JP4814945B2 - キャピラリー電気泳動法による試料の分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、キャピラリー電気泳動法によるタンパク質含有試料の分析方法に関する。

キャピラリー電気泳動法では、キャピラリー管内壁に集合したイオンが、印加によって移動することで電気浸透流が生じ、これにより試料が移動して電気泳動が行われる。キャピラリー管としては、溶融シリカ製のキャピラリー管が使用されているが、これは、試料の吸着により良好な電気浸透流が得られない場合がある。このため、キャピラリー管内壁を被覆する技術が提案されている（特許文献１、２、３、４）。一方、血液中のヘモグロビン（Ｈｂ）は、血液中のグルコースと反応して糖化Ｈｂとなる。血液中の糖化Ｈｂは、生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における指標とされており、中でも、β鎖Ｎ末端のバリンが糖化したものは、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と呼ばれ、特に重要な指標として、臨床検査等で、その測定が実施されている。血液中のヘモグロビンの測定方法は、例えば、アガロース電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、ＨＰＬＣ法、免疫法、酵素法等がある。これらの中で、ヘモグロビンの遺伝的変異等の微小な変異が検出できるのは、キャピラリー電気泳動法とＨＰＬＣ法である。一方、ヘモグロビンの分析装置に対しては、小型化が求められている。この点に関し、ＨＰＬＣ法は、装置全体の小型化が困難である。これに対し、キャピラリー電気泳動法では、マイクロチップ化することで、装置全体を小型化することが可能である。

しかしながら、前述の従来のキャピラリー電気泳動法では、ヘモグロビンを高精度で分析できないという問題がある。この問題を解決するために、キャピラリー管内壁を、タンパク質で被覆し、さらにこの上を多糖類で被覆するという技術がある（特許文献５）。しかしながら、この技術では、分析の度に、キャピラリー管内壁をタンパク質で被覆する操作が必要であり、分析が煩雑になるという問題がある。一方、キャピラリー管内壁を被覆せずに、双性イオン性タイプのランニングバッファーに脂肪族ジアミン等の流れ阻害剤を含有させてキャピラリー電気泳動するという方法がある（特許文献６）。しかしながら、この方法では、変異ヘモグロビンは分離できても、ヘモグロビンＡ１ｃは分離できないという問題がある。これらの問題は、ヘモグロビンに限らず、その他の試料におけるキャピラリー電気泳動法全般の問題である。

特開２００５−２９１９２６号公報 特開平４−３２０９５７号公報 特表平５−５０３９８９号公報 特表平８−５０４０３７号公報 特開平９−１０５７３９号公報 特開２００６−１４５５３７号公報

そこで、本発明の目的は、装置の小型化が可能であり、分析精度が高く、容易に実施することが可能なキャピラリー電気泳動法によるタンパク質含有試料の分析方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、キャピラリー電気泳動法によるタンパク質含有試料の分析方法であって、
前記キャピラリー電気泳動法に用いるキャピラリー管を準備する工程と、
前記キャピラリー管中において、タンパク質含有試料と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する工程とを含み、
前記キャピラリー管が、前記キャピラリー管内壁に、陰極性基含有化合物から形成された陰極性層が積層されたキャピラリー管であり、前記陰極性層は共有結合により前記キャピラリー管内壁に固定されていることを特徴とする。

本発明の分析方法では、キャピラリー管内壁に共有結合で固定された陰極性層が形成されているキャピラリー管を使用するため、ヘモグロビン等の血液試料中のタンパク質含有試料のキャピラリー管内壁への吸着を防止でき、これにより、良好な電気浸透流を生じさせることが可能である。また、本発明の分析方法では、タンパク質含有試料と陰極性基含有化合物とを結合させて複合体を生成し、これを電気泳動するため、タンパク質含有試料単独で電気泳動するよりも分離効率が高くなる。これらのことから、本発明の分析方法によれば、短時間かつ高精度でヘモグロビン等のタンパク質含有試料の分析が実施できる。また、前記陰極性層は、キャピラリー管内壁に強固に固定されているため、一度形成してしまえば、洗浄しても容易に剥離することが無く、繰り返し使用可能である。このため、本発明の分析方法では、一度陰極性層を形成すれば、分析の度に陰極性層を形成する必要がないため、容易に分析を実施することができる。また、本発明では、キャピラリー電気泳動法を採用しているため、分析装置を小型化することが可能である。

図１は、本発明の一実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。 図２は、本発明のその他の実施例におけるヘモグロビンの分析結果を示すチャートである。 図３は、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置の一例の構成を示す図である。図３（Ａ）は、この例のキャピラリー電気泳動装置の平面図であり、図３（Ｂ）は、図３（Ａ）のＩ−Ｉにおける断面図であり、図３（Ｃ）は、図３（Ａ）のＩＩ−ＩＩにおける断面図である。 図４は、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置のその他の例の構成を示す図である。 図５は、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置のさらにその他の例の構成を示す図である。 図６は、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置のさらにその他の例の構成を示す図である。

本発明において、前記ランニングバッファーとは、実際の分離工程に使用する緩衝液（バッファー）をいう。本発明の分析方法の前記キャピラリー管において、陰極性基含有化合物を含むランニングバッファーにタンパク質含有試料を添加し、ついで、キャピラリー管の両端を印加して、前記タンパク質含有試料と陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動することが好ましい。

本発明の分析方法において、前記タンパク質含有試料と複合体を形成する前記陰極性基含有化合物としては、陰極性基含有多糖類が好ましい。前記陰極性基含有多糖類としては、例えば、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類およびリン酸化多糖類があり、このなかで、硫酸化多糖類およびカルボン酸化多糖類が好ましい。前記硫酸化多糖類としては、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等が好ましく、より好ましくは、コンドロイチン硫酸である。前記カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が好ましい。コンドロイチン硫酸は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋの七種類があり、いずれを用いてもよい。

本発明の分析方法では、前記陰極性層を形成する前記陰極性基含有化合物において、前記陰極性基は、スルホン基およびカルボキシル基の少なくとも一方であることが好ましい。

本発明において、前記タンパク質含有試料は、ヘモグロビンを含むタンパク質含有試料が好ましい。

本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置において、基板と、複数の液槽と、キャピラリー管とを含み、前記基板上に、前記複数の液槽が形成され、前記複数の液槽が、前記キャピラリー管で連通され、前記キャピラリー管が前記本発明の分析方法にかかるキャピラリー管であってもよい。この場合において、前記基板の最大長さは、例えば、１０〜１００ｍｍの範囲であり、好ましくは、３０〜７０ｍｍの範囲であり、前記基板の最大幅は、例えば、１０〜６０ｍｍの範囲であり、前記基板の最大厚みは、例えば、０．３〜５ｍｍの範囲である。なお、前記基板の最大長さとは、前記基板の長手方向の最長部の長さであり、前記基板の最大幅とは、前記基板の前記長手方向とは垂直な方向（幅方向）の最長部の長さであり、前記基板の最大厚みとは、前記基板の前記長手方向および前記幅方向の両方に垂直な方向（厚み方向）の最長部の長さである。このように、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置は、小型化（マイクロチップ化）されたマイクロチップ電気泳動装置であってもよい。

つぎに、本発明を詳しく説明する。

前述のように、本発明にかかるキャピラリー管は、その内壁に前記陰極性層が形成されている。

前記キャピラリー管の材質は、特に制限されず、例えば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等があげられる。ガラス製、溶融シリカ製のキャピラリー管の内壁は、通常、陰性の電荷を有する状態である。プラスチック製のキャピラリー管内壁は、プラスチック中の極性基の有無や種類により、陽性もしくは陰性の電荷を有する状態であり、または無電荷（無極性）の状態である。また、極性基を持たないプラスチックであっても、極性基を導入することにより、電荷を有する状態にすることができる。前記プラスチック製のキャピラリー管としては、市販品を使用してもよく、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等から形成されたキャピラリー管があげられる。前記キャピラリー管の内径は、例えば、１０〜２００μｍの範囲、好ましくは、２５〜１００μｍの範囲である。前記キャピラリー管の長さは、例えば、１０〜１０００ｍｍの範囲である。

前記陰極性基含有化合物による前記キャピラリー管内壁への前記陰極性層の形成は、例えば、前記陰極性基および反応基を含む化合物を用いればよい。前記キャピラリー管が、ガラス製若しくは溶融シリカ製である場合は、陰極性基およびケイ素を有する化合物（シリル化剤）を使用することができる。前記陰極性基としては、スルホン基およびカルボキシル基の少なくとも一方が好ましいのは、前述のとおりである。

前記シリル化剤は、例えば、２−（４−クロロスルフォニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、２−（４−クロロスルフォニルフェニル）エチルトリクロロシラン等がある。

前記シリル化剤において、ケイ素原子をチタン若しくはジルコニウムに置換したものを用いてもよい。前記シリル化剤は、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上で併用してもよい。

前記シリル化剤を用いた陰極性層の形成は、例えば、つぎのようにして実施する。まず、シリル化剤を有機溶媒に溶解若しくは分散させて処理液を調製する。前記処理液の調製に使用する前記有機溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、トルエン等が使用できる。前記処理液のシリル化剤の濃度は特に制限されない。この処理液を、ガラス製若しくは溶融シリカ製のキャピラリー管に通液し、加熱する。この加熱によって、前記シリル化剤が前記キャピラリー管内壁に共有結合で結合し、その結果、陰極性基が前記キャピラリー管内壁に配置されることになる。その後、有機溶媒（ジクロロメタン、メタノール、アセトン等）、酸性溶液（リン酸等）、アルカリ性溶液および界面活性剤溶液の少なくとも一つで洗浄（後処理）する。なお、この洗浄は任意であるが、実施することが好ましい。前記シリル化剤により陰極性層が形成されたキャピラリー管は、市販品を使用してもよい。

前記ランニングバッファーは、特に制限されないが、酸を用いたバッファーが好ましい。前記酸は、例えば、マレイン酸、酒石酸、こはく酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸がある。また、前記ランニングバッファーは、弱塩基を含むことが好ましい。前記弱塩基としては、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリス等がある。前記ランニングバッファーのｐＨは、例えば、ｐＨ４．５〜６の範囲である。前記ランニングバッファーのバッファーの種類は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等がある。前記ランニングバッファーにおいて、前記タンパク質含有試料と複合体を形成する前記陰極性基含有化合物の濃度は、例えば、０．０１〜５重量％の範囲である。

つぎに、本発明の分析方法は、例えば、ヘモグロビンを含むタンパク質含有試料に対し、つぎのようにして実施できる。

まず、ガラス製若しくは溶融シリカ製のキャピラリー管を準備する。このキャピラリー管の内壁には、陰極性基含有化合物が共有結合で固定されている。このキャピラリー管に、精製水を通液して洗浄する。前記精製水の通液時間は、例えば、１〜１０分間であり、前記通液時の圧力は、例えば、０．０５〜０．１ＭＰａである。つぎに、コンドロイチン硫酸等の陰極性基含有多糖類を含むランニングバッファーを前記キャピラリー管に、ポンプ等により圧力をかけて通液する。この通液の時間は、例えば、１０〜６０分間であり、通液の圧力は、例えば、０．０５〜０．１ＭＰａである。前記キャピラリー管に前記ランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビン含有試料を前記キャピラリー管に導入し、前記キャピラリー管の両端を印加して、電気泳動を行う。前記ヘモグロビン含有試料は、特に制限されず、例えば、全血を溶血処理した試料があげられ、また、この試料を精製水やランニングバッファーで希釈してもよい。前記ヘモグロビン含有試料の導入は、前記キャピラリー管の陽極側から行う。導入されたヘモグロビンは、前記ランニングバッファー中の陰極性基含有多糖類と結合して複合体となる。印加により、前記キャピラリー管内のランニングバッファーにおいて電気浸透流が生じ、前記複合体がキャピラリー管の陰極側に向かって移動する。前記印加の程度は、例えば、１０〜３０ｋＶである。この移動を、光学的手法により検出する。光学的手法による検出は、特に制限されないが、４１５ｎｍの波長で行うことが好ましい。

本発明において、分析対象となるヘモグロビンは、特に制限されず、例えば、正常ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン（例えば、ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＧＨｂＬｙｓ等）、遺伝的変異型ヘモグロビン等がある。本発明では、ＨｂＡ１ｃと、これ以外のヘモグロビンとを分離して分析することが可能である。

つぎに、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置について例を挙げて説明する。ただし、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置は、下記の例に限定されない。

図３に、本発明の分析方法に使用するキャピラリー電気泳動装置の一例を示す。図３（Ａ）は、この例のキャピラリー電気泳動装置の平面図であり、図３（Ｂ）は、図３（Ａ）のＩ−Ｉにおける断面図であり、図３（Ｃ）は、図３（Ａ）のＩＩ−ＩＩにおける断面図である。また、同図において、分かりやすくするために、各構成要素の大きさや比率等は、実際と異なっている。この例のキャピラリー電気泳動装置は、小型化（マイクロチップ化）されたマイクロチップ電気泳動装置である。図示のように、このマイクロチップ電気泳動装置は、基板１と、複数（この例では４つ）の液槽２ａ〜ｄと、４本のキャピラリー管３ｘ１、３ｘ２、３ｙ１および３ｙ２とを含む。前記４本のキャピラリー管は、全て前記本発明の分析方法にかかるキャピラリー管である。前記４つの液槽２ａ〜ｄは、第１の導入槽２ａ、第１の回収槽２ｂ、第２の導入槽２ｃおよび第２の回収槽２ｄを含む。前記４本のキャピラリー管は、そのそれぞれの一端が、中心部ｃで集合し、十字状に連結している。この結果、前記４本のキャピラリー管は、その内部が連通されている。前記基板１には、前記４本のキャピラリー管をはめ込むための空洞が設けられている（図示せず）。前記キャピラリー管３ｘ１は、その他端が、前記第１の導入槽２ａの底面に位置するように、前記基板１中にはめ込まれている。前記キャピラリー管３ｘ２は、その他端が、前記第１の回収槽２ｂの底面に位置するように、前記基板１中にはめ込まれている。前記キャピラリー管３ｘ１および３ｘ２は、試料分析用のキャピラリー流路３ｘとなっている。前記キャピラリー管３ｙ１は、その他端が、前記第２の導入槽２ｃの底面に位置するように、前記基板１中にはめ込まれている。前記キャピラリー管３ｙ２は、その他端が、前記第２の回収槽２ｄの底面に位置するように、前記基板１中にはめ込まれている。前記キャピラリー管３ｙ１および３ｙ２は、試料導入用のキャピラリー流路３ｙとなっている。前記複数の液槽２ａ〜ｄは、それぞれ、前記基板１上に凹部として形成されている。前記基板１は、前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙより第１の回収槽２ｂ側に直方体状の開口部（窓）９を有する。なお、この例のマイクロチップ電気泳動装置は、直方体状である。ただし、本発明は、これに限定されない。本発明の分析方法に使用するマイクロチップ電気泳動装置は、電気泳動測定に支障をきたさなければ、いかなる形状であってもよい。また、この例のマイクロチップ電気泳動装置の平面形状は、長方形である。ただし、本発明は、これに限定されない。本発明の分析方法に使用するマイクロチップ電気泳動装置の平面形状は、例えば、正方形やその他の形状であってもよい。そして、この例のマイクロチップ電気泳動装置では、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘと前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙの最大長さは、異なっている。ただし、本発明は、これに限定されない。本発明の分析方法に使用するマイクロチップ電気泳動装置において、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘと前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙの最大長さは、同じであってもよい。これら以外においても、本発明の分析方法に使用するマイクロチップ電気泳動装置の構成は、この例に限定されない。

つぎに、この例のマイクロチップ電気泳動装置の製造方法について説明する。ただし、前記マイクロチップ電気泳動チップは、下記の製造方法以外の方法で製造されてもよい。

この例のマイクロチップ電気泳動装置においては、前記基板１として、例えば、ガラス、ポリマー材料等から形成されたものが使用できる。前記ガラス材料としては、例えば、合成石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等が挙げられる。前記ポリマー材料としては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸等が挙げられる。

この例のマイクロチップ電気泳動装置において、前記基板１の最大長さ、最大幅および最大厚みは、前述のとおりである。

前記４本のキャピラリー管の内径は、それぞれ、前記本発明の分析方法にかかるキャピラリー管の内径のとおりである。前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘおよび前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙの最大長さは、例えば、０．５〜１５ｃｍの範囲である。前記４本のキャピラリー管の長さは、それぞれ、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘおよび前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙの最大長さに従って決定される。

前記複数の液槽２ａ〜ｄの容積は、特に制限されないが、例えば、それぞれ、１〜１０００ｍｍ^３の範囲であり、好ましくは、５０〜１００ｍｍ^３の範囲である。図３においては、前記複数の液槽２ａ〜ｄの形状は、円柱状である。ただし、本発明は、これに限定されない。本発明の分析方法に使用するマイクロチップ電気泳動装置において、前記複数の液槽の形状は、後述の試料の導入および回収に支障のないものであれば特に制限されず、例えば、四角柱状、四角錘状、円錐状、これらを組み合わせた形状等、任意の形状とすることができる。また、前記複数の液槽の容積および形状は、全て同じであってもよいし、それぞれ異なってもよい。

この例のマイクロチップ電気泳動装置の製造工程の一例を、下記に示す。ただし、前記マイクロチップ電気泳動装置は、下記の製造工程以外の工程で製造されてもよい。

まず、前記基板１を作製する。前記基板１への前記４つの液槽２ａ〜ｄおよび前記開口部（窓）９の形成方法は、特に制限されない。例えば、前記基板１の材質が前記ガラスの場合、前記形成方法としては、例えば、超音波加工等が挙げられる。例えば、前記基板１の材質が前記ポリマー材料の場合、前記形成方法としては、例えば、金型を用いた射出成型、注入成型、プレス成型等の成型法や切削加工法等が挙げられる。前記４つの液槽２ａ〜ｄおよび前記開口部（窓）９は、それぞれ別個に形成してもよいし、全てを同時に形成してもよい。前記４つの液槽２ａ〜ｄおよび前記開口部（窓）９を別個に形成する場合には、どの順序で形成してもよい。前記金型を用いた方法等により、前記４つの液槽２ａ〜ｄおよび前記開口部（窓）９の全てを同時に形成することが、工程が少なくてすみ、好ましい。

つぎに、前記４本のキャピラリー管を、前記基板１にはめ込む。このようにして、この例のマイクロチップ電気泳動装置を得ることができる。

前記マイクロチップ電気泳動装置は、さらに、複数の電極を有してもよい。図４に、前記複数の電極を有するこの例のマイクロチップ電気泳動装置を示す。同図において、図３と同一部分には、同一符号を付している。図示のように、このマイクロチップ電気泳動装置は、４本の電極６ａ〜ｄを有する。前記４本の電極６ａ〜ｄは、それぞれ、その一端が前記複数の液槽２ａ〜ｄ内に位置するように、前記基板１に埋め込まれている。前記４本の電極６ａ〜ｄは、例えば、前記基板１の製造時に、前記４本の電極６ａ〜ｄの導入孔を前記基板１側面に形成しておくことで、容易に配置することができる。なお、前記マイクロチップ電気泳動装置において、前記複数の電極は、任意の構成部材である。前記複数の電極は、例えば、前記マイクロチップ電気泳動装置の使用時に、前記複数の液槽内に挿入してもよい。

前記複数の電極６ａ〜ｄは、電気泳動法に使用可能なものであればいかなるものであってもよい。前記複数の電極６ａ〜ｄは、例えば、それぞれ、ステンレス鋼（ＳＵＳ）製電極、白金（Ｐｔ）電極、金（Ａｕ）電極等である。

前記マイクロチップ電気泳動装置は、さらに、ヘモグロビン等を含む試料を溶血させ、且つ希釈するための前処理槽を含んでいてもよい。前記ヘモグロビン含有試料の溶血処理は、特に制限されないが、例えば、前記ヘモグロビン含有試料を溶血剤で溶血させる処理であってもよい。前記溶血剤は、例えば、前記ヘモグロビン含有試料中の血球成分の血球膜を破壊する。前記溶血剤としては、例えば、前記ランニングバッファー、サポニン、ナカライテスク（株）製の商品名「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」等が挙げられ、特に好ましくは、前記ランニングバッファーである。前記前処理槽は、例えば、前記導入槽と連通されていることが好ましい。前記前処理槽は、それが連通される液槽、例えば、前記第２の導入槽２ｃの近くなど、適当な場所に形成すればよい。前記前処理槽がある場合には、前記ヘモグロビン含有試料は、前記前処理槽に導入される。これにより前処理された前記ヘモグロビン含有試料は、前記前処理槽とそれが連通される液槽、例えば、前記第２の導入槽２ｃとを結ぶ流路により、前記第２の導入槽２ｃへと導入される。前記前処理槽は、前記ヘモグロビン含有試料を溶血させるための槽と前記ヘモグロビン含有試料を希釈するための槽との２つの槽が連通された構成であってもよい。

前記マイクロチップ電気泳動装置は、さらに、分析部を有してもよい。図５に、前記分析部を有するこの例のマイクロチップ電気泳動装置を示す。同図において、図３および４と同一部分には、同一符号を付している。図示のように、このマイクロチップ電気泳動装置は、分析部７を有する。この例のマイクロチップ電気泳動装置においては、前記分析部７が、検出器（ライン検出器）である。前記ライン検出器は、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘと前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙとの交差部分より前記第１の回収槽２ｂ側に位置するように、前記キャピラリー管３ｘ２上に直接配置されている。このマイクロチップ電気泳動装置では、基板１に、前記４本のキャピラリー管をはめ込むための空洞に加え、前記分析部（ライン検出器）７をはめ込むための空洞が設けられている（図示せず）。前記ライン検出器は、光源および検出部を内蔵する。前記ライン検出器は、前記光源から試料に向けて光を発し、試料からの反射光を前記検出部で検出することで、吸光度を測定する。前記分析部７は、前記ライン検出器に限定されず、例えば、ヘモグロビンを含む試料の分析を行えるものであれば、いかなるものであってもよい。例えば、前記分析部７は、前記マイクロチップ電気泳動装置の下方に配置された光源と、前記ライン検出器の配置箇所に対応する位置に配置された検出部とで構成されていてもよい。この場合には、前記光源から試料に向けて光を発し、試料からの透過光を前記検出部で検出することで、吸光度を測定する。

図６に、本発明の分析方法に使用するマイクロチップ電気泳動装置のさらにその他の例を示す。同図において、図５と同一部分には、同一符号を付している。図示のとおり、この例のマイクロチップ電気泳動装置は、分析部７が異なること以外、図５に示したマイクロチップ電気泳動装置と同様の構成である。この例のように、前記分析部７は、１点で吸光度を測定するものであってもよい。

図５および６に示したマイクロチップ電気泳動装置を用いた本発明の分析方法は、例えば、ヘモグロビンを含む試料に対し、つぎのようにして実施できる。

まず、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘおよび前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙに、精製水を通液して洗浄する。前記精製水の通液時間および前記通液時の圧力は、例えば、前述のとおりである。つぎに、コンドロイチン硫酸等の陰極性基含有多糖類を含むランニングバッファーを、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘおよび前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙに、ポンプ等で圧力をかけて通液する。この通液の時間および通液の圧力は、例えば、前述のとおりである。ついで、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘおよび前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙに、前記ランニングバッファーを、圧力または毛細管作用によって充填する。

なお、マイクロチップ電気泳動装置非使用時（非分析時）において、あらかじめ前記ランニングバッファーの充填工程までが完了していれば、前述の各工程を省略し、ただちに以下の工程に移ることが可能であるため好ましい。

つぎに、前記第２の導入槽２ｃにヘモグロビン含有試料を導入する。前記ヘモグロビン含有試料としては、前述のとおりである。マイクロチップ電気泳動装置が、前記前処理槽（図示せず）を有する場合には、前記ヘモグロビン含有試料を、前記前処理槽に導入し、そこで前処理する。ついで、前記電極６ｃおよび前記電極６ｄに電圧を印加して、前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙの両端に電位差を生じさせる。これにより、前記ヘモグロビン含有試料を、前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙに導入する。導入されたヘモグロビンは、前記ランニングバッファー中の陰極性基含有多糖類と結合して複合体となる。印加により、前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙ内のランニングバッファーにおいて電気浸透流が生じ、前記複合体が前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘと前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙとの交差部分まで移動する。

前記電極６ｃと前記電極６ｄとの間の電位差は、例えば、０．５〜５ｋＶの範囲である。

つぎに、前記電極６ａおよび前記電極６ｂに電圧を印加して、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘの両端に電位差を生じさせる。このように、両端に電位差があるキャピラリー流路を、前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙから前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘに瞬間的に切り替えることにより、図５および６に矢印で示すように、前記試料８を、前記試料分析用のキャピラリー流路３ｘと前記試料導入用のキャピラリー流路３ｙとの交差部分から、前記第１の回収槽２ｂ側に移動させる。

前記電極６ａと前記電極６ｂとの間の電位差は、例えば、０．５〜５ｋＶの範囲である。

つぎに、前記検出器７により、移動速度の差により分離された前記ヘモグロビン含有試料中の各成分を検出する。これにより、前記ヘモグロビン含有試料中の各成分を分離して分析することが可能である。

つぎに、本発明の実施例について説明する。

（実施例１）
内壁にスルホン基を有するシリル化剤が共有結合で固定されて形成された陰極性層を有する溶融シリカ製のキャピラリー管（全長３２ｃｍ、有効長８．５ｃｍ、内径５０μｍ）を準備した。このキャピラリー管に、精製水を圧力０．１ＭＰａ（１０００ｍｂａｒ）で２０分間通液して洗浄した。つぎに、１００ｍＭリンゴ酸とアルギニン酸水溶液に、０．５重量％の割合でコンドロイチン硫酸を添加したランニングバッファー（ｐＨ５．５）を準備した。このランニングバッファーを、前記キャピラリー管に、前記と同じ圧力で通液した。前記キャピラリー管内にランニングバッファーが充填された状態で、ヘモグロビンを精製水に溶解した試料を前記キャピラリー管内に注入し、前記キャピラリー管の両端を１０ｋＶで印加し電気泳動を行った。前記ヘモグロビン含有試料の注入は、前記キャピラリー管の陽極側から行った。移動したヘモグロビンを、４１５ｎｍの吸光度で検出した。この結果を、図１のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ０）と糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を分離して検出することができた。また、本実施例で用いたキャピラリー管は、洗浄した後、直ぐに分析可能となった。

（実施例２）
内壁にカルボキシル基を有するシリル化剤が共有結合で固定されて形成された陰極性層を有する溶融シリカ製のキャピラリー管（全長３２ｃｍ、有効長８．５ｃｍ、内径５０μｍ）を用いた以外は、実施例１と同様にしてキャピラリー電気泳動を行ってヘモグロビンを分析した。この結果を、図２のチャートに示す。図示のように、本実施例において、正常ヘモグロビン（ＨｂＡ０）と糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を分離して検出することができた。また、本実施例で用いたキャピラリー管は、洗浄した後、直ぐに分析可能となった。

以上のように、本発明によれば、キャピラリー電気泳動法により、ヘモグロビン等のタンパク質含有試料の分析を、容易かつ高精度で実施可能である。しかも、本発明は、キャピラリー電気泳動法を採用しているため、分析装置を小型化することも可能である。本発明は、臨床検査、生化学検査、医学研究等のヘモグロビン等のタンパク質含有試料を分析する全ての分野に適用することができ、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。

Claims (7)

1. キャピラリー電気泳動法によるタンパク質含有試料の分析方法であって、
   前記キャピラリー電気泳動法に用いるキャピラリー管を準備する工程と、
   前記キャピラリー管中において、タンパク質含有試料と陰極性基含有化合物とが結合した複合体を電気泳動する工程とを含み、
   前記キャピラリー管が、前記キャピラリー管内壁に、陰極性基含有化合物から形成された陰極性層が積層されたキャピラリー管であり、前記陰極性層は共有結合により前記キャピラリー管内壁に固定されていることを特徴とする分析方法。
2. 前記キャピラリー管において、陰極性基含有化合物を含むランニングバッファーにタンパク質含有試料を添加し、ついで、キャピラリー管の両端を印加して、タンパク質含有試料と陰極性基含有化合物との複合体を電気泳動する請求項１記載の分析方法。
3. 前記タンパク質含有試料と複合体を形成する前記陰極性基含有化合物が、陰極性基含有多糖類である請求項１または２記載の分析方法。
4. 前記陰極性基含有多糖類が、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類およびリン酸化多糖類からなる群から選択される少なくとも一つの多糖類である請求項３記載の分析方法。
5. 前記硫酸化多糖類が、コンドロイチン硫酸である請求項４記載の分析方法。
6. 前記陰極性層を形成する前記陰極性基含有化合物において、前記陰極性基が、スルホン基およびカルボキシル基の少なくとも一方である請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
7. 前記タンパク質含有試料が、ヘモグロビンを含むタンパク質含有試料である請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。

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