化学家以及药学家研究的热点。
定量评价核酸-药物的相互作用是药物研发过程中的重要环节。对于开发新型核酸结合药物的需求促进了多种定量方法的发展，例如核磁共振、拉曼光谱、电喷雾质谱、圆二色谱、紫外光谱、X-射线单晶衍射、足迹法和毛细管电泳分离等方法已经被应用于定量评价核酸-药物的相互作用。一般来说，简单快速的方法不能得到更高的信息量，而相对信息量大的方法却有耗时和高仪器要求的。因此，引入一种高信息量、低样品消耗和快速简单的分析方法能够极大地促进核酸-药物相互作用的研究。更进一步地，为了满足不断增长的分析同量的要求，发展一种具有平行分析多个样品能力的技术更为重要。
微流控芯片以其高效、快速、微量及便于自动化等特点，已经被广泛用于生物分子的分析测定。而阵列微流控芯片以其高通量平行分析的能力在基因测序和分析领域发挥了重要的作用。将阵列微流控芯片应用到定量评价药物核酸相互作用领域对研制和开发作用于核酸靶药物具有重要的意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种快速定量评价药物核酸相互作用的方法，即使用专用的阵列微流控芯片对药物核酸相互作用进行定量评价。
本发明提供了一种快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：使用专用的阵列微流控芯片对药物核酸相互作用进行定量评价；
所述的阵列微流控芯片由四组平行的电泳单元(电泳单元是指可提供分析物在高压直流电场下定向运动，并根据分析物在该电场中的迁移速度的不同进行分离和分析的微通道系统。)组成，每个电泳单元(1)由样品池(2)、进样通道(3)、缓冲液储液池(4)、分离通道(5)、缓冲液废液池(6)组成。
方法过程为：
将芯片电泳缓冲液放入阵列微流控芯片缓冲液储液池(4)中，并充满分离通道(5)和进样通道(3)；
将不同药物-核酸浓度配比的混合样品分别放入的样品池(2)；
然后对样品池(2)和缓冲液废液池(6)之间施加电压进行进样；
进样完成后，在缓冲液储液池(4)和缓冲液废液池(6)之间施加电压，进行电泳分离和检测。记录核酸的峰高峰面积变化，用于计算药物核酸的结合常数，定量评价相互作用。
本发明提供的快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述的每个电泳单元的组成部分结构相同或成镜像对称，分离通道(5)在检测区域集中排列。
本发明提供的快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述的进样通道(3)或分离通道(5)的深度或宽度的范围为10～100微米。进样通道(3)或分离通道(5)的最适宜深度尺寸是10～20微米。深度太浅，进样量过小，对检测器灵敏度要求很高，不宜匹配；深度太深，芯片制作耗时长，物料成本增加，并且对分离造成负面的影响。从理论上讲，进样通道(3)或分离通道(5)的宽度越窄越好，通道越窄越有利于所针对的可操作物质的分离，但窄的通道不宜制作且容易堵塞，因此一般40～60微米的宽度较好，既可以满足分离要求，也可以满足芯片的制作。
本发明提供的快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述阵列微流控芯片中的不同的电泳单元中所使用的缓冲液是同一种缓冲液。该缓冲液能溶解进行相互作用的所有药物和核酸。电泳过程常用一些缓冲液作为运行溶液，例如磷酸缓冲液、硼砂缓冲液和醋酸缓冲液等。
本发明提供的快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：药物-核酸的混合样品中浓度比例范围为0.5：1～2：1。
本发明提供的快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述各个电泳单元使用的电泳场强一致，场强范围为150～1000伏/厘米。一般从低场强向高场强逐次实验确定所用的场强，其最佳范围是300～600伏/厘米。
本发明提供的快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述的检测器同时检测多个通道，在各分离通道的相同位置同时采集信号，通常采用电荷藕合器件图像传感器(CCD)的采集系统。
多个平行的电泳单元公用一个缓冲液池(4)是为了方便操作，在本发明所进行的实验中均采用此种设计。公用的缓冲液废液池(6)就是用来存储废液的，没有其他特殊用途。采用独立的缓冲液废液池当然也可以实现本发明的目的。
微流控芯片技术是当前仪器分析的研究热点，该技术主要以分析化学和生物化学为基础，利用微机电加工技术，在硅、玻璃、石英、高聚物表面加工出10-100微米的微通道网络，主要以电渗流和电泳流为驱动力，通过改变驱动电压，控制流体在微通道网络中的流动方向和速率，不仅易于实现对目标分析物的采样、稀释、富集、萃取、混合、反应、分离、检测等操作，而且易于将操作单元阵列化。迄今为止，采用多组平行电泳单元进行快速定量评价药物核酸相互作用的报道还没有。本发明创造性地设计了用于定量评价药物核酸相互作用的阵列微流控芯片，可实现多个不同样品的同时分离测定。整个过程在50秒内完成，样品消耗在微升级。本发明与液相色谱，核磁共振，微孔板等传统相互作用研究方法相比，具有直接、快速、操作简单和样品用量少等优势。
总之，本发明可在一块几平方厘米的塑料、玻璃或石英芯片上，在短时间内完成多个样品的分离分析，并利用得到的数据计算药物核酸的结合常数，进而定量评价药物核酸的相互作用。相对于现有技术而言，本发明具有直接、快速、操作简单和样品用量少的特点，具有可预见的巨大的科学价值和经济价值。
附图说明：
图1为阵列微流控芯片的结构图，
图2为荧光标记核酸的电泳谱图，
图3为不同浓度的纺锤菌素核酸混合物的电泳谱图；
具体实施方式：
实施例1
对荧光标记的核酸测定。本实验所用芯片为图1所示含四个电泳单元的玻璃芯片，通道宽50μm，深15μm。缓冲液放入缓冲液储液池(4)，并应用负压将缓冲液充满分离通道(5)和废液池(6)，将10μM荧光标记的核酸混合10μM内标物荧光素，将四份样品加入到样品池(2)。在样品池(2)和废液池(6)之间加电压(场强400V)，时间6秒，然后切换电压至缓冲液储液池(4)和废液池(6)之间(场强400V)，样品池(2)施加抑制电压以防止样品泄漏，在距离进样点3cm处检测(结果见图2)。从图中可以看出，各个分离通道之间荧光标记的核酸与内标物的峰高峰面积比例基本一致，整个分析过程在50秒内完成。
实施例2
对纺锤菌素(netropsin)和核酸的结合常数测定。本实验所用芯片为图1所示含四个电泳单元的玻璃芯片，通道宽50μm，深15μm。缓冲液放入缓冲液储液池(4)，并应用负压将缓冲液充满分离通道(5)和废液池(6)，将纺锤菌素和荧光标记的核酸按0.5：1-2：1浓度比例混合(加入10μM内标物荧光素)，将四种不同浓度比例的混合溶液加入到样品池(2)。在样品池(2)和废液池(6)之间加电压(场强400V)，时间6秒，然后切换电压至缓冲液储液池(4)和废液池(6)之间(场强400V)，样品池(2)施加抑制电压以防止样品泄漏，在距离进样点3cm处检测(结果见图3)。从图中可以看出，随着纺锤菌素加入浓度的增加，内标物峰高峰面积不变，核酸峰高、峰面积下降。整个分析过程在50秒内完成。
Claims (9)
1.一种快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：使用专用的阵列微流控芯片对药物核酸相互作用进行定量评价；
所述的阵列微流控芯片由四组平行的电泳单元(1)组成，每个电泳单元由样品池(2)、进样通道(3)、缓冲液储液池(4)、分离通道(5)、缓冲液废液池(6)组成；
方法过程为：
将芯片电泳缓冲液放入阵列微流控芯片缓冲液储液池(4)中，并充满分离通道(5)和进样通道(3)；
将不同药物-核酸浓度配比的混合样品分别放入的样品池(2)；
然后对样品池(2)和缓冲液废液池(6)之间施加电压进行进样；
进样完成后，在缓冲液储液池(4)和缓冲液废液池(6)之间施加电压，进行电泳分离和检测，记录核酸的峰高峰面积变化，用于计算药物核酸的结合常数，定量评价相互作用。
2.按照权利要求1所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述的每个电泳单元(1)的组成部分结构相同或成镜像对称，分离通道(5)在检测区域集中排列。
3.按照权利要求1所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述的进样通道(3)和分离通道(5)的深度或宽度的范围为10～100微米。
4.按照权利要求3所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述的进样通道(3)和分离通道(5)的深度范围为10～20微米，宽度的范围为40～60微米。
5.按照权利要求1所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述阵列微流控芯片中的不同的电泳单元中所使用的缓冲液是同一种缓冲液。
6.按照权利要求1所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：药物-核酸的混合样品中浓度比例范围为0.5：1～2：1。
7.按照权利要求1所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述各个电泳单元使用的电泳场强一致，场强范围为150～1000伏/厘米。
8.按照权利要求7所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述各个电泳单元使用的电泳场强一致，场强范围为300～600伏/厘米。
9.按照权利要求1所述快速定量评价药物核酸相互作用的方法，其特征在于：所述的检测器同时检测多个通道，在各分离通道的相同位置同时采集信号。
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